CEDIA® tacrolimusassay

CEDIA ® tacrolimusassay
: 10008656
Beoogd gebruik
De CEDIA ® tacrolimusassay is een in vitro diagnostisch medisch hulpmiddel dat dient
voor de kwantitatieve bepaling van tacrolimus in menselijk vol bloed op geautomatiseerde
klinische-chemieanalyzers als hulp bij het management van patiënten met een allogeen
nier- en/of levertransplantaat die met tacrolimus worden behandeld.
Samenvatting en verklaring van de test
Tacrolimus (FK506, Prograf ® ) is een macrolide antibioticum van schimmeloorsprong,
Streptomyces tsukubaensis, met potente immunosuppressieve functie, als
voorgeschreven voor patiënten met een nier- en/of levertransplantaat. 1 Tacrolimus is
een remmer van calcineurine, dat van aard een fosfatase is en de vermenigvuldiging
van T-cellen activeert. 2-4 Tacrolimus bindt in cellulaire gebeurtenissen een familie
bindende eiwitten, FKBP’s (FK506-bindende eiwitten) genoemd, en vormt dan een
pentameercomplex dat tacrolimus, FKBP, calcineurine A en B en calmoduline bevat. 2-5
De pentameervorming resulteert in de remming van de fosfataseactiviteit van
calcineurine, die nodig is voor het activeren van transcriptiefactoren voor transport naar
de celkern. De genexpressie van T-lymfocyten wordt dus geschaad, in het bijzonder voor
cytokinen zoals IL-2, wat resulteert in een immunosuppressief effect bij patiënten. 2-5
Tacrolimus vertoont een vergelijkbaar effect als dat van ciclosporine bij concentraties
die ongeveer 100 keer lager zijn dan die van ciclosporine. 1 De verdeling van tacrolimus
tussen vol bloed en plasma hangt af van diverse factoren, zoals hematocriet,
concentratie van het geneesmiddel en plasma-eiwitconcentratie. De verhouding van
volbloed- tot plasmaconcentratie was gemiddeld 35 (met een bereik van 12 tot 67). 6-7
Tacrolimus wordt uitgebreid gemetaboliseerd door het cytochroom P-450-systeem,
voornamelijk CYP3A. 8-11 Het geneesmiddel wordt gemetaboliseerd in 8 metabolieten
(M1-M-8) door demethylering en hydroxylering. Metabolieten M-1 en M-2 vertoonden
significante farmacologische activiteit in bioassays. 11 De gemiddelde halfwaardetijd van
tacrolimus in vivo is op 48 uur geschat. 8-11 Een therapeutisch bereik van 5 tot 20 ng/ ml
in vol bloed is over het algemeen aanbevolen voor patiënten met standaardrisico van
afstoting. 11-14 Ook is gemeld dat de tacrolimusconcentratie in volbloed grote intra- en
interpatiënt-variabiliteit vertoonde. 15 Controle van tacrolimus is dus belangrijk voor
effectief gebruik van het geneesmiddel bij de preventie van afstoting van allogene
nier- en levertransplantaten, vooral bij hoogrisicopatiënten. De meting van de
tacrolimusconcentratie in vol bloed in combinatie met andere laboratoriumgegevens
en klinische evaluatie is de beste manier om bij patiënten de immunosuppressie te
optimaliseren en de bijwerkingen te minimaliseren.
De CEDIA tacrolimusassay vormt een uniek homogeen enzym-immuno-assaysysteem
op basis van recombinant-DNA-technologie (Amerikaans [VS] octrooinr. 4708929). 16
De assay is gebaseerd op het enzym -galactosidase, dat genetisch is gemanipuleerd
tot twee inactieve fragmenten (enzymdonor en enzymacceptor). Deze fragmenten
reassociëren spontaan tot volledig actieve enzymen die, in het assayformaat,
een substraat splitsen, en daarbij een verandering van kleur doen ontstaan die
spectrofotometrisch kan worden gemeten.
In de assay wedijvert geneesmiddel in het monster met tacrolimusanaloog dat met
enzymdonor (ED) van -galactosidase is geconjugeerd, voor een beperkt aantal
tacrolimusanaloog-antilichaambindingsplaatsen. Als geneesmiddel in het monster
aanwezig is, bindt het aan het geneesmiddelanaloog-antilichaam. Het ED-conjugaat
is dan vrij om actieve enzymen met de enzymacceptor (EA) te vormen. Als er geen
geneesmiddel in het monster aanwezig is, bindt het geneesmiddelanaloog-antilichaam
aan het geneesmiddelanaloog dat met de ED is geconjugeerd, waarbij de reassociatie
van ED met EA wordt onderdrukt en geen actief enzym wordt gevormd. De hoeveelheid
gevormd actief enzym en de resulterende absorptieverandering zijn recht evenredig
met de aanwezige hoeveelheid geneesmiddel in het monster.
Reagentia
1 EA-reconstitutiebuffer: Bevat PIPES [piperazine-N, N-bis (2-ethaansulfonzuur)],
0,39 µg/ml muis monoklonale antitacrolimusanaloog-antilichamen, stabilisator en
conserveringsmiddel (1 x 26 ml).
1a EA-reagens: Bevat 0,171 g/l enzymacceptor (microbieel), bufferzouten en
conserveringsmiddel (1 x 26 ml).
2 ED-reconstitutiebuffer: Bevat MES [2-(N-morfolino)- ethaansulfonzuurbuffer),
secundair antilichaam, detergens en conserveringsmiddel (1 x 11 ml).
2a ED-reagens: Bevat 6 nM (119 ng/ml) enzymdonor (microbieel) geconjugeerd met
tacrolimusanaloog, 3,27 g/l chloorfenolrood- -D-galactopyranoside, stabilisatoren
en conserveringsmiddel (1 x 11 ml).
3 Extractiereagens: Bevat 300 mM ZnSO4 (1 x 50 ml).
Aanvullend materiaal: Hitachi barcodes, 1xR1- en 1xR2-barcodes.
Aanvullend benodigd materiaal (maar niet bijgeleverd):
Catalogusnr. 10008666 – CEDIA tacrolimuskalibratorkit
Geautomatiseerde klinische-chemieanalyzer
Methanol, HPLC-kwaliteit (> 99,8% zuiverheid)
Microcentrifugebuisjes met ronde bodem
Tacrolimuscontroles (bel voor aanbevelingen met de technische ondersteuning van
Microgenics)
Voorzorgsmaatregelen en waarschuwingen
Uitsluitend voor gebruik bij in-vitrodiagnostiek: Neem bij het hanteren van alle
laboratoriumreagentia de vereiste normale voorzorgsmaatregelen in acht.
Uitsluitend voor gebruik bij
in-vitrodiagnostiek
LET OP – WAARSCHUWING: Materiaal van menselijke oorsprong is getest op HIV-1,
HIV-2, hepatitis B en hepatitis C met een door de FDA goedgekeurde methode. De
resultaten waren negatief. Omdat geen enkele testmethode echter het potentiële risico
van infectie met absolute zekerheid kan uitsluiten, moet het materiaal net zo voorzichtig
worden behandeld als een patiëntenmonster. In geval van blootstelling, moeten de
richtlijnen van de verantwoordelijke gezondheidsautoriteiten worden gevolgd.
LET OP – WAARSCHUWING: De reagentia die bij de CEDIA tacrolimusassay zijn
inbegrepen, bevatten minder dan 0,1% natriumazide. Aanraking met huid en slijmvliezen
vermijden. Getroffen oppervlakken met ruime hoeveelheden water spoelen. Onmiddellijk
medische hulp inroepen bij opname van reagentia door de mond of contact met de
ogen. Natriumazide kan met loden of koperen afvoerleidingen reageren en potentieel
explosieve metaalaziden vormen. Bij het afvoeren van dergelijke reagentia altijd
met grote hoeveelheden water doorspoelen om ophoping van azide te voorkomen.
Blootgestelde metalen oppervlakken met natriumhydroxide 10% reinigen.
Bereiding en opslag van reagentia
Zie voor de bereiding van de oplossingen voor Hitachi analyzers de instructies hieronder.
Zie voor alle andere analyzers het analyzerspecifieke toepassingsblad. Bereid de
volgende oplossingen met gebruik van gekoelde reagentia en buffers (2 à 8 °C). Neem
de kit onmiddellijk vóór de bereiding van de werkoplossingen uit de koelkast.
Bereid de oplossingen in de volgende volgorde om mogelijke verontreiniging te
minimaliseren.
R2-enzymdonoroplossing: Sluit flesje 2a (ED-reagens) aan op flesje 2 (EDreconstitutiebuffer)
met een van de inbegrepen adapters. Meng de inhoud door de
flesjes voorzichtig om te keren en zorg dat alle gevriesdroogde materiaal uit flesje 2a in
flesje 2 wordt overgebracht. Schuimvorming voorkomen. Maak flesje 2a en de adapter
los van flesje 2 en voer ze af. Zet de dop op flesje 2 en laat het ongeveer 5 minuten
bij kamertemperatuur (15 à 25 °C) staan. Nogmaals voorzichtig mengen. Noteer de
datum van reconstitutie op het etiket van het flesje. Plaats het flesje onmiddellijk in het
reagensvak van de analyzer of in de koelkast (2 à 8 °C) en laat het 15 minuten staan
vóór gebruik.
R1-enzymacceptoroplossing: Sluit flesje 1a (EA-reagens) aan op flesje 1 (EAreconstitutiebuffer)
met een van de inbegrepen adapters. Meng de inhoud door de
flesjes voorzichtig om te keren en zorg dat alle gevriesdroogde materiaal uit flesje 1a
in flesje 1 wordt overgebracht. Schuimvorming voorkomen. Maak flesje 1a los van de
adapter en voer het flesje af. Zet de dop op flesje 1 en laat het ongeveer 5 minuten
bij kamertemperatuur (15 à 25 °C) staan. Nogmaals voorzichtig mengen. Noteer de
datum van reconstitutie op het etiket van het flesje. Plaats het flesje onmiddellijk in het
reagensvak van de analyzer of in de koelkast (2 à 8 °C) en laat het 15 minuten staan
vóór gebruik.
Extractieoplossing: Voeg precies 10 ml extractiereagens op kamertemperatuur toe
aan een schoon, droog, luchtdicht flesje. Voeg precies 40 ml methanol van HPLCkwaliteit
(≥ 99,8% zuiverheid) aan het flesje toe. Voorzichtig mengen. Vermeld op
het etiket ‘Tacrolimus-werkextractieoplossing’. Noteer de huidige datum en de
uiterste gebruiksdatum (2 weken na de fabricagedatum) op het etiket. Bewaren bij
kamertemperatuur.
Opmerking 1: De in deze kit geleverde componenten zijn bestemd om als één geheel
te worden gebruikt. Gebruik geen componenten van verschillende kitbatches van de
CEDIA tacrolimusassay of andere CEDIA kits door elkaar.
Opmerking 2: Vermijd kruisverontreiniging van de reagentia door de reagensdoppen
op de overeenstemmende reagensflesjes te zetten. De R2-oplossing (ED-reagens)
moet geeloranje van kleur zijn. Een rode of paarsrode kleur duidt erop dat het reagens
verontreinigd is en moet worden afgevoerd.
Opmerking 3: Laat de R1- en R2-oplossingen op de opslagtemperatuur van het reagensvak
van de analyzer komen alvorens de assay uit te voeren. Zie het analyzerspecifieke
toepassingsblad voor aanvullende informatie.
Opmerking 4: Bereid de R2-oplossing alvorens de R1-oplossing te bereiden.
Opmerking 5: Om de stabiliteit van gereconstitueerd EA-reagens te waarborgen, moet
het tegen langdurige continue blootstelling aan fel licht worden beschermd.
Bewaar de componenten als volgt op de juiste temperatuur. NIET INVRIEZEN. Zie de
doos of de etiketten op de flesjes voor de uiterste gebruiksdatum om de stabiliteit van
de ongeopende componenten te controleren.
R1-oplossing: 60 dagen gekoeld op analyzer of bij 2 à 8 °C.
R2-oplossing: 60 dagen gekoeld op analyzer of bij 2 à 8 °C.
Extractieoplossing: 2 weken bij kamertemperatuur (15 à 25 °C).
Monsters afnemen en hanteren
Met EDTA behandeld vol bloed gebruiken. Let erop dat het monster intact wordt
bewaard, vanaf het moment dat het wordt afgenomen tot het moment dat de assay
wordt uitgevoerd. Monsters moeten worden voorzien van een etiket met het tijdstip
van bloedafname en het tijdstip van de laatste toediening van het geneesmiddel. De
monsters moeten van een dop worden voorzien en de assay moet worden uitgevoerd
binnen 7 dagen als de monsters bij 2 à 8 °C worden bewaard of binnen 2 maanden als
de monsters bij ≤ -70 °C worden bewaard. 6, 10-11 Herhaaldelijk invriezen en ontdooien
vermijden. Geen schuim in de monsters opwekken.

Monsters bereiden
Opmerking: Volg de leverancierspecifieke instructies en aanbevelingen voor kalibrators
en controles op de bijsluiter, indien inbegrepen.
1. Laat kalibrators, controles, en patiëntenmonsters op kamertemperatuur komen.
2. Meng de monsters (kalibrators, controles of patiëntenmonsters) goed door ze 15
à 20 minuten heen en weer te schudden.
Monsterextractie
Opmerking: Voordat u de patiëntresultaten met gebruik van de CEDIA tacrolimusassay
produceert en verstrekt moet u zich vertrouwd maken met de extractieprocedure en
controleren of de extractieoplossing niet is verstreken, dat wil zeggen, de oplossing
wordt gebruikt binnen 2 weken na het constitueren.
1. Pipetteer precies 200 µl monster in een microcentrifugebuisje met ronde bodem.
2. Pipetteer precies 200 µl extractieoplossing in het microcentrifugebuisje.
3. Onmiddellijk 15 à 20 seconden vortexen met maximale snelheid.
4. Laat het microcentrifugebuisje 5 à 7 minuten staan bij kamertemperatuur.
5. Vijf minuten in een microcentrifuge bij 13.000 tpm (ongeveer 15.000-16.000 x g)
centrifugeren.
6. Giet het supernatant uit in een monstercupje en voer de meting onmiddellijk uit.
Opmerking: Hitachi analyzers
Als de analyzer de barcode niet afleest, kan de cijferreeks op het barcode-etiket via
het toetsenbord handmatig worden ingevoerd.
De CEDIA tacrolimusassay is bestemd voor gebruik op geautomatiseerde analyzers.
Toepassingsspecifieke prestatiegegevens zijn beschikbaar bij Microgenics Corporation. 17
Assayprocedure
Kalibratie
De CEDIA tacrolimusassay produceert een lineaire standaardcurve met gebruik van
de juiste CEDIA tacrolimuskitkalibrators. Valideer alvorens patiëntenmonsters met
de assay te analyseren, de assaykalibratie door commerciële controle(s) met vaste
terugvindingsbereiken voor de CEDIA tacrolimusassay te testen.
Opmerking: Elke kalibratorkit bevat kaarten met toegewezen waarden voor de kalibrator.
Controleer alvorens een nieuwe kalibratorkit te gebruiken uw chemische parameters om
u ervan te verzekeren dat de kalibratorconcentraties overeenkomen met de toegewezen
waarden op de kaart.
Kalibratiefrequentie
Nieuwe kalibratie wordt aanbevolen
• na verwisselen van reagensflesje
• na verwisselen van kalibrator- of reagens(kit)batch
• na maandelijks onderhoud van instrumenten
• al naargelang nodig volgens kwaliteitscontroleprocedures
Meetbereik
Het meetbereik voor de CEDIA tacrolimusassay is 2,0 ng/ml tot 30 ng/ml tacrolimus.
De minimale detecteerbare tacrolimusconcentratie in vol bloed voor de CEDIA
tacrolimusassay is 2,0 ng/ml.
Monsters buiten bereik
Monsters met een kwantitatieve bepaling > 30 ng/ml tacrolimus kunnen worden gemeten
als een tacrolimusconcentratie > 30 ng/ml of worden verdund (één deel oorspronkelijk
monster met één deel lage kalibrator) en opnieuw met de assay worden geanalyseerd.
De waarde die bij de opnieuw uitgevoerde assay wordt verkregen, moet als volgt
worden afgeleid:
werkelijke waarde = 2 x verdunde waarde
Monsters met een resultaat onder de minimale detecteerbare concentratie van de assay
moeten worden gemeten als < 2,0 ng/ml tacrolimus.
Kwaliteitscontrole en kalibratie
Elk laboratorium moet zijn eigen controlefrequentie bepalen. Volgens goede
laboratoriumpraktijken is het raadzaam ten minste twee niveaus (d.w.z. lage en hoge
medische beslissingspunten) kwaliteitscontrole te testen elke dag dat patiëntenmonsters
met de assay worden geanalyseerd en elke keer dat een kalibratie wordt uitgevoerd.
Controleer de controlewaarden op eventuele trends of verschuivingen. Als trends of
verschuivingen worden gedetecteerd of als de controle niet wordt teruggevonden
binnen het gespecificeerde bereik, neem dan alle operationele parameters door. Neem
contact op met de technische ondersteuning van Microgenics voor verdere assistentie
en aanbevelingen over geschikt controlemateriaal.
Opmerking: Bepaal na verwisseling van de reagens(kit)batch de controledoelen en -bereiken
opnieuw.
Resultaten en verwachte waarden
Zie de juiste gebruiksaanwijzing of het juiste analyzerspecifieke protocol voor informatie
over de gedetailleerde berekening.
Beperkingen – endogene stoffen
Er zijn geen prestatiekenmerken voor de CEDIA tacrolimusassay vastgesteld voor andere
lichaamsvloeistoffen dan menselijk vol bloed met EDTA.
2
Acceptatiecriteria: De prestaties worden aanvaardbaar geacht wanneer de terugvinding
±1,5 ng/ml tacrolimus is bij initiële concentraties < 10 ng/ml tacrolimus of ±10% van
initiële concentraties > 10 ng/ml tacrolimus.
Geelzucht: Geen significante interferentie door ongeconjugeerd bilirubine tot een
concentratie van maximaal 60 mg/dl.
Lipemie: Geen significante interferentie door triglyceriden tot een concentratie van
maximaal 1500 mg/dl en door cholesterol tot maximaal 500 mg/dl.
Totaal eiwit: Geen significante interferentie door albumine tot een concentratie van
maximaal 12 g/dl en door -globuline tot maximaal 12 g/dl.
Reumafactor: Geen significante interferentie door reumafactor tot een concentratie
van maximaal 573 IU/ml.
Hematocrietbereik: Er is geen significante interferentie wanneer het hematocriet tussen
15% en 60% bedraagt.
EDTA-concentratie: Te testen volbloedmonsters moeten worden afgenomen in EDTAbuisjes
(met lavendel stop). De EDTA-concentratie mag niet hoger zijn dan 4,5 mg/ ml;
monsters afgenomen in buisjes met lavendel stop moeten tenminste 1/3 van het
afnamebuisje beslaan zodat de EDTA-concentratie minder dan 4,5 mg/ml is. EDTAconcentraties
van meer dan 4,5 mg/ml kunnen een effect hebben op de kwantitatieve
bepaling.
De incidentie van patiënten met antilichamen tegen E. coli -galactosidase is uiterst
laag. Sommige monsters met dergelijke antilichamen kunnen echter verkeerdelijk hoge
tacrolimusconcentraties produceren, die onverenigbaar zijn met het klinische profiel van
de patiënt. Als u vermoedt dat dit het geval is, neem dan contact op met de technische
ondersteuning van Microgenics voor assistentie.
Zoals met elke assay die gebruikmaakt van muis-antilichamen bestaat de kans van
interferentie door humane antimuis-antilichamen (HAMA) in het monster. Het is mogelijk
dat monsters met dergelijke antilichamen verkeerdelijk hoge tacrolimusconcentraties
produceren, die onverenigbaar zijn met het klinische profiel van de patiënt. Als u
vermoedt dat dit het geval is, neem dan contact op met de technische ondersteuning
van Microgenics voor assistentie.
Beperkingen – effect van gelijktijdig toegediende geneesmiddelen op de
tacrolimusconcentratie
Tacrolimus wordt extensief gemetaboliseerd door het CYP3A4-iso-enzym in de darmen
en de lever. Daarom kunnen de absorptie en de daaropvolgende eliminatie van de
systemisch geabsorbeerde tacrolimus worden beïnvloed door geneesmiddelen die een
effect op dit iso-enzym hebben. CYP3A4-remmers kunnen het tacrolimusmetabolisme
verlagen en de tacrolimusconcentratie verhogen, terwijl CYP3A4-inductoren het
tacrolimusmetabolisme kunnen verhogen en de tacrolimusconcentratie kunnen
verlagen. Van de volgende geneesmiddelen is bekend dat ze een effect hebben op de
tacrolimusconcentratie door de absorptie te verhogen en/of de klaring te verlagen.
Deze lijst is niet definitief. 7
Geneesmiddelen die de tacrolimusconcentratie kunnen verhogen, zijn onder meer:
Immunosuppressiva: ciclosporine
Calciumkanaalblokkers: diltiazem, nicardipine, verapamil, nifedipine
Antischimmelmiddelen: clotrimazol, fluconazol, ketoconazol, itraconazol
Macrolide antibiotica: claritromycine, erytromycine, troleandomycine
Gastro-intestinale prokinetische middelen: cisapride, metoclopramide
Overige: bromocriptine, cimetidine, danazol, HIV-proteaseremmers (zoals ritonavir,
indinavir), ethinylestradiol, methylprednisolon, omeprazol, nefazodon
Geneesmiddelen die de tacrolimusconcentratie kunnen verlagen, zijn onder meer:
Anti-epileptica: carbamazepine, fenobarbital, fenytoïne
Antibiotica: rifampicine, rifabutine
Kruidenpreparaten:: Sint-Janskruid
Beperkingen – verschillen en variatie tussen assays
Verschillende immunoassays kunnen variabele resultaten voor hetzelfde monster
opleveren als gevolg van assayspecifieke variaties in de kruisreactiviteit van
metabolieten. Patiënten met verminderde klaring vertonen wellicht de meeste variatie.
Voor deze patiënten kan het gebruik van deze assay worden ondersteund met een
chromatografische methode die meer specifiek is voor de stamverbinding. Gezien de
potentiële spreiding over de vergelijking van de CEDIA tacrolimusassay en LC/MS voor
de detectie van tacrolimus in vol bloed, is het belangrijk dat elk laboratorium zijn eigen
therapeutische bereik vaststelt.
Verwachte waarden
Het aanbevolen bereik van de tacrolimusconcentratie in vol bloed voor het
effectieve postoperatieve management van patiënten met een allogeen nier- en/of
levertransplantaat, is 5 ng/ml tot 20 ng/ml met gebruik van LC/MS. 11-14 Het optimale
therapeutische bereik voor tacrolimus in vol bloed is niet vastgesteld met deze assay.
De medische toestand van de patiënt nu en in het verleden, de individuele verschillen
in gevoeligheid voor de immunosuppressiva en toxische effecten van tacrolimus, de
gelijktijdige toediening van andere immunosuppressiva, de tijd na de transplantatie
en een aantal andere factoren kunnen ertoe leiden dat de vereiste optimale
tacrolimusconcentratie in het bloed varieert. Individuele tacrolimusconcentraties
mogen niet worden gebruikt als enig criterium voor het maken van veranderingen
in een behandelschema. Gezien de heterogeniteit van de klinische toestand van
de patiënt moeten artsen een beoogd therapeutisch managementbereik bepalen
op basis van hun eigen ervaring en de klinische eisen van elke patiënt. Daarnaast
kan de tacrolimusconcentratie variëren naar gelang de gebruikte methode.
Omrekeningsfactoren mogen niet worden gebruikt om waarden voor individuele
patiënten te voorspellen voor de ene methode met gebruik van het resultaat van
een tweede methode. Bovendien moet de tacrolimusconcentratie voor individuele
patiënten worden bepaald met gebruik van een enkele, consistente methode om

verstorende effecten in verband met kruisreactiviteit en herkenning van metabolieten
te minimaliseren.
Specifieke prestatiekenmerken
De typische prestatiegegevens die voor de CEDIA tacrolimusassay zijn verkregen, staan
hieronder. 17 Tenzij anders vermeld zijn alle assays uitgevoerd in overeenstemming
met de hierin verstrekte assayprocedure met gebruik van de Hitachi 917 analyzer.
In individuele laboratoria verkregen resultaten kunnen afwijken van deze gegevens.
Zie voor aanvullende analyzerspecifieke prestatiegegevens het analyzerspecifieke
toepassingsprotocol of bel de technische ondersteuning van Microgenics voor
assistentie.
Precisie
Studies van de intra- en interassayprecisie (reproduceerbaarheidsonderzoek) zijn
uitgevoerd met gebruik van volbloedpatiëntenmonsters en gespikete monsters.
Resultaten voor intra-assay- en totale assayprecisie (bepaald door 21 individuele runs
in 11 dagen, zoals beschreven in een NCCLS-gemodificeerd replicatie-experiment,
EP5-A) zijn als volgt:
Intra-assay- en totale assayprecisie (reproduceerbaarheid)
Intra Totaal
Monster n Gem SD VC% SD VC%
Patiënt 1 126 6,30 0,43 6,80 0,49 7,80
Patiënt 2 126 9,23 0,43 4,68 0,56 6,06
Patiënt 3 126 15,18 0,47 3,12 0,65 4,26
Spike 1 126 5,33 0,32 5,97 0,48 8,90
Spike 2 126 10,54 0,35 3,28 0,49 4,69
Spike 3 126 21,01 0,43 2,04 0,72 3,40
Lineariteit
Voor het bepalen van assaylineariteit is een volbloedmonster gespiket met hoge
tacrolimus verdund met een tacrolimusvrij bloedmonster om een reeks monsters over
het dynamische bereik van de assay te verkrijgen. Het terugvindingspercentage is
bepaald door de waargenomen tacrolimusconcentratie door de verwachte concentratie
te delen. De verwachte concentraties zijn bepaald door de geteste hoge concentratie
te vermenigvuldigen met een verdunningsfactor.
Terugvinding
% hoog
monster
100
80
60
40
20 0
Verwachte
waarde
(ng/ml)
28,9
23,1
17,3
11,5
5,8
0,0
Waargenomen
waarde
(ng/ml)
28,9
23,9
18,1
12,4
6,1
0,0
Terugvinding
(%)
100,0
103,4
104,7
107,7
106,2
--
Om de terugvinding van de CEDIA tacrolimusassay te bepalen, is tacrolimus
toegevoegd aan normale, tacrolimusvrije volbloedmonsters en aan patiëntenmonsters
met tacrolimus. Er zijn duplicaten van elk monster met de assay geanalyseerd. Het
terugvindingspercentage is bepaald door de waargenomen dosis van elk monster
te delen door de verwachte concentratie van toegevoegd tacrolimus plus het
oorspronkelijke in de monsters aanwezig tacrolimus.
Monster A
Monster B
Monster C
Monster D
Specificiteit
n
20
20
20
20
Verwachte
waarde
(ng/ml)
5,0
10,0
15,0
25,0
Waargenomen
waarde
(ng/ml)
5,1
9,6
15,8
25,3
Terugvinding
(%)
101,0
96,5
105,2
101,2
Monsters met tacrolimusmetabolieten zijn toegevoegd aan volbloedmonsters met
ongeveer 12 ng/ml tacrolimus. Monsters zijn getest door de assay en de resultaten zijn
vergeleken met een metabolietvrije controle. De kruisreactiviteit van de metabolieten
is berekend volgens de formule:
gemeten concentratie - controleconcentratie
toegevoegde metabolietconcentratie
x 100%
3
De resultaten staan in de tabel hieronder.
Kruisreactiviteit met tacrolimusmetabolieten
Verwachte
Tacrolimusmetabolieten conc
(ng/ml)
M-1, 13-O-demethyl
20
M-2, 31-O-demethyl
20
M-3, 15-O-demethyl
20
M-4, 12-hydroxyl
NB
M-5, 15,31-O-didemethyl NB
M-6,13,31-O-didemethyl 20
ND – niet detecteerbaar
NB – materiaal niet beschikbaar
Waargenomen
conc
(ng/ml)
7,5
0,9
0,9
NB
NB
0,6
Kruisreactiviteit
(%)
37,7
ND
ND
NB
NB
ND
Tegelijk toegediende immunosuppressiva zijn toegevoegd aan volbloedmonsters met
ongeveer 15 ng/ml tacrolimus en getest op kruisreactiviteit. De resultaten staan in de
tabel hieronder.
nr.
1
2
3
4
5
6
Tegelijk toegediende
immunosuppressiva
Ciclosporine
Sirolimus
Mycofenolzuur
Prednison
Hydrocortisol
Prednisolon
Geteste
concentratie
(ng/ml)
10.000
30
100.000
100.000
100.000
100.000
Kruisreactiviteit
(%)
De volgende verbindingen zijn toegevoegd aan tacrolimusvrije volbloedmonsters en
geanalyseerd op kruisreactiviteit met gebruik van de CEDIA tacrolimusassay. Zoals
uit de onderstaande tabel blijkt, is er geen kruisreactiviteit waargenomen voor alle
verbindingen bij de geteste concentratie.
Kruisreactiviteit met gewone geneesmiddelen
Verbinding
Acykloguanosin
Amikacin
Ampicillin
Atenolol
Azatioprin
Cimetidin
Digitoksin
Digoksin
Disopyramid
Erytromycin
Fenobarbitol
Fenytoin
Flukonazol
Furosemid
Ganciklovir
Gentamicin
Hydroklortiazid
Ibuprofen
Itrakonazol
Kanamycin A
Kanamycin B
Karbamazepin
Ketokonazol
Kinidin
Kloramfenikol
Lidokain
Metoklopramid
Metylprednisolon
Morfinsulfat
MPA-glukuronid
N-acetylprokainam
Naproksen
Nifedipin
Paracetamol
Penicillin
Prazosin
Primidon
Prokainamid
Propanolol
Rifampcin
Salisylsyre
Spektinomycin
Streptomycinsulfat
Teofyllin
Tobramycin
Triametren
Valproatsyre
Vankomycin
Varapamil
Geteste
concentratie
(ng/ml)
100 000
100 000
100 000
40 000
100 000
100 000
10 000
10 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
40 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
40 000
60 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
100 000
Gemeten
concentratie
(ng/ml)
-0,5
0,8
0,8
-0,6
0,6
0,1
-0,2
0,0
0,7
0,3
-2,0
-2,1
0,6
-0,6
-0,4
0,1
-0,5
-0,6
0,0
0,1
-0,1
0,6
-0,2
0,0
0,4
0,3
0,0
-0,8
-0,6
-1,3
-1,5
0,7
-0,2
0,8
-1,6
0,1
-0,3
0,2
0,2
-0,7
-1,2
-1,3
-0,5
-1,2
-2,2
-1,4
-2,0
-2,0
-1,7
0,0
0,7
0,0
0,0
0,0
0,0
Kruisreactiviteit
(%)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00

Gevoeligheid
De functionele gevoeligheid voor de CEDIA tacrolimusassay is 2,0 ng/ml en is bepaald
als de concentratie van de analyt met een variatiecoëfficiënt van ongeveer 20%.
Vergelijking van methoden
Een vergelijking is uitgevoerd tussen de CEDIA tacrolimusassay (y) LC-MS/MS en MEIA.
Deze vergelijking van methoden is uitgevoerd met monsters (concentratiebereik van
0 tot 30 ng/ ml tacrolimus) verkregen uit patiënten met een lever- en/of niertransplantaat.
CEDIA
vs.
LC-MS/
MS
LC-MS/
MS
LC-MS/
MS
Type
transplantaat
n Helling Intercept Correlatie (r)
Nier en lever 187 1,190 0,70 0,9643
Nier 118 1,157 1,01 0,9777
Lever 69 1,193 1,04 0,9616
MEIA Lever 50 0,945 0,28 0,8228
Literatuur
1. Kino T, Hatanaka H, Myata S, et al. FK506, a novel immunosuppressant isolated from
a streptomyces II. Immunosuppressive effect of FK506 in vitro. J Antibiotics 1987;
40:1256-1265.
2. Bierer BE, Jin YJ, Fruman DA, et al. FK506 and rapamycin: molecular probes of
T-lymphocyte activation. Transplant Proc 1991;23:2850-2855.
3. Schreiber SL. Chemistry and biology of the immunophilins and their
immunosuppressive ligands. Science 1991;251:283-287.
4. Thomson AW, Bonham CA, and Zeevi A. Mode of action of tacrolimus (FK506): molecular
and cellular mechanisms. Ther Drug Monit 1995;17:584-591.
5. Griffith JP, Kim JL, Kum EE, et al. X-ray structure of calcineurin inhibited by the
immunophilin-immunosuppressant FKBP12-FK506 complex. Cell 1995;82:507-522.
6. Jusko WJ, Thomson AW, Fung W, et al. Consensus document; therapeutic monitoring
of tacrolimus (FK506). Ther Drug Monit 1995;17:606-614.
7. Physicians’ Desk Reference,58th ed. Thomson PDR at Montvale, NJ. 2004; Prograf ® :
1323-1327.
8. Lhoest GJJ, Maton N, Latinne D, et al. 15-demethyl FK506 and 15,
31-demethyl FK506 from human liver microsomes: isolation, identification (by
fast bombardment mass spectrometry and NMR), and evaluation of in vitro
immunosuppressive activity. Clin chem. 1994:50:740-744.
9. Gonschior AK, Christians U, Winkler M, et al. Tacrolimus (FK506)
metabolite patterns in blood from liver and kidney transplant patients.
Clin Chem. 1996;42:1426-1432.
10. Alak AM. Measurement of tacrolimus (FK506) and its metabolites: a review of assay
development and application in therapeutic drug monitoring and pharmacokinetic
studies. Ther Drug Monit.
1997;19:338-352.
11. Jusko WJ. Analysis of tacrolimus (FK506) in relation to therapeutic drug monitoring.
Ther Drug Monit. 1995:17:596-601.
12. Busuttil RW, Klintmalm GB, Lake JR, et al. General guidelines for the use of tacrolimus
in adult liver transplant patients. Transplantation 1996;61:845-847.
13. van Hooff JP, Boots JM, van Duijnhoven EM, et al. Dosing and management guidelines
for tacrolimus in renal transplant patients. Transplant Proc. 1999;31:54S-57S.
14. Oellerich M, Armstrong VW, Schutz E, and Shaw LM. Therapeutic drug monitoring
of cyclosporine and tarcolimus. Clin Biochem.
1998;31:309-316.
15. Staatz CE, Willis C, Taylor PJ, and Tett SE. Population pharmacokinetics of tacrolimus
in adult kidney transplant recipients. Clin Pharmacology & Ther. 2002;72:660-669.
16. Henderson DR, Friedman SB, Harris JD, et al. CEDIA, a new homogeneous
immunoassay system. Clin chem.. 1986;32:1637-1641.
17. Data on file at Microgenics Corporation.
4
Fabrikant:
Microgenics Corporation
46360 Fremont Blvd.
Fremont, CA 94538-6406, VS
Gratis is de VS: 800-626-0690
Andere landen:
Neem contact op met uw lokale vertegenwoordiger van Microgenics.
Gemachtigde vertegenwoordiger
in de EU:
Microgenics GmbH
Spitalhofstrasse 94
D-94032 Passau, Duitsland
Tel.: +49 (0) 851 886 89 0
FAX: +49 (0) 851 886 89 10
CEDIA is een gedeponeerd handelsmerk van Roche Diagnostics. 10008692-2_NL