Cutolo CSA HCV

Meccanismi di azione notie meno noti dellaCICLOSPORINA AMaurizio CutoloUnità Operativa Clinica ReumatologicaDIMILaboratori di RicercaScuola di Specializzazione inRheumatologiaDIMI - Università di GenovaOspedale San Martino

• La storia della CsA inizia con il suo isolamento da fungi del nord-Europa(Tolypocladium inflatum e Clyndocarpon lucidum) avvenuta nel 1970(Borel FJ).• Si notò, sin dal 1972, che era dotata di azione immunosopressiva.• I primi studi sperimenali nella prevenzione del rigetto dei trapiantiavvengono nel 1978.• Sintesi di laboratorio 1980 e comercializzazione 1983.

IL 6APCB7CD 28MHCTCRIL 12IL 10, IL 4,IL 3BcCD40LCD40IL 6Th2FIL IL 24TcIL 2, IFN IL 10, IL 4, IL 13IL 16IL IFN 2Th1IFN IL 15IL 2, IL18,IFN CD40LCD40BcIL 1, TNF-, , PDGFIL 6, IL 8, GM-CSFM

Meccanismo della risposta immunitariaCellula presentantel’Antigene (APC)LinfocitaDiffusioneIL-2EspansionelinfocitariaIn presenza di uno stimolo antigenico,il linfocita lo riconosce e risponde con la produzione di citochine specifiche.Tra queste l’IL-2 interagisce con altri linfociti T e ne stimola l’espansione clonaleattivandone la risposta immunitaria.Menù

Attivazione complesso proteine citoplasmaticheAPCLinfocitaNucleoLegameantigene recettoreMembranacellularePresentazioneantigeneda parte di celluledendritiche (APC)

Attivazione complesso proteine citoplasmaticheAPCLinfocitaCiclofilina B (CypB)NucleoCalmodulina (CaM)Calcineurina (CaN)Legameantigene recettoreMembranacellularePresentazioneantigeneda parte di celluledendritiche (APC)Si genera un segnaledi attivazione per le diverseproteine citoplasamatichetra cui la calcineurina:una fosfatasi calmodulinaCa-dipendente

Attivazione complesso proteine citoplasmaticheAPCLinfocitaCiclofilina B (CypB)NucleoCalmodulina (CaM)Calcineurina (CaN)Legameantigene recettoreComplessoproteinecitoplasmaticheMembranacellularePresentazioneantigeneda parte di celluledendritiche (APC)Si genera un segnaledi attivazione per le diverseproteine citoplasamatichetra cui la calcineurina:una fosfatasi calmodulinaca-dipendenteLa calcineurina,in particolaresvolge attività fosfatasicaessenziale perl’attivazione genicaMenù

Attivazione Gene IL-2AttivazioneGene IL-2ComplessoCmA/CypB/CaNP0 4-Defosforilazionedel NF-ATTraslocazioneNF-ATNFATNuclear factorof activated T cellsla calcineurina consentela fosforilazionedel fattore di trascrizioneNF-AT (Nuclear factorof activated T cells)L’NF-AT fosforilatotrasloca nel nucleoa livello dellaregione promotoredel gene dell’IL-2attiva il gene IL-2e ne stimolala trascrizioneMenù

Trascrizione e sintesi IL-2TrascrizionemRNA IL-2attivazionedella trascrizionedel gene dell’IL-2e formazionedel mRNA

Trascrizione e sintesi IL-2TrascrizionemRNA IL-2Produzione IL-2attivazionedella trascrizionedel gene dell’IL-2e formazionedel mRNAtraduzionedell’mRNAe sintesidelle molecoledi IL-2

Trascrizione e sintesi IL-2TrascrizionemRNA IL-2Produzione IL-2LiberazioneIL-2attivazionedella trascrizionedel gene dell’IL-2e formazionedel mRNAtraduzionedell’mRNAe sintesidelle molecoledi IL-2liberazionedell’IL-2 prodottaall’esternodello spaziointercellulareMenù

Attivazione espansione linfocitariaLegameIL-2 al recettorelegame dell’IL2sui recettori specificidi membrana, costituitida diverse subunità:alfa, beta, gamma.

Attivazione espansione linfocitariaLegameIL-2 al recettorelegame dell’IL2sui recettori specificidi membrana, costituitida diverse subunità:alfa, beta, gamma.Il legame dell’IL2alla subunità specifica gammatrasmette all’interno della cellulail segnale di attivazionedella espansione linfocitariaMenù

Ruolo della ciclosporinaCiclosporina(CsA)La ciclosporinaè un immunosoppressore,impiegato per la prevenzionedel rigetto e per il controllodelle malattie autoimmuni

Ruolo della ciclosporinaCiclosporina(CsA)Espansionelinfocitariadefosforilazionee traslocazione del fattore NFATLa ciclosporinaè un immunosoppressore,impiegato per la prevenzionedel rigetto e per il controllodelle malattie autoimmuniLa ciclosporina agiscesull’inibizione di alcune proteinecoinvolte nell’espressionegenicaMenù

Ruolo della ciclosporinaCsACypBla ciclosporinaentra passivamenteall’interno della cellulae si legaalla ciclofilina B

Ruolo della ciclosporinaComplessoCypB/CsACaNCaMla ciclosporinaentra passivamenteall’interno della cellulae si legaalla ciclofilina Bil complesso CypB/CsAsi lega alla calmodulinae alla calcineurina,una fosfatasi indispensabileper la traslocazionenel nucleo del fattore NF-AT

Ruolo della ciclosporinaComplessoCypB/CsA/CaN/CaMInibizione defosforilazionee traslocazione nel nucleola ciclosporinaentra passivamenteall’interno della cellulae si legaalla ciclofilina Bil compesso CypB/CsAsi lega alla calmodulinae alla calcineurina,una fosfatasi indispensabileper la traslocazionenel nucleo del fattore NF-ATil compessoCypB/CsA/CaN/CaMinibisce l’attivitàdefosforilantedella calcineurinae quindi la traslocazionedel NF-AT al nucleoMenù

CsA: immunosoppressore di riferimentoDuplice beneficio della ciclosporina

CsA: immunosoppressore di riferimentoVirusEpatite C(HCV)DiffusioneviraleTrascrizionee replicazione RNADuplice beneficio della ciclosporinainibisce l’espansione clonale dei linfociti T• efficace contro il rigetto nel trapianto d’organo,• efficace nelle malattie autoimmuni dermatologichee reumatiche)contrasta la replicazione virale dell’HCV(Recentemente è stato individuato il suo coinvolgimentonella replicazione del virus dell’epatite C)Watashi K. et al.: Molecular Cell. 2005; 19: 111-122 - Nakagawa M. et al.:Gastr. 2005; 129: 1030-1041 - Lindenbach B.D., Rice C.M.: Nature 2005; 436: 933-938Menù

CsA+CsA-CyclophilinCyclophilin: inhibitionCalcineurinNF-AT and AP-1CD4Th1IL-2IL-3IL-4TNF-IFN-

Blocca la codifica di:- IL-2, LINFOCHINA NECESSARIA PER LA CRESCITA DELLE CELLULE T-e di altre CITOCHINE Gli effetti della ciclosporina sono specifici e reversibili

Rev Med Virol. 2007 Jul-Aug;17(4):245-52.Chemical genetics approach to hepatitis C virus replication: cyclophilin as a target foranti-hepatitis C virus strategy.Shimotohno K Watashi K,.CsA+CsA-CyclophilinCyclophilinAnalysis using CsA as a bioprobe showed that cyclophilin (CyP) B, a cellulartarget of CsA, regulates the function of HCV RNA polymerase NS5B, which isessential for efficient viral genome replication.By targeting CyP, HCV genome replication was drastically suppressed.Thus, chemical genetics analysis identified CyPB as a cellular cofactor of HCVgenome replication and a target for novel anti-HCV agents.

HCV: Meccanismo ciclo replicativoVirus HCVNucleoCellulaDiffusioneviraleTrascrizionee replicazione RNAL’HCV, oltre ad essere responsabile dell’epatite C,è causa di numerose manifestazioni extraepatiche di tipo linfoproliferativo o autoimmune.Il virus invade la cellula bersaglio e, sfruttando i suoi meccanismi biochimici,la usa per moltiplicarsi e diffondersi ad altre cellule sane infettandole.Watashi K. et al.: Molecular Cell. 2005; 19: 111-122 - Nakagawa M. et al.:Gastr. 2005; 129: 1030-1041 - Lindenbach B.D., Rice C.M.: Nature 2005; 436: 933-938Menù

HCV: ingresso nella cellulaNucleoVirus HCVCellulaRNA+NucleocapsideL’HCV è un viruscostituito daun nucleocapsideche avvolge unfilamento di RNA +,costituito da circa9600 nucleotidiMembranafosfolipidicaLindenbach B.D., Rice C.M.: Nature 2005; 436: 933-938Lauer G.M., Walker B.D.: N. Engl. J. Med. 2001; 345 (1): 41-52

HCV: ingresso nella cellulaRNA+Degradazionedel nucleocapsideL’HCV è un viruscostituito daun nucleocapsideche avvolge unfilamento di RNA +,costituito da circa9600 nucleotidiL’HCVpenetra la cellulamediante endocitosie libera il suogenoma RNA+nel citoplasmaMenù

HCV: Traduzione RNA+ e sintesi polipeptideRNA+ReticoloEndoplasmaticorugosoL’RNA+comportandosida RNA messaggeroentra in contatto coni ribosomi del reticoloendoplasmaticorugoso

HCV: Traduzione RNA+ e sintesi polipeptidePolipeptideTraduzionepolipeptideL’RNA+comportandosida RNA messaggeroentra in contatto coni ribosomi del reticoloendoplasmaticorugosoAttaccato dai ribosomiviene immediatamentetradotto e sintetizzatoin un polipeptideMenù

HCV: formazione complesso replicativoClivaggiopoliproteinail polipetidesubisce un clivaggiopost traduzionalee origina proteinestrutturalie funzionali

HCV: formazione complesso replicativoNS5Bil polipetidesubisce un clivaggiopost traduzionalee origina proteinestrutturalie funzionaliUna di questeè la NS5B(una proteina funzionalead attività RNA polimerasicaRNA dipendente)indispensabileper la replicazione virale

HCV: formazione complesso replicativoRNA+ComplessoNS5B / CypBCypBNS5Bil polipetidesubisce un clivaggiopost traduzionalee origina proteinestrutturalie funzionaliUna di questeè la NS5B(una proteina funzionalead attività RNA polimerasicaRNA dipendente)indispensabileper la replicazione viraleLa NS5B si legaalla ciclofilina Be successivamenteall’RNA viraleformando cosìil complessoreplicativoMenù

HCV: replicazione genoma viraleRNA-ComplessoNS5B / CypB / RNAil complessoreplicativoNS5B/CypB/RNAorigina il filamentocomplementaredi RNA negativo

HCV: replicazione genoma viraleRNA-RNA+il complessoreplicativoNS5B/CypB/RNAorigina il filamentocomplementaredi RNA negativoL’RNA negativocostituiscela matrice attivaper la replicazionedi nuovi filamentidi genoma viraleMenù

HCV: replicazione genoma viraleLe copie del genoma viralee le proteine viralisubiscono l’assemblaggionell’apparato di Golgi

HCV: replicazione genoma viraleLe copie del genoma viralee le proteine viralisubiscono l’assemblaggionell’apparato di Golgisi formanonuove progenie viraliche espulse all’esternomediante esocitosisi diffondonoin nuove cellule

Ruolo della ciclosporinaCiclosporina(CsA)La ciclosporinarappresenta un notevoleprogresso in ambitoterapeutico

Ruolo della ciclosporinaDiffusioneviraleCiclosporina(CsA)Trascrizionee replicazione RNALa ciclosporinarappresenta un notevoleprogresso in ambitoterapeuticoIn quanto agendo direttamentesu una proteina funzionale del virusè associata ad un minor rischiodi sviluppo di resistenzafarmacologicaMenù

CsA: Interazione con ciclofilinaciclosporinaCiclofilina Bla ciclosporinapossiede una elevataaffinità per la famigliadelle ciclofilinetra cui la ciclofilina B

CsA: Interazione con ciclofilinaciclosporinaRNA+Ciclofilina BNS5Bla ciclosporinapossiede una elevataaffinità per la famigliadelle ciclofilinetra cui la ciclofilina BLegandosialla ciclofilina Bnon la rende più disponibileper la formazionedel complessoNS5B/RNA/CypB

CsA: Interazione con ciclofilinaRNA -la ciclosporinapossiede una elevataaffinità per la famigliadelle ciclofilinetra cui la ciclofilina BLegandosialla ciclofilina Bnon la rende più disponibileper la formazionedel complessoNS5B/RNA/CypBL’inibizione delfilamento complementaredi RNA negativoblocca di conseguenzal’avvio allareplicazione viraleMenù

Cyclosporin A

CsACsA+-CyclophilinCalcineurinMIL 12NF-AT+CsA- : inhibition+ : stimulationIL 2CD4Th1-+TGFß1CD4Th3

CONCLUSIONI•La Ciclosporina esercita una potente azione immunosoppressiva, attraversoil blocco del NFAT riesce a ridurre la sintesi citochinica (specie IL-2)direttamente a livello dei linfociti T•Con lo stesso meccanismo viene bloccata la replicazione del virus Cdell’epatite•Indirettamente, aumentando la disponibilità locale di metaboliti attivi delTestosterone (DHT) rinforza l’azione immunosoppressiva naturale esercitatadagli androgeni (segno clinico dell’irsutismo)* I macrofagi sono un uleriore bersaglio indiretto con ridotta sintesi di TNF inparticolare* In pratica, l’azione della Ciclosporina si esercita attraverso meccanismimolto più complessi di quanto accertato almeno nei primi studi