Documento Informativo nr - CheLab

Documento Informativo nr. 156Data di emissione: 31.08.2010Revisione n. 3LABORATORIO PCRRICERCA O.G.M. NEGLI ALIMENTIRiferimento interno: dr. Riccardo Zuccherato - Biologo Responsabile CHELAB s.r.l.(tel. 0423 - 7177; e-mail: r.zuccherato@chelab.it)Mod. 174/SQ rev. 2

1 - ABSTRACTUn Organismo Geneticamente Modificato (OGM) è “…un organismo diverso da un essere umano,il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura conl’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale…”.2 – INTRODUZIONEGli OGM sono dunque quegli organismi in cui sono stati trasferiti geni con tecniche di laboratorio,secondo modalità differenti da quanto avviene con l’incrocio sia in natura, sia con la praticaagricola tradizionale, basata sul breeding.Perché una pianta viene modificata geneticamente? Per:- Migliorarne il valore nutritivo;- Creare varietà di piante ed animali maggiormente produttive;- Eliminare o ridurre degli effetti nocivi ed indesiderati di agenti di vario tipo, per esempio:-insetti e nematodi-virus-batteri-funghi patogeni-infestanti vegetali-fattori abiotici di stress.- Migliorare delle caratteristiche di conservazione e trattamento post-raccolta.Numerose sono le specie vegetali che sono state e sono tuttora oggetto di ricerca: si tratta divarietà importanti dal punto di vista alimentare o industriale la cui coltivazione è ampiamentediffusa.I Regolamenti CE n. 1829/2003 e n. 1830/2003, entrati in vigore in Europa rispettivamente il 19 e il15 aprile 2004, costituiscono gli atti fondamentali su cui si basa l’attuale legislazione comunitaria inmateria di OGM.Una delle sezioni più significative del suddetto Regolamento è relativa all’obbligo di etichettaturadegli OGM autorizzati all’immissione in commercio – gli OGM non autorizzati sono, di fatto, illegali– al di sopra dello 0,9% rispetto al singolo ingrediente alimentare o al singolo componente di unmangime. Tale obbligo non sussiste a percentuali di OGM < 0,9% purché la presenza di OGM siaaccidentale o tecnicamente inevitabile (gli operatori devono dimostrare di avere adottato tutte lemisure appropriate per evitarne la presenza).Un altro aspetto importante riguarda gli OGM non ancora autorizzati, per cui il Regolamentostabilisce una soglia di tolleranza dello 0,5% purché la loro presenza sia accidentale otecnicamente inevitabile.L’indagine di screening delle derrate alimentari, geneticamente modificate, viene eseguita sempretramite l’identificazione di elementi comuni alle piante geneticamente modificate. Elementi dicontrollo come per esempio i promotori e i terminatori di trascrizione, possono essere alla base diquesti metodi di screening per i vegetali. I promotori sono dei siti di riconoscimento e di legame perla RNA-polimerasi e permettono l’espressione dell’informazione genetica. Il promotore ottenuto dalVirus a mosaico del cavolfiore (CAMV 35S) è spesso utilizzato per le piante dicotiledoni come lasoia RR o il mais Mon 810. I terminatori sono dei segnali di stop per la RNA-polimerasi eappartengono anch’essi alle sequenze regolatrici.3 – ANALISI DEL DNA: GENERALITÀ’3.1 La tecnica PCRLa PCR (polymerase chain reaction) è una tecnica di analisi basata sull'azione enzimatica di unaPagina 2 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it

DNA polimerasi termostabile. Questo enzima è in grado, in presenza di nucleotidi trifosfati, diduplicare molte volte una determinata regione di DNA, allungando due oligonucleotidi (primer) cheibridizzano con i filamenti di DNA complementari in direzione opposta. I primer fungono dainiziatori, permettendo la duplicazione da parte della DNA polimerasi della regione di DNAcompresa tra di essi.L'amplificazione si svolge in tre fasi:1) fase di denaturazione del DNA (92-96°C): la doppia elica del DNA viene separata nei duefilamenti che la costituiscono;2) fase di ibridizzazione (temperatura variabile secondo la sequenza): i primer si appaiano in modospecifico con il filamento di DNA complementare;3) fase di sintesi (72°C): la polimerasi allunga i primer, copiando la sequenza di DNA cui sonoappaiati.Utilizzando un termostato programmabile (termociclatore) è possibile ripetere numerose volte (20-40) questo ciclo e quindi amplificare in modo esponenziale il frammento di DNA desiderato. Latecnica è molto potente e, in teoria, permette di individuare e amplificare una sequenza presentenel campione in singola copia.La tecnica PCR è attualmente applicata in diversi campi della diagnostica e, in alcuni casi, vienepreferita ad altri metodi di analisi per i vantaggi che offre:-stabilità chimica e termica del suo bersaglio (il DNA) rispetto alle proteine;-alta sensibilità (può rilevare, in teoria, la presenza di una sola molecola bersaglio nel campione);-semplicità tecnica e possibilità di automazione del sistema;-possibilità di esaminare i risultati in modo rapido e semplice (gel di agarosio).Applicata alla rivelazione di sequenze di DNA transgeniche la PCR presenta alcune limitazioni chedevono essere prese in considerazione (Heyer, 1997; Greiner e Konietzny, 1997):-è necessario conoscere, almeno in parte, la sequenza del DNA modificato e introdotto nellapianta;-la sequenza del DNA modificato deve possedere qualche caratteristica peculiare che permetta ladistinzione rispetto a organismi non geneticamente modificati (per esempio una combinazionetipica degli elementi genetici inseriti);-alcune tecniche di produzione, trattamento o conservazione degli alimenti possono diminuire lastabilità del DNA; in alcuni casi la molecola bersaglio può risultare degradata e perciò nonrilevabile;-la PCR è una reazione enzimatica su cui possono agire in senso inibitorio sostanze presenti neglialimenti;-la PCR è una tecnica molto sensibile e richiede particolari attenzioni per evitare possibilicontaminazioni da parte di DNA estraneo.3.2 La scelta dei primerLa scelta di primer adatti è determinante per assicurare la specificità del saggio. La sequenza deveessere costituita da almeno 20 basi: primer più corti non assicurano specificità di riconoscimento,primer più lunghi potrebbero allinearsi in modo altrettanto aspecifico durante la fase di estensionea 72°C.Per individuare con sicurezza la presenza di OGM negli alimenti è necessario scegliere i primer inmodo che siano complementari ad elementi distinti del costrutto transgenico (per esempiopromotore, gene modificato, terminatore) in modo da amplificare regioni a cavallo tra questi. Lasequenza amplificata in questo modo è costituita da una combinazione unica di elementi genicinon riscontrabile né nel prodotto convenzionale né in altri prodotti geneticamente modificati.Ad esempio i primer utilizzati per la ricerca di soia transgenica Roundup Ready amplificano unaregione di DNA compresa tra il promotore 35S (presente nel virus del mosaico del cavolfiore) e ilpeptide di traslocazione della petunia (Wurz e Wilmund,1997). Questa combinazione genica è statacostruita artificialmente e non si rinviene in natura: anche nel caso sfortunato in cui il campione siaPagina 3 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it

contaminato con DNA del virus o della petunia l'amplificazione non potrà aver luogo dal momentoche è necessaria la presenza simultanea delle due sequenze combinate.3.3 Falsi positivi e falsi negativiE' possibile che la polimerasi amplifichi delle sequenze diverse da quella bersaglio (risultato falsopositivo) quando:- si è verificata una contaminazione di DNA (soprattutto proveniente da precedenti amplificazioni)attraverso le soluzioni o gli strumenti usati;- il campione è contaminato da microrganismi che contengono il DNA bersaglio senza esseretransgenici (contaminazione del campione da parte di microrganismi da cui provengono lesequenze inserite artificialmente);- i primer non sono sufficientemente specifici;- le condizioni del saggio (temperatura, concentrazione di ioni) non sono sufficientementerestrittive.Risultati falsi negativi (mancata amplificazione della sequenza bersaglio che è però presente nelcampione) possono essere dovuti alla presenza nel campione di fattori inibenti la DNA polimerasi,riscontrabili abbondantemente negli alimenti (Rossen et al., 1997). In alcuni casi infatti laprocedura di estrazione standard del DNA non è sufficiente ad eliminare tali interferenti.Alcune delle strategie per prevenire l'inibizione sono descritte in letteratura (Gasch et al.,1997) eprevedono, per esempio, la diluizione del campione (con lo svantaggio di ridurre la sensibilità delmetodo) o l'aggiunta di BSA e altre proteine in grado di complessare gruppi fenolici e di proteggerein tal modo la polimerasi. E’ indispensabile comunque dedicare molto tempo alla ottimizzazionedell’estrazione del DNA, con estrazioni ad hoc per ogni matrice, in modo da partire con un DNApuro e in buono stato.3.4 Sensibilità del testCome è già stato sottolineato, la PCR permette di rilevare quantità di DNA molto piccole (in teoria,è possibile amplificare una sola copia della sequenza bersaglio). Tuttavia l'applicazione di questareazione a campioni alimentari introduce dei fattori (interferenza della matrice sulla efficienza diestrazione del DNA, sostanze inibenti la polimerasi) in grado di abbassare la sensibilità del test di50-100 volte (Greiner e Konietzny, 1997)A causa del miscuglio durante la raccolta, lo stoccaggio e il trasporto, gli OGM sono spesso evolentieri ripartiti in maniera eterogenea nei campioni e ciò può dare luogo in fase analitica e nelcaso di campionamenti poco rappresentativi a falsi negativi. Al momento della scelta dei campionisi ha quindi bisogno di complessi piani di campionamento che sembrano al momento essere moltovicini alle modalità di prelievo ufficiali per cereali contaminati da micotossine. Le modalità dicampionamento da applicare ai prelievi per il controllo degli OGM nei prodotti agricoli sfusi e neglialimenti e mangimi preconfezionati sono state definite con la Raccomandazione della CommissioneEuropea del 4 ottobre 2004, relativa agli orientamenti tecnici sui metodi di campionamento e dirilevazione degli organismi geneticamente modificati e dei materiali ottenuti da organismigeneticamente modificati come tali o contenuti in prodotti (Reg. CE n.1830/2003). I campi diapplicazione disciplinati dalla Raccomandazione sono i seguenti:- campionamento di prodotti agricoli sfusi; si raccomanda che il campionamento di prodotti diprodotti sfusi (granelle, semi oleosi) avvenga secondo i principi generali e metodi dicampionamento descritti nelle norme ISO 6644 e 13690. Il campionamento di materiali didimensioni maggiori rispetto alle granelle dovrebbe essere effettuato secondo la norma ISO 2859;- campionamento di lotti di alimenti e mangimi preconfezionati;il campionamento deglialimenti e dei mangimi preconfezionati dovrebbe esseresvolto secondo le proceduredescritte nella norma ISO 2859.Pagina 4 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it

3.5 Qualità del DNAIn diagnostica alimentare questo aspetto deve essere considerato come uno dei più importanti perla riuscita del test. Negli alimenti, sottoposti a varie fasi di lavorazione e conservazione, spesso ilDNA è presente in forma frammentata o degradata. Se la lunghezza media dei frammenti èsignificativamente inferiore a quella della sequenza bersaglio la reazione di amplificazione può nonaver luogo e portare di conseguenza ad una errata interpretazione dei risultati del saggio.Fattori che contribuiscono alla frammentazione del DNA sono:-un trattamento termico prolungato (idrolisi del DNA);-la presenza di nucleasi (degradazione enzimatica);-bassi valori di pH (depurinazione ed idrolisi).Quindi la qualità del DNA in cibi altamente processati, trattati con il calore e a bassi valori di pH(per esempio salsa di soia e ketchup) può essere molto scarsa e non permettere l'amplificazione.4 – SERVIZI CHELAB4.1 Determinazione degli OGM tramite DNADate le sensibilità dei metodi utilizzati (vedi di seguito), in tutte le fasi CHELAB assicura la qualitàdelle analisi sugli OGM tramite:• segregazione fisica delle zone di trattamento campione, estrazione del DNA e analisivera e propria;• esecuzione in doppio dei campioni;• impiego di diluizioni seriali per ovviare a problemi di interferenze della matrice;• controlli positivi e negativi per ogni fase di trattamento (controlli di estrazione, controllidi amplificazione);4.1.1 Test Qualitativo (accreditato ISO 17025 SINAL).Il metodo è suddivisibile in tre fasi analitiche distinte.La prima fase permette l’estrazione del DNA per mezzo di solventi organici per i quali il DNA dauna parte e altre macromolecole biologiche (proteine, lipidi e zuccheri) dall’altra presentano unadiversa affinità. La concentrazione approssimata del DNA così ottenuto viene calcolata attraversouna misura dell’assorbanza dell’estratto a 260 nm.La seconda fase sfrutta le capacità di sintesi di un enzima termostabile (la Taq DNApolimerasi) per amplificare migliaia di volte un tratto di DNA di cui è nota la sequenza.L’amplificazione viene eseguita tramite un termociclatore predisposto nello strumento ABI-PRISM 7900.Elementi chiave della metodica di rilevazione sono: l’ABI Prism 7900 che consente una letturafluorimetrica in continuo della reazione di PCR, e l’attività nucleasica 5' sulla sonda. Il saggioimpiega una sonda fluorogenica con sequenza complementare ad un tratto interno del gene che sivuole ricercare, questa sonda porta legato un colorante reporter e un quencher che a quella datadistanza impedisce l’emissione.Durante la PCR la sonda fluorogenica e i due primers si appaiano al tratto di DNAcomplementare,ovviamente se questo è presente. Successivamente la sonda viene tagliatadall’attività nucleasica 5' della Ampli–TaqDNA polimerasi. Il taglio della sonda genera un aumentodell’intensità di fluorescenza del colorante reporter che sarà funzione del numero di copie del genericercato e che un sistema di rilevamento basato sull’ABI Prism 7900 Sequence Detection Systeme TaqMan LS-50B PCR legge in continuo.Pagina 5 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it

La PCR di screening è una semplice PCR End Point ottimizzata allo scopo di verificare econfermare l’eventuale presenza di:1. Promotore CaMV35S;2. Terminatore Nos;3. tRNAleu (Cloroplasto).La terza fase viene, svolta utilizzando dei kit specifici, solo in caso di positività allo screening ed èindirizzata a rilevare quanto segue:PCR per la rilevazione e identificazione di OGM- Soia Roundup Ready (RR soy);- Mais Maximizer Bt176:Mais Bt11;Mais Mon810;Mais Liberty Link T25;Mais RoundUp Ready GA21;Mais RoundUp Ready NK603;Mais MIR604Mais MON 863Riso BT63Riso LL62/601ColzaLino FP967Patata Amflora (EH-92)La sensibilità del test qualitativo è dello 0.01%.4.1.2 Test Quantitativo (accreditato ISO 17025 SINAL).La tecnica di PCR quantitativa viene condotta con lo strumento GENE AMP 7900 che utilizza oltreagli oligonucleotidi sintetici denominati primers indispensabili per una reazione a catena dellapolimerasi (PCR), un terzo oligonucleotide sonda denominato Probe non estendibile che ibridaspecificatamente una regione del DNA target compresa tra le sequenze degli oligonucleotidi primere l’attività 5’ Nucleasica della AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer). Il probe consiste in un oligonucleotideappositamente disegnato al quale sono legate due molecole di fluorocromi: al 5’ è legato ilreporter e al 3’ il quencher. Nel sistema del probe integro le emissioni di qualsiasi reporter vengonomascherate da un unico quencher rappresentato da una molecola di rodamina modificata, ilTAMRA (carbossitetrametil rodamina), solitamente posizionata all’estremità 3’ del probe. Nellasonda intatta, anche ibridata al target, la vicinanza tra quencher e reporter è tale per cui, comeindicato sopra, la fluorescenza del primo viene soppressa dal secondo per la legge di trasferimentodi energia di Förster (Förster V.Th., 1948-Lakowicz, 1983). Durante le varie fasi dell’amplificazionedell’eventuale target presente, il probe ibrida un tratto di DNA compreso tra i primers e alpassaggio della polimerasi esso viene staccato dalla stessa in seguito all’attività 5’-3’ esonucleasidella Taq Gold. In questo modo il reporter viene allontanato dal quencher annullandone l’effetto dimascheramento della fluorescenza. Si verifica in questo modo la registrazione dell’aumentodell’emissione di fluorescenza del reporter direttamente riconducibile all’amplificazione del targetdesignato e funzione del numero di copie del gene ricercato: ciò permette di avere una stimaquantitativa del DNA bersaglio presente nel campione di partenza. Tutto questo è possibile perchélo strumento ABI PRISM 7900 legge in continuo l’emissione di fluorescenza durante tutta lareazione di PCR ed effettua una parametrizzazione dei dati che consente l’estrapolazione dellaquantitativa nella fase esponenziale della reazione, fase in cui è possibile relazionare conappropriati parametri standard la quantità di emissione alla quantità di DNA bersaglio iniziale delPagina 6 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it

campione.Per la quantificazione relativa del DNA transgenico si usa il metodo della curva standard. Occorrecostruire due curve di taratura con DNA di riferimento a titolo noto (una per l’evento transgenico euna per il DNA specie-specifico) conducendo la determinazione in doppio per ogni standard. Ognicampione viene deposto in piastra in doppio a due concentrazioni sia per la quantificazione delgene transgenico sia per la quantificazione del DNA specie-specifico.Il risultato finale è espresso in percentuale ed è dato dal rapporto tra DNA transgenico e DNAspecie specifico. (ES. Soia Roundup Ready/Soia vegetale).Gli eventi transgenici quantificabili sono:1. Soia Roundup Ready (RR soy)2. Mais Maximizer Bt1763. Mais Bt114. Mais Mon8105. Mais Liberty Link T256. Mais NK6037. Mais RoundUp Ready GA218. Mais MIR 6049. Mais MON 863Il limite di rivelabilità è dello 0.007%.Matrici accreditate a cui sono applicabili i metodi :1. carne e derivati2. cereali e derivati3. prodotti da forno4. cioccolato5. prodotti di pasticceria6. semi e sfarinati7. mangimi8. additivi9. prodotti di gastronomia10. conserve vegetali11. pasta di riso12. riso13. gallette di riso14. farina di riso15. colza16. lino e derivati17. patate5 – RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI• Agrisole, numeri vari.• Börchers, T., Franke, R. e Spener, F. (1997) Simplified detection of genetically modified foodby PCR-ELISA. in: BgVV Hefte, Foods Produced by Means of Genetic Engineering, 2nd StatusReport, 01/1997, 123-133.• Bottura C. Fogher C. 2000. Tissue and phase specific production of the Cry protein intransgenic maize. Transgenic Res. (in stampa).• Braunschweig, G. e Conzelmann, C. (1997) Food industry supplies obtained through geneticmodification: What's already on the market? in: BgVV Hefte, Foods Produced by Means ofPagina 7 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it

Genetic Engineering, 2nd Status Report, 01/1997, 1-13.• Fogher C., Reggi S., Marundelli M. 1997. Verifica della presenza di transgeni in vegetali e loroderivati alimentari. In “La difesa antiparassitaria nelle industrie alimentari e la protezione deglialimenti”, P. Cravedi Ed. Atti 6° Simp., Piacenza 24-26 settembre, Chiriotti Ed., pp. 391-398.• Fogher C.. 1999. Genetically engineering plants for crop improvement: risks and opportunities.In “Human and environmental exposure to xenobiotics” Del Re AAM et al. (Eds.). Proc. of the XISymposium Pesticide Chemistry, September 11-15, Cremona., pp. 861-871.• Gasch, A., Wilborn, F., Scheu, P. e Berghof, K. (1997) Detection of genetically modifiedorganisms with the polymerase chain reaction: potential problems with the food matrix. in:BgVV Hefte, Foods Produced by Means of Genetic Engineering, 2nd Status Report, 01/1997,90-99..• Greiner, R. e Konietzny, U. (1997) Is there a pssibility to identify foods as produced throughgenetic engineering by PCR technology? in: BgVV Hefte, Foods Produced by Means ofGenetic Engineering, 2nd Status Report, 01/1997, 100-102.• Hemmer, W. (1997) Foods derived from genetically modified organisms and detectionmethods. BATS report, 02/1997.• Heyer, A.G. (1997) Limitations in the identification of genetically modified food. in: BgVV Hefte,Foods Produced by Means of Genetic Engineering, 2nd Status Report, 01/1997,80-89.• J. D. Watson et al.: Biologia Molecolare del Gene ed. Zanichelli (1989)• Müller, N., Zimmermann, V., Hentrich, B., Gottstein, B. (1996) Diagnosis of Neurospora caniumand Toxoplasma gondii by PCR and DNA-Hybridization Immunoassay. J Clin Microbiol 342850-2852.• Regolamento (CE) n. 1813/97 della commissione del 19 settembre 1997, Gazzetta ufficialedelle Comunità europee n. L 257/7-8.• Regolamento (CE) n. 258/97 del parlamento europeo e del consiglio del 27 gennaio 1997,Gazzetta ufficiale delle Comunità europee n. L 43/1-7.• Rossen,L., Norskov, P., Holmstrom, K. e Rasmussen, O.F. (1997) Inhibition of PCR bycomponents of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. Int JFood Microbiol 17 37-45.• S.E. Luria, S.J. Gould, S. Singer,: Una Visione della vita, introduzione alla biologia ed Zanichelli(1984)• Schulze, M. (1997) Detection of food produced with the help of genetic engineering. in: BgVVHefte, Foods Produced by Means of Genetic Engineering, 2nd Status Report, 01/1997, 73-7.Wurz, A. e Wilmund, R. (1997) Identification of transgenic glyphosate-resistant soybeans. in:BgVV Hefte, Foods Produced by Means of Genetic Engineering, 2nd Status Report, 01/1997,115-117.Pagina 8 di 8chelab srl - analisi per industria - agricoltura - ambiente31023 resana (tv) - via fratta, 25 - tel. 0423.7177 (15 linee r.a.) - fax 0423.715058 - codice fiscale, p. iva e reg. imprese tv 01500900269r.e.a. treviso n. 156079 - capitale sociale € 103.408,00 interamente versato - http://www.chelab.it - e-mail: box@chelab.it