Quorum sensing definitivo 27 08 2007

Quorum sensing microbico e igiene degli alimentiValerio GiacconeDipartimento di “Sanità pubblica, Patologia comparata e Igiene veterinaria”, Facoltàdi Medicina veterinaria, Università degli Studi di Padova.1. PREMESSAI batteri sono esseri viventi come tutti gli altri, solo un po’ meno complessi comestruttura. Per decenni sono stati visti come esseri viventi molto individualisti checonducono la loro esistenza come singole cellule libere in un mezzo, alla costantericerca di nutrienti per sopravvivere e, se ci sono le possibilità, riprodursi. In realtàoggi sappiamo che i batteri fanno parte di una società piuttosto complessa e chesono in grado di comunicare fra loro. Non si può dire che parlino o cantino, così comeaccade all’uomo o come fanno (in modo più elementare) delfini e balene, ma certo siscambiano informazioni rilasciando nell’ambiente una serie di messaggi che i loroconsimili percepiscono.Per esempio, i batteri periodicamente fanno il censimento della popolazione e tastanoil terreno, ossia verificano praticamente in tempo reale le condizioni dell’ambienteche li circonda, sia esso l’ambiente esterno o l’interno di un essere animato come unapianta, un animale o l’uomo stesso.In questo contesto i batteri producono e rilasciano nell’ambiente circostante alcunicomposti chimici specifici che fungono da trasmettitori del messaggio; altri batteri licaptano, li interpretano e rispondono producendo a loro volta dei messaggi, diciamocosì, odorosi.Nella società dei batteri (o meglio, nell’ambiente in cui una certa popolazionemicrobica è inserita) corrono costantemente dei segnali chimici, molecole di piccoledimensioni simili agli anticorpi e chiamati autoinduttori. Queste molecole siaccumulano al di fuori delle singole cellule microbiche, ma finché la carica microbicaè bassa e diluita nell’ambiente esterno non succede nulla. Quando però la stessapopolazione si accresce e supera un certo livello (un quorum, visto come numerolegale per una votazione) le molecole che si sono accumulate possono innescare unaserie di eventi che si succedono per lo più con effetto “a cascata” determinandoqualche reazione o qualche effetto. Questo sistema di comunicazione è chiamato,appunto, quorum sensing. Il quorum sensing, in altri termini, è un sistema complessodi comunicazione “cellula-cellula” con il quale i batteri sono in grado di comunicarefra loro.Grazie a questo sistema i batteri sono capaci di mettere in atto attività coordinate,una capacità che un tempo si riteneva propria soltanto degli esseri viventi superiori.Questa capacità di comportarsi come un organismo complesso coordinato ha parecchivantaggi per una popolazione microbica, quali la capacità di migrare verso un altroambiente dove si trovino migliori condizioni di habitat e di nutrienti o l’adozione dinuovi modelli di sviluppo che potrebbero costituire una difesa contro le aggressioniesterne.Alla luce delle nuove acquisizioni in questo settore si profila all’orizzonte una nuovadisciplina, la “socio-microbiologia” che dovrebbe studiare i comportamenti di unasingola popolazione batterica che funziona come un aggregato coordinato di esseri

viventi e non come un insieme caotico e disordinato di singoli entità (Parsek eGreenberg, 2005; Gobbetti et al., 2007).Sfruttando il quorum sensing i batteri possono regolare:1) l’emissione di bioluminescenza2) la formazione di biofilm sulle superfici di lavoro nelle industrie alimentari3) la crescita competitiva tra differenti popolazioni e la sporulazione4) la sintesi di antibiotici e di batteriocine5) l’induzione di fattori di virulenza nelle piante o negli umani6) i processi di infezione degli organismi superiori7) la differenziazione di linee cellulari a partire da cellule primigenie.Il presupposto essenziale perché i microrganismi possano colloquiare fra loro ecoordinarsi nelle loro attività sta proprio nelle concentrazioni dei mediatori chimici delmessaggio nel mezzo in cui i batteri sono immersi. È indispensabile qui ricordare chei batteri possono essere presenti nell’ambiente in due forme di vita:a) la forma libera nel mezzo acquoso, definita forma planctonicab) la forma sessile, adesa a una qualsiasi superficie e immersa inuna matrice amorfa di sostanza organica al cui interno i batteripossono sopravvivere e moltiplicare. Questo speciale aggregatodi batteri e sostanza organica (EPS Extracellular PolymericSubstances) è chiamato biofilm.I biofilm sono un universo in miniatura e per i microrganismi costituiscono unambiente di vita in cui la crescita o la riduzione della popolazione microbica è regolatadal quorum sensing in base alle condizioni più o meno favorevoli del substrato. Cometali, i biofilm costituiscono un aspetto importante per l’igiene degli alimenti perché èproprio grazie ai biofilm che batteri alteranti o pericolosi per la salute (come Listeriamonocytogenes, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus) possono sopravvivere susuperfici di lavoro anche in assenza di nutrienti e resistere all’azione dei disinfettanti.Inoltre, sempre grazie al quorum sensing all’interno della loro popolazione i batteripossono modulare la manifestazione di determinate caratteristiche fenotipicherispetto ad altre secondo le necessità.Immersi in un biofilm o liberi nell’ambiente in forma planctonica, i batteri comunicanofra di loro sintetizzando e liberando nel mezzo dei messaggi di tipo chimico costituitida specifici composti. I più conosciuti e studiati sono gli AHL ossia gli acil-omoserinalattoni.Posto di fronte a un sistema di comunicazione piuttosto complesso che si fonda suuna cascata di reazioni biochimiche e sulle interazioni di geni che codificano questasintesi, un igienista degli alimenti, da buon “praticone”, è portati a chiedersi a checosa possa servire entrare così a fondo nella vita intima di una comunità batterica, acosa serva studiare i sofisticati meccanismi biochimici di comunicazione dei batteri.L’importanza di una simile conoscenza diventa evidente se ricorriamo, comeparagone, all’esempio dei codici cifrati utilizzati dai Comandi militari giapponesi nellaSeconda Guerra mondiale per emanare ordini alle truppe dislocate lontano dallamadrepatria. Quando gli Americani riuscirono a decifrare il codice cifrato utilizzato daiNipponici, le sorti della guerra si ribaltarono perché i primi riuscirono a inserirsi nellecomunicazioni del nemico e a scoprire quali fossero i bersagli degli attacchi.Traslando il concetto, conoscere i meccanismi che regolano la comunicazione tra isingoli componenti di una popolazione microbica immersa in un biofilm puòpermetterci di tenerla meglio sotto controllo e di dominarla, facendo in modo chequella rallenti il suo sviluppo (come nel caso di germi patogeni o alteranti) o lo

accentui, nel caso di batteri utili nelle fermentazioni microbiche. In questa sede miprefiggo soltanto di riassumere i concetti essenziali del quorum sensing rimandando ilettori ai riferimenti bibliografici citati alla fine del documento per ulterioriapprofondimenti sull’argomento.È importante sottolineare subito che i batteri possono scambiarsi messaggi siaall’interno di una stessa specie sia tra generi microbici differenti. Tuttavia, imeccanismi chimici sui quali si fonda il quorum sensing dei batteri Gram negativisono differenti da quelli che permettono ai Gram positivi di comunicare fra loro: inpratica, i mediatori chimici in gioco non sono gli stessi.2. QUORUM SENSING DEI BATTERI GRAM NEGATIVIIl primo meccanismo di quorum sensing scoperto ha riguardato proprio un batterioGram negativo, Vibrio fischeri, un batterio bioluminescente che vive come simbiontenegli organi luminosi specializzati di un particolare cefalopode decapode (Euprymnascolopes) e del pesce Monocentres japonicus. Questo sistema è sempre preso aparadigma per dare una prima idea e spiegare meglio i meccanismi del quorumsensing.Il gene luxI, racchiuso in un operone chiamato luxICDABE, codifica la sintesi di unaspecifica sintetasi che a sua volta porta alla sintesi di una molecola specifica, N-(3-ossoesanoil)-omoserina lattone (OHHL) che è l’autoinduttore.Il gene luxR, a sua volta, codifica la produzione di un fattore trascrizionale il quale,dopo avere interagito con l’autoinduttore prima citato, va a legarsi all’operoneluxICDABE rendendo possibile e attivando la trascrizione di tutti i geni ivi contenutiche portano alla sintesi di tutti i componenti del sistema luciferasi così come a unaumento esponenziale della sintesi di LuxI.Per passare alla forma attiva il trascrittore LuxR richiede la presenza di due distintechaperonine, GroEL e GroESL (Adar et al., 1992). In sintesi, quindi, l’autoinduttore fasapere a tutti i batteri che essi esistono all’interno di un organo luminescente e chenon sono, invece, immersi nel mare dove sarebbero così dispersi da non poterecreare mai le concentrazioni sufficienti per dare origine al messaggio.Nei batteri Gram negativi il quorum sensing è mediato dagli acil-omoserina-lattoni(AHL), la cui sintesi prende le mosse da due differenti gruppi di composti, l’Sadenosil-metionina(SAM) e una proteina acil-acil carrier (acil-ACP).Il LuxI promuove la formazione di un legame ammidico tra acil-ACP e SAM, e dallesuccessive reazioni si origina un AHL. In tutti i segnali sinora individuati le molecolehanno come denominatore comune proprio l’anello omoserina-lattone (Parsek eGreenberg, 2005). Le molecole possono poi contenere catene laterali con un numerodi atomi di carbonio che varia tra 4 e 14 e altre piccole differenze strutturali e dicomposizione.La membrana dei batteri Gram negativi è permeabile agli AHL e man mano che lacellula li sintetizza, li emette nell’ambiente esterno, dove devono avere la possibilitàdi accumularsi. Finché le concentrazioni microbiche sono basse l’AHL diffondepassivamente al di fuori delle singole cellule a causa del gradiente di concentrazione(maggiore all’interno della cellula e più basso al di fuori di essa). Quando però ilnumero di batteri presenti in un ambito piuttosto ristretto comincia a diventarenotevole, la concentrazione di AHL al di fuori delle singole cellule batteriche diventapresto superiore a quello presente all’interno di ciascuna di esse. A questo punto,l’AHL deve prima accumularsi all’interno della cellula finché la sua concentrazione

diventa superiore a quella presente all’esterno. Solo a quel punto potrà fuoriuscirnedell’altro.Le principali specie batteriche di interesse alimentare in cui è documentata lapresenza di proteine LuxI sono: Vibrio fischeri, Burkholderia cepacia, Enterobacteragglomerans, Erwinia carotovora, Escherichia coli, Pseudomonas aureofaciens, Ps.aeruginosa, Ralstonia solanacearum, Salmonella enterica ser. typhimurium, Serratialiquefaciens, Yersinia enterocolitica.2.1. QUORUM SENSING E ALTERAZIONI DEGLI ALIMENTI DA BATTERI GRAM NEGATIVICon i dovuti distinguo, si può generalizzare ricordando che la flora microbica dellecarni fresche refrigerate in via di putrefazione è costituita essenzialmente da:(1) pseudomonadacee che possono arrivare a cariche fino a 10 9 ufc/g se lecarni sono conservate in aria(2) batteri lattici ed enterobatteri (fino a 10 5 -10 7 ufc/g) nel caso delle carniconfezionate in pellicola plastica sotto vuoto.Parecchi autori, tra cui cito Jay e coll. (2003) e Medina-Martinez e coll. (2006) hannorilevato la presenza di AHL in campioni di carni prelevati direttamente dal circuitocommerciale, pervenendo alla conclusione che batteri quali Pseudomonas possanoformare dei biofilm sulla superficie delle carni alterate e che il quorum sensing siauno dei meccanismi che facilitano la formazione di questi biofilm.È sempre grazie al quorum sensing che i batteri regolano la produzione di enzimiidrolitici e che coordinano fra loro attività quali la loro mobilità e la colonizzazione diun substrato. Alla luce di queste considerazioni si è anche ipotizzato che siano propriogli AHL a favorire e accentuare la sintesi enzimatica quando la carica microbica deglienterobatteri raggiunge valori soglia sufficienti, contribuendo alla comparsa dimodificazioni sensoriali sgradevoli nelle carni fresche anche se la CMT non ha ancoraraggiunto valori, diciamo così, “esplosivi” (Gram et al., 1999). In effetti, nella carne sipuò riscontrare la presenza evidente di AHL quando la carica ha appena raggiunto le10 6 ufc/g, una concentrazione microbica che non è ancora sufficiente per parlarenelle carni di vera e propria putrefazione.Fra gli enterobatteri che formano una delle due principali componenti della floramicrobica delle carni fresche confezionate sotto vuoto, predominano Hafnia alvei eSerratia spp. (Riddel e Korkeala, 1997). Sottoponendo a gascromatografia ilsurnatante di colture di ceppi di questi due batteri isolati dalle carni, Bruhn e coll.(2004) hanno dimostrato che fra tutti gli AHL presenti la molecola più abbondanteera costituita dall’OHHL, molecola citata più sopra.Anche Yersinia enterocolitica è in grado di sintetizzare degli acil-omoserina-lattonicome l’OHHL e l’N-esanoil omoserina-lattone, se fatta crescere in estratti di carne eanche di pesce (Medina-Martinez et al., 2006).Tutto ciò ha portato Hentzer e coll. (2003) a ipotizzare che in futuro si potrebbeaumentare la conservabilità delle carni e dei prodotti ittici freschi e confezionati sottovuoto utilizzando particolari additivi conservanti che siano specificamente in grado diinibire la sintesi di AHL e che potrebbero essere definiti come “inibitori del quorumsensing”. Va però rimarcato che non tutti i ricercatori sono concordi con questeproposte; alcuni studiosi (Bruhn et al., 2004) fanno notare che il quorum sensing, puressendo un fattore che favorisce lo scadimento sensoriale delle carni, non è e nonpuò essere considerato la causa fondamentale della putrefazione delle carni fresche.

Dal punto di vista diagnostico, il rilevamento dei AHL nei substrati in cui si sospettauna parte attiva del quorum sensing nei processi degradativi può essere fatto condue tipi di controlli analitici:(a) prove biologiche che utilizzano vari ceppi batterici, in cui si punta ainattivare il gene luxI omologo responsabile della produzione degliAHL. Eliminato il gene suddetto in una certa popolazione batterica, èevidente che l’espressione del gene sopra indicato diventeràpossibile solo se nel substrato che si vuole esaminare si ha lapresenza di altro AHL(b) vettori di plasmidi che rispondono all’inattivazione degli omologhiLuxR, come è stato fatto in colture di E. coli. Grazie alla specificità diciascun omologo del LuxR diventa possibile individuare le differentimolecole di AHL e di distinguerne il profilo di produzione.Con questi sistemi diagnostici, i brasiliani Pinto e coll. (2007) hanno condotto indaginisulla presenza dei principali mediatori chimici del quorum sensing, gli acil-omoserinalattoni,nelle flore microbiche Gram negative isolate dal latte crudo refrigerato. GiàLiu e Griffiths (2003) avevano rimarcato che i difetti del latte crudo provocati da uneccessivo sviluppo di Pseudomonas fluorescens potevano essere correlabili allacapacità del batterio di produrre AHL e di sintetizzare proteasi extracellulari. Iricercatori brasiliani hanno studiato la liberazione di AHL da parte della floramicrobica Gram negativa isolata da latte crudo. In totale hanno isolato e identificato53 differenti ceppi di batteri dei generi Acinetobacter, Aeromonas, Burkholderia,Cedecea, Chryseomonas, Chryseobacterium, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella,Moraxella, Pantoea, Providencia, Pseudomonas, Rahnella e Serratia. Gli autori hannoevidenziato che quasi l’85% di tutti questi ceppi era in grado di produrre AHL e che,di conseguenza, fra i batteri Gram negativi responsabili delle alterazioni del lattecrudo il quorum sensing gioca un ruolo di estrema importanza.3. QUORUM SENSING DEI BATTERI GRAM POSITIVII batteri Gram positivi mettono in atto il quorum sensing utilizzando molecole“segnale” e modalità differenti da quelle utilizzate dai Gram negativi. I Gram positivisfruttano come molecola di trasmissione del segnale un oligopeptide di origineribosomiale chiamato peptide autoinduttore (AIP o “peptide feromone”). Il gene checodifica la sintesi di questa molecola messaggero, sovente è adiacente a un gene checodifica il sistema regolatore a due componenti (2CRS). I Gram positivi che si sonosinora rivelati in grado di produrre questo composto sono: Bacillus subtilis,Carnobacterium maltaromaticum e C. piscicola, Enterococcus faecalis, Lactobacillusplantarum e L. casei, Lactococcus lactis, Staphylococcus aureus, Streptococcuspneumoniae. Mancano ancora dati certi sull’esistenza di un quorum sensing inListeria monocytogenes e nelle listeria in genere, anche se ciò è probabile.L’insieme dei due geni associati prende nome di “sistema regolatore a 3 componenti”(3CRS). È opportuno ricordare che in tutti i batteri il sistema 2 CRS, formato daistidina-proteina-chinasi (HPK) di membrana e da un regolatore di risposta (RR), è ilprincipale sistema di trasduzione di segnale attraverso la membrana cellulare. Ègrazie a questo sistema 2CRS che i batteri possono percepire le modificazioni di pH,concentrazioni di soluti, temperatura ecc. che intervengono nell’ambiente in cui sonoinseriti.

Nei batteri Gram negativi le molecole di AHL diffondono passivamente attraverso lamembrana del batterio, fluendo dal suo interno all’esterno; perché una secondacellula riesca a captare questo messaggio, invece, bisogna che il mediatore chimicosia trasportato attivamente all’interno della cellula, se si vuole ottenerne unareazione.Nel caso dei batteri Gram positivi, invece, il modello peptide-feromone non prevedequest’ultima fase, proprio grazie al fatto che la proteine sensore vista prima è giàcollocata sulla faccia esterna della membrana. Il sistema 3CSR tiene sotto controllo eregola la manifestazione di alcuni aspetti fenotipici dei batteri Gram positivi:a) sintesi di batteriocine in Carnobacterium piscicola, Lactobacillus plantarum,L. casei ed Enterococcus faeciumb) trasferimento di plasmidi mediante coniugazione in Enterococcus faecalisc) competenza genetica in Streptococcus pneumoniae e Bacillus subtilisd) espressione dei fattori di virulenza negli stafilococchie) sporulazione di Bacillus subtilisf) formazione di biofilmg) risposte che i batteri mettono in atto contro gli stress subletali.Studiando le sequenze genomiche complete esistenti di Streptococcus thermophilusscopriamo che tutte comprendono i geni che codificano la sintesi del sistema 2CRS;ne desumiamo, quindi, che tutti i ceppi del batterio sono potenzialmente in grado dimettere in atto il quorum sensing (Hols et al., 2005).Autori giapponesi hanno segnalato, infine, che probabilmente nei batteri Grampositivi il quorum sensing funziona anche con altre molecole-segnale differenti dalsistema 3CRS, i gamma-butiro-lattoni. Il fatto non deve stupire perché questemolecole sono strutturalmente simili agli AHL dei Gram negativi e sembranointervenire nello stimolare la produzione di antibiotici in Streptomyces (Takano et al.,2001).IN SINTESI …… Xavier e Bassler (2003) definiscono il quorum sensing «un processo dicomunicazione tra cellule batteriche che comporta la sintesi, la liberazione e lacaptazione di “molecole segnale” extracellulari chiamate autoinduttori».… un requisito essenziale perché il fenomeno si realizzi è il raggiungimento da partedella popolazione microbica di un valore soglia, perché si possa contare su una certaquantità minima di molecole antoinduttrici per trasmettere il segnale (Bassler, 2002).… la scoperta dell’esistenza del quorum sensing e le sempre maggiori conoscenzeche si accumulano su questo argomento cominciano a rivoluzionare l’approccio che iricercatori hanno nello studio dei microrganismi.… con le conoscenze del quorum sensing si cominciano a giustificare megliocomportamenti prima non ben spiegabili, come la sporulazione dei batteri sporigeni ealtri aspetti di fisiologia microbica.… il quorum sensing ci fa comprendere che le popolazioni microbiche non sono deisemplici aggregati più o meno caotici di microrganismi che vivono ciascuno perproprio conto, bensì una comunità coordinata al cui interno fluiscono costantementeinformazioni che permettono alla comunità stessa di resistere alle condizioni avversee di avvantaggiarsi per il loro fine.… per altro verso, le conoscenze che si stanno accumulando sul quorum sensingmicrobico permetteranno all’uomo di comprendere meglio i meccanismi di

colonizzazione microbica degli alimenti e dei loro processi alterativi. Le possibilità chesi schiudono sono quelle di potere interferire, per via chimica, con il coordinamentodelle società microbiche, scardinandolo o quanto meno disturbandolo. In questomodo si dovrebbe riuscire a tenere meglio sotto controllo le popolazioni microbiche,avendo come risultati ultimi un migliore livello di salubrità e igiene dei prodotti e unaumento della loro conservabilità commerciale.Riferimenti bibliografici1. Adar Y.Y., Simaan M., Ulitzur S. (1992) “Formation of the LuxR protein in the Vibrio fischeri luxsystem is controlled by HtpR through the GroESL proteins”. J. Bacteriol., 174, 7138-7143.2. Bassler B.L. (2002) “Cell-Cell Communication In Bacteria. A promising new approach toimprove bioleaching efficiency?” In: Microbial processing of metal sulfides, 253-264, SpringerVerlag, The Netherlands.3. Bruhn J.B., Christensen A.B., Flodgaard L.R., Nielsen K.F., Larsen T.O., Givskov M., Gram L.(2004) “Presence of acylated homoserine lactones (AHLs) and AHL-producing bacteria in meatand potential role of AHL in spoilage of meat”. Appl. Environm. Microbiol., 70, 4293-4302.4. Gobbetti M., De Angelis M., Di Cagno R., Minervini F., Limitine A. (2007) “Cell – cellcommunication in food related bacteria”. Int. J. Food Microbiol., xx, xxx-xxx.5. Gram L., Christensen A.B., RAvn L., Molin S., Givskov M. (1999) “Production of acylatedhomoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated fromfoods”. Appl. Environm. Microbiol., 65, 3458-3463.6. Hentzer M., Wu H., Andersen J.B., Riedel K., Rasmussen T.B., Bagge N., Kumar N., SchembriM.A., Song Z., Kristoffersen P., Maniefeld M., Costerton J.W., Molin S., Eberl L., Steinberg P.,Kjelleberg S., Hoiby N., Givskov M. (2003) “Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulenceby quorum sensing inhibitors”. EMBO Journal, 22, 3803-3815.7. Hols P., Hancy F, Fontanine L., Grossiord B., Prozzi D., Leblond-Bourgert N., Decaris B.,Bolotin A., Delborme C., Ehrlich S.D., Guèdon E., Monnet V., Renault P., Kleerebezem M.(2005) “New insights in the molecular biology and physiology of Streptococcus thermophilusrevealed by comparative genomics”. FEMS Microbiol. Reviews, 29, 435-463.8. Jay J.M., Vilai J.P., Hughes M.E. (2003) “Profile and activity of the bacterial biota of groundbeef held from freshness to spoilage at 5-7°C”. Int. J. Food Microbiol., 81, 105-111.9. Medina-Martinez M.S., Uyttaendaele M., Meireman S., Debevere J. (2006) “Relevance of N-acyl-l-homoserine lactone procuction by Yersinia enterocolitica in fresh foods”. J. AppliedMicrobiol., 100, 1-9.10. Parsek M.R., Greenberg E.P. (2005) “Sociomicrobiology: the connections between quorumsensing and biofilms”. Trends in Microbiol., 13, 27-33.11. Pinto U.M., de Souza Viana E., Lopes Martins M., Dantas Vanetti M.C. (2007) “Detection ofacylated homoserine lactones in gram-negative proteolytic psychrotrophic bacteria isolatedfrom cooled raw milk”. Food Control, 18, 1322-1327.12. Riddel J., Korkeala H. (1997) “Minimum growth temperature of Hafnia alvei and otherEnterobacteriaceae isolated from refrigerated meat determined with a temperature gradientincubator”. Int. J. Food Microbiol., 35, 287-292.13. Takano E., Chakraburtti R., Nihira T., Yamada Y., Bibb M.J. (2001) “A complex role for thegamma-butyro-lactone SCB1 in regulating antibiotic production in Streptomyces ceolicolorA3(2)”. Molecular Microbiol., 41, 1015-1028.14. Whitehead N.A., Barnard A.M.L., Slater H., Simpson N.J.L., Salmond G.P.C. (2001) “Quorumsensingin gram-negative bacteria”. FEMS Microbiol. Rev., 25, 365-404.15. Xavier K. B., Bassler B. L. (2003) “LuxS quorum sensing: more than just a numbers game”.Curr. Opin. Microbiol., 6, 191-197.16. Zhu J., Chai Y., Zhong Z., Winans S.C. (2003) “Agrobacterium bioassay strain for ultrasensitivedetection of an N-acylhomoserine lactone-type quorum-sensing molecules: detection ofautoinducers in Mesorhizobium huakuii”. Appl. Environm. Microbiol. 69, 6949-6953.