Liceo Lugano 2 - ZyXEL NSA210

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________1.2. Medicina del CoQ 10E’ stato osservato un effetto positivo del CoQ 10 nella patologia del cancro già dal 1961quando, grazie a ricerche farmacologiche, si è notata una bassa concentrazione di Q 10 neimalati affetti da alcuni tipi di tumore 2 .Numerosi studi dimostrano che il CoQ 10 stimola il sistema immunitario 3 ; altri studi hannopermesso di appurare un effetto positivo contro patologie che affliggono il sistemacardiovascolare quali ischemie, infarti e ipertensione 4 .Dopo somministrazione di CoQ 10 si sono notati miglioramenti in malattie come il morbo diParkinson 5 e il morbo di Alzheimer 6 .Si sono osservati anche miglioramenti nell’attività locomotoria dove probabilmente il CoQ 10agisce da stimolante del metabolismo e della produzione di energia. 7Pure da segnalare lavori che indicano un potere antiossidante per la pelle 8 e nel plasmasanguigno. 9Da questo insieme di lavori si può desumere il grande interesse medico per questamolecola naturale.1.3. Caratteristiche chimico-fisiche del CoQ 1010,11Formula molecolare: C 59 H 90 O 4Massa molecolare: 862; Massa molare: 862g/molPunto di fusione: 49°CAspetto fisico: polvere di colore giallo-arancione o liquido viscoso rosso scuro a 50°CSpettro IR: è stato registrato uno spettro in laboratorio dal campione di riferimento CoQ 10Sigma (Fig. 3).Figura 3: spettro IR del campione CoQ 10 Sigma ottenuto in laboratorio. Spettrofotometro Perkin-Elmer IR1310; supporto: KBr (pastiglia)______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 6 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Lo spettro registrato è ben corrispondente con lo spettro trovato in letteratura 12 (Fig 4):Figura 4: Spettro CoQ 10 da http://www.omikron-online.de/cyberchem/cheminfo/1181-lex.htmSpettro UV: (in etanolo:isopropanolo:metanolo – 4:3,5:2,5, Fig. 5): non è stato possibiletrovare uno spettro in letteratura; sotto è riportato lo spettro registrato in laboratorio con uncampione di riferimento (CoQ 10 Sigma) con lo spettrometro Kontron (vedi sezione 5.2):Figura 5: spettro UV dello standard Q 10 Sigma: si può notare una banda di assorbimento con unmassimo a 275 nm.Solubilità 13 , 14 la molecola è lipidica, quindi solubile nei solventi apolari o a bassa polarità,in particolare è ben solubile in acetone ed etere, molto poco solubile in etanolo,praticamente insolubile in acquaStabilità: instabile alla luce 15______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 7 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________2. PRESENTAZIONE DEL PROBLEMAIl CoQ 10 oltre a rappresentare una molecola di grande interesse per la medicina (sviluppodi farmaci per varie patologia, vedi punto 1.2) trova attualmente largo utilizzo nell’industriaalimentare e cosmetica. Attualmente la sua presenza è propagandata in prodotticommerciali cosmetici e nutraceutici quali creme per il corpo, ad esempio BodyCoQ 10Jamieson 16 e NiveaQ 10 Night 17 , creme anti-invecchiamento 18 e numerosi alimentifunzionali: integratori alimentari e prodotti funzionali in forma di compresse antivecchiaiaed in generale antiossidanti 19 .Non sono descritti in letteratura procedimenti di estrazione preparativa applicati oapplicabili su scala industriale. Le pubblicazioni di ricerca (in particolare nel campo medicoe farmaceutico) descrivono metodi analitici in grado di determinare il contenuto di CoQ 10 invegetali, batteri, tessuti e liquidi fisiologici senza concentrazione o isolazione delcomposto 20 , 21 .Produttori asiatici offrono CoQ 10 con alta purezza in grandi quantitativi; non è del tuttochiaro se queste produzioni avvengono per sintesi o per estrazione da matrici naturalicome cellule batteriche selezionate o prodotte per via biotecnologia 22 , 23 .Non è da escludere che siano stati messi a punto processi di estrazione e di purificazioneche, data l’importanza commerciale del composto, rimangono protetti da segreti aziendali.L’unica via sicuramente applicata industrialmente è la sintesi chimica 24 , 25 , 26 , 27 chepermette di ottenere un prodotto tecnico naturalidentico, ma non di origine naturale. Ciòdiminuisce il valore del prodotto poiché il consumatore ne percepisce emotivamentel’origine sintetica; inoltre le reazioni di sintesi che avvengono in un ambiente chimicototalmente diverso da quello biologico, richiedono reattivi, catalizzatori e solventi eproducono prodotti secondari non presenti in natura che non possono essere totalmenteseparati dal prodotto voluto. Esse si differenziano da composti naturali che possonoessere presenti quali sostanze di accompagnamento non separate dal prodotto naturale.Queste ultime potrebbero infine avere un importante ruolo biochimico legatoall’assorbimento, al trasporto e alla funzione del CoQ 10 stesso.La difficoltà di estrarre il CoQ 10 da matrici naturali quali batteri, lieviti, foglie ecc. derivadalle caratteristiche chimico-fisiche della molecola (grandi dimensioni, elevata massamolecolare, scarsa solubilità in solventi polari), e alla sua localizzazione nelle cellule(immobilizzazione in membrane citoplasmatiche nel caso dei batteri, immobilizzazione inmembrane mitocondriali, protette a loro volta da pareti cellulari, nel caso di lieviti e divegetali).D’altra parte essendo liposolubile potrebbe essere estratto con buona efficacia da matricibiologiche che non presentino barriere particolarmente difficili da superare per il solvente.Per questi motivi si è pensato di valutare la possibilità di estrarre il CoQ 10 da matriciorganiche, possibilmente microbiologiche, mediante solventi atossici con alto potenziale didiffusione e alto potere solvente per composti apolari.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 8 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________3. OBIETTIVI DEL LAVORODopo aver verificato attraverso l’analisi bibliografica le notevoli potenzialità della molecolanonché il forte interesse industriale per la stessa, sono stati fissati i seguenti obiettivi:1. Verificare la presenza di CoQ 10 in batteri, lieviti e vegetali (legumi, cereali);2. Determinare la concentrazione di CoQ 10 nelle varie matrici naturali, in particolarebatteri e lieviti quali scarti industriali;3. Sviluppare un processo estrattivo del CoQ 10 dalle matrici nelle quali ne sia stataverificata la presenza, mediante un metodo che non ne comprometta la naturalezzae che lo renda utilizzabile per usi alimentari, farmaceutici e cosmetici. Di particolareinteresse è l’uso di un fluido supercritico (CO 2 densa) quale solvente di estrazione;4. Valutare la resa dell’estrazione e ottimizzare il processo mediante uno studioparametrico del processo estrattivo;5. verificare la possibilità di purificare il composto dagli estratti ottenuti sempremantenendone la naturalezza.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 9 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________4. SVILUPPO DEL LAVOROLa ricerca è stata sviluppata attraverso le fasi mostrate nel seguente diagramma di flussoMESSA IN FUNZIONEDI UN APPARECCHIOHPLC PER L’ANALISIQUALITATIVA EQUANTITATIVAPREPARAZIONEDEGLISTANDARD DICoQ 10CALIBRAZIONEDELLO STANDARD(spettrofotometria)MESSA A PUNTO DELMETODO HPLC PERL’ANALISI DEL CoQ 10ESTRAZIONEANALITICA DABATTERI E LIEVITIANALISIHPLCCALCOLO DELLACONCENTRAZIONEDI CoQ 10 NEGLIESTRATTI E NELLEMATRICIESTRAZIONEPREPARATIVA DABATTERI, LIEVITI EVEGETALIESTRAZIONEANALITICA DELLAMATERIA PRIMARESIDUAANALISI HPLCDEGLI ESTRATTI______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 10 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5. PARTE SPERIMENTALE5.1. Cromatografia liquida ad alta pressione HPLC5.1.1. Principi teorici della cromatografia HPLCLa cromatografia liquida ad alta pressione (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC)rappresenta il metodo analitico più preciso e sensibile per individuare la presenza di uncomposto non volatile in una soluzione di un solvente organico e per determinarne la suaconcentrazione.Essendo il CoQ 10 un composto ad alto peso molecolare non volatile la tecnica HPLC siadatta in modo eccellente all’identificazione del composto in soluzione e alla misura dellasua concentrazione nel solvente.La tecnica HPLC permette di identificare un composto in base al tempo di ritenzione dellostesso, vale a dire il tempo che intercorre tra l’iniezione di una sua soluzione mediantel’iniettore automatico (Fig. 6) e il trasporto dello stesso attraverso una colonna (Fig. 7) chefunge da fase stazionaria, nella quale avviene la separazione dei componenti dellasoluzione iniettata.Figura 6: sistema automatico di iniezioneFigura 7: colonna HPLCLa soluzione viene trasportata attraverso la colonna mediante una soluzione eluente (fasemobile) spinta ad alta pressione dall’azione di una pompa (Fig. 8).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 11 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 8: pompa HPLCL’uscita del composto dalla colonna viene rilevata attraverso l’assorbimento da parte delcomposto di luce emessa da una lampada, generalmente UV posta nell’unità di detezione(Fig. 9). La luce emessa dalla lampada deve avere una lunghezza d’onda per la quale ilcomposto denota una spiccata assorbanza.Figura 9: detettore UV per la rivelazione dei composti in uscita dalla colonna______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 12 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________L’assorbimento di luce viene tradotto in un picco la cui area è proporzionale al numero dimolecole del composto quindi della sua concentrazione, secondo la legge di Lambert eBeer 28 :A = log I 0 /I = ξ* c* lA = Assorbanzaξ = coefficiente di estinzione molare (tipico del composto)l = spessore della cellac = concentrazione del composto (mol/l)I 0 = intensità della luce incidenteI = intensità della luce uscente dal campionePer il CoQ 10 con λ = 275 nm : ξ= 14’200 29 , 30Il nostro spettrofotometro utilizza cuvette con spessore l = 1 cmIl tempo di ritenzione tipico del composto deve essere stabilito attraverso una soluzione diriferimento, cioè una soluzione che contenga il composto, ottenuto da una fonte garantita.Analogamente la quantificazione del composto nella soluzione iniettata richiede unacalibrazione del metodo attraverso una serie di soluzioni a concentrazione nota, oppure ilconfronto del segnale ottenuto con quello di una soluzione di riferimento a concentrazioneconosciuta.5.1.2. Messa in funzione di uno strumento HPLCDurante l’anno 2004 il laboratorio di chimica della scuola ha ricevuto i componenti di unapparecchio HPLC dalla ditta Helsinn Chemicals SA di Biasca, completamente smontato.Per mettere in funzione l’apparecchio è stato necessario esaminare un apparecchioanalogo montato presso il centro professionale di Trevano (SPAI: Scuola per laboratoristi)per risolvere tutti i problemi di assemblaggio e di connessioni. Dopo registrazione di unoschema accurato è stato possibile assemblare tutti i componenti, connetterli e testarli.Durante l’estate 2005, grazie alla collaborazione Pharmaton SA di Bioggio, è statopossibile risolvere i problemi residui riguardanti la comunicazione tra il detettore UV e il PCper la registrazione e la visualizzazione dei cromatogrammi. Inoltre Pharmaton SA hagentilmente messo a disposizione alcune colonne specifiche per le analisi di compostianaloghi al CoQ 10 con preziosi consigli pratici per l’effettuazione delle analisi.L’apprendimento della logica di navigazione nel software MS-DOS in linguaggio Pascaltramite i manuali Kontron ha richiesto molto tempo e lavoro.A partire da agosto 2005 è stato possibile utilizzare l’apparecchio secondo tutte le suefunzioni (Fig. 10).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 13 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 10: HPLC Kontron in piena funzione5.1.2. Preparazione delle soluzioni standard e verifica dell’assorbanza UVL’analisi HPLC avviene tramite la misura dell’assorbimento di luce da parte di un detettore.Dallo spettro di assorbimento UV (sezione 1.3) si desume che l’assorbimento massimo delCoQ 10 avviene a 275 nm. Occorre quindi verificare la possibilità di produrre una retta dicalibrazione per un intervallo di concentrazioni applicabili poi nell’analisi HPLC.Sulla base della legge di Lambert e Beer e del coefficiente di estinzione molare 31 a 275 nm(ξ 275 = 14’200) 32 e allo spessore della cella l (1cm) si calcolano valori teorici di assorbanza(A) per diverse concentrazioni di CoQ 10 :A = c (mol/l) * ξ 275 * lSi preparano soluzioni corrispondenti dello standard di riferimento e si misura il valore diassorbanza verificandone la corrispondenza con il valore teorico.Le misure di assorbanza vengono effettuate con uno spettrofotometro UV-VIS KontronUVIKON 930 (Fig. 11).Quale standard di riferimento viene utilizzato un campione di CoQ 10 ottenuto da Sigma(Sigma C9538 “min. 98% (HPLC)”) per il quale è stato eseguito lo spettro infrarosso e lospettro ultravioletto (vedi Sezione 1.3).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 14 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 11: spettrofotometro UV-VIS per la misura dell'assorbanza delle soluzioni di riferimentoLe soluzioni di riferimento vengono preparate sciogliendo in solvente organico masse distandard determinate con la bilancia analitica (0.1 mg). Quali solventi si scelgono:1) etanolo 332) miscela etanolo /isopropanolo/ metanolo (4/3.5/2.5) 34I valori di assorbanza delle diverse soluzioni vengono misurati in cuvette di quarzo con lospettrofotometro a doppio raggio contro solvente (parecchio tempo è stato perso causal’utilizzo di cuvette in vetro che assorbono intensamente nell’ultravioletto falsandocompletamente i dati!).Misura dell’assorbanza a λ = 275 nmSolvente etanoloIl valore di assorbanza calcolato e quello misurato per tre soluzioni a diversaconcentrazione sono riportati in tabella.Calcolo dell’assorbanza teorica:A = ξ 275 * c * l = 14’200 * c * 1 cmSoluzione C c (mol/l) A teorica A misurata(mg/ml)1 0.022 2,55*10 -5 0.3624 0.34142 0.021 2,43*10 -5 0.3459 0.38213 0.042 4,87*10 -5 0.6918 0.6426Tabella 1: valori di assorbanza teorica e sperimentale con soluzioni di CoQ 10 in etanolo______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 15 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Ass orbanza teorica e sperim entale0.80000.70000.60000.5000A0.4000A teor.A sperim.0.30000.20000.10000.00000 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05c (m g/m l)Grafico 1: retta di calibrazione dai dati di tabella 1Solvente etanolo/ isopropanolo/ metanolo:Risultati di assorbanza (λ=275 nm):soluzione C (mg/ml) C (mol/l) A teorica A misurata4 0.008 9.28*10 -5 0.132 0.06105 0.015 1.74*10 -5 0.247 0.20526 0.021 2.43*10 -5 0.346 0.41967 0.042 1.21*10 -5 0.692 0.9992Tabella 2: valori di assorbanza teorica e sperimentale per soluzioni di CoQ 10 in miscelaetanolo/isopropanolo/metanolo______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 16 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Assorbanza teorica e sperim entale1.2001.0000.800A0.600A teorA sperim0.4000.2000.0000 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05c(m g/m l)Grafico 2: retta di calibrazione dai dati di tabella 2Dal confronto dei valori calcolati con quelli misurati in soluzione di etanolo si può dedurreche lo standard sia in buono stato.Con la soluzione di solo etanolo i valori di assorbanza sono lineari a concentrazioni tra0.02 e 0.05 mg/ml. Con la soluzione etanolo/isopropanolo/metanolo si ottiene una buonaretta di calibrazione fino a valori di concentrazione nell’ordine di 0.01 mg/ml. La pendenzaretta sperimentale si scosta da quella teorica. Ciò è in accordo con il fatto che la rettateorica si ottiene con un coefficiente di estinzione per soluzioni di CoQ 10 in solo etanolo. Ilcoefficiente molare di estinzione dipende infatti dal solvente nel quale è sciolto il compostoche assorbe 35 .Per le analisi HPLC un metodo applicabile con la strumentazione a disposizione prevedel’impiego della miscela eluente etanolo/isopropanolo/metanolo impiegata per questemisure.La buona proporzionalità dei valori ottenuti in queste prove ci permette di concludere chela misura della quantità di CoQ 10 è possibile con precisione mediante assorbanza a λ =275 nm .Si è per tanto deciso di utilizzare la seconda soluzione quale miscela eluente per l’analisiHPLC calibrando però il metodo secondo la risposta del detettore UV dell’apparecchioHPLC nelle condizioni specifiche di eluizione.Altri metodi trovati in letteratura prevedono l’impiego miscele eluenti diverse, in particolaremiscele metanolo-esano, sempre comunque con detezione a 275 nm 36 , 37 , 38 .Per ogni miscela eluente si renderebbe necessaria una nuova specifica calibrazione.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 17 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5.1.4. Calibrazione HPLC con le soluzioni standardAnalogamente all’apparecchio UV anche il detettore UV dell’apparecchio HPLC deve dareuna risposta proporzionale alla concentrazione delle soluzioni standard iniettate e eluitecon la stessa miscela etanolo / isopropanolo / metanolo. Il processo cromatografico sisviluppa in modo tale da portare al detettore il composto (CoQ 10 ) in forma possibilmentepura e concentrata attraverso un numero adatto di piatti teorici della colonna 39 . Questodetermina che il composto diffonde comunque in una certa misura nella colonna e diconseguenza le molecole del composto non arrivano tutte insieme al detettore. Latraduzione grafica dell’andamento dell’assorbanza durante il passaggio attraverso ildetettore della frazione di eluente contenente il composto diventa un picco approssimabilea un triangolo. Una quantificazione del composto può avvenire attraverso l’integrazionedella funzione che descrive questi picco (area dello stesso), che sarà proporzionale allaquantità. Quindi si iniettano soluzioni a concentrazione differente e si registrano le aree deipicchi attraverso l’integrazione compiuta dal software dell’apparecchio.Preparazione dell’apparecchio e della miscela eluenteIn HPLC si consiglia generalmente di sciogliere i campioni da analizzare nello stessosolvente utilizzato quale eluente. È importante eliminare tutti i gas presenti nella miscelaeluente in quanto possono disturbare la separazione in colonna e dare segnali estranei,perciò l’eluente prima di essere usato è sempre stato lasciato per almeno 5 minuti in unbagno a ultrasuoni ( Fig. 12). Il riconoscimento di un composto (CoQ 10 ) avviene attraversoil tempo di ritenzione (intervallo di tempo che ripercorre tra l’iniezione e la detezione, cioè ilmassimo del picco). Questo tempo di ritenzione dipende dall’impostazionedell’apparecchio (riempimento e lunghezza della colonna, portata dell’eluente, pressionenella colonna) e dall’eluente utilizzato. Quindi anche l’analisi degli estratti verrà fatta con lastessa miscela eluente e nelle stesse condizioni adottate per le soluzioni standard.Figura 12: eluente per HPLC nel bagno a ultrasuoni per l’eliminazione dei gas disciolti.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 18 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Per la verifica del corretto funzionamento del sistema HPLC alcune soluzioni standard(CoQ 10 Sigma in concentrazione nota in soluzione etanolo/isopropanolo/metanolo) sonostate analizzate mediante HPLC nelle seguenti condizioni cromatografiche-:Fase mobile: Etanolo 400 ml, Isopropanolo 350 ml, Metanolo 250 ml.Flusso: 1 ml/minVolume iniezione: 50 µlLunghezza d’onda del detettore UV: 275 nmColonna: SUPELCOSIL LC-18, 58230-U, 15 cm x 4,6 mm, 5 µmLa colonna viene eluita per almeno 30 minuti prima dell’analisi da effettuare.Preparazione delle soluzioni standardLe soluzioni standard vengono preparate per diluizione progressiva di una primasoluzione.Le soluzioni standard devono essere preparate con estrema cura, come già descritto inprecedenza, in particolare per il fatto che il CoQ 10 si scioglie con una certa difficoltà, ciòche richiede un lungo tempo di agitazione al buio (Fig. 13) e un tempo relativamentelungo in bagno di ultrasuoni (Fig. 14). Gli ultrasuoni, oltre a sgasare la soluzioneproducono la frammentazione dei cristalli del CoQ 10 facilitando una completasolubilizzazione del prodotto, in particolare per la prima soluzione. In seguito è importantela precisione nel prelevare dalla soluzione l’aliquota che dovrà essere diluita. Questaoperazione avviene mediante pipette graduate di precisione e matracci tarati (Fig. 15).Figura 13: una soluzione standard in fase di agitazione mediante agitatore magnetico.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 19 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 14: lo standard nel bagno ultrasuoni.Esempio di diluizione progressiva di una soluzione standard di CoQ 10 in soluzionesolvente etanolo/isopropanolo/metanolo:Soluzione Standard 1: 4 mg CoQ 10 in 100 ml soluzione solvente(concentrazione ottenuta: 4 mg/100 ml)Soluzione Standard 2: 12,5 ml di Soluzione Standard 1 in 25 ml di soluzione solvente(concentrazione ottenuta: 2 mg/100 ml)Standard 3: 12,5 ml di Soluzione Standard 2 in 25 ml di soluzione solvente(concentrazione ottenuta: 1 mg/100 ml)Standard 4: 12,5ml di Soluzione Standard 3 in 25 ml di soluzione solvente(concentrazione ottenuta: 0,5 mg/100 ml)Figura 15: soluzioni standard in matracci tarati.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 20 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Impostazione della procedura d’analisi cromatograficaCarico delle soluzioni nell’autosampler (Fig. 16): i contenitori da 1 ml (vials) contenenti icampioni da analizzare (soluzioni da 0.5 a 1 ml) vengono posti nel caricatore nelle sedinumerate. Questi numeri dovranno essere specificati nella compilazione del protocollod’analisi.Figura 16: autosampler con vials pronti per l'analisiProgrammazione delle analisiMediante la funzione EDIT devono essere compilati i file riguardanti il metodo d’analisi, ilprogramma d’analisi e il protocollo di analisi (set di campioni da analizzare).Impostazione del metodo (Method File, Fig. 17)Vengono definiti i parametri per la registrazione, la visualizzazione e la riproduzione delcromatogrammi.Figura 17: schermata rappresentate il metodo usato per le analisi HPLC______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 21 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Impostazione del programma di analisi (Program File, Fig. 18)Vengono definiti i parametri per lo svolgimento dell’analisi e per l’acquisizione dei dati.Figura 18: schermata rappresentante il programma utilizzato per le analisiImpostazione del protocollo di analisi (Sample File, Fig. 19)Vengono definiti i parametri per l’esecuzione dell’analisi sulla serie di campioni.Figura 19: schermata rappresentante il protocolloEsecuzione dell’analisiMediante la funzione “Online” si accede alla videata di comando che permette di metterein funzione o di fermare la pompa, di caricare il protocollo d’analisi e impartire il comandodi inizio analisi (Fig 20).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 22 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 20: videata di comando per l'avvio dell'analisiElaborazione dei datiA fine analisi è possibile riprodurre i cromatogrammi ed eseguire l’integrazione dei segnalimediante la funzione “Utilities”.Visualizzazione del cromatogrammiIl cromatogramma viene registrato, visualizzato durante l’analisi e memorizzatoautomaticamente; mediante la funzione “Utilities/Chromatogram plot” il cromatogramma diun singolo campione può essere in seguito riprodotto solo oppure in sovrapposizione aglialtri cromatogrammi dello stesso set di campioni analizzati oppure ancora insovrapposizione con cromatogrammi di altre analisi; il confronto tra i cromatogrammi puòessere visualizzato in diversi modi (sovrapposizione dei profili in 2D (Fig. 21) o in 3D (Fig.22)), impostando opportunamente i parametri di visualizzazione (estensione degli assi).Figura 21: visualizzazione 2D dei cromatogrammi (st5 2x, st4 3x, st6 3x, st7 3x)______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 23 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 22: visualizzazione 3D dei cromatogrammi (st5 2x, st4 3x, st6 3x, st7 3x)Elaborazione dei segnali HPLCMediante la funzione “Utilities/Manual Integration” il software fornisce l’integrazione deisegnali in forma di area (Fig. 23).Figura 23: videata di integrazioneAnalisi di un set di soluzioni standard e calibrazione del metodoSecondo il file di metodo “LiLu2” e il file di programma (COQ) creati in modo specifico perle analisi del CoQ 10 , vengono eseguite le analisi delle soluzioni standard e in seguitoquelle degli estratti.In tabella si riporta un tipico set di dati ottenuti sa soluzioni standard a varieconcentrazioni:______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 24 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________* valore anomalo scartatoconcentrazione(mg/ml) area (mV*min)0.005 00.005 0.309470.005 0.34490.01 0.378310.01 0.537110.01 0.575750.02 0.49027*0.02 0.989890.02 0.946020.04 1.0740.04 3.1550.04 3.194Verificata una buona riproducibilità delle aree (ad eccezione del valore scartato) siprocede al calcolo dei valori medi:concentrazione area media0 00.005 0.3271850.01 0.556430.02 0.9679550.04 3.000I valori di area vengono diagrammati in funzione della concentrazione delle soluzioneiniettata.Ciò fornisce la seguente curva di calibrazione:Calibrazione CoQ10 HPLC3.5y = 73.786x - 0.1365Area32.521.5area mediaLineare (areamedia)10.500 0.02 0.04 0.06concentrazione (mg/ml)Grafico 3: retta di calibrazione HPLCLa linearità di risposta dell’HPLC in funzione della concentrazione di CoQ 10 è buonanell’intervallo di concentrazione tra 5 e 40 µg/ml.Questa curva di calibrazione permette quindi di stabilire che con soluzioni standard diCoQ 10 in questo intervallo può essere calcolato il contenuto di CoQ 10 negli estratti dabatteri, lieviti, vegetali ecc.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 25 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Il lavoro di calibrazione è stato ripetuto più volte per verificarne la riproducibilità. Si èpotuto stabilire che la risposta assoluta del detettore può variare da una sessione di analisiall’altra ma la proporzionalità del segnale e dell’area ottenuta dall’integrazione risultariproducibile. Ciò significa che ogni analisi va effettuata utilizzando almeno una soluzionestandard di riferimento, in base alla quale eseguire i calcoli di concentrazione e dicontenuto. I campioni dovranno essere diluiti in modo tale da dare picchi con aree cherientrino nell’intervallo definito da questo studio.Per ottenere le soluzioni da iniettare è stata utilizzata la stessa soluzione utilizzata comeeluente. Come riferito alla sezione “Preparazione delle soluzioni standard” lasolubilizzazione del CoQ 10 in questa soluzione pone delle difficoltà e rimane il dubbio cheessa non sia sempre completa, anche dopo prolungata agitazione e azione ultrasonica.Andrà verificato in futuro se utilizzando altre miscele come eluente e solvente secondo glialtri metodi descritti in letteratura (già citati) si ottiene una maggior risposta e una maggiorsensibilità.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 26 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5.2. Estrazione da cellule procariote e eucarioteStruttura delle cellule procariote (Fig. 24)I batteri sono gli organismi più semplici (unicellulari) che si trovano negli ambienti naturali.Essi possono avere forme diverse (sferica, bastoncino,…) e dimensioni variabili da 0,3 a1,5 µ. Spesso possiedono un rivestimento protettivo (parete cellulare) che contiene DNA,RNA e altre molecole.La respirazione cellulare dei batteri avviene nella membrana plasmatica che si trova aridosso della parete cellulare; gli enzimi e i coenzimi responsabili dei processi chimici dellacatena respiratoria sono inseriti nella fase lipidica del doppio strato fosfolipidico. Lebarriere che devono essere superate per l’estrazione del CoQ 10 sono solo due (tre per ibatteri Gram che sono ulteriormente avvolti in una capsula protettiva); la parete cellulare(che ha la funzione di proteggere la cellula dalla pressione osmotica) è costituita da unasostanza chimica chiamata mureina (peptide glicosidato). La membrana plasmatica cheracchiude il citoplasma è costituita da un doppio strato di fosfolipidi, da molecole proteichecon funzione soprattutto enzimatica e da una bassa percentuale di carboidrati 40 .Figura 24: cellula batterica Gram- con capsula, non presente nei batteri Gram+Struttura delle cellule eucariote (Fig. 25)Le cellule eucariote hanno dimensioni dell'ordine di decine di µm; esse sono delimitatedalla membrana cellulare e contengono il citoplasma nel quale sono dispersi gli organulicellulari, delimitati anch’essi da membrane, ognuno con funzioni specializzate.La caratteristica principale di questo tipo di cellule è quella di avere un nucleo, ben definitoda una membrana nucleare e isolato dal resto degli organelli, all’interno del quale si trovail codice genetico (DNA).I mitocondri hanno somiglianze con i batteri e fanno parte degli organuli principali dellacellula; molto probabilmente sono originariamente batteri inglobati dalle cellule eucariote,dentro le quali hanno mantenuto le loro funzioni.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 27 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________La respirazione cellulare avviene solo nei mitocondri.Le barriere da superare durante un processo estrattivo di CoQ 10 nel caso dei lieviti sono 4(Fig. 25): parete cellulare (chitina, un polimero di un aminozucchero), membrana cellulare(doppio strato fosfolipidico), e due membrane mitocondriali, ognuna a doppio stratofosfolipidico. Gli enzimi della respirazione (compreso il CoQ 10 ) si trovano sulla secondamembrana mitocondriale, cioè quella più interna 41 .Figura 25: cellula di lievito, sono ben visibili le 4 membraneI lieviti rappresentano quindi una materia prima che pone maggiori problemi di estrazionerispetto alle cellule batteriche per il numero doppio di membrane da superare (4) e per ilfatto che una di esse ha una natura maggiormente reticolata (chitina).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 28 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5.3. Verifica del contenuto di CoQ 10 in cellule batteriche medianteestrazione analiticaSi è voluto effettuare un’estrazione analitica per verificare l’effettiva presenza di CoQ 10 incellule batteriche secche e in lieviti.L’operazione ha lo scopo di ottenere sia da un campione di batteri che da un campione dilieviti una soluzione direttamente iniettabile in HPLC per verificare la presenza neicromatogrammi del picco del CoQ 10 , quantificandola mediante l’integrazione del segnale.Dalla concentrazione nella soluzione e dalle biomasse utilizzate è possibile in seguitocalcolare il contenuto di CoQ 10 nelle stesse.L’estrazione è stata effettuata su cellule di un ceppo denominato GN30, selezionato daGnosis SpA (Desio, MI) per produzioni biotecnologiche.Il metodo di estrazione è stato scelto tra metodi per l’analisi del CoQ 10 trovati inletteratura 42 .PrincipioLe cellule batteriche secche e i lieviti liofilizzati vengono sospesi in acqua e sottoposti adestrazione con isopropanolo e con benzochinone; l’estratto filtrato viene analizzato perHPLC.Procedimento- Pesare accuratamente 0.3 g di cellule essiccate- Sospendere con 5-6 ml di acqua bidistillata in un matraccio da 10 ml e poi portare avolume;- Prelevare 2 ml di sospensione e aggiungere 10 ml di isopropanolo;- Agitare per 10 minuti (il metodo prevede l’impiego di un vortex ma in laboratoriodisponiamo solo di un agitatore orizzontale);- In una provetta Eppendorf da 1,5 ml aggiungere 1 ml di tale sospensione e 10 µl di unasoluzione di benzochinone;- Tenere in agitazione su vortex per 10 minuti;- Filtrare su filtri da 0,45 µm e iniettare in HPLC.RisultatiIn Fig. 26 è mostrato il cromatogramma dell’estratto (profilo posteriore) unitamente alprofilo dello standard:______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 29 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 26: cromatogramma dell'estratto di cellule batteriche GN30Risultati e discussioneCon un tempo di ritenzione R t = 20 minuti compare il picco del CoQ 10 nel profilocromatografico della soluzione standard. Il profilo dell’estratto dei batteri mostra un piccoperfettamente corrispondente per quanto riguarda R t . Questo permette di identificare ilCoQ 10 nell’estratto.L’integrazione dei due picchi permette il calcolo della concentrazione di CoQ 10 nell’estrattoe quindi nei batteri.La quantità di CoQ 10 nei batteri può essere calcolata considerando il rapporto tra le aree,la concentrazione dello standard, il volume di soluzione, la massa di batteri e la frazione diessa dalla quale è stato ottenuto l’estratto finale:AreaE* Cst* Vsolfin*5*12 *100= 0.34 %Area * Massas tbatteriArea E = area picco estrattoC st = concentrazione dello standard utilizzatoV solfin = volume di soluzione filtrata (= 1 ml)Area st = Area picco standardMassa batteri = Massa di batteri sospesi5 , 12 = fattore di frazionamento secondo protocolloDurante la filtrazione non tutto l’estratto è passato attraverso il filtro con conseguentediminuzione del volume finale.E’ inoltre probabile che l’impiego dell’agitatore orizzontale al posto di un vortex abbiaridotto l’efficacia dell’estrazione.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 30 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Il contenuto delle cellule in CoQ 10 potrebbe dunque essere superiore. Il valore misurato ècomunque molto positivo e potrebbe essere di interesse industriale a dipendenza dei costidi produzione della biomassa, del rendimento dell’estrazione e dei costi di estrazione e dipurificazione su grande scala.Disponendo di pochissima biomassa si è preferito utilizzare la stessa per prove diestrazione di concentrati senza ulteriori verifiche.5.4. Produzione di estratti concentrati in CoQ 10 da cellule battericheDopo la messa a punto del sistema e del metodo analitici che permettano di identificare equantificare il CoQ 10 in un estratto e dopo aver verificato la presenza del composto almenonelle cellule batteriche è possibile partire con l’indagine sulla possibilità di estrarre il CoQ 10in forma di miscugli sufficientemente concentrati da permettere in seguito l’isolazione delcomposto in quantità interessanti per un suo impiego nei vari campi studiati.I metodi applicabili per estrazioni preparative si basano sul contatto con un solvente e sultrasporto di massa. Il solvente deve essere eliminato dall’estratto a fine processo.5.4.1. Estrazione con fluido supercriticoCome detto nell’introduzione, oggi si cerca sempre di più di condurre le estrazioni dicomposti naturali a scopo farmaceutico, alimentare o cosmetico in modo tale dasalvaguardare la naturalezza degli stessi, in particolare utilizzando metodi estrattivi chenon creino contatto con prodotti tossici o comunque non compatibili con la funzione che ilcomposto dovrà avere. Ciò riguarda in particolare l’uso di solventi organici apolari chesciolgono bene composti non solubilizzabili e estraibili con l’acqua o con l’etanolo. La viaalternativa più promettente è quella dell’anidride carbonica in forma di gas denso (dettaanche fluido supercritico): essa è atossica e ottenibile in questa forma a temperaturaambientale (31°C) e non può in ogni caso rimanere n é negli estratti né nei materiali da cuisi è effettuata l’estrazione, risolvendo così ogni problema di naturalezza sia per i prodottivalorizzabili sia per gli scarti.Per ottenere il CoQ 10 con il massimo grado di naturalezza possibile e con un resa diestrazione possibilmente elevata, si eseguirà quindi un’estrazione con CO 2 in forma difluido supercritico 43 .I fluidi supercritici si ottengono pressurizzando la fase aeriforme del composto oltre il puntocritico dello stesso (nel caso della CO 2 sopra 31°C, Fig. 27) fino ad una pressione chesuperi la sua pressione critica (nel caso della CO 2 74 bar): sia crea uno stato fluido nelquale la densità del vapore è uguale a quella del liquido rimasto e i due stati non sono piùdistinguibili (Fig. 28).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 31 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 27: diagramma di fase dell'anidride carbonicaLa viscosità del fluido supercritico si mantiene molto prossima a quella della faseaeriforme originale.Si ottiene quindi un fluido avente la densità tipica di un liquido e la viscosità tipica di ungas 44 .Figura 28: I vari passaggi della CO 2 da liquido e gas a fluido supercritico. (www.galenotech.org)L’effetto mostrato in figura è osservabile in filmato dal vivo attraverso il sito di chimica (www.lilu2.ch ->materie -> chimica -> portale di chimica -> documenti -> transizione supercritica.I fluidi supercritici sono ottimi solventi e vengono utilizzati per estrazione e purificazione disostanze presenti in matrici complesse, come ad esempio un lievito o in generale lematrici organiche. In fatti in questo stato il potere solvente, dato dalla densità del fluido, èelevata, come pure il potere di diffusione nelle matrici complesse (come cellule). Questifluidi riuniscono quindi in pregi dei liquidi per la capacità solvente e i pregi dei gas per ilpotere di diffusione.La CO 2 come fluido supercritico non è difficile da ottenere, non è costosa e inoltre non ètossica ed è gassosa in condizioni ambientali. Utilizzandola come solvente in sostituzionedei solventi organici liquidi si evitano tutti i problemi di tossicità derivanti dalla permanenzadi tracce di questi ultimi sia negli estratti che nella materia prima esausta.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 32 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5.4.2. Procedura di estrazione con l’impianto di estrazione a fluidosupercritico (Figura 29)• pulire bene il paniere con uno straccio o con aria compressa o con acqua (in talcaso asciugare accuratamente)• pulire i setti del paniere con straccio o carte o eventualmente in acqua o etanolocon ultrasuoni con successivo siccaggio in forno.• verificare che la bombola di CO 2 sia collegata all’impianto• inserire la camera nell’estrattore, appoggiarci il primo tappo e poi avvitare ilsecondo.• controllare che tutte le valvole siano chiuse (blu, rosse gialle + azzurra)• attivare l’impianto elettrico girando l’interruttore principale (in basso a destra) su 1.• Impostare le temperature per la camera di estrazione e per i separatori 1 e 2+3mediante i selezionatori in basso a destra. Se si desidera lo stato gassoso osupercritico la temperatura deve superare i 32°C• aprire bombola CO 2• aprire le valvole di entrata blu : prima quella in alto a sinistra, quindi quella a livellodella camera di estrazione ed infine quella a destra• impostare il flussimetro sulla funzione “CO 2 tot” e azzerare mediante reset (tenerepremuto per 5 s)• mettere in funzione la pompa, premendo il pulsante verde in basso a destra• regolare la pressione nella camera di estrazione mediante la manopola blu dellavalvola regolatrice• regolare la pressione nei separatori mediante le valvole ad ago nere all’uscita delrispettivo separatore.• Commutare il flussometro sulla funzione portata (rate: kg/h) e regolare la portatamediante le manopole poste sulle pompe• durante l’estrazione ogni tanto aprire valvole gialle, per ricavare l’estratto daiseparatori; usare contenitori di plastica, la pressione è molto alta, potrebbe rompereil vetro.• di volta in volta pesare gli estratti• A fine ciclo spegnere la pompa, chiudere le valvole blu, aprire quelle gialle perscaricare il più possibile i separatori.• aprire valvole rosse per scaricare la CO 2 dai separatori e dalla camera diestrazione.• quando la pressione all’interno dell’estrattore è 0 atm, aspettare 5 minuti, aprire lavalvola azzurra di scarico della camera di estrazione• aprire l’estrattore e estrarre la camera.• pesare il contenuto della camera e trascrivere la differenza di massa dall’iniziodell’estrazione.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 33 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 29: SFE: impianto per estrazioni con la CO 2 a fluido supercritico.5.4.3. Estrazione con fluido supercritico da cellule battericheLe cellule batteriche rappresentano la matrice più facile per estrarre CoQ 10 in quanto inesse il complesso di enzimi e coenzimi della catena respiratoria è localizzato nellamembrana cellulare. Quindi il solvente deve superare solo una barriera (membranacellulare) e diffondere nella membrana plasmatici.Un problema nel caso specifico può essere dato dal fatto che il CoQ 10 è inserito in uncomplesso di enzimi dal quale deve essere liberato. Il solvente deve quindi diffondereattraverso una barriera di fosfolipidi che è esternamente polare e internamente apolare,sciogliendo poi il CoQ 10 apolare da un complesso proteico che può avere carattererelativamente polare e dimensioni tali da sporgere dalla membrana stessa. Difficile quindistabilire quale sia il grado di polarità ideale per il solvente che deve effettuare l’estrazione.Anche per questo motivo si è pensato di eseguire direttamente le prove con un solventequale la CO 2 supercritica che è normalmente apolare ma relativamente polarizzabile conun aumento di pressione (densità) o con eventuali aggiunte di cosolventi polari quali adesempio alcoli (etanolo, metanolo, isopropanolo).Le prove di estrazione hanno avuto inizio con cellule batteriche secche di un ceppodenominato GN30, ottenuto per via biotecnologica.In letteratura sono riportati alcuni studi sulla solubilità del CoQ 10 in CO 2 : il composto puroacquista una solubilità apprezzabile a pressioni superiori a 180 bar, aumenta conl’aumentare della pressione e diminuisce con l’aumentare della temperatura 45 .______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 34 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Condizioni di estrazione applicate:solventeCO 2 puroPressione (autoclave) 200 barTemperatura (autoclave) 50°Cportata del solvente 2-3 kg/hmassa caricata187 gtempo di estrazione 7 hRisultati e discussioneIl processo ha fornito un estratto pastoso di colore rosso intenso (Fig. 30) che fonde a50°C.Figura 30: Estratto GN30Massa cellule caricata 156.7 gMassa estratto 11.3 g% estratto 7.2%Le cellule scaricate dopo l’estrazione risultano nettamente più chiare (Fig. 31).Figura 31: cellule GN30 prima (a sin.) e dopo l'estrazioneLa ricerca, l’identificazione e la misura della concentrazione di CoQ 10 nell’estratto è stataeffettuata per HPLC.Il cromatogramma mostra chiaramente la presenza di CoQ 10 nell’estratto.L’analisi HPLC viene ripetuta tre volte. In base all’integrazione del picco e alla retta dicalibrazione viene calcolata la quantità di CoQ 10 estratto me(g) e la percentuale di CoQ 10rispetto alla massa di cellule caricate (% mp).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 35 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________n°estratto concentrazione(mg/ml) area (mV*min) C(mg/ml) %Ce me(g) %mp2 5.53 2.593 0.024771 0.004479 0.044974 0.0292 5.53 2.4514 0.023419 0.004235 0.042518 0.0272 5.53 2.28 0.021781 0.003939 0.039545 0.025Ne risulta un valore medio di 42 mg di CoQ 10 estratti corrispondenti al 0.03% della massadi cellule. Ciò rappresenta solo il 10% circa del CoQ 10 contenuto nelle cellule, misuratocon l’estrazione analitica (sezione 5.3).Per verificare l’efficienza dell’estrazione è stata condotta un’estrazione analitica sullecellule scaricate dall’impianto secondo il metodo descritto alla sezione 5.3.Figura 32: analisi delle cellule batteriche GN30 prima e dopo l’estrazione con CO 2profilo azzurro: GN30 normale; profilo bianco: GN30 scaricato dopo estrazione con CO 2Dall’estrazione analitica delle cellule scaricate risulta che l’estrazione con CO 2 siaavvenuta solo parzialmente (rapporto tra le aree: 62:100).Il fluido supercritico nelle condizioni applicate riesce dunque ad estrarre CoQ 10 dallecellule. Dall’analisi delle cellule scaricate risulta però che in questa prima proval’estrazione non è stata completa, infatti il picco del CoQ 10 nelle cellule scaricate dovrebbeessere assente o minimo e la quantità estratta dovrebbe corrispondere alla quantitàpresente nella biomassa, determinata con l’estrazione analitica.Bisogna ancora considerare che è stata eseguita una sola prova senza condizionamentodell’impianto: in questa prima prova viene perso parecchio estratto che rimane aderito allesuperfici e negli spazi morti. Questa perdita si annulla solo dopo diverse estrazioni(saturazione delle superfici e degli spazi morti), dopo di che l’estrazione diventariproducibile dal punto di vista quantitativo. Questo non è stato possibile per mancanza dimateria prima.Disponendo di un quantitativo sufficiente di cellule per una decina di prove sarà possibiletrovare le condizioni necessarie ad un’estrazione completa, parametrizzandoopportunamente il processo. I parametri da considerare sono la pressione e latemperatura nell’autoclave, la portata del solvente e il tempo di estrazione.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 36 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5.5. Verifica del contenuto di CoQ10 in lieviti mediante estrazioneanaliticaSi è pensato di estrarre il CoQ 10 da lievito di birra perché in letteratura 46 è bendocumentata la presenza di CoQ 10 in questa biomassa che dopo la fermentazione per lafabbricazione della birra rappresenta un prodotto di scarto, senza valore. Una suavalorizzazione sarebbe perciò conveniente; in chiave industriale è inoltre interessante ilfatto che rappresenterebbe una materia prima gratuita.Si è pensato quindi di procedere a prove di estrazione con lievito di birra quale scarto difermentazione, ottenuto dalla birreria di Bioggio. Questo lievito deve essere separato dallabirra residua e seccato prima dell’estrazione in quanto la presenza di acqua disturberebbel’estrazione con solventi apolari. I vari tentativi di seccare il lievito senza disporre diliofilizzatori o di apparecchiature specifiche (soffiatori, spraydrying, ..) non hanno dato irisultati sperati. Sono state ottenute delle paste molto scure che fanno pensare ad undegrado del materiale.Si è pertanto deciso di eseguire dapprima delle prove con lieviti liofilizzati ottenibili incommercio. Quale prodotto è stato scelto il lievito di birra vitaminizzato Actilife di Migros(Fig. 33).Figura 33: imballaggio del lievito di birra vitaminizzato ActilifeL’analisi viene condotto con lo stesso principio e con lo stesso metodo descritto allasezione 5.3 per le cellule battericheIn base alle considerazioni del punto 5.2 sulla struttura delle cellule eucariote dei lieviti esulle difficoltà che possono porre al solvente, si è pensato di macinare i lieviti fino al puntoda rompere le cellule aprendo così le barriere.Per la macinazione si è utilizzato un mulino a rotazione asimmetrica con anelli concentriciSiebtechnik T100, (400 V, 50 Hz, 1000 rpm) in dotazione all’Istituto Tecnico Sperimentaledella SUPSI di Trevano (Fig. 34 e 35).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 37 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 34: mulino Siebtechnik T100Figura 35: camera di macinazione con anelli concentriciLa macinazione è stata effettuata per un tempo di 5 min su ogni carico parziale di 15-20 g.Non è stato possibile eseguire una misura granulometrica per determinare le dimensionemedie dei granelli di macinato; il macinato è stato perciò osservato al microscopio perverificare l’effetto della macinazione sulle cellule.Risultati e discussioneIn Fig. 36 è mostrato il risultato analitico ottenuto con diverse soluzioni di estratto e con lasoluzione standard (profilo anteriore): il CoQ 10 della soluzione standard ha un tempo diritenzione di 11 min; allo stesso R t le soluzioni degli estratti di lievito non mostrano alcunpicco cromatografico. Questo potrebbe significare che il CoQ 10 non è stato estratto inmisura rilevabile, oppure che nei lieviti il composto non è presente.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 38 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 36: cromatogramma dell'estratto di lievito liofilizzatoLa prima ipotesi considera che il protocollo applicato è previsto per cellule batterichestrutturalmente diverse dalle cellule dei lieviti. La macinazione potrebbe essere statainsufficiente. In effetti l’osservazione al microscopio non permette di osservare differenze,quindi di pensare ad una rottura delle cellule. La macinazione ha solo permesso didisgregare i granelli del materiale.Figura 37: lievito liofilizzato prima della macinazioneFigura 38: lievito macinato______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 39 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Va però osservato che non è stato possibile stabilire l’origine del lievito Migros impiegato,in particolare le condizioni in cui è stato allevato e le lavorazioni che ha subito prima dellaliofilizzazione. In particolare è noto che lieviti allevati o cresciuti in condizioni difermentazione (anaerobiche) riassorbono l’apparato respiratorio che non viene utilizzato 47 .Una possibilità per aumentare il contenuto di CoQ 10 potrebbe essere quella di allevare illievito per un certo periodo in condizioni aerobiche.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 40 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________5.6. Produzione di estratti concentrati in CoQ 10 da lievitiMalgrado il risultato negativo della prova analitica sono state comunque eseguite alcuneprove di estrazione su masse di 50-200 g di lievito Actilife.Prima di indagare la possibilità di estrarre il CoQ 10 con un metodo tecnologicamenteinnovativo quale quello con CO 2 supercritica è comunque consigliabile eseguire una primaverifica con un metodo tradizionale come l’estrazione con solvente organico in estrattoreSoxhlet. Questo tipo di estrazione è molto ben conosciuta anche su scala industriale erichiede costi molto più bassi rispetto a processi che avvengono in sistemi pressurizzati apressioni nell’orine di 100-300 bar. Si è quindi pensato di effettuare una prova diestrazione con un metodo tradizionale (Soxhlet) utilizzando come solvente la miscelaeluente impiegata per l’analisi HPLC (etanolo/ isopropanolo/ metanolo).5.6.1. Estrazione preparativa da lievito liofilizzato con solvente organico inestrattore SoxhletPrincipioUn solvente organico viene messo a contatto con la polvere così da permetterne ladiffusione fino ai vacuoli delle cellule contenenti l’olio. La soluzione estratto-solvente vienescaricata e il ciclo viene ripetuto rievaporando lo stesso solvente. Infine il solvente vieneseparato dall’estratto mediante distillazione.Procedimento• Viene montato il sistema Soxhlet (calotta riscaldante, pallone, estrattore concartuccia e condensatore) (Fig. 39);• Si trasferiscono nel pallone 200 ml di soluzione etanolo/isopropanolo/metanolo40/35/25 v/v/v;• Nella cartuccia vengono caricati 40 g di lievito non macinato (Fig. 40);• Viene circolato il solvente durante 48 h;• A fine estrazione la soluzione viene distillata in evaporatore rotante per concentrarel’estratto prima dell’analisi HPLC..______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 41 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 39: sistema Soxhlet per estrazione con solvente organicoFigura 40: capsula contenente lievito di birraRisultati e discussioneIn Fig. 41 a R t = 11 min compare il picco cromatografico della soluzione standard (profilobianco), mentre l’estratto di lievito (profilo azzurro) non presenta alcun piccocromatografico.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 42 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 41: cromatogramma dell’estratto soxhlet:profilo bianco = sol. standard; profilo azzurro = estrattoL’estrazione non è risultata efficace; il lievito, come già detto in precedenza, presentamolte barriere da superare per il solvente e non raggiunge dunque il CoQ 10 . L’esperimentoandrebbe ripetuto con una miscela solvente diversa. Si è rinunciato a macinare il lievito inbase all’esperienza negativa precedente. Gli alcoli si addicono bene alla dissoluzione dellebarriere ma la presenza nella miscela di un solvente polare (ad esempio esano) potrebbeaumentare il potere solvente per il CoQ 10 .Non avendo molto tempo a disposizione si è pensato di effettuare l’estrazione con CO 2come fluido supercritico apolare unito alla miscela di alcoli quale cosolvente.5.5.2. Estrazione con fluido supercritico da lievito liofilizzato ActilifeE’ stata eseguita un’estrazione da lievito di birra (macinato) con CO 2 supercritica conaggiunta di miscela eluente HPLC come co-solvente; il tentativo di estrazione con solaCO 2 non ha dato nessun estratto.L’impiego di un cosolvente in soluzione di CO 2 supercritica ha richiesto una modificadell’impianto d’estrazione: nella linea di CO 2 che alimenta la camera d’estrazione è statointrodotta un raccordo “T” per l’entrata nella linea stessa della soluzione di alcoli (Fig. 42).Questa soluzione viene spinta nel flusso di CO 2 da una pompa di un HPLC fuori uso ingrado di fornire fino a 4 ml/min di soluzione ad una pressione di 100-300 bar (Fig. 43).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 43 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 42: connessione sulla linea della CO 2 per l'impiego del cosolventeFigura 43: pompa HPLC Perkin-Elmer utilizzata per l'invio del cosolventeL’esttraazione è stata condotta nelle stesse condizioni di pressione, temperatura e portatadi CO 2 applicate nella prova su cellule batteriche, con una portata di cosolvente di 2ml/min.Da un carico di 83 g di lievito (non macinato) è stato ottenuto un estratto successivamentecentrifugato (Fig. 44), evaporato in evaporatore rotante (Fig. 45), ridisciolto in miscelaeluente HPLC e infine iniettato in HPLC.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 44 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 44: centrifuga utilizzata per accelerare la sedimentazione dell’estratto.Figura 45: rotavapor in azioneDopo l’analisi si è notata una suddivisione in due fasi dell’estratto, una fase piuttostooleosa e una più acquosa, sono state quindi separate e analizzate separatamente.Risultati e discussioneNel profilo cromatografico della fase scura dell’estratto del lievito di birra vitaminizzato noncompare il picco corrispondente allo standard di CoQ 10 (Fig. 46).Anche nel profilo cromatografico della fase chiara dell’estratto non risulta alcun piccocorrispondente allo standard di CoQ 10 (Fig. 47).______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 45 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 46: analisi della fase oleosaFigura 47: analisi della fase acquosaQuesto primo tentativo non ha dato risultati soddisfacenti, non si osserva nessun picco diCoQ 10 .Come secondo tentativo si è pensato di ritentare la via della macinazione, ricorrendoall’azoto liquido.Il lievito umidificato al 5% viene tenuto per 10-20 secondi in azoto liquido (-196°C) prima diessere trasferito nel mulino. Il congelamento provoca una fragilizzazione delle strutturecellulari e quindi una maggior probabilità di rompere le barriere. L’esame al microscopio(Fig. 48) dimostra che circa la metà delle cellule sono state rotte:______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 46 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Figura 48: cellule macinate dopo criogenizzazione con azoto liquidoLa biomassa macinata è quindi stata estratta con CO 2 e cosolvente nelle stesse condizioniprecedentemente applicate.Massa iniziale di lievito (macinato): 188,71 g.L’estratto è stato suddiviso in 8 frazioni successive in ordine di tempo; la Fig. 49rappresenta il cromatogramma della soluzione standard (profilo bianco) e della frazionenumero VII nel quale compare il picco del CoQ 10 . Esso compare anche neicromatogrammi di tutte le altre frazioni dell’estratto.Figura 49: cromatogramma della frazione VII dell’estratto di lievito liofilizzato dopo macinazione conazoto liquidoPer ogni frazione è stato calcolato il quantitativo di CoQ 10 estratto secondo il principio giàapplicato, ad esempio per la frazione VII:______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 47 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________AreaEArea* Cstst* Vsolfin* Massa*100= 0.0112 %batteriArea E = area picco estrattoC st = concentrazione dello standard utilizzatoV solfin = volume soluzione da RotavaporArea st = Area picco standardMassa batteri = Massa di batteri sospesi______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 48 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________Sommando i valori ottenuti per tutte le funzioni si ottiene:Estratto % CoQ 101 0.0532 0.0093 0.0044 0.0105 0.0536 0.0097 0.0048 -Totale 0.075Questo secondo tentativo ha dato risultati interessanti: l’identificazione del CoQ 10attraverso il suo picco ci indica che l’estrazione è possibile se la biomassa vieneadeguatamente preparata, in particolare macinata dopo criogenizzazione con azotoliquido. Non è possibile stabilire se tutta la quantità di CoQ 10 contenuta nel lievito è stataestratta: manca infatti un dato analitico sul lievito (l’estrazione analitica potrebbe a questopunto essere ripetuta sfruttando la macinazione dopo criogenizzazione)..______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 49 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________6. ConclusioniDall’esame della bibliografia risulta che il CoQ10 è molto interessante dal punto di vista siascientifico che tecnologico, per la medicina, la farmaceutica, l’industria alimentare ecosmetica.Nel nostro laboratorio sono ora disponibili la strumentazione e i metodi per analizzare ilcontenuto di CoQ 10 in cellule batteriche.Probabilmente trattando i lieviti con azoto liquido prima della macinazione lo stessometodo applicato alle cellule batteriche permette la misura del contenuto di CoQ10 anchenei lieviti. Questo dovrà essere verificato, in particolare utilizzando lieviti quali scarti dibirreria, che rappresentano una materia prima gratuita e interessante da valorizzare.Dalle cellule batteriche GN30 risulta possibile estrarre con sola CO 2 supercritica, senzaco-solventi; ciò assicura la massima naturalezza del prodotto. È stato ottenuto un estrattodal quale non si è ancora studiata la procedura di purificazione.Dai lieviti risulta possibile estrarre CoQ 10 con CO 2 supercritica solo se le cellule vengonoumidificate, criogenizzate con azoto liquido e macinate. Inoltre sembra assolutamentenecessario l’utilizzo di un co-solvente (miscela di alcoli) quale aiuto alla CO 2 .Sia per batteri che per lieviti il processo estrattivo deve essere ottimizzato, per estrarrecompletamente il CoQ 10 .Il lievito di birra potrebbe essere relativamente povero di mitocondri e andrebbe studiata lapossibilità di aumentarne il contenuto con un allevamento aerobico prima del siccaggio,della macinazione e dell’estrazione.Considerazioni personaliHo scelto questo lavoro di maturità poiché molto interessata sia alla chimica che allabiologia, ma soprattutto alla tecnologia chimica e biologica.L’estrazione del Coenzima Q 10 da matrici biologiche copre entrambe queste discipline:infatti, il composto oggetto del lavoro è una molecola organica, che svolge specifichefunzioni biochimiche all’interno dell’organismo e l’analisi della sua concentrazione nellecellule effettuata mediante tecniche cromatografiche sono attività che ricadono nel campodella chimica analitica, mentre la produzione di biomasse e l’estrazione preparativa voltead un’applicazione industriale ricadono nel campo della biotecnologia e dell’ingegneriachimica.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 50 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________7. RingraziamentiSi ringraziano:• Helsinn SA di Biasca, per la donazione dei componenti dell’apparecchio HPLCKontron;• Pharmaton SA di Bioggio, nella persona del Signor M. Tenore per la collaborazionedurante la messa in funzione dell’apparecchio HPLC e per averci messo adisposizione una colonna HPLC;• Gnosis SpA di Desio (MI), per averci fornito le cellule batteriche GN30;• Istituto Tecnico Sperimentale, SUPSI Trevano, per l’assistenza durantel’operazione di macinazione del lievito;• Officina della Birra di Bioggio, per la fornitura gratuita di lievito di birra.______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 51 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________8. Bibliografia1 http://www.anagen.net/coq10.htm2 S.Hodges et al, BioFactors 9 (1999) 365-370 IOS Press3 S.Hodges et al, BioFactors 9 (1999) 365-370 IOS Press; Petere Heidt, Diss. Uni Ge,19994 Peter H. Langsjoen et al. BioFactors (1999) 237-284 IOS Press ,M.L.Genova et al., Ludmila Korkina, et. al, Bio factors 18 (2003) 245-254 IOS PressPetere Heidt, Diss. Uni Ge, 1999.Christophe Pause, tesi di laurea5 M.Flint Beal, Clifford W. Schults, BioFactors 18 (2003) 153-161 IOS Press.6 M.Battino et al., BioFactors 18 (2003) 277-281 IOS Press.7 D.S.Sinatra et al., BioFactors 18 (2003) 283-287 IOS Press8 Hoppe, et al., , Biofactors 9, (1999), 371-3789 M. Battino et al., BioFactors 18 (2003) 299-305 IOS Press10 Merck Index,11 Pharmacopea Europea, Supplemento 2001, pag 156512 www.omikron.de13 The Merck Index, 12 Ed, 9974, pag 167914 Farmacopea Europea, Supplemento 2001, pag 156515 ibid16 http://www.biovita.com/product_item.asp?id=99,17 http://shop.store.yahoo.com/buyinprivate/nivcoenq10wr.html),18 http://www.ablesrl.com/prodotti/prodotti_viso.htm19 http://www.marcoantonetto.com/dietetici.asp20 M.B. Rassam et al.; Molecular and Biochemical Parasitology, 29 (1988), 61-6421 T.Okamoto et al., Journal of Chromatography, 342 (1985), 35-46, BiochemicalApplications22 http://www.ecplaza.net/ecmarket/list.asp?cmd=search&keywords=coenzyme+q1023 brevetto WO2004074487/ EP159496724 brevetto US2004151711 - 2004-08-05 (www.espacenet.ch)25 The Merck Index, 12 Ed, 9974, pag. 167926 brevetto WO0214530/ US200307386927 brevetto US 2003/0073869 (www.espacenet.ch)28 Williams e Fleming, Metodi spettroscopici in chimica organica, Martello, pag. 729 http://www.coenzymeq10.it/method.html30 Beilstein, 8, IV, 331931 http://www.coenzymeq10.it/method.html32 ibid33 ibid34 Gnosis SpA, Desio (MI), banca dati interna per metodi HPLC35http://www.dicom.uninsubria.it/campusweb/corsi/sc_amb/stage/stage_2003/Spettrofotometri.htm36 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=Pager&DB=pubmed37 S.Nazzal, et al., Pharmazie, 56 (2001), 5, 394-39638 Crane, F.L., and Barr, R. Methods in Enzymology, Vol.18 (1971), 137-16939 K. K. Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1, Merck, pagg. 12-1640 Alberto Tagliaferro et al. Biotecnologie e chimica delle fermentazioni, Zanichelli,(pagg.25-27)______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 52 di 53 dicembre 2005

Chiara Gianesello Coenzima Q 10 Lavoro di maturità in chimica________________________________________________________________________________________________41 Neil A. Campbell, Biologia, Zanichelli, pag. 66842 G. Grossi, et al, J Chromatogr. 1992 Feb 28;593(1-2):217-2643 Reverchon, E; …44 Krukonis, Hughes, …45 http://sfst.kmcom.com.cn/new_page_25.htm46 Guo J, Lemire BD, J Biol Chem. 2003 Nov 28;278(48):47629-35. Epub 2003 Sep 16.47 Methods in enzimology, Vol 10______________________________________________________________________________________Liceo Lugano 2, CH-6942 Savosa Pagina 53 di 53 dicembre 2005