Elisa Maria Guimarães de Souza CARACTERIZAÇÃO DOS ... - UFF

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROCIÊNCIAS
Elisa Maria Guimarães de Souza
CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS DOS
RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO
NO SISTEMA GABAÉRGICO AO LONGO DO
DESENVOLVIMENTO DA RETINA DE PINTO
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL
FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM NEUROCIÊNCIAS
Orientadora: Profa. Dra. Karin da Costa Calaza
NITERÓI
2010
i

Elisa Maria Guimarães de Souza
CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS DOS
RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO
NO SISTEMA GABAÉRGICO AO LONGO DO
DESENVOLVIMENTO DA RETINA DE PINTO
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Neurobiologia da Retina do
Departamento de Neurobiologia, Instituto de Biologia, UFF.
Dissertação de Mestrado submetida ao
Programa de Pós-Graduação em
Neurociências da Universidade
Federal Fluminense como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Neurociências.
Área de concentração: Ciências
Biológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Karin da Costa Calaza
NITERÓI
2010
ii

GUIMARÃES-SOUZA, Elisa Maria
– Niterói: UFF, 2010.
98 f.
Dissertação – Mestrado em Neurociências
Universidade Federal Fluminense
1. retina 2. GABA 3. receptor metabotrópico de glutamato
4. liberação de neurotransmissor
iii

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Neurobiologia da Retina, do
Programa de Pós-Graduação em Neurociências, do Instituto de Biologia da
Universidade Federal Fluminense, sob a orientação da Professora Dr. Karin da
Costa Calaza e na vigência dos auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), pela Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Programa de Apoio
aos Núcleos de Excelência (PRONEX/MCT) e pela Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-
Graduação e Inovação da Universidade Federal Fluminense (PROPPi/UFF).
iv

AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ser um mistério e ser a vida que desvendamos.
Agradeço a meus pais, José e Laïs, por serem simplesmente fonte de
tudo: amor, esperança, ensinamentos, exemplos, e por toda a dedicação para com
este ser imperfeito, incompleto e incrivelmente chato que sou eu.
Obrigada, vovô e vovó, por ajudarem nos primeiros passos.
Renata, você é minha melhor amiga, e a pessoa mais verdadeira que eu
conheço. Flávio, você é muito importante na minha vida. Obrigada por existirem e
tornarem minha vida mais feliz.
Agradeço aos professores do Guido por terem me proporcionado o gosto
pelo estudo. Em especial, agradeço ao professor Ivan, que repetidamente deu lições
valiosas do que é ser um professor, com sua dedicação e empenho. Na época do
vestibular, em que me convidava para sua casa e dava aulas extras de Química de
três, quatro horas, várias e várias vezes, sem cobrar um tostão.
Agradeço à professora Mônica, de inglês, por dado o melhor de si (e faz
uma diferença absurda esse inglês), e por ter sido uma amiga quando eu precisei de
uma.
Obrigada a todos os meus colegas de faculdade. Todos eles, cada um
com suas características, ajudaram a tornar o tempo de faculdade inesquecível e
muito, muito engraçado. Particularmente, agradeço às “Camponesas de Nobre
Coração”, Tati, Lissa, Ana Flávia, Mariana, Carolina e Gisella. Vale falar também dos
meus calouros mais queridos: Sarah, Bruna, Felipe e Dan. Sou muito feliz por ter
conhecido todos vocês.
Finalmente, agradeço aos companheiros de laboratório, as pessoas que
vejo todos os dias e implico cada vez mais: Professores Roberto, Mariana, e
Marcelo, Cristiane, Alexandre, Renato, Camila, Eliza Lelé, Thaísa, Ivan, Felipe,
Sarah e Luzeli. Também aos antigos dos laboratórios, Daniel, Luciane.
Agradeço aos professores de todo o departamento pela paciência e por
toda a ajuda: Claudio Serfaty, Adriana Melibeu, Elizabeth Giestal, Paula Campello,
Suellen Marques e Priscilla Oliveira. Agradeço em especial à professora Lucianne
Fragel, por ter feito uma revisão muito cuidadosa e criteriosa, que melhorou muito o
trabalho, e à professora Ana Ventura, que ajudou muito com a dosagem de
glutamato.
Obrigada também aos professores Patrícia Gardino e Fernando Mello, por
todo o apoio que dão às nossas idéias.
Agora, uma parte mais detalhada, para as pessoas mais envolvidas neste
pedacinho da minha vida que foi o mestrado: os Karinérgicos (alunos da Karin, para
quem não está familiarizado com o termo).
Raquel, você é uma pessoa maravilhosa. Está sempre ajudando,
v

conversando, especulando, indo lanchar comigo (e me xingando também, às vezes).
Você se tornou uma amiga muito valiosa. Muito obrigada por me deixar ser a
primeira banca da sua vida (na monografia), e por ser a única que ri
exacerbadamente das minhas piadas sem graça. Meu coração se enche de alegria
quando você está perto! Só vê se “mente” e “chora” menos, ok? Nesse ritmo, vai
virar um salgueiro chorão (essa é a parte que você não entende e ri mesmo assim)!
Vívian, eu estou escrevendo esses agradecimentos no dia do seu
aniversário deste ano, e estou propositalmente “esquecendo” de te dar parabéns
hoje, porque amanhã faremos um bolo-surpresa. Então, quando você ler isto,
lembre-se deste dia, e saiba que você é uma pessoa muito querida mesmo para
mim! É a minha amiga japonesa favorita, que tem muitas histórias que eu adoro
ouvir, e que está sempre disposta a ajudar. Domo arigato, Vivi-chan! Sempre que
cair uma melancia na sua vida, me dá que eu como!
Rafael, antes de tudo, você é “meu amigoooooooooo”! Você é um cara
muito legal, cheio de garra, fibra, e totalmente desprovido de vergonha (no sentido
de ser capaz de fazer perguntas a grandes personalidades científicas, não se
zangue, hehe). Admiro muito todo o seu esforço e seu interesse, e espero que
sigamos juntos por todo o doutorado, como fizemos na iniciação científica e no
Mestrado. Sério, só tem três coisas que eu queria de você: 1) renovação do
repertório de músicas cantadas; 2) uma chance para o “Lost”; 3) mil e quinhentas
lâminas gelatinizadas por você especialmente para mim no dia de Natal. Hahaha, a
3 é pegadinha, tá? Não chora! Boa sorte com as arrecadações do EPA (Escola para
o Progresso da Adenosina).
Raul, Havana e Daniel, os mais novos Karinérgicos: vocês são muito
esforçados e queridos. Contem comigo para o que precisarem!
Por último, agradeço à poderosa chefona Karin. Escolhi você como
orientadora por sua dedicação e empenho nas aulas, quando você me deu aula no
segundo período. Faz cinco anos que trabalhamos juntas, e não sei se eu saberia ou
conseguiria trabalhar com outra pessoa, tão capacitada, equilibrada e interessada
como você. Acho que de tanto você esperar o melhor de todos nós, no fim,
conseguimos fazer trabalhos incríveis! Muito obrigada por me aturar todos esses
anos, e espero não enlouquecer você no doutorado.
vi

RESUMO
Glutamato e GABA são, respectivamente, os principais
neurotransmissores excitatórios e inibitórios da retina, participando das vias através
das quais a retina processa a informação luminosa. Receptores metabotrópicos de
glutamato de todos os três grupos estão presentes na retina e podem ser detectados
em corpos celulares e contatos sinápticos de células amácrinas. Já foi mostrado que
o glutamato induz a liberação de GABA de células amácrinas pela ativação de
receptores ionotrópicos de glutamato na retina de pinto de E14 a PE. Então,
decidimos verificar os efeitos causados pela ativação de receptores metabotrópicos
de glutamato no sistema GABAérgico em três estágios do desenvolvimento e no
animal pós-eclosão. Em E14 e E16, não encontramos efeitos induzidos por
receptores metabotrópicos de glutamato no número de células amácrinas GABApositivas.
No entanto, o tratamento de retinas de animais E18 e PE com o agonista
dos grupos I e II, trans-ACPD, promoveu uma diminuição de cerca de 40% no
número de células GABA-positivas em relação ao controle, efeito que foi impedido
por antagonistas de ambos os grupos, enquanto o L-SOP, agonista do grupo III,
promoveu um efeito similar, que foi prevenido por seu antagonista. Os efeitos de
trans-ACPD e L-SOP também foram inibidos com o bloqueio de GAT-1, um
transportador de GABA expresso em células amácrinas. O bloqueio de receptores
ionotrópicos de glutamato de ambos os tipos inibiu fortemente a diminuição do
número de células GABA-positivas. A fim de avaliar a possibilidade de que a
ativação de receptores metabotrópicos de glutamato estaria produzindo um aumento
da liberação de glutamato, verificamos que os níveis de glutamato extracelular
encontrados no meio de incubação das retinas tratadas com trans-ACPD eram 65%
maiores do que retinas controle, efeito este que era inibido pela ausência de cálcio,
mas não verificamos o mesmo efeito com L-SOP. Desta forma,, reportamos que, na
retina de pinto em desenvolvimento, receptores metabotrópicos de glutamato estão
envolvidos na circuitaria GABAérgica.
vii

ABSTRACT
Glutamate and GABA are, respectively, the major excitatory and inhibitory
transmitter molecules in the retina, participating in the two pathways through which
the retina processes light information. Metabotropic glutamate receptors of all three
groups are present in the retina, and can be detected in amacrine cell bodies and
synaptic contacts. Glutamate has been shown to induce GABA release from
amacrine cells by activating ionotropic glutamate receptors in the chicken retina.
Thus, we verified the effect caused by the activation of metabotropic glutamate
receptors on GABA release from these cells in three developmental stages and in the
post-hatch animal. In E14 and E16, we were not able to find an effect induced by
metabotropic glutamate receptors agonists in GABA-positive amacrine cell number.
However, we did find effects in ages E18 and post-hatch animal. Group I/II agonist
trans-ACPD promoted a 40% decrease in the number of GABA-positive cells in
relation to the control, effect that was prevented by antagonists of both groups, while
L-SOP, group III agonist, promoted a similar release, which was prevented by its
antagonist. Also, we could inhibit trans-ACPD and L-SOP effects by blocking GAT-1,
a GABA transporter expressed in amacrine cells. We found that blocking ionotropic
glutamate receptors of both types could strongly inhibit the decrease in GABApositive
cells. Evaluating the possibility that the activation of metabotropic glutamate
receptors would be yielding enhanced glutamate release, we discovered that
extracellular glutamate levels found in bath solutions were about 65% higher in trans-
ACPD treated than in control retinas, effect that was blocked by calcium absence, but
we could not detect such an effect with L-SOP treatment. Therefore, we report that,
in the chicken retina, metabotropic glutamate receptors are present, functional, and
are involved in the GABAergic circuitry.
viii

6-OHDA 6-hidroxidopamina
LISTA DE ABREVIATURAS
AAT Aspartato aminotransferase
ABC Avidina-biotina peroxidase
AIDA Ácido 1-aminoindan-1,5-dicarboxílico
AMPA amino-5-metil-4-isoxalona propionato
AMPc Adenosina monofosfatada cíclica
ATP Trifosfato de adenosina
BSA Albumina sérica bovina
Ca 2+ Cálcio
CaMKII Cinase dependente de cálcio/calmodulina do tipo II
CCG Camada de células ganglionares
Cl - Íon cloreto
CNE Camada nuclear externa
CNI Camada nuclear interna
CPE Camada plexiforme externa
CPI Camada plexiforme interna
DNQX 6,7-Dinitroquinoxalina-2,3(1H-4H)-diona
EAAT Transportador de aminoácidos excitatórios
ERK Cinase regulada por sinais extracelulares
EX Embrião com X dias de desenvolvimento
GABA Ácido γ-aminobutírico
GABA+ (Células) GABA-positivas
GABA-T GABA-transaminase
GABAX
Receptor de GABA do tipo X
ix

GAD Descarboxilase do ácido glutâmico
GAT Transportador de GABA
GDH Desidrogenase do ácido glutâmico
GMPc Guanosina monofosfatada cíclica
GS Glutamina sintetase
H + Hidrogênio/próton
iGluR Receptor ionotrópico de glutamato
IP3 Inositol trifosfato
K + Íon potássio
KA Cainato
LDH Lactato desidrogenase
L-SOP L-serina-O-fosfato
LTD Depressão de longo termo
LTP Potenciação de longo termo
MAP-4 Ácido (S)-2-amino-2-metil-4-fosfonobutanóico
MCCG (2S,3S,4S)-2-Metil-2-(carboxiciclopropil)glicina
Mg 2+ Íon magnésio
mGluR Receptor metabotrópico de glutamato
MK-801 / MK
Na + Íon sódio
(5R,2S)-(+)-5-Metil-10,11-diidro-5H-dibenzo[a,d]
ciclohepteno-5,10-imina hidrogênio maleato
NMDA N-metil-D-aspartato
NOSn Sintase do óxido nítrico neuronal
NO-711
hidrocloridrato de ácido (1-[2-[[(difenilmetileno)imino]oxi]etil] -
1,2,5,6-tetrahidro-3-piridinacarboxílico
PAC1 Receptor de PACAP do tipo 1
x

PACAP Peptídeo ativador da adenilato ciclase da pituitária
PAG Glutaminase ativada por fosfato
PBS Solução salina de tamponada com fosfato
PE Pós-eclosão
PI3K Cinase de inositol trifosfato
PKC Proteína cinase dependente de cálcio
PLC Fosfolipase C
PSD-95 Proteína de densidade pós-sináptica de 95kDa
PX Animal nascido a X dias
SNC Sistema Nervoso Central
T-ACPD / T Ácido 1-aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico
TBS Solução salina tamponada com Tris
TRPM
Canal de potencial receptor transitório (Transient Receptor
Potential Channel Melastin)
VGAT Transportador vesicular de GABA
VGLUT Transportador vesicular de glutamato
xi

LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 – Esquema ilustrando o ciclo glutamato-glutamina.................................. 16
Figura 2 – Representação gráfica do receptor NMDA........................................... 19
Tabela 1 – Apresentação dos subtipos de receptores metabotrópicos de
glutamato............................................................................................................
Figura 3 – Representação gráfica de um receptor metabotrópico de
glutamato................................................................................................................
Figura 4 – Esquema simplificado da reação através da qual o GABA é
sintetizado..............................................................................................................
Figura 5 – Esquema simplificando o processo de liberação de GABA por
transportador.......................................................................................................... 27 Sistema gluta
Figura 6 – Esquema da morfologia retiniana.......................................................... 30
Figura 7 – Esquema resumindo os períodos do desenvolvimento nos quais
ocorrem a geração de cada tipo celular da retina de pinto....................................
Figura 8 – Esquema mostrando o circuito de células horizontais e bipolares ON. 36
Figura 9 – Esquema demonstrando a função fisiológica das células amácrinas... 37
Figura 10 – Quadro ilustrando a localização dos mGluRs nas camadas da retina 39
Tabela 2 – Relação das drogas utilizadas nos experimentos................................ 44
Figura 11 – Efeito da ativação de mGluRI/II/III na retina de E14........................... 51
Figura 12 – Efeito da ativação de mGluRI/II/III na retina de E16........................... 52
Figura 13 – Efeito da ativação de mGluRI/II na retina de E18............................... 55
Figura 14 – Efeito da ativação de mGluRIII na retina de E18................................ 56
Figura 15 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com
agonista de mGluRI/II em E18...............................................................................
21
22
25
33
57
xii

Figura 16 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com
agonista de mGluRIII em E18................................................................................
Figura 17 – Efeito da ativação de mGluRI/II na retina de PE................................. 61
Figura 18 – Efeito da ativação de mGluRIII na retina de PE.................................. 62
Figura 19 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I, II e
III na liberação de LDH em PE...............................................................................
Figura 20 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I, II e
III na imunorreatividade nas sublâminas da CPI em PE........................................
Figura 21 – Efeito da inibição de GAT-1 no tratamento com agonista de mGluRI,
II e III em PE...........................................................................................................
Figura 22 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com
agonista de mGluRI/II em PE.................................................................................
Figura 23 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com
agonista de mGluRIII em PE..................................................................................
Figura 24 – Efeito da ausência de cálcio no tratamento com agonista de
mGluRI/II em PE.....................................................................................................
Figura 25 – Efeito de agonistas de mGluRI/II/III e da ausência de cálcio na
liberação de glutamato em PE...............................................................................
59
63
63
64
66
67
69
70
xiii

SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................ iv
RESUMO ........................................................................................................... vii
ABSTRACT........................................................................................................ viii
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ..................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 17
1.1- Sistema glutamatérgico ............................................................... 17
1.1.1. Metabolismo do glutamato ................................................ 17
1.1.2. Liberação e recaptação de glutamato .............................. 18
1.1.3. Receptores ionotrópicos de glutamato ............................. 19
1.1.4. Receptores metabotrópicos de glutamato ........................ 22
1.2- Sistema GABAérgico ................................................................... 27
1.2.1. Metabolismo do GABA ...................................................... 27
1.2.2. Liberação e recaptação de GABA .................................... 28
1.3- Retina ........................................................................................... 30
1.3.1. A retina de galinha e suas vantagens na
pesquisa.............................................................................
1.3.2. Organização morfológica e tipos celulares........................ 31
1.3.3. Desenvolvimento da retina de galinha............................... 33
1.3.4. Vias de processamento visual retiniano............................. 35
30
xiv

1.3.4.1. Via radial.................................................................... 35
1.3.4.2. Via lateral................................................................... 37
1.4- Receptores metabotrópicos de glutamato na retina ..................... 40
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 43
2.1- Objetivos gerais ........................................................................... 43
2.2- Objetivos específicos ................................................................... 43
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 44
3.1- Animais ........................................................................................ 44
3.2- Estimulação farmacológica do tecido retiniano intacto ................ 45
3.3- Crioproteção e secção em criostato ............................................ 46
3.4- Imunohistoquímica ....................................................................... 47
3.5- Ensaio de medição do glutamato liberado ................................... 48
3.6- Ensaio de liberação de LDH ........................................................ 49
3.7- Análise quantitativa e estatística ................................................. 50
4. RESULTADOS ............................................................................................. 51
4.1- Embrião com 14 dias de desenvolvimento .................................. 51
4.2- Embrião com 16 dias de desenvolvimento .................................. 51
4.3- Embrião com 18 dias de desenvolvimento ................................. 54
4.4- Animal pós-eclosão ..................................................................... 60
4.4.1. Efeito da ativação de mGluRs na imunorreatividade do
GABA ................................................................................
4.4.2. Influência do bloqueio do transportador de GABA (GAT-
60
xv

1) no efeito induzido por mGluRs...................................... 61
4.4.3. Influência do bloqueio dos receptores ionotrópicos de
glutamato no efeito induzido por mGluRs..........................
4.4.4. Liberação de glutamato induzida por ativação de
mGluRs .............................................................................
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 72
5.1- A liberação de GABA induzida por glutamato durante o
desenvolvimento ..........................................................................
5.2- A liberação de GABA induzida por glutamato no animal pós-
eclosão .........................................................................................
5.3- A liberação de glutamato induzida por mGluRs no animal pós-
eclosão .........................................................................................
5.4- Mecanismos de modulação da função de receptores.................... 78
5.5- Células amácrinas GABAérgicas e mGluRs ................................. 80
5.6- mGluRs, glutamato e GABA: neuroproteção ou injúria?.............. 81
6. CONCLUSÕES ........................................................................................... 84
7. PERSPECTIVAS ......................................................................................... 85
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 87
66
69
72
74
76
xvi

1. INTRODUÇÃO
1.1- Sistema glutamatérgico
1.1.1. Metabolismo do glutamato
Há muitos anos, o glutamato já era considerado importante para o
metabolismo geral do corpo humano, pois este neurotransmissor participa de
processos bioquímicos de oxidação para geração de energia, síntese de proteínas e
formação de diferentes compostos. Sua ação excitatória no sistema nervoso foi
descoberta por Hayashi em 1954, quando se verificou que a injeção de glutamato de
sódio no córtex motor de caninos e primatas provocava convulsão nesses animais
(Takeuchi, 1987). Desde então, o glutamato se tornou um dos neurotransmissores
mais estudados, e os mecanismos de muitos de seus efeitos celulares e moleculares
já foram elucidados. No sistema nervoso central (SNC), particularmente, atua como
o principal neurotransmissor excitatório, sendo o mediador químico de cerca de 80 a
90% das sinapses excitatórias cerebrais (McKenna, 2007).
O glutamato pode ser sintetizado de duas formas: a partir do α-
cetoglutarato (α-CG) do ciclo de Krebs, pela enzima desidrogenase do ácido
glutâmico (GDH); ou a partir da glutamina, pela enzima glutaminase ativada por
fosfato (PAG) (fig. 1). Normalmente, quando há excesso de glutamato extracelular,
as células gliais atuam no sentido de diminuir a excitabilidade e excitotoxicidade
produzida por glutamato. Para isso, estas células captam o glutamato e o utilizam
como substrato para a síntese de proteínas ou moléculas como a glutationa, que é
neuroprotetora. Nas células da glia, o glutamato também pode ser metabolizado a
glutamina, que pode ser liberada e captada pelo neurônio, representando uma nova
17

fonte para a síntese de glutamato (McKenna, 2007).
Figura 1 – Esquema ilustrando o ciclo glutamato-glutamina. Tanto no astrócito quanto no neurônio, o
glutamato pode ser sintetizado a partir do α-cetoglutarato (α-CG), proveniente do ciclo de Krebs. A
desidrogenase do ácido glutâmico (GDH) é a enzima responsável por catalisar esta reação. No
astrócito, o glutamato pode seguir quatro destinos diferentes: voltar para o ciclo de Krebs como αcetoglutarato,
reação catalisada pela própria GDH, ou pela aspartato aminotransferase (AAT); ser
utilizado para a síntese de glutationa; ser substrato para a síntese da glutamina pela glutamina
sintetase (GS); ou ser metabolizado para a formação de CO2 e H2O. O astrócito pode, ainda, liberar
glutamina, e esta, uma vez captada pelo neurônio, gerar novas moléculas de glutamato pela reação
catalizada pela enzima glutaminase ativada por fosfato (PAG) (Modificado de McKenna, 2007).
1.1.2. Liberação e transporte de glutamato
Em neurônios, após sua síntese, o glutamato é armazenado em vesículas
sinápticas através de transportadores vesiculares (VGLUTs), que fazem antiporte de
glutamato e H + . Os H + estão em maior concentração dentro da vesícula graças à
ação de uma bomba de próton que, através da energia da hidrólise de ATP,
18

transporta H + para dentro da vesícula, tornando-a mais ácida e positiva, favorecendo
o gradiente eletroquímico para a entrada do glutamato acoplada à saída de H +
(Liguz-Lecznar e Skangiel-Kramska, 2007).
Após sua liberação sináptica, a ação do glutamato consiste na ativação
de diversos tipos de receptores glutamatérgicos, que podem estar situados na
membrana de células pré ou pós-sinápticas. Estes receptores serão abordados
detalhadamente nas seções a seguir.
O término da ação do glutamato se dá pela sua recaptação através de
transportadores de glutamato na membrana plasmática. Existem dois tipos de
transportadores de glutamato: os dependentes de sódio e que também transportam
aspartato, conhecidos como transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs),
subdivididos em cinco tipos (EAAT1 a 5); e os independentes de sódio, como o
trocador cistina-glutamato (Xc-) (Gether et al., 2006).
1.1.3. Receptores ionotrópicos de glutamato
Os receptores ionotrópicos de glutamato podem ser divididos em dois
grupos: os receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) e os receptores não-NMDA, entre
os quais estão incluídos os subtipos α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isozazole--ácido
propiônico (AMPA) e cainato (KA).
Os receptores NMDA, tipos de receptores glutamatérgicos mais
estudados, são heterômeros compostos por quatro subunidades e formam um canal
permeável aos íons K + , Na + e Ca 2+ (fig. 2). Estes receptores possuem duas
características que os diferem dos demais canais iônicos cuja abertura depende de
19

ligante: para a abertura do canal, além do glutamato, há a necessidade da ligação
de um aminoácido glicina ou D-serina, que funcionam como co-agonistas, e da
prévia despolarização da membrana em que se encontra o receptor para que o íon
Mg 2+ , que bloqueia o canal no potencial de repouso, seja deslocado (Stephenson,
2006). As subunidades dos receptores NMDA, que formam arranjos tetraméricos,
são NR1, NR2 e NR3. NR1 é a subunidade obrigatória para que o receptor seja
funcional, e é também a que abriga o sítio da glicina / D-serina; NR2 é a subunidade
que abriga o sítio do glutamato; o papel da subunidade NR3 não foi bem elucidado
até o momento (Stephenson, 2006).
Os papéis funcionais dos receptores NMDA são inúmeros. Uma vez
ativados, os canais NMDA mobilizam uma grande quantidade de cálcio para dentro
das células e, por conseguinte, ativam diversas vias intracelulares. Estes receptores
também estão acoplados a diversas proteínas intracelulares, como a proteína da
densidade pós-sináptica de 95kDa (PSD-95) que, por sua vez, ancora proteínas
como a enzima sintase do óxido nítrico neuronal (NOSn), proteína cinase C (PKC) e
a cinase dependente de cálcio-calmodulina II (CaMKII) (Stephenson, 2006).
A função mais conhecida dos receptores NMDA é a promoção da
potenciação de longo termo (LTP) de sinapses, possível responsável pela formação
de memória, aumentando a inserção de receptores AMPA na membrana. No
entanto, pela sua capacidade de mobilizar um grande influxo de cálcio extracelular, o
receptor NMDA também é estudado como promotor de morte celular por
excitotoxicidade (Léveillé et al., 2008).
20

Figura 2 – Representação gráfica do receptor NMDA, mostrando quatro subunidades formadoras
do canal catiônico permeável a K + (não mostrado), Na + , Ca 2+ , bloqueado por Mg 2+ e algumas
drogas (ex. fenciclidina ou PCP). NR1 contém sítios para zinco e glicina / D-serina, enquanto NR2
possui sítios para poliaminas e glutamato. (Modificado de Carlson, 1998).
Os receptores AMPA e KA, assim como os receptores NMDA, formam
poros iônicos. No entanto, existem grandes diferenças entre os receptores NMDA e
não-NMDA. Uma delas é o fato de os receptores AMPA e KA não dependerem de
uma despolarização prévia da membrana, nem da presença de um co-agonista,
podendo ser ativados apenas pela ligação do glutamato. Por esse motivo, esses
receptores são responsáveis por mediar respostas sinápticas rápidas (Hollmann et
al., 1994).
Os receptores AMPA são formados por combinações de quatro
subunidades em arranjo tetramérico (GluR1-4). A composição dos receptores por
diferentes subunidades garante características diferentes a cada um deles. O
exemplo mais claro dessas diferenças é o fato de receptores AMPA que não
possuem a subunidade GluR2 permearem íons Ca 2+ , receptores estes que podem
ter um papel fisiológico em processos isquêmicos, haja vista que ocorre um aumento
21

do redirecionamento deles para locais sinápticos em neurônios privados de glicose e
oxigênio (Liu et al., 2006).
Os receptores KA podem ser de baixa afinidade, se contiverem apenas
subunidades GluR5, GluR6 e GluR7, ou de alta afinidade, se contiverem as
subunidades KA1 ou KA2 (Hollmann e Heinemann, 1994). Também existem
receptores KA permeáveis ou impermeáveis a Ca 2+ , dependendo da forma
recombinante da subunidade GluR5 ou GluR6 presente no receptor (Burnashev et
al., 1995).
As funções e o tráfego dos receptores AMPA já foram bastante
estudados, devido ao seu importante papel na plasticidade de neurônios
glutamatérgicos. Entretanto, o mesmo não pode ser dito sobre os receptores KA,
pois os mecanismos e funções dos quais participam não são bem conhecidos.
Basicamente, a principal diferença entre AMPA e KA é a capacidade deste último de
ter tanto uma ação fásica como, por exemplo, abertura de canal e despolarização da
membrana, quanto uma ação tônica, como modulação de canais iônicos e liberação
de neurotransmissores (Pinheiro e Mulle, 2006).
1.1.4. Receptores metabotrópicos de glutamato
Com o aumento do interesse e dos estudos acerca do glutamato, muitos
grupos começaram a descrever efeitos produzidos pela utilização desta molécula
que não puderam ser explicados pela ativação de canais iônicos. Estes efeitos
incluíam a capacidade de aumentar a hidrólise de fosfolipídeos e a modulação dos
níveis de AMPc. Logo, foram identificadas proteínas que interagiam com o
22

glutamato, mas que possuíam características de receptores acoplados à proteína: os
receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) (Hollmann e Heinemann, 1994).
Os mGluRs podem ser divididos em três grupos: o grupo I, do qual fazem
parte os receptores dos tipos 1 e 5 (mGluR1 e mGluR5); o grupo II, do qual fazem
parte os receptores dos tipos 2 e 3 (mGluR2 e mGluR3); e o grupo III, do qual fazem
parte os receptores dos tipos 4, 6, 7 e 8 (mGluR4, mGluR6, mGluR7 e mGluR8)
(Tabela 1) (Hollmann e Heinemann, 1994).
Grupo I:
mGluR1
mGluR5
Grupo II:
mGluR2
mGluR3
Grupo III:
mGluR4
mGluR6
mGluR7
mGluR8
Subtipos de receptores metabotrópicos de glutamato
Acoplados a Gq; ativam PLC, hidrólise de fosfolipídeos, formação
de IP3 e mobilização de Ca 2+ intracelular.
Acoplados a Gi ou Go; inibem adenilil ciclase, abrem canais de K +
e fecham canais de Ca 2+ .
Acoplados a Gi ou Go; inibem adenilil ciclase, abrem canais de K +
e fecham canais de Ca 2+ .
Tabela 1 – Apresentação dos subtipos de receptores metabotrópicos de glutamato de cada grupo,
e resumo de suas características (Modificado de Palmada e Centelles, 1998).
A estrutura dos mGluRs é composta por um terminal amino (N-terminal),
que corresponde ao sítio de ligação ao glutamato. Esta porção do receptor é
freqüentemente citada como domínio “Venus flytrap”, pois sua conformação se
assemelha à armadilha da planta carnívora (fig. 3). Esses receptores se apresentam
23

na forma de dímeros, nos quais se ligam as moléculas de glutamato ou do agonista,
promovendo uma mudança conformacional da estrutura do receptor, resultando na
ativação da proteína G (Acher et al., 2011).
Figura 3 – Representação gráfica de um receptor metabotrópico de glutamato, mostrando a
porção N-terminal extracelular, onde se liga o glutamato, um domínio rico em cisteínas, os sete
domínios transmembrana, e a porção C-terminal (Adaptado de Spooren et al., 2001).
Os receptores metabotrópicos do grupo I (mGluRI) estão acoplados à
proteína Gq, podendo ativar a via da fosfolipase C (PLC), levando ao aumento da
concentração citoplasmática de fosfatidil inositol trifosfato (IP3) e cálcio (Francesconi
e Duvoisin, 1998; Gereau e Heinemann, 1998). Além disso, existe um complexo de
proteínas intracelulares acoplado aos mGluRI conhecidas como Homer, que faz com
que esses receptores sejam capazes de produzirem respostas complexas de
24

sinalização. Por exemplo, o acoplamento à proteína ativa outras cascatas
intracelulares, acarretando na fosforilação de ERK, PI3K e tradução de novas
proteínas (Ronesi e Huber, 2008), além de permitirem a interação desses receptores
com receptores NMDA através da ligação com a proteína Shank, que se liga à PSD-
95 (Tu et al., 1999). Como já foi evidenciada a importância dos receptores do grupo I
para alguns processos de aprendizado e memória (Steckler et al., 2005), inferimos
que estes receptores podem ter um papel importante na LTP e na LTD.
Os receptores dos grupos II e III são mais encontrados na membrana pré-
sináptica, e estão acoplados a proteínas Gi ou Go, podendo inibir a adenilil ciclase e
modular a atividade de canais iônicos via subunidade βγ (Conn e Pin, 1997) como,
por exemplo, causando a inibição de alguns tipos de canais de cálcio (Chavis et al.,
1994). O grupo II é conhecido por atenuar a transmissão excitatória tanto por
diminuir liberação de glutamato, quanto provocando respostas pós-sinápticas de
hiperpolarização (Alexander e Godwin, 2006). A ativação dos mGluRIII,
particularmente, pode inibir a morte neuronal mediada por 6-hidroxidopamina (6-
OHDA) (Vernon et al., 2007). O receptor mGluR6 é encontrado exclusivamente na
retina, e terá suas funções específicas abordadas mais à frente neste trabalho.
A atividade dos receptores metabotrópicos de glutamato está relacionada
a diversos distúrbios. Em humanos, estudos post-mortem já verificaram uma
alteração no padrão de expressão de mGluRs dos grupos I e II em axônios e na glia
de pacientes portadores de esclerose múltipla, o que pode indicar uma possível
implicação destes receptores nos danos cerebrais progressivos causados pela
doença (Geurts et al., 2003).
A atividade exacerbada dos mGluRs do grupo I pode, ainda, estar
25

elacionada a diversos distúrbios, como, por exemplo, epileptogênese (Wong et al.,
2005), excitotoxicidade (Lafon-Cazal et al., 1999; Makarewicz et al., 2006) e morte
de neurônios em eventos isquêmicos (Pin e Bockaert, 1995; Pellegrini-Giampietro et
al., 1999). Por outro lado, alguns trabalhos sugerem a possibilidade desses
receptores promoverem neuroproteção pelo aumento da transmissão GABAérgica
(Battaglia et al., 2001; Cozzi et al., 2002; Zheng e Johnson, 2003).
Os receptores do grupo II têm a capacidade de prevenir danos causados
por estresse oxidativo induzido por alta glicose. O provável mecanismo desta
neuroproteção é através da ativação de mGluR3 de células gliais, que produzem e
liberam glutationa para os neurônios. A ação antioxidante da glutationa
contrabalança os níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio, impedindo a
ativação de caspases e da cascata de morte celular programada (Anjaneyulu et al.,
2008), o que torna o estudo desses receptores importante para a elucidação da
neuropatia diabética.
Já foi mostrado que, em indivíduos esquizofrênicos, há uma alteração no
padrão de expressão de mGluRs dos grupos I e II (Ohnuma et al., 1998; Gupta et
al., 2005). A ativação dos receptores dos grupos II e III pode, ainda, estar envolvida
em modulações comportamentais, tendo sido observados efeitos ansiolíticos
(Wierońska et al., 2005) e antidepressivos (Belozertseva et al., 2007) sob utilização
de seus agonistas.
Com relação à função desses receptores em sinapses, alguns trabalhos
demonstraram que a ativação de receptores metabotrópicos pode reduzir a
transmissão sináptica GABAérgica em algumas áreas cerebrais, como, por exemplo,
no estriado de rato (Calabresi et al., 1992) e no hipocampo de coelho (Liu et al.,
26

1993). Posteriormente, a questão da importância dos receptores metabotrópicos de
glutamato para a função retiniana será detalhada.
1.2- Sistema GABAérgico
1.2.1- Metabolismo do GABA
O ácido gama-aminobutírico, ou GABA, é o neurotransmissor inibitório
mais abundante do SNC. Ele foi detectado pela primeira vez no cérebro nos anos
50, mas a sua função inibitória foi mais bem estudada e reconhecida apenas em
meados dos anos 60 (Krnjević, 2010).
O GABA é sintetizado a partir do glutamato (fig. 4) pela enzima
descarboxilase do ácido glutâmico (GAD) (Palmada e Centelles, 1998).
Figura 4 – Esquema simplificado da reação através da qual o GABA é sintetizado. O glutamato,
proveniente do α-cetoglutarato ou da glutamina, sobre uma descarboxilação pela enzima GAD,
originando o GABA (Modificado de Palmada e Centelles, 1998).
27

1.2.2- Liberação e transporte de GABA
Depois de sintetizado, o GABA pode ser armazenado em vesículas
sinápticas por um transportador vesicular (VGAT), dependente de uma bomba de
prótons, e liberado pelo clássico mecanismo vesicular dependente de cálcio
(McIntire et al., 1997).
Apesar de poder ser armazenado e liberado pelo mecanismo vesicular
clássico dependente de cálcio, o GABA presente no citosol pode ser liberado para o
meio extracelular através de uma maneira independente de cálcio, mas dependente
de sódio: através da reversão de seu transportador de membrana. Normalmente, os
transportadores de GABA (GAT) atuam captando o neurotransmissor do meio
extracelular, a favor do gradiente de sódio mantido pela bomba Na + K + ATPase.
Quando ocorre um aumento intracelular de sódio nas proximidades do transportador,
ele passa a atuar de maneira inversa, enviando Na + e GABA para fora da célula (fig.
5). Uma grande diferença entre os dois mecanismos de liberação é que, enquanto a
liberação vesicular promove liberação de uma quantidade maciça de
neurotransmissores, o transportador libera menos moléculas. A eficiência da
liberação por transportador vai depender do número e da densidade de
transportadores em um determinado local da célula, bem como da quantidade de
íons sódio e moléculas de transmissor a serem transportadas (Schwartz, 2002;
Calaza et al., 2006).
28

Figura 5 – Esquema exemplificando o processo de liberação de GABA mediada por transportador.
Ocorre entrada de Na + em um local próximo ao transportador, invertendo o gradiente do íon e
favorecendo o transporte de Na + e GABA para fora da célula (Modificado de Ozkan e Ueda, 1998).
O GABA pode agir em três receptores pós-sinápticos: GABAA, GABAB e
GABAC. GABAA e GABAC são receptores ionotrópicos que, quando ativados, abrem
um canal permeável ao íon Cl - que, por estar mais concentrado no meio extracelular,
vai entrar na célula e hiperpolarizá-la. Já o receptor GABAB é um receptor
metabotrópico acoplado a uma proteína Gi, que leva à abertura de canais de K + ,
tendo o mesmo efeito de hiperpolarizar a célula (Bormann, 2000).
O término da ação do GABA ocorre através da recaptação por um dos
quatro transportadores de GABA (GAT-1 a GAT-4), pelo próprio terminal pré-
sináptico ou por células gliais (Gether et al., 2006). A enzima GABA transaminase
(GABA-T) catalisa a primeira reação de metabolização do GABA, reagindo com o α-
cetoglutarato e formando glutamato (De Graaf et al., 2006).
29

1.3- A retina
1.3.1- A retina de galinha e suas vantagens na pesquisa
Devido à grande complexidade do SNC, o estudo da morfologia e das
propriedades neuroquímicas de cada região que o compõe é fundamental para a
compreensão de mecanismos fisiológicos através dos quais eles exercem suas
funções e investigar as possíveis causas de patologias existentes. Além disso, o
estudo do desenvolvimento dos animais permite a identificação de modificações na
expressão de diferentes proteínas em cada etapa e a seqüência de eventos que leva
à formação normal do organismo.
A retina de galinha é muito utilizada como modelo para o estudo do SNC.
Algumas vantagens são bastante claras com relação ao uso da espécie no estudo
do desenvolvimento em comparação, por exemplo, aos roedores: como a galinha se
desenvolve no ovo, a obtenção dos embriões é mais fácil, o que exclui a
necessidade de cirurgia e sacrifício da mãe; o tecido retiniano é abundante e simples
de ser manipulado, permitindo um uso mais eficiente; e é necessária uma menor
quantidade de animais por experimento. No caso do estudo da fisiologia retiniana, o
estudo da retina de pinto se torna interessante também pelo fato de ser um animal
diurno como o homem. Assim, algumas características da retina, como prevalência
de cones em detrimento de bastonetes, são mais semelhantes entre pinto e homem
do que rato, que é um animal noturno.
Sendo assim, estudamos a retina de embriões de galinha e animais pós-
eclosão na tentativa de identificar características neuroquímicas que possam se
assemelhar à espécie humana e que ajudem a compreender melhor a complexa
fisiologia retiniana.
30

1.3.2- Organização morfológica e tipos celulares
A retina é uma estrutura situada na parte posterior do globo ocular e faz
parte do sistema nervoso central (SNC). Este tecido é relativamente simples em
comparação às outras estruturas neurais centrais, possuindo apenas cinco tipos
principais de neurônios ordenados nas seguintes camadas: camada dos segmentos
externos dos fotorreceptores, camada nuclear externa (CNE), camada plexiforme
externa (CPE), camada nuclear interna (CNI), camada plexiforme interna (CPI),
camada das células ganglionares (CCG) e camada de fibras ópticas. Enquanto nas
camadas nucleares encontram-se apenas os corpos celulares dos neurônios,
intercalam-se entre elas as camadas plexiformes externa e interna, onde se
localizam os prolongamentos das células e os contatos sinápticos (fig. 6) (Kolb,
2003).
A camada dos segmentos externos dos fotorreceptores contém as partes
sensíveis à luz dessas células. Na camada nuclear externa, estão localizados os
corpos celulares dos fotorreceptores dos tipos cone e bastonete. Estes dois tipos
celulares são os responsáveis por captarem a luz do ambiente e a transduzirem em
um sinal eletroquímico, que será repassado para as outras células retinianas. A
diferença entre estas células é que os cones respondem a cores, e são menos
sensíveis à luz, necessitando da intensa luminosidade do dia para funcionarem; já
no caso dos bastonetes, uma luminosidade fraca e difusa, como a luz do luar, é
capaz de ativá-los (Lagnado, 2000).
31

Figura 6 – Esquema da morfologia retiniana, mostrando suas camadas de células e plexos
(Adaptado de Kolb, 2003).
Na camada nuclear interna, estão localizadas as células horizontais, as
células bipolares e as células amácrinas. As células bipolares recebem aferência
dos fotorreceptores e estão encarregadas de repassarem a informação recebida
para as células ganglionares, localizadas na camada de células ganglionares. Já as
células horizontais e as células amácrinas têm a função de modular o sinal antes de
este ser repassado às ganglionares, processo importante para aumentar acuidade
visual, contraste, entre outras funções.
Finalmente, na camada de células ganglionares, estão as células de
mesmo nome e células amácrinas deslocadas. Os axônios das células ganglionares
formam o nervo óptico, que será responsável por levar a informação luminosa pré-
processada para os centros visuais cerebrais (Kolb, 2003).
32

Na retina, também existem células gliais, conhecidas como glia de Müller.
Essas células atravessam todas as camadas retinianas, formando a borda mais
interna (vitreal) da retina, conhecida como membrana limitante interna, e se
projetando até a camada de fotorreceptores, formando a membrana limitante externa
(Bringmamm et al., 2001; Newman, 2004).
A via caracterizada pela passagem de informação de fotorreceptores para
células bipolares e células ganglionares é denominada via radial, enquanto a
modulação desses sinais pelas células horizontais e células amácrinas é
denominada via lateral.
Os neurônios retinianos se comunicam por meio de um intrincado padrão
de conexões, o que torna a retina um excelente modelo para o estudo do
processamento de informações por circuitos neurais complexos.
Em estudos prévios, já foi descrita a presença de quase todos os
sistemas de neurotransmissores do SNC na retina da maioria das espécies. No
entanto, o glutamato e o GABA são considerados, respectivamente, os
neurotransmissores excitatório e inibitório mais importantes, tanto no encéfalo
quanto na retina, na qual são responsáveis pelas duas vias de processamento dos
estímulos luminosos, que serão abordadas mais à frente neste trabalho.
1.3.3- O desenvolvimento da retina de galinha
A retina se desenvolve a partir de estruturas do diencéfalo, conhecidas
como vesículas ópticas. Desde a fertilização até aproximadamente o terceiro dia
embrionário (E3), as células são multipotentes e totalmente indiferenciadas. No
33

entanto, já em E2 começam a surgir as células ganglionares, que em E9 tem toda a
sua população gerada. Em E2 também começam a surgir as células amácrinas, que
param de se multiplicar em E10. Em E4 inicia-se a neurogênese de células
horizontais e fotorreceptores, que só termina em E9. Por último, em E5 começam a
surgir as células bipolares, que também são as últimas a saírem do ciclo celular, em
E13 (fig. 7) (Prada et al., 1991). As camadas plexiformes interna e externa
aparecem, respectivamente, em E8 e E9, presumidamente aumentando sua
espessura e complexidade até a eclosão e vida adulta do animal (Calaza e Gardino,
2010).
A partir de E14, todas as células da retina de galinha já estão em suas
respectivas camadas. Os eventos que ocorrem durante este período até a eclosão
do animal são sinaptogênese e o aparecimento de precursores de oligodendrócitos.
Em E15, surgem os segmentos externos dos fotorreceptores, sendo que todos os
fotopigmentos estão expressos em E16. Diferentemente dos mamíferos, o sistema
visual do pinto é bastante maduro no nascimento do animal. Portanto, em E19, dois
dias antes da eclosão, os padrões de eletroretinograma são similares aos de
animais maduros (Calaza e Gardino, 2010).
34

Figura 7 – Esquema resumindo os períodos do desenvolvimento nos quais ocorrem a geração de
cada tipo celular da retina de pinto (Modificado de Prada et al., 1991 e Martins e Pearson, 2007).
1.3.4- Vias de processamento visual retiniano
1.3.4.1- A via radial
O processamento retiniano de sinais luminosos é bastante complexo,
devido aos diferentes tipos celulares encontrados e as conexões que existem entre
eles. Existem duas vias de processamento: a via radial e a via lateral.
O glutamato é utilizado como neurotransmissor pelas células da via radial,
ou seja, fotorreceptores, células bipolares e células ganglionares. Este mediador
pode agir através das duas classes de receptores presentes na retina: os iGluRs e
os mGluRs (Brandstätter et al., 1998).
35

No escuro, os fotorreceptores se encontram despolarizados e liberam
glutamato devido aos altos níveis de GMPc que mantêm canais catiônicos abertos,
permitindo o influxo de Na + e Ca 2+ . Quando o fotopigmento sensível à luz presente
nessas células (a rodopsina do bastonete ou a opsina do cone) absorve luz do
ambiente, ocorre a ativação da chamada tranduscina, uma proteína G, que irá ativar
a fosfodiesterase que degradará o GMPc e fechará os canais catiônicos. Assim, os
fotorreceptores hiperpolarizam e reduzem a liberação do glutamato e, desta forma, a
informação luminosa é codificada e transmitida às células bipolares (Lagnado,
2000).
Existem dois tipos de células bipolares: do tipo ON e do tipo OFF. Os
fotorreceptores do tipo bastonete se comunicam somente com células bipolares do
tipo ON; cones se comunicam com bipolares ON ou OFF. Células bipolares do tipo
ON possuem receptores mGluR6. Como, no escuro, fotorreceptores liberam
glutamato, o mGluR6 presente nestas bipolares é ativado e a interação da proteína
G com o canal de cálcio dependente de GMPc o fecha, o que hiperpolariza a célula
nesta situação (Nawy, 1999; Duvoisin et al., 2005). Se o fotorreceptor receber luz,
menos glutamato será liberado e ativará menos mGluR6, permitindo a
despolarização da célula bipolar ON (fig. 8) (Hack et al., 1999; Thoreson e
Witkovsky, 1999). O receptor mGluR6 tem uma importante função na fisiologia da
retina. Em camundongos nocaute para este receptor, não é possível observar
registro de ondas b de células bipolares ON em eletroretinograma, nem de potencial
de campo das células do colículo superior correspondentes, mostrando que a
ausência deste receptor causa a perda funcional da via ON (Masu et al., 1995;
Yoshida et al., 1998; Takao et al., 2000).
36

Estudos recentes relacionaram o funcionamento da via ON e da
sinalização por mGluR6 a canais TRP (“transient receptor potential”), ao invés de
canais dependentes de GMPc. Especificamente, camundongos nocaute para
TRPM1 não apresentam as respostas de onda b e potenciais oscilatórios,
características da ativação de mGluR6 e da via ON (Morgans et al., 2009). Portanto,
tanto mGluR6 quanto canais catiônicos do tipo TRPM1 parecem ser necessários
para o correto funcionamento da via ON.
Já células bipolares do tipo OFF ficam despolarizadas no escuro,
juntamente com o fotorreceptor com o qual faz sinapse; quando este último recebe
luz e hiperpolariza, a bipolar OFF também hiperpolariza. Isto porque essas células
possuem receptores ionotrópicos de glutamato, que mantêm o sentido do sinal que
foi passado à célula (Hack et al., 1999).
As células ganglionares possuem receptores ionotrópicos de glutamato e,
ao receberem o glutamato liberado pelas células bipolares, se despolarizam e
desencadeiam potenciais de ação para levar a informação até os centros visuais
cerebrais (Manookin et al., 2008).
1.3.4.2- A via lateral
As células horizontais e células amácrinas são responsáveis pela
modulação das sinapses glutamatérgicas formadas pelos neurônios da via radial
através da interação entre células horizontais e fotorreceptores, e células amácrinas
e bipolares.
Células horizontais são responsáveis por gerar os campos receptores
37

com respostas antagônicas entre o centro e a periferia. Isto porque estas células
liberam GABA para os cones iluminados que, por sua vez, liberarão menos
glutamato e permitirão uma despolarização maior da célula bipolar ON via mGluR6,
garantindo o disparo da célula ganglionar do centro do campo receptor (fig. 8)
(Rodieck, 1998).
Figura 8 – Esquema mostrando o circuito das células horizontais e a resposta de células bipolares
ON (rosa), que possuem mGluR6. O primeiro e o último cone representam a periferia e o cone do
meio, o centro do campo receptor da célula bipolar ON. O primeiro e o último, estando no escuro,
estariam despolarizados e liberando glutamato. Esses cones despolarizam (setas verdes) também
as células horizontais, que liberam GABA (seta vermelha) para o cone no centro do campo
receptor da bipolar (rosa). O cone no centro, já previamente hiperpolarizado pela luz, hiperpolariza
ainda mais, liberando menos glutamato e ativando ainda mais a célula bipolar ON. (Modificado de
Kandel et al., 2003).
Existem dezenas de tipos de células amácrinas com fenótipos de
diferentes tipos de neurotransmissores. Até o momento, estão descritos sete tipos
de células amácrinas que são GABAérgicas, e essas células têm uma função muito
importante para o correto processamento da informação luminosa pela retina (fig. 9).
38

Quando o glutamato é liberado para uma célula amácrina, esta pode liberar GABA
para uma célula bipolar adjacente (feedback lateral) ou para a mesma célula bipolar
que a ativou (sinapse recíproca) (Dowling e Boycott, 1965; Sterling e Lampson,
1986; Koulen et al., 1998; Chávez et al., 2010). O GABA, então, ativa seus
receptores, produzindo sinais inibitórios que seriam importantes para a
transitoriedade e sintonia fina dos sinais glutamatérgicos (Euler e Masland, 2000;
Dong e Hare, 2003), bem como impediriam a rápida depleção de glutamato nas
vesículas sinápticas (Singer and Diamond, 2006; Chávez et al., 2010).
Figura 9 – Esquema demonstrando a função fisiológica das células amácrinas. Quando a luz
incide no campo receptor dos fotorreceptores (azul-petróleo e magenta), eles deixam de liberar
glutamato (seta vermelha), deixando de ativar mGluR6 da bipolar (amarelo). A bipolar, por sua
vez, libera glutamato (seta verde) para células amácrinas (azuis), que podem liberar
neurotransmissores inibitórios para a mesma bipolar que a ativou, ou para outra bipolar
(Modificado de Bloomfield e Xin, 2000).
39

Um estudo recente mostrou que camundongos mutantes super-
expressando o receptor PAC1 para o polipeptídeo ativador de adenilato ciclase da
pituitária (PACAP) tem o desenvolvimento retiniano prejudicado, pois o animal
apresenta uma diminuição da espessura da CPI, e diminui o número de células
GABAérgicas na CNI. Além disso, testes optocinéticos mostram que esses mutantes
apresentam uma diminuição da acuidade visual (Lang et al., 2010). Estes resultados
evidenciam a participação de células amácrinas GABAérgicas na modulação de
respostas complexas de células ganglionares e na formação de antagonismo centro
/ periferia (fig. 9) (Bloomfield e Xin, 2000). Outra evidência da importância das
células amácrinas no processamento eletrofisiológico da retina foi verificada através
do estudo em animais nocautes para a NOSn. Estes animais apresentavam
diminuição da sensibilidade a luz (Wang et al., 2007). Além disso, nós
demonstramos previamente que o óxido nítrico modula liberação de GABA das
células amácrinas da INL. Assim, a modulação do GABA por óxido nítrico parece ser
importante para estabelecer o limiar de sensibilidade à luz (Maggesissi et al., 2009).
Os sinais de células amácrinas são particularmente importante em retinas
de mamíferos, os quais possuem poucas células horizontais para gerar o
antagonismo centro-periferia das bipolares e conseqüentemente da células
ganglionares
1.4- Receptores metabotrópicos de glutamato e liberação de GABA na retina
A presença de todos os receptores para glutamato acoplados à proteína
G já foi demonstrada na retina de diversas espécies (Brandstätter et al., 1998;
Sampaio e Paes de Carvalho, 1998; Kreimborg et al., 2001; Hirasawa et al., 2002). A
40

figura 10 mostra a localização dos tipos de receptores e onde eles foram detectados
na retina de camundongo e rato.
Figura 10 – Quadro ilustrando a localização dos mGluRs de diferentes subtipos nas camadas da
retina de roedores. Os círculos representam corpos celulares, e as faixas, as lâminas das
camadas plexiformes nas quais cada receptor é encontrado. Quanto mais escuro o cinza, maior a
expressão do receptor na região. O mGluR3 não aparece no quadro porque não foi detectado na
retina (Modificado de Brandstätter et al., 1998; e Quraishi et al., 2007).
Recentemente, a distribuição dos receptores do grupo I foi analisada na
retina de galinha por técnicas imunohistoquímicas, e constatou-se que mGluR1 e
mGluR5 aparecem nos mesmos locais sinápticos, o que pode indicar uma provável
interação funcional entre estes dois receptores. Aparentemente, estes receptores se
localizam, em sua maioria, na membrana pós-sináptica da CPI, mas podem estar em
ambas as membranas pré e pós-sinápticas na CPE (Sen e Gleason, 2006).
Os receptores metabotrópicos do grupo II (mGluR2/3) já foram
41

encontrados em todas as camadas na retina de peixe, tanto na forma monomérica
quanto dimérica, com exceção da camada de fotorreceptores, e a ativação
farmacológica deles promoveu neuroproteção contra danos provocados por anóxia
(Beraudi et al., 2007). Receptores do grupo II também foram detectados na retina de
coelho por imunohistoquímica, principalmente, nas sublâminas 2 e 4 (Jensen, 2006).
No entanto, todos esses estudos foram feitos com anticorpos para os dois
receptores (mGluR2 e mGluR3).
Quraishi e colaboradores (2007) estudaram a distribuição dos receptores
metabotrópicos do grupo III na retina de camundongo. O subtipo mGluR6, que é
exclusivamente encontrado na retina, localizou-se na camada plexiforme externa de
ambas as membranas sinápticas, e os outros subtipos (mGluR4, 7 e 8) foram
encontrados na camada plexiforme interna (Quraishi et al., 2007).
A ativação farmacológica de receptores metabotrópicos pode modular a
liberação de diversas substâncias produzidas por células neuronais, como o próprio
glutamato, aspartato, dopamina, serotonina, acetilcolina, purinas, substância P,
taurina e GABA, em diversas regiões do SNC (Cartmell e Schoepp, 2000).
Considerando os inúmeros papéis fisiológicos destes receptores já foram
demonstrados em outras regiões do SNC, um trabalho que investigue se
mecanismos similares ocorrem na retina pode ser relevante para uma compreensão
mais abrangente dos circuitos retinianos, da interação entre seus sistemas de
neurotransmissores, e da forma através da qual tais fatores convergem para gerar
uma resposta fisiológica. Diante das evidências apresentadas, investigamos, neste
trabalho, se a ativação de receptores metabotrópicos de glutamato é capaz de
modular a liberação de GABA em células amácrinas da retina de galinha.
42

2. OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Caracterizar os efeitos da ativação dos receptores metabotrópicos de
glutamato na liberação de GABA da retina interna ao longo do
desenvolvimento.
2.2- Objetivos específicos
Caracterizar os efeitos da ativação dos receptores metabotrópicos de
glutamato na liberação de GABA de células amácrinas ao longo do
desenvolvimento e no animal pós-eclosão;
Investigar o mecanismo de liberação de GABA dessas células;
Verificar a participação de receptores ionotrópicos de glutamato neste
processo;
Avaliar o efeito da ativação de mGluRs no conteúdo de glutamato no meio
extracelular.
43

3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Animais
Os procedimentos deste estudo envolvendo animais foram previamente
notificados, analisados e aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa com Animais
da CEPA/PROPPI, Universidade Federal Fluminense, sob o protocolo número 112.
Neste trabalho, foram utilizadas técnicas para o estudo morfológico da
retina de galinha (Gallus domesticus). Os ovos galados foram adquiridos de uma
granja local, e permaneceram em estufas com temperatura (37°C) e umidade
relativa apropriadas (de 65 a 70%) até sua eclosão. Os animais que não eram
imediatamente utilizados eram mantidos em uma criadeira apropriada com alimento
e água ad libitum. Os experimentos foram realizados com embriões de 14, 16 e 18
dias de desenvolvimento (E14, E16, E18) e animais pós-eclosão (PE) com idades de
zero a cinco dias (P0 a P5).
Após a eutanásia dos animais, seus olhos foram retirados e cortados em
uma orientação coronal, dividindo o olho nas partes anterior e posterior. O segmento
contendo a câmara anterior do olho foi descartado, assim como o humor vítreo, e o
posterior, onde se encontra a retina, foi utilizado nos experimentos.
Cada animal representou um grupo de quatro diferentes tratamentos;
sendo assim, as retinas dos dois olhos eram novamente divididas ao longo do eixo
superior-inferior para a obtenção de quatro partes de tecido retiniano de um mesmo
animal.
44

3.2- Estimulação farmacológica do tecido retiniano intacto
Todos os experimentos de estimulação da retina foram feitos em 500µl de
uma solução salina nutridora (Ringer Locke; NaCl 157 mM, KCl 5,6 mM, HEPES 5
mM, glicose 5,6 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2,3 mM, Na2HCO3 3,6 mM) borbulhado, por
15 minutos, com uma mistura de gases contendo 95% de O2 e 5% de CO2. Todos os
fármacos (Tabela 2) foram diluídas nesse meio, que foi utilizado para os grupos
controle sem diluição de outros compostos (CTR). Nos experimentos com ausência
de cálcio, não adicionamos CaCl2 no Ringer, e aumentamos a concentração de
MgCl2 para 10 mM.
ABREV.
T-ACPD
L-SOP
AIDA
EGLU /MCCG
MAP-4
MK801 (MK)
DNQX
NO-711
MECANISMO DE
AÇÃO
Agonista mGluR
grupos I e II
Agonista mGluR
grupo III
Antagonista
mGluR grupo I
Antagonistas
mGluR grupo II
Antagonista
mGluR grupo III
Antagonista iGluR
NMDA
Antagonista
iGluRs AMPA/KA
Bloqueador de
GAT-1
CONCENTRAÇÃO EMPRESA
100 µM Sigma-Aldrich
100 µM Sigma-Aldrich
200 µM Tocris
200 µM Tocris / Sigma-Aldrich
500 µM Sigma-Aldrich
5 µM Sigma-Aldrich
200 µM Sigma-Aldrich
100 µM Sigma-Aldrich
Tabela 2 – Relação dos fármacos utilizados nos experimentos. Foram utilizados os agonistas
individualmente, ou em combinação com um ou mais antagonistas, nas concentrações indicadas.
45

As retinas dos grupos experimentais que utilizavam antagonistas foram
pré-incubadas com eles por 20 minutos a 37°C; as outras ficaram incubadas apenas
em Ringer Locke pelo mesmo período de tempo. Após o período de pré-incubação,
as retinas foram estimuladas com agonistas por 30 minutos, na mesma temperatura.
Terminada a incubação com os fármacos, as retinas foram fixadas em
paraformaldeído 4% diluído em tampão fosfato por três horas. Uma vez fixadas,
foram lavadas três vezes, por dez minutos, com tampão fosfato 0,16M (pH=7,2).
3.3- Crioproteção e secção em criostato
Para a preparação das lâminas, foi necessário que as retinas fossem
seccionadas transversalmente, com a espessura de 12 m, em um criostato. Um dia
antes do processo de criosecção, as retinas foram imersas em um gradiente de
sacarose, sendo submetidas às concentrações de 15% e 30%, ficando nesta última
solução pelo menos durante o pernoite.
Para que não houvesse diferença entre os tratamentos
imunohistoquímicos subseqüentes entre os grupos, as retinas dos diferentes grupos
experimentais foram montadas e congeladas no mesmo bloco em um meio de
inclusão OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), utilizando nitrogênio líquido ou gelo
seco (-179°C). Um dia antes de colher os cortes, as lâminas foram gelatinizadas em
uma solução de gelatina e alúmen de cromo, na concentração final de 0,5%.
Uma vez colhidos, os cortes de retina secaram a temperatura ambiente e
foram guardados a -20°C em caixas envolvidas com filme PVC, até o
processamento imunohistoquímico ser feito.
46

3.4- Imunohistoquímica
O processo de imunohistoquímica envolveu duas etapas, que ocorreram
em dois dias consecutivos.
No primeiro dia, os cortes foram lavados três vezes com PBS (KCl 2,7
mM, KH2PO4 1,47 mM, NaCl 136 mM, Na2HPO4.7H2O 8,0 mM; pH=7,4), por dez
minutos. Após as lavagens, o tecido foi incubado em BSA 5% por uma hora.
O BSA, citado anteriormente, e os anticorpos mencionados a seguir foram
diluídos em PBS + Triton-X100 0,25%.
Posteriormente, aplicou-se o anticorpo primário anti-GABA feito em
coelho (Sigma, 1:7000), que agiu durante o período de pernoite.
No segundo dia, novamente, as lâminas foram lavadas três vezes com
PBS por dez minutos, e incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho (Vector,
1:200) por duas horas a temperatura ambiente. Após este tempo, foram feitas três
lavagens de dez minutos com PBS; depois, aplicou-se o complexo avidina-biotina
peroxidase (ABC, Vector, 1:50) por uma hora e meia. Novamente, os cortes foram
lavados três vezes, sendo que a primeira vez foi com PBS, e as duas últimas, com
TBS (Tris 50,0 mM; pH=7,6). Iniciou-se, então, a reação com o cromógeno: 1 ml de
solução de peróxido de hidrogênio a 0,01% foi adicionado a 1 ml de uma solução a
0,05% de diaminobenzidina (DAB, Sigma Aldrich) diluída em Tris (0,1 mM; pH=7,6);
o produto foi adicionado às lâminas por dez minutos. Após a reação, as lâminas
foram lavadas três vezes com TBS, e montadas com glicerol diluído em tampão
fosfato a 40% para posterior análise.
47

3.5- Ensaio de medição do glutamato liberado
A enzima desidrogenase do ácido glutâmico (GDH) é capaz de produzir α-
cetoglutarato a partir de glutamato, e esta reação gera como produto secundário
NADH, que pode ser detectado em amostras através da medição de sua
fluorescência. Com o objetivo de medir o glutamato liberado por duas retinas durante
o período de estimulação com diversas drogas, nós colhemos duas amostras de 250
µl do meio no qual as retinas foram incubadas. Essas amostras foram fervidas de 1
a 2 minutos para que enzimas que poderiam degradar o NAD fossem desnaturadas.
Em cada tubo de amostra, adicionamos 750 µl de uma solução reagente, composta
pelo solvente Tris-acetato 75 mM, pH=8,4, por 400µM de NAD (que é transformado
em NADH) e 150µM de ADP (que impede a reversão da reação). Os totais de 1000
µl de amostras e reagente foram medidos no fluorímetro Modulus Single Tube
Multimode Reader (Turner Biosystems), com o filtro de excitação de 365 nm e o filtro
de emissão de 410-450 nm, e os valores obtidos foram considerados como a
fluorescência inicial da amostra. Após a obtenção da fluorescência inicial de cada
amostra, foram adicionadas 48 unidades da enzima GDH em cada tubo, e 60
minutos depois, após o equilíbrio da reação, as amostras foram lidas novamente. Os
valores obtidos foram considerados como a fluorescência final da amostra. A
fluorescência específica à reação feita pela enzima, correspondente à concentração
de glutamato, era obtida a partir da subtração do valor da fluorescência inicial do
valor da fluorescência final.
48

3.6- Ensaio de liberação de LDH
A liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH) é utilizada para
verificar se existe morte celular por necrose. A atividade da LDH foi medida através
de um teste de citotoxicidade colorimétrico e não radioativo (Promega). Após o
período de estimulação com as drogas, as retinas eram incubadas com uma solução
de lise (Triton 0,9%) a temperatura ambiente por 15 minutos, e o meio era recolhido
e mantido a 4°C. O tecido era, então, congelado por 30 minutos, descongelado em
banho maria a 37°C por 15 minutos, e, finalmente, centrifugado a 2000 rpm. Dois μl
do sobrenadante e 20 μl do meio extracelular eram diluídos em 48μl e 30μl da
solução salina Locke, respectivamente. Posteriormente, as amostras eram
incubadas em uma diluição de 1:2 (50μl) do substrato a temperatura ambiente por
30 minutos. A solução de parada (50 μl) era adicionada em cada poço, e a
absorbância era lida no comprimento de onda de 490 nm. A concentração de LDH
externa e interna foi medida.
3.7- Análise quantitativa e estatística
Todas as observações ao microscópio (Axioskop, Zeiss; Nikon Eclipse
80i) foram feitas com a ocular de 10 vezes de aumento e a objetiva de 40 vezes.
A análise consistiu na contagem de células marcadas, ou seja, que
continham GABA. Foram contadas células amácrinas da camada nuclear interna,
sendo todos os cortes obtidos de um mesmo tratamento imunohistoquímico.
Quantificamos quatro campos de três cortes diferentes de um mesmo animal e, no
mínimo, três animais por experimento.
49

A média de células contadas nos grupos controle era de 400 por corte, ou
100 células por campo. Portanto, a análise final de três animais, levava em conta o
total de mais de 3000 células GABA+, de pelo menos 36 campos diferentes.
A análise da densidade óptica da camada plexiforme interna foi feita da
seguinte forma: foram tiradas 35 fotos de cada grupo experimental (n=7) na
resolução de 119992 pixels, e cada uma dessas fotos foi analisada no programa
ImageJ 1.42q. A camada plexiforme interna foi dividida em cinco partes,
correspondentes às cinco sublâminas. Os valores obtidos em cada grupo
experimental foram comparados aos valores do controle.
Em todos os casos, a estatística foi feita através do teste One-way
ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. Nos gráficos, são representados os
valores da média ± erro padrão.
50

4. RESULTADOS
4.1- Embrião com 14 dias de desenvolvimento
Utilizamos um protocolo de 50 minutos de incubação, no qual as retinas
eram deixadas apenas na salina por 20 minutos (pré-incubação), e mais 30 minutos
expostas às drogas. Em retinas de E14, os tratamentos com T-ACPD, agonista dos
grupos I e II dos mGluRs na concentração de 100 µM, e com L-SOP, agonista do
grupo III, na mesma concentração, não promoveram nenhuma alteração na
marcação para GABA, nem no número de células amácrinas GABA-positivas
(GABA+) na CNI. Não encontramos diferenças entre o número de células amácrinas
GABA+ na retina interna entre os grupos controle e tratados com os agonistas
metabotrópicos (Fig. 11).
4.2- Embrião com 16 dias de desenvolvimento
Com os embriões de E16, foi realizado o mesmo procedimento: fizemos
20 minutos de incubação apenas na salina, adicionando as drogas T-ACPD e L-SOP
a 100 µM nos 30 minutos adicionais. Nesta idade, observamos que parece ocorrer
uma tendência à diminuição do número de células amácrinas da CNI, principalmente
com o tratamento com T-ACPD. No entanto, essa diminuição não se apresentou
significativa em nenhum dos dois casos (Fig. 12).
51

CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 11 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I, II e III nas
células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de
cortes transversais de retinas de E14 marcadas para GABA. A, controle; B, 100 µM de T-ACPD,
agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, 100 µM de L-SOP, agonista do grupo III dos mGluRs.
Escala = 50 µm; D, histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas GABA+
em relação a 100% do controle. Números nas barras indicam número de animais utilizados em
cada grupo experimental.
CPE
CNI
CPI
CCG
52

CNI
CPI
CCG
CNI
CPI
CCG
Figura 12 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I, II e III nas
células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de
cortes transversais de retinas de E16 marcadas para GABA. A, controle; B, 100 µM de T-ACPD,
agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, 100 µM de L-SOP, agonista do grupo III dos mGluRs.
Escala = 50 µm; D, histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas GABA+
em relação a 100% do controle. Números nas barras indicam número de animais utilizados em
cada grupo experimental.
CNI
CPI
CCG
53

4.3- Embrião com 18 dias de desenvolvimento
Os embriões de E18 foram submetidos ao período de incubação de 50
minutos: durante 20 minutos, ficaram imersos na solução salina, e nos 30 minutos
posteriores, foram adicionados T-ACPD ou L-SOP, na concentração de 100 µM.
Observamos que as retinas desses embriões apresentaram uma diminuição de 30%
do número de células GABA+ em relação ao controle, tanto no grupo tratado com T-
ACPD quanto no grupo tratado com L-SOP (Fig. 13 e 14).
Como, neste caso, as drogas tiveram efeito na imunorreatividade para o
GABA, fizemos experimentos utilizando drogas antagonistas para os receptores
metabotrópicos, para verificar se o efeito observado foi decorrente da ativação
desses receptores. Os antagonistas foram diluídos no meio com as retinas durante
os 20 minutos que precediam a incubação com os agonistas, e permaneciam
durante os 30 minutos posteriores. Os antagonistas utilizados com o T-ACPD foram
o AIDA (antagonista do grupo I) e o EGLU (antagonista do grupo II), ambos usados
na concentração de 200 µM. O uso separado dos antagonistas promoveu o bloqueio
do efeito do T-ACPD, fazendo com que o número de células ficasse comparável ao
controle. Os antagonistas utilizados de forma concomitante também bloquearam o
efeito do agonista (Fig. 13). O uso de MAP-4, antagonista do grupo III, na
concentração de 500 µM, inibiu completamente o efeito do L-SOP, elevando o
número de células ao nível do controle (Fig. 14).
54

Considerando a possibilidade de a liberação de GABA observada pela
ativação de receptores metabotrópicos de glutamato ocorrer devido a uma ativação
indireta de receptores ionotrópicos (Calaza et al., 2001), realizamos experimentos
nos quais pré-incubávamos as retinas com MK-801, antagonista do receptor NMDA,
na concentração de 5 µM, e / ou com DNQX, antagonista dos receptores AMPA /
KA, na concentração de 200 µM. O bloqueio do receptor NMDA inibiu
acentuadamente o efeito de liberação de GABA de células amácrinas pelo T-ACPD
(Fig. 15) assim como pelo L-SOP (Fig. 16). O DNQX também exerceu um efeito
inibitório sobre a liberação de GABA induzida pelo uso do T-ACPD (Fig. 15) e pelo L-
SOP (Fig. 16). O uso concomitante dos dois antagonistas de receptores ionotrópicos
também resultou no bloqueio da liberação de GABA induzida pela ativação dos três
grupos de receptores metabotrópicos de glutamato (Fig. 15 e Fig. 16).
55

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 13 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I e II nas células
amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de cortes
transversais de retinas de E18 marcadas para GABA. A, controle; B, 100 µM de T-ACPD, agonista
dos grupos I e II dos mGluRs; C, pré-incubação com 200 µM de AIDA, antagonista do grupo I dos
mGluRs, e posterior tratamento com T-ACPD e AIDA; D, pré-incubação com 200 µM de MCCG,
antagonista do grupo II dos mGluRs, e posterior tratamento com T-ACPD e MCCG; E, préincubação
de AIDA e MCCG (200 µM), e posterior tratamento com T-ACPD, AIDA e MCCG.
Escala = 50 µm; F, histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas GABA+
em relação a 100% do controle (*** - p

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 14 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos do grupo III nas células
amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de cortes
transversais de retinas de E18 marcadas para GABA. A, controle; B, 100 µM de L-SOP, agonista
do grupo III dos mGluRs; C, pré-incubação com 500 µM de MAP-4, antagonista do grupo III dos
mGluRs, e posterior tratamento com L-SOP e MAP-4. Escala = 50 µm; D, histograma mostrando
a estatística do número de células amácrinas GABA+ em relação a 100% do controle (*** -
p

CPE
CNI
CPI
CCG
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 15 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com agonista de
mGluRI/II nas células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias
representativas de cortes transversais de retinas de E18. A, controle; B, 100 µM de T-ACPD,
agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, pré-incubação com 5 µM de MK-801, antagonista de
receptores NMDA, e posterior tratamento com T-ACPD e MK; D, pré-incubação com 200 µM de
DNQX, antagonista de receptores KA, e posterior tratamento com T-ACPD e DNQX; E préincubação
com MK e DNQX, e posterior tratamento com T-ACPD e os dois antagonistas. Escala =
50 µm; F, histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas GABA+ em relação
a 100% do controle (* - p

CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 16 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com agonista de
mGluRIII nas células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias
representativas de cortes transversais de retinas de E18 marcadas para GABA. A, controle; B, 100
µM de L-SOP, agonista do grupo III dos mGluRs; C, pré-incubação com 5 µM de MK-801,
antagonista de receptores NMDA, e posterior tratamento com L-SOP e MK; D, pré-incubação com
200 µM de DNQX, antagonista de receptores KA, e posterior tratamento com L-SOP e DNQX; E
pré-incubação com MK e DNQX, e posterior tratamento com L-SOP e os dois antagonistas. Escala
= 50 µm; F, histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas GABA+ em
relação a 100% do controle (* - p

4.4- Animal pós-eclosão
4.4.1- Efeito da ativação de mGluRs na imunorreatividade do GABA
Em comparação a retinas fixadas diretamente, que não foram incubadas
por 30 ou 50 minutos em Ringer (não mostrado), a imunorreatividade para o GABA
apresentada pelos controles de retinas de PE se mostrou com um padrão similar,
mas com diminuição da intensidade de marcação, principalmente nas células
horizontais (Fig. 17 e 18).
Começamos testando qual seria o efeito da ativação dos grupos I, II e III
durante 30 minutos na liberação de GABA em PE. Observamos que, tanto o
tratamento com 100 µM de T-ACPD (Fig. 17) quanto com 100 µM de L-SOP (Fig. 18)
foi capaz de induzir a diminuição do número de células GABA+ em relação ao
controle.
Realizamos um ensaio de liberação de LDH para verificarmos se a
diminuição do número de células poderia ter acontecido devido a morte celular por
necrose. Os níveis de LDH liberados em todos os grupos experimentais foram
similares, indicando que, provavelmente, o efeito das drogas não era por indução de
morte celular (Fig. 19).
A densidade óptica da imunorreatividade para o GABA foi medida nos
grupos tratados, e verificamos que ocorre a diminuição da intensidade de marcação
em todas as sublâminas, tanto no tratamento com T-ACPD quanto no com L-SOP,
com exceção da sublâmina 1 no tratamento com L-SOP (Fig. 20).
Posteriormente, utilizamos os antagonistas dos mGluRs para verificar se
os agonistas estariam agindo especificamente sobre os receptores. A pré-incubação
60

de 20 minutos com AIDA, antagonista do mGluRI, na concentração de 200 µM e
posterior incubação com T-ACPD, inibiu parcialmente o efeito do agonista, indicando
a participação dos mGluRI na diminuição do número de células GABA+. O
antagonista do mGluRII, MCCG, na concentração de 200 µM, também bloqueou
parcialmente o efeito do T-ACPD. A utilização dos dois antagonistas de forma
concomitante bloqueou totalmente o efeito da ativação dos receptores, elevando o
número de células GABA+ ao nível do controle (Fig. 17).
A utilização do antagonista MAP-4, na concentração de 500 µM, bloqueou
completamente o efeito de L-SOP em diminuir o número de células GABA+ (Fig. 18).
4.4.2- Influência do bloqueio do transportador de GABA (GAT-1) no efeito
induzido por mGluRs
Em trabalhos anteriores já foi descrito que, na retina de pinto, a liberação
de GABA induzida pela ativação de receptores ionotrópicos de glutamato ocorre pela
reversão do transportador de GABA do tipo GAT-1 (Calaza et al., 2001). Para
verificar se o mesmo ocorre devido à ativação dos mGluRs, utilizamos a droga NO-
711, bloqueadora de GAT-1, na concentração de 100 µM por 20 minutos antes da
adição de T-ACPD ou L-SOP, e por mais 30 minutos em conjunto com estes
agonistas. Verificamos que o bloqueio de GAT-1 inibiu a liberação de GABA
estimulada pelos agonistas mGluRs, e também aumentou o número de células em
relação ao controle (Fig. 21).
61

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 17 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I/II nas células
amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de cortes
transversais de retinas de animais pós-eclosão marcadas para GABA. A, controle; B, 100 µM de T-
ACPD, agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, pré-incubação com 200 µM de AIDA,
antagonista do grupo I dos mGluRs, e posterior tratamento com T-ACPD e AIDA; D, pré-incubação
com 200 µM de MCCG, antagonista do grupo II dos mGluRs, e posterior tratamento com T-ACPD
e MCCG; E, pré-incubação de AIDA e MCCG (200 µM), e posterior tratamento com T-ACPD, AIDA
e MCCG. Escala = 50 µm; F, histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas
GABA+ em relação a 100% do controle (* - p

Figura 18 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos do grupo III nas células
amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de cortes
transversais de retinas de animais pós-eclosão marcadas para GABA. A, controle; B, 100 µM de L-
SOP, agonista do grupo III dos mGluRs; C, pré-incubação com 500 µM de MAP-4, antagonista do
grupo III dos mGluRs, e posterior tratamento com L-SOP e MAP-4. Escala = 50 µm; D,
histograma mostrando a estatística do número de células amácrinas GABA+ em relação a 100%
do controle (*** - p

Figura 19 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I, II e III na
liberação de LDH de células retinianas. Histograma mostrando estatisticamente os resultados
do ensaio de liberação de LDH com 100 µM de T-ACPD e nos grupos tratados com 100 µM de L-
SOP (n=3).
Figura 20 – Efeito da ativação dos receptores metabotrópicos dos grupos I, II e III na
imunorreatividade nas sublâminas da CPI. Histograma mostrando a densidade óptica da
imunorreatividade para o GABA na CPI no controle, nos grupos tratados com 100 µM de T-ACPD
e nos grupos tratados com 100 µM de L-SOP (n=7).
64

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 21 – Efeito da inibição de GAT-1 no tratamento com agonista de mGluRI, II e III nas
células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de
cortes transversais de retinas de animais pós-eclosão marcadas para GABA. A, controle; B, 100
µM de T-ACPD, agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, 100 µM de L-SOP, agonista do grupo
III; D, pré-incubação com 100 µM de NO-711, bloqueador de GAT-1, e posterior tratamento com T-
ACPD e NO-711; E pré-incubação com 100 µM de NO-711, antagonista bloqueador de GAT-1, e
posterior tratamento com L-SOP e NO-711. Escala = 50 µm; F, histograma mostrando a estatística
do número de células amácrinas GABA+ em relação a 100% do controle (* - p

4.4.3- Influência do bloqueio dos receptores ionotrópicos de glutamato no
efeito induzido por mGluRs
Assim como em E18, verificamos se para que haja a liberação de GABA
induzida pela ativação de mGluRs, é necessária uma ativação indireta de receptores
ionotrópicos. As retinas de PE foram pré-incubadas por 20 minutos com MK-801,
antagonista do receptor NMDA, na concentração de 5 µM, e/ou com DNQX,
antagonista dos receptores AMPA/KA, na concentração de 200 µM. Observamos
que o bloqueio dos receptores NMDA e KA, separadamente, inibiu totalmente o
efeito da liberação de GABA pelo T-ACPD (Fig. 22) assim como pelo L-SOP (Fig.
23). O uso concomitante dos dois antagonistas de receptores ionotrópicos resultou
no bloqueio da liberação de GABA induzida pela ativação dos três grupos de
mGluRs, inclusive aumentando o número de células em relação ao controle (Fig. 22
e Fig. 23).
66

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 22 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com agonista de
mGluRI/II nas células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias
representativas de cortes transversais de retinas de animais pós-eclosão marcadas para GABA. A,
controle; B, 100 µM de T-ACPD, agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, pré-incubação com 5
µM de MK-801, antagonista de receptores NMDA, e posterior tratamento com T-ACPD e MK; D,
pré-incubação com 200 µM de DNQX, antagonista de receptores KA, e posterior tratamento com
T-ACPD e DNQX; E, pré-incubação com MK e DNQX, e posterior tratamento com T-ACPD e os
dois antagonistas. Escala = 50 µm; F, histograma mostrando a estatística do número de células
amácrinas GABA+ em relação a 100% do controle (* - p

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CPE
CNI
CPI
CCG
Figura 23 – Efeito da inibição dos receptores ionotrópicos no tratamento com agonista de
mGluRIII nas células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias
representativas de cortes transversais de retinas de animais pós-eclosão marcadas para GABA. A,
controle; B, 100 µM de L-SOP, agonista do grupo III dos mGluRs; C, pré-incubação com 5 µM de
MK-801, antagonista de receptores NMDA, e posterior tratamento com L-SOP e MK; D, préincubação
com 200 µM de DNQX, antagonista de receptores KA, e posterior tratamento com L-
SOP e DNQX; E pré-incubação com MK e DNQX, e posterior tratamento com L-SOP e os dois
antagonistas. Escala = 50 µm; F, histograma mostrando a estatística do número de células
amácrinas GABA+ em relação a 100% do controle (* - p

4.4.4- Liberação de glutamato induzida por ativação de mGluRs
Anteriormente, mostramos que a ativação de mGluRs induz a liberação
de GABA de células amácrinas da retina de animais PE, e que este efeito depende
da ativação de receptores ionotrópicos de glutamato. Considerando a possibilidade
de que os mGluRs estariam levando a um aumento da liberação de glutamato em
células da retina, e este glutamato ativaria receptores ionotrópicos, levando à
liberação de GABA, nós verificamos o efeito do T-ACPD na ausência de cálcio, e
quantificamos o glutamato presente no meio extracelular após incubação com os
fármacos.
A ausência de cálcio no meio extracelular foi capaz de bloquear
totalmente a liberação de GABA induzida por T-ACPD (Fig. 24), indicando que este
efeito deve depender da liberação de alguma substância de maneira vesicular.
No ensaio de liberação de glutamato, o tratamento com 100 µM de T-
ACPD por 30 minutos levou ao aumento de cerca de 50% da liberação de glutamato
em relação ao controle (Fig. 25). Este efeito foi bloqueado pela ausência do íon Ca 2+
no meio extracelular, indicando que o mecanismo de liberação de glutamato
mediado por mGluRs dos grupos I e II deve ser vesicular. O tratamento com L-SOP,
no entanto, não promoveu aumento na liberação de glutamato.
69

CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CNI
CPI
CCG
Figura 24 – Efeito da ausência de cálcio no tratamento com agonista de mGluRI/II nas
células amácrinas GABA+ da camada nuclear interna. Fotomicrografias representativas de
cortes transversais de retinas de animais pós-eclosão marcadas para GABA. A, controle; B, 100
µM de T-ACPD, agonista dos grupos I e II dos mGluRs; C, 100 µM de T-ACPD, agonista dos
grupos I e II dos mGluRs, na ausência de cálcio. Escala = 50 µm; D, histograma mostrando a
estatística do número de células amácrinas GABA+ em relação a 100% do controle (*** - p

Figura 25 – Efeito de agonistas de mGluRI/II/III e da ausência de cálcio na liberação de
glutamato de células retinianas. Histograma mostrando a estatística do ensaio de dosagem do
glutamato liberado em relação a 100% do controle. Números nas barras indicam número de
animais utilizados em cada grupo experimental. * p

5. DISCUSSÃO
5.1- A liberação de GABA induzida por glutamato durante o desenvolvimento
Nossos resultados mostram que a ativação de receptores metabotrópicos
de glutamato promove liberação de GABA de células amácrinas da retina de galinha
a partir de E18, mas não significativamente em idades anteriores. Porém, há
evidências da expressão dos mGluRs em estágios anteriores a E14. Um estudo
prévio mostrou que, em células amácrinas de cultura de células da retina de E8 (6
dias in vitro), a ativação de receptores mGluR5 promove uma modulação positiva do
receptor GABAA, aumentando a corrente por este receptor, sendo esse aumento
dependente de PKC (Hoffpauir e Gleason, 2002). Na retina de gato P2, a injeção
intraocular de L-AP4, agonista de mGluRIII, por 28 dias, promove alterações na
arborização dendrítica de células ganglionares (Deplano et al., 2004). Sendo assim,
inferimos que, durante o desenvolvimento, os mGluRs devem estar acoplados às
suas respectivas proteínas G, promovendo sinalização semelhante àquela
encontrada no animal adulto, mas que devem estar voltadas para funções
pertinentes às etapas do desenvolvimento, como diferenciação celular e
sinaptogênese.
Além disso, um trabalho prévio do nosso grupo descreve que, em E14, a
ativação de receptores NMDA e KA induz a liberação de GABA de células amácrinas
da retina (Calaza et al., 2003). Assim, a maquinaria envolvida na liberação de GABA
estaria presente já em E14. Porém, apesar de os mGluRI já estarem expressos em
E14 e E16 (Kreimborg et al., 2001), a maquinaria responsável por promover a
liberação de glutamato e, conseqüentemente, de GABA, poderia não ser funcional
72

nestas etapas do desenvolvimento.
As vias de sinalização intracelular envolvidas nos processos mediados
por mGluRs também já tem sido investigadas. Um exemplo é a participação de
receptores dos grupos I e III em eventos de diferenciação e proliferação celular de
células-tronco embrionárias demonstrada em roedores. O receptor mGluR5, na
presença do fator inibidor de leucemia (LIF), mantém células-tronco em estado
indiferenciado e com pluripotência. Isto porque o mGluR5 ativa a PKC, inibindo a
atividade da AKT, permitindo que a expressão do gene c-Myc seja mantida
(Cappuccio et al., 2005; Spinsanti et al., 2005). Quando essas células se tornam
corpos embrióides, elas passam a expressar mGluR4, cuja ativação, dependendo
das outras substâncias presentes no microambiente, pode levar ao
comprometimento dessas células com o fenótipo neural ou com outros fenótipos,
como ectodermal ou mesodermal (Cappuccio et al., 2006). Já como neuroesferas,
essas células expressam o receptor mGluR7 que, ativado, utiliza a sinalização por
MAP-cinases para promover a diferenciação dessas células em neurônios (Tian et
al., 2010). Portanto, é provável que os mGluRs ativem vias que contribuam com
processos biológicos básicos para o desenvolvimento normal do organismo.
Em E14 e E16, os segmentos externos dos fotorreceptores ainda não
estão completamente desenvolvidos, mas em E18, eles já estão presentes,
permitindo que os fotorreceptores respondam a estímulos luminosos (Calaza e
Gardino, 2010). Sendo assim, podemos supor que exista alguma relação entre a
liberação de glutamato induzida por mGluRs e o início de atividades elétricas
espontâneas na retina externa, e que a liberação de GABA estimulada pela ativação
de mGluRs seja característica de uma retina com perfil maduro e, portanto,
73

importante para o correto pré-processamento da informação luminosa feito pela
retina.
5.2- A liberação de GABA induzida por glutamato no animal pós-eclosão
Dados previamente publicados por nosso grupo demonstraram que a
ativação de receptores do tipo NMDA e KA induz uma redução de cerca de 50% do
número de células amácrinas GABA+ em relação ao controle (Calaza et al., 2001).
Os resultados obtidos neste trabalho mostram fortes evidências de que a liberação
de GABA induzida por glutamato na retina ocorre, em sua maior parte, devido a
ativação direta de receptores ionotrópicos, haja vista que o bloqueio desses
receptores foi bastante eficiente em impedir a liberação de GABA induzida por T-
ACPD e L-SOP. Aparentemente, há uma diferença na quantidade total de células
amácrinas que liberam GABA pelo estímulo direto com agonistas iGluRs (50%) ou
com agonistas mGluRs (30%). Assim, é possível que os mGluRs estejam regulando
mais especificamente um determinado circuito, que envolve também os iGluRs, para
liberar GABA das células amácrinas.
Recentemente, Monnerie e Le Roux (2008) mostraram que células
corticais em cultura, quando expostas a glutamato na concentração de 100 µM por 5
minutos, apresentam diminuição da expressão da enzima GAD, responsável pela
síntese de GABA, através de um mecanismo envolvendo Ca 2+ e cisteína-proteases
como a calpaína. Aparentemente, no nosso modelo, não ocorre a diminuição de
GABA dentro da célula devido a uma menor expressão da GAD, principalmente pelo
fato de que o bloqueador da GAT mostrou um efeito significativo em inibir a
diminuição do número de células GABA+ induzida pelo T-ACPD.
74

Os transportadores de GABA são majoritariamente expressos na retina
interna, em corpos celulares e prolongamentos de células amácrinas e células da
camada de células ganglionares, possivelmente células amácrinas deslocadas
(Calaza et al., 2003). A função principal destes transportadores seria a de captar o
GABA extracelular. Na retina de aves, inclusive de galinha, a captação de GABA é
feita pelos transportadores presentes nos neurônios, enquanto que, na retina de
mamíferos, ocorre a captação também pelas células de Müller (Yazulla, 1986;
Andrade da Costa et al., 2000).
A liberação de GABA induzida pela ativação de receptores
metabotrópicos e ionotrópicos, via reversão do transportador, pode ocorrer devido à
entrada de sódio na proximidade do transportador, aumentando a concentração do
íon localmente, o que permite que o sódio volte para o meio extracelular, levando
consigo uma molécula de neurotransmissor. Acreditamos que nosso efeito ocorra
através deste mecanismo, pois o bloqueio do transportador GAT-1 preveniu
completamente o nosso efeito de diminuição do número de células GABA+, inclusive
aumentando o número de células em relação ao controle.
Um trabalho recente usando a retina de camundongo investigou a
influência da aplicação de um fármaco agonista do receptor mGluR8 em respostas
eletrofisiológicas de células ganglionares à luz. Na presença do fármaco, células
ganglionares ON-OFF tiveram sua resposta OFF suprimida, enquanto a resposta ON
se manteve inalterada, o que indica que este receptor pode estar modulando a
liberação de neurotransmissores para essas células, favorecendo a ativação de
apenas uma das vias (Quraishi et al., 2010).
Já foi sugerido que a liberação de neurotransmissores inibitórios de
75

células amácrinas possa ser responsável por inibições cruzadas entre as vias ON e
OFF: quando glutamato é liberado pelas bipolares ON, talvez ele possa promover a
inibição de bipolares OFF adjacentes através da liberação de GABA por células
amácrinas (Higgs et al., 2002). Sendo assim, nossos dados e trabalhos da literatura
corroboram com o fato de os mGluRs terem uma importância grande na fisiologia da
retina, modulando a circuitaria GABAérgica.
5.3- A liberação de glutamato induzida pela ativação de mGluRs no animal pós-
eclosão
Verificamos que ocorre o aumento da liberação de glutamato quando as
retinas são tratadas com T-ACPD. No entanto, o tratamento com L-SOP não
promoveu alterações nos níveis de glutamato no meio em relação ao controle. Isto
pode ser explicado pelo fato de estarmos observando a liberação de glutamato da
retina inteira, e o L-SOP pode ativar também o receptor mGluR6. Além de o mGluR6
diminuir a liberação de glutamato nas células bipolares ON, agonistas do grupo III
também podem diminuir a liberação de glutamato devido a um menor influxo de
cálcio em fotorreceptores (Koulen et al., 1999). Então, o fato de não termos
detectado esta diminuição na liberação poderia ser devido: 1) a não ativação destes
receptores, ou 2) por um efeito compensatório do aumento da liberação de
glutamato por outros tipos celulares, e outros subtipos do mGluRIII. A primeira
hipótese parece mais fraca já que a mesma concentração induziu a liberação de
GABA, que é bloqueada pelos antagonistas seletivos do grupo III e de forma
dependente dos iGluRs, sugerindo que os mGluRIII estejam sendo ativados nesta
concentração. Já a segunda hipótese explicaria o motivo pelo qual não
76

encontramos variação na liberação de glutamato. Possivelmente, a ativação não-
seletiva de todos os receptores metabotrópicos do grupo III gera efeitos diferentes
em tipos celulares diferentes, impedindo a análise de variações (tanto a diminuição
quanto o aumento) na liberação de glutamato.
O bloqueio simultâneo de ambos os receptores ionotrópicos de glutamato
aumentou significativamente o número de células marcadas em relação ao controle,
indicando que, mesmo nossas condições controle, existe liberação de GABA
induzida por glutamato endógeno, que foi confirmado posteriormente pelo nosso
ensaio de liberação de glutamato, mostrando que, no controle, existe tanto
glutamato no meio quanto no padrão de 25 µM. Ou seja, os receptores ionotrópicos
são ativados por glutamato basal, e a ativação de mGluRs aumenta a concentração
de glutamato, o que leva a uma maior liberação de GABA de células amácrinas.
Existem trabalhos que explicam como os mesmos receptores poderiam
gerar efeitos antagônicos. Um fator determinante para a diferença na resposta seria
o receptor estar fosforilado ou não. Um receptor não fosforilado, quando ativado,
levaria a formação de IP3 e aumento de liberação de glutamato; um receptor
fosforilado pela PKC, por exemplo, poderia ativar uma via alternativa, que levaria a
diminuição da liberação de glutamato (Herrero et al., 1998; Nicoletti et al., 1999).
Com relação a receptores do grupo III, já foi descrito que, em
sinaptossomas, a liberação de glutamato estimulada por alto potássio pode ser tanto
aumentada ou diminuída quando o receptor mGluR7 é ativado. Essa modulação
ocorria devido a pequenas mudanças no tipo de estimulação. A diminuição da
liberação de glutamato era vista quando o receptor recebia estímulos breves (30
segundos) com L-AP4, agonista do grupo III, e o aumento da liberação de glutamato
77

era visto quando L-AP4 era utilizado por 10 minutos. O autor sugere que possa
haver ativação de duas vias distintas: com a estimulação breve seria ativada a via
clássica do receptor, dependente de proteína Gi/o, o que diminuiria o influxo de
cálcio e a liberação de glutamato; com a estimulação longa, seria ativada uma via
alternativa, que levaria à ativação de fosfolipase C, hidrólise de fosfolipídeos,
formação de diacilglicerol, e que esse último seria responsável pela translocação da
proteína munc13-1, que faz parte de complexos de ancoramento de vesículas
sinápticas à membrana, e isto geraria um aumento da liberação de glutamato (Martín
et al., 2010).
5.4- Mecanismos de modulação da função de receptores
Apesar de sabermos que ocorre a liberação de glutamato após o
tratamento com o agonista dos mGluRI/II, não podemos excluir outras possibilidades
para os nossos efeitos, já que os receptores metabotrópicos estão localizados tanto
em terminais pré quanto pós-sinápticos.
Já foi mostrado que existe a possibilidade de mGluRs interagirem
fisicamente com receptores ionotrópicos da mesma microrregião da célula. Esta
interação dependeria da presença da cauda C-terminal destes receptores, e
funcionaria como um mecanismo para a regulação mútua destes receptores, ou
seja, se os dois fossem ativados ao mesmo tempo, a resposta fisiológica final
decorrente da ativação de um deles seria diminuída (Perroy et al., 2008).
Em outras regiões do SNC, como no hipocampo, já foi visto outro tipo de
interação entre receptores ionotrópicos e metabotrópicos de glutamato. Negrete-
78

Díaz e colaboradores (2007) realizaram um trabalho no qual perceberam que a
aplicação de KA ou de um agonista do grupo II dos receptores metabotrópicos
produzia um efeito similar de inibição de potencial excitatório pós-sináptico (PEPS),
e que a ação concomitante das drogas nos dois receptores impediria este efeito, o
que pode significar uma convergência entre os mecanismos utilizados por esses
receptores (Negrete-Díaz et al., 2007). Nossos resultados apontam efeitos
sinergísticos, e não antagônicos, entre receptores metabotrópicos e ionotrópicos de
glutamato quando são ativados ao mesmo tempo, mas não temos informações
sobre a localização e a proximidade dos receptores.
Os receptores metabotrópicos do grupo I podem potencializar o efeito de
liberação de GABA induzido pela ativação do receptor NMDA decorrente da
liberação de glutamato endógeno, sem necessitar da interação entre os receptores.
Este mecanismo se daria por duas vias paralelas: pela ativação da fosfolipase C β
(PLC β) ou pela ativação direta da tirosina cinase citoplasmática Src pela β-arrestina
(Gerber et al., 2007). Os receptores KA também podem ser modulados por mGluRs
do grupo I. Foi demonstrado previamente que o antagonista do grupo I, AIDA, é
capaz de prevenir a disfunção epiléptica hipocampal promovida por cainato,
mostrando que também é possível a integração funcional desses receptores
(Renaud et al., 2002).
Receptores do grupo II também podem estar localizados pós-
sinapticamente e, inclusive, potencializar a corrente de receptores NMDA, assim
como os mGluRs do grupo I, mas o mecanismo através do qual isto ocorre é
desconhecido (Oliveira et al., 2008).
Os receptores dos grupos II e III podem se associar a proteínas
79

intracelulares na retina. Já foi mostrado que, na retina de rato, a proteína RanBPM
pode se ligar a todos os receptores destes dois grupos, exceto ao mGluR6 (Seebahn
et al., 2008). Várias isoformas de outra proteína, conhecida como Band 4.1,
interagem com o receptor mGluR8 (Rose et al., 2008). Tanto RanBPM quanto Band
4.1 são bastante expressas na retina e, sendo proteínas adaptadoras do
citoesqueleto, seriam responsáveis pela manutenção da estabilidade dos receptores
na membrana e pela aproximação de receptores, como ionotrópicos e
metabotrópicos de glutamato, o que poderia facilitar a integração da sinalização
promovida por eles. Ainda, poderiam modular a ligação da proteína G ao receptor e
permitir a ativação de vias de sinalização alternativas, como a da proteína fostatase
1 (Seebahn et al., 2008; Rose et al., 2008). Além disso, já foi descrita ao longo de
todo o desenvolvimento da retina de galinha a presença do RNAm para as proteínas
Homer, que podem se ligar a receptores do grupo I, mas não foi feito um estudo
sobre a expressão das proteínas (Wahlin et al., 2008).
Sendo assim, mais estudos devem ser conduzidos para o correto
entendimento da sinalização e da integração de sinais destes receptores na retina e
das proteínas que podem se ligar a eles.
5.5- Células amácrinas GABAérgicas e mGluRs
Alguns estudos propõem funções fisiológicas para os mGluRs em células
amácrinas. Na retina de coelho, a ativação dos receptores do grupo II promove a
diminuição de respostas seletivas a sentido de movimento da luz, pelas quais são
responsáveis as células amácrinas starburst, que liberam GABA e acetilcolina, o que
indica a possibilidade desses receptores estarem relacionados às funções exercidas
80

por essas células (Jensen, 2006).
Outros trabalhos, realizados em cultura de células da retina, mostram que
a ativação de receptores do grupo III modula negativamente a liberação de
acetilcolina de células amácrinas. Apesar de a ativação somente do grupo I não ter
tido efeito, quando os grupos I e III eram ativados ao mesmo tempo, o efeito de
diminuição da liberação de acetilcolina era bloqueado. A ativação dos receptores do
grupo II diminuía a produção de AMPc. Esses dados demonstram que,
aparentemente, todos os grupos de receptores estão na célula, que suas vias
podem interagir e que eles têm papéis funcionais importantes (Caramelo et al.,
1999).
5.6- mGluRs, glutamato e GABA: neuroproteção ou injúria?
O fato de altas concentrações de glutamato poderem levar a
excitotoxicidade em células neuronais é bastante conhecido e estudado. Isto
ocorreria devido ao aumento de cálcio, que causa aumento de radicais livres e
ativação de vias de morte celular (Léveillé et al., 2008).
Já foi visto que a ativação de mGluR5 de células amácrinas em cultura
causa um aumento do cálcio intracelular, enquanto a ativação concomitante de
mGluR1 inibe este aumento, o que é bastante interessante, já que os dois
receptores são do mesmo grupo e, teoricamente, se acoplam à mesma via de
sinalização (Kreimborg et al., 2001). Essa ação protetora de mGluR1 parece ser
mediada pela fosforilação da ERK, sendo esta fosforilação dependente da ativação
de Src e independente da ativação de proteína G (Emery et al., 2010).
81

Em outros sistemas, a ativação dos receptores do grupo I é capaz de
reduzir a morte celular promovida por tratamento com NMDA (Adamchik e Baskys,
2000). Possivelmente, as ações protetoras promovidas por esses receptores em
outros regiões (Battaglia et al., 2001; Cozzi et al., 2002; Zheng e Johnson, 2003)
poderia estar ocorrendo na retina. Se um excesso de glutamato estivesse a ponto de
causar danos por excesso de excitabilidade, a liberação de GABA poderia atuar
diminuindo a entrada de cálcio excessiva e prevenindo a ativação de vias celulares
que levariam a estresse oxidativo, injúria e morte dessas células.
Existe outra linha de raciocínio para relacionar nossos efeitos a
neuroproteção: a liberação de glutamato poderia estar sendo protetora por estar
promovendo a liberação de BDNF, uma neurotrofina. Este efeito protetor do
glutamato foi demonstrado em células da retina de ratos em desenvolvimento e
dependia da ativação de receptores NMDA (Rocha et al., 1999). Já foi visto que a
ativação de receptores metabotrópicos de glutamato do grupo II aumenta o RNAm
para BDNF no hipocampo (Di Liberto et al., 2010). Sendo assim, a ativação desses
receptores, além de estarem contribuindo para o aumento da liberação de glutamato
que, através de receptores NMDA, podem estar também auxiliando no aumento da
síntese e da liberação de BDNF, participando da neuroproteção de células retinianas
induzida por glutamato.
Quanto à liberação de GABA induzida por glutamato na retina de galinha,
também existem relatos de que poderia aumentar a injúria e morte celular. Os
estudos, feitos em embriões de 14 a 16 dias, mostram que estímulos que induzem a
liberação de GABA por reversão do transportador (adição de NMDA ou KA) levam
ao inchaço de células amácrinas e de células da camada de células ganglionares
82

(Zeevalk e Nicklas, 1997). Esse efeito ocorreria devido à entrada de cloreto (Cl - ) pelo
próprio receptor ionotrópico de GABA, ou outros canais, sendo uma possibilidade da
ocorrência de excitotoxicidade independente de cálcio (Chen et al., 1998). Portanto,
apenas com os dados obtidos neste estudo, não podemos afirmar se, além de
participarem da fisiologia da retina, os receptores metabotrópicos exercem um efeito
protetor ou tóxico.
83

6. CONCLUSÕES
• Em E14, a circuitaria GABAérgica não parece ser modulada por mGluRs;
• Em retinas E16, parece começar a ocorrer uma discreta modulação do
sistema GABAérgico por mGluR, que não é significativa;
• A ativação de mGluRI/II/III promove liberação de GABA de células amácrinas
de E18 e PE;
• A estimulação de mGluRI/II ou mGluRIII não induz morte celular na retina;
• A liberação de GABA por células amácrinas parece ocorrer via reversão do
transportador de GABA.
• Os resultados sugerem que a ativação dos mGluRs poderia induzir a uma
liberação de glutamato dependente de cálcio, que atuaria em receptores
ionotrópicos de glutamato, resultando na liberação de GABA dependente de
sódio pelas células amácrinas.
84

7. PERSPECTIVAS
Como não foram descritas muitas informações sobre os receptores
metabotrópicos de glutamato do grupo III na retina de pinto, durante o
desenvolvimento, nossos próximos passos serão estudar a ontogênese dos mGluRs
do grupo III na retina de pinto, utilizando imunohistoquímica e Western blot.
Estudaremos, a princípio, os receptores mGluR4 e mGluR6/7, por disponibilidade de
anticorpo que funciona na retina de pinto.
Para o estudo da liberação de glutamato mediada por mGluRIII na retina,
precisamos utilizar agonistas específicos para cada tipo de receptor.
Investigaremos, ainda, quais são as vias de sinalização intracelulares que
estão envolvidas no mecanismo de liberação de GABA induzido pela ativação de
mGluRs e iGluRs na retina.
Além disso, pretendemos também fazer estudos de localização desses
receptores com receptores ionotrópicos, através de dupla marcação por
imunofluorescência. Também existe a possibilidade de realizarmos ensaios de
imunoprecipitação, para verificar se existe interação física entre estes receptores.
Ainda, é interessante verificarmos o efeito dos receptores metabotrópicos
sendo protetor ou danoso à retina. Pretendemos, para este estudo, utilizar uma
abordagem na qual induzimos morte celular através de deprivação de glicose e
oxigênio. Caso a adição de antagonistas de receptores metabotrópicos promova
algum tipo de proteção, teremos indícios de que a ativação deles contribui para
danos excitotóxicos promovidos pela liberação de glutamato e GABA na retina.
85

Os resultados obtidos neste trabalho e as referências consultadas nos
oferecem diversas linhas de raciocínio e possibilidades para o prosseguimento deste
projeto. Ainda há muitas perguntas a serem respondidas e muitas controvérsias a
serem explicadas, mas resta a certeza de que os receptores metabotrópicos de
glutamato são importantes para o processamento da luz pela retina, que permanece
aos nossos olhos como uma das estruturas mais complexas e instigantes de serem
estudadas.
86

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACHER, F. C., SELVAM, C., PIN, J. P., GOUDET, C., BERTRAND, H. O. A
critical pocket close to the glutamate binding site of mGlu receptors opens new
possibilities for agonist design. Neuropharmacology, v. 60(1), pp. 102-107, 2011.
ALEXANDER, G. M., GODWIN, D. W. Unique presynaptic and postsynaptic roles
of group II metabotropic glutamate receptors in the modulation of thalamic
network activity. Neuroscience, v. 141 (1), pp. 501-513, 2006.
ADAMCHIK, Y., BASKYS, A. Glutamate-mediated neuroprotection against Nmethyl-D-aspartate
toxicity: a role for metabotropic glutamate receptors.
Neuroscience, v. 99 (4), pp. 731-736, 2000.
ANDRADE DA COSTA, B. L., DE MELLO, F. G., HOKOÇ, J. N. Transportermediated
GABA release induced by excitatory amino acid agonist is associated
with GAD-67 but not GAD-65 immunoreactive cells of the primate retina. Brain
Research, v. 863(1-2), pp. 132-142, 2000.
ANJANEYULU, M., BERENT-SPILLSON, A., RUSSEL, J. W. Metabotropic
glutamate receptors and diabetic neuropathy. Current Drugs Targets, v. 9, pp. 85-
93, 2008.
BATTAGLIA, G., BRUNO, V., PISANI, A., CENTONZE, D., CATANIA, M.V.,
CALABRESI, P., NICOLETTI, F. Selective blockade of type-1 metabotropic
glutamate receptors induces neuroprotection by enhancing GABAergic
transmission. Molecular and Cellular Neurosciences, v. 17 (6), pp.1071-83, 2001.
BELOZERTSEVA, I.V., KOS, T., POPIK, P., DANYSZ, W., BESPALOV, A.Y.
Antidepressant-like effects of mGluR1 and mGluR5 antagonists in the rat forced
swim and the mouse tail suspension tests. European neuropsychopharmacology,
v. 17 (3), pp. 172-179, 2007.
BERAUDI, A., BRUNO, V., BATTAGLIA, G., BIAGIONI, F., RAMPELLO, L.,
NICOLETTI, F., POLI, A. Pharmacological activation of mGluR2/3 metabotropic
glutamate receptors protects retinal neurons against anoxic damage in the
goldfish Carassius auratus. Experimental Eye Research, v. 84, pp. 544-552,
2007.
BLOOMFIELD, S. A., XIN, D. Surround inhibition of mammalian AII amacrine cells
is generated in the proximal retina. Journal of Physiology, v. 523 (3), pp. 771-783,
2000.
BORMANN, J. The „ABC‟ of GABA receptors. Trends in Pharmacological
Sciences, v. 21 (1), pp. 16-19, 2000.
87

BRANDSTÄTTER, J. H., KOULEN, P., WÄSSLE, H. Diversity of glutamate
receptors in the mammalian retina. Vision Research, v. 38, pp. 1385-1397, 1998.
BRINGMANN, A., REICHENBACH, A. Role of Müller cells in retinal degeneration.
Frontiers in Bioscience, v. 6, pp. 72-92, 2001.
BURNASHEV, N., VILLARROEL, A., SAKMANN, B. Dimensions and ion
selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their
dependence on Q/R site residues. Journal of Physiology, v. 496 (1), pp. 165-173,
1995.
CALABRESI, P., MAJ, R., PISANI, A., MERCURI, N. B., BERNARDI, G. Longterm
synaptic depression in the striatum: physiological and pharmacological
characterization. The Journal of Neuroscience, v. 12 (11), pp. 4224-4233, 1992.
CALAZA, K. C., DE MELLO, F. G., GARDINO, P. F. GABA release induced by
aspartate-mediated activation of NMDA receptors is modulated by dopamine in a
selective subpopulation of amacrine cells. Journal of Neurocytology, v. 30 (3), pp.
181-93, 2001.
CALAZA, K. C., DE MELLO, M. C. F., DE MELLO, F. G., GARDINO, P. F. Local
differences in GABA release induced by excitatory amino acids during retina
development: selective activation of NMDA receptors by aspartate in the inner
retina. Neurochemical Research, v. 28, pp. 1475-1485, 2003.
CALAZA, K. C., HOKOÇ, J. N., GARDINO, P. F. GABAergic circuitry in the
opossum retina: a GABA release induced by L-aspartate. Experimental Brain
Research, v. 172 (3), pp. 322-330, 2006.
CALAZA, K. C., GARDINO, P. F. Neurochemical phenotype and birthdating of
specific cell populations in the chick retina. Anais da Academia Brasileira de
Ciências, v. 82(3), pp. 595-608, 2010.
CAPPUCCIO, I., SPINSANTI, P., PORCELLINI, A., DESIDERATI, F., DE VITA,
T., STORTO, M., CAPOBIANCO, L., BATTAGLIA, G., NICOLETTI, F.,
MECHIORRI, D. Endogenous activation of mGlu5 metabotropic glutamate
receptors supports self-renewal of cultured mouse embryonic stem cells.
Neuropharmacology, v. 49 (1), pp. 196-205, 2005.
CAPPUCCIO, I., VERANI, R., SPINSANTI, P., NICCOLINI, C., GRADINI, R.,
COSTANTINO, S., NICOLETTI, F., MECHIORRI, D. Context-dependent
regulation of embryonic stem cell differentiation by mGlu4 metabotropic glutamate
receptors. Neuropharmacology, v. 51 (3), pp. 606-611, 2006.
CARAMELO, O. L., SANTOS, P. F., CARVALHO, A. P., DUARTE, C. B.
Metabotropic glutamate receptors modulate [(3)H]acetylcholine release from
88

cultured amacrine-like neurons. Journal of Neuroscience Research, v. 58(4), pp.
505-514, 1999.
CARLSON, N. R. Physiology of Behaviour, 6/e., Allyn and Bacon, 1998.
CARTMELL, J., SCHOEPP, D. D. Regulation of neurotransmitter release by
metabotropic glutamate receptors. Journal of Neurochemistry, v. 75 (3), pp. 889-
907, 2000.
CHÁVEZ, A. E., GRIMES, W. N., DIAMOND, J. S. Mechanisms underlying lateral
GABAergic feedback onto rod bipolar cells in rat retina. The Journal of
Neuroscience, v. 30(6), pp. 2330-2339, 2010.
CHAVIS, P., SHINOZAKI, H., BOCKAERT, J., FAGNI, L. The metabotropic
glutamate receptor types 2/3 inhibit L-type calcium channels via a pertussis toxinsensitive
G-protein in cultured cerebellar granule cells. The Journal of
Neuroscience, v. 14 (11 pt 2), pp. 7067-7076, 1994.
CHEN, Q., OLNEY, J. W., LUKASIEWICZ, P. D., ALMLI, T., ROMANO, C. Ca2 + -
independent excitotoxic neurodegeneration in isolated retina, an intact neural net:
a role for Cl - and inhibitory transmitters. Molecular Pharmacology, v. 53, pp. 564-
572, 1998.
CONN, P. J., PIN, J-P. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate
receptors. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. v. 37, pp. 205-237,
1997.
COZZI, A., MELI, E., CARLÀ, V., PELLICCIARI, R., MORONI, F., PELLEGRINI-
GIAMPIETRO, D. E. Metabotropic glutamate 1 (mGlu1) receptor antagonists
enhance GABAergic neurotransmission: a mechanism for the attenuation of postischemic
injury and epileptiform activity? Neuropharmacology, v. 43(2):119-30,
2002.
DE GRAFF, R. A., PATEL, A. B., ROTHMAN, D. L., BEHAN, K. L. Acute
regulation of steady-state GABA levels following GABA-transaminase inhibition in
rat cerebral cortex. Neurochemistry International, v. 48, pp. 508-514, 2006.
DEPLANO, S., GARGINI, C., MACCARONE, R., CHALUPA, L. M., BISTI, S.
Long-term treatment of the developing retina with the metabotropic glutamate
agonist APB induces long-term changes in the stratification of retinal ganglion cell
dendrites. Developmental Neuroscience, v. 26(5-6), pp. 396-405, 2004.
DI LIBERTO, V., BONOMO, A., FRINCHI, M., BELLUARDO, N., MUDÒ, G.
Group II metabotropic glutamate receptor activation by agonist LY379268
treatment increases the expression of brain derived neurotrophic factor in the
mouse brain. Neuropharmacology, v. 165(3), pp. 863-873, 2010.
89

DONG, C. J., HARE, W. A. Temporal modulation of scotopic visual signals by A17
amacrine cells in mammalian retina in vivo. Journal of Neurophysiology, v. 89(4),
pp. 2159-2166, 2003.
DOWLING, J. E., BOYCOTT, B. B. Neural connections of the retina: fine
structure of the inner plexiform layer. Cold Spring Harbor Symposia on
Quantitative Biology, v. 30, pp. 393-402, 1965.
DUVOISIN, R. M., MORGANS, C. W., TAYLOR, W. R. The mGluR6 receptors in
the retina: Analysis of a unique G-protein signaling pathway. Cellscience
Reviews, v. 2 (2), pp. 225–243, 2005.
EMERY, A. C., PSHENICHKIN, S., TAKOUDJOU, G. R., GRAJKOWSKA, E.,
WOLFE, B. B., WROBLEWSKI, J. T. The Protective Signaling of Metabotropic
Glutamate Receptor 1 Is Mediated by Sustained, β-Arrestin-1-dependent ERK
Phosphorylation. The Journal of Biological Chemistry, v. 285(34), pp. 26041-
26048, 2010.
EULER, T., MASLAND, R. H. J. Light-evoked responses of bipolar cells in a
mammalian retina. Neurophysioly, v. 83(4), pp. 1817-1829, 2000.
FRANCESCONI, A., DUVOISIN, R. M. Role of the second and third intracellular
loops of metabotropic glutamate receptors in mediating dual signal transduction
activation. The Journal of Biological Chemistry, v. 273 (10), pp. 5615-5624, 1998.
GERBER, U., GEE, C. E., BENQUET, P. Metabotropic glutamate receptors:
intracellular signaling pathways. Current Opinion in Pharmacology, v. 7, pp. 56-
61, 2007.
GEREAU, R. W. 4TH, HEINEMANN, S. F. Role of protein kinase C
phosphorylation in rapid desensitization of metabotropic glutamate receptor 5.
Neuron, v. 20 (1), pp.143-151, 1998.
GETHER, U., ANDERSEN, P. H., LARSSON, O. M., SCHOUSBOE, A.
Neurotransmitter transporters: molecular function of important drug targets.
Trends in Pharmacological Sciences, v. 27(7), pp. 375-383, 2006.
GEURTS, J. J. G., WOLSWIJK, G., BÖ, L., VAN DER VALK, P., POLMAN, C. H.,
TROOST, D., ARONICA, E. Altered expression patterns of group I and II
metabotropic glutamate receptors in multiple sclerosis. Brain, v. 126, pp. 1755-
1766, 2003.
GUPTA, D. S., MCCULLUMSMITH, R. E., BENEYTO, M., HAROUTUNIAN, V.,
DAVIS, K. L., MEADOR-WOODRUFF, J. H. Metabotropic glutamate receptor
protein expression in the prefrontal cortex and striatum in schizophrenia.
Synapse, v. 57 (3), pp. 123-131, 2005.
90

HACK, I., PEICHL, L., BRANDSTÄTTER, J. H. An alternative pathway for rod
signals in the rodent retina: Rod photoreceptors, cone bipolar cells, and the
localization of glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America (PNAS), v. 96 (24), pp. 14130-14135,
1999.
HERRERO, I., MIRAS-PORTUGAL, M. T., SÁNCHEZ-PRIETO, J. Functional
switch from facilitation to inhibition in the control of glutamate release by
metabotropic glutamate receptors. The Journal of Biological Chemistry, v. 273(4),
pp. 1951-1958, 1998.
HIGGS, M. H., ROMANO, C., LUKASIEWICZ, P. D. Presynaptic effect of group III
metabotropic glutamate receptors on excitatory synaptic transmission in the
retina. Neuroscience, v. 115 (1), pp. 163-172, 2002.
HIRASAWA, H. E., SHIELLS R., YAMADA, M. A Metabotropic glutamate receptor
regulates transmitter release from cone presynaptic terminals in carp retinal
slices. The Journal of General Physiology, v.119 (1), pp. 55-68, 2002.
HOFFPAUIR, B. K., GLEASON, E. L. Activation of mGluR5 modulates GABA(A)
receptor function in retinal amacrine cells. Journal of Neurophysiology, v. 88 (4),
pp. 1766-1776, 2002.
HOLLMANN, M., HEINEMANN, S. Cloned glutamate receptors. Annual Reviews
in Neuroscience, v. 17, pp. 31-108, 1994.
HOLLMANN, M., MARON, C., HEINEMANN, S. N-glycosylation site tagging
suggests a three transmembrane domain topology for the glutamate receptor
GluR1. Neuron, v.13 (6), pp. 1331-1343, 1994.
JENSEN, R. J. Activation of group II metabotropic glutamate receptors reduces
directional selectivity in retinal ganglion cells. Brain Research, v. 1122 (1), pp. 86-
92, 2006.
KANDEL, E. R., SCHWARTZ, J. H., JESSEL, T. M. Principles of Neuroscience,
4/e, McGraw-Hill Companies, 2003.
KOLB, H. How the retina works. American Scientist, v. 91, pp. 28-35, 2003.
KOULEN, P., BRANDSTÄTTER, J. H., ENZ, R., BORMANN, J., WÄSSLE, H.
Synaptic clustering of GABA(C) receptor rho-subunits in the rat retina. European
Journal of Neuroscience, v. 10(1), pp. 115-127, 1998.
KOULEN, P., KUHN, R., WÄSSLE, H., BRANDSTÄTTER, J.H. Modulation of the
intracellular calcium concentration in photoreceptor terminals by a presynaptic
metabotropic glutamate receptor. Proceedings of the National Academy of
91

Sciences of the United States of America (PNAS), v. 96, pp. 9909-9914, 1999.
KREIMBORG, K. M., LESTER, M. L., MEDLER, K. F., GLEASON, E. L. Group I
metabotropic glutamate receptors are expressed in the chicken retina and by
cultured retinal amacrine cells. Journal of Neurochemistry, v. 77 (2), pp. 452-465,
2001.
KRNJEVIĆ, K. When and why amino acids? The Journal of Physiology, v. 588(Pt
1), pp. 33-44, 2010.
LAFON-CAZAL, M., VIENNOIS, G., KUHN, R., MALITSCHEK, B., PIN, J. P.,
SHIGEMOTO, R., BOCKAERT, J. mGluR7-like receptor and GABA(B) receptor
activation enhance neurotoxic effects of N-methyl-D-aspartate in cultured mouse
striatal GABAergic neurones. Neuropharmacology, v. 38(10), pp. 1631-1640,
1999.
LAGNADO, L. Visual signals in the retina: from photons to synapses.
Experimental Physiology, v. 85 (1), pp. 1-16, 2000.
LAN, J., SKEBERDIS, V. A., JOVER, T., ZHENG, X., BENNETT, M. V. L., ZUKIN,
R. S. Activation of Metabotropic Glutamate Receptor 1 Accelerates NMDA
Receptor Trafficking. The Journal of Neuroscience, v. 21 (16), pp. 6058-6068,
2001.
LANG, B., ZHAO, L., CAI, L., MCKIE, L., FORRESTER, J. V., MCCAIG, C. D.,
JACKSON, I. J., SHEN, S. GABAergic amacrine cells and visual function are
reduced in PAC1 transgenic mice. Neuropharmacology, v. 58 (1), pp. 215-225,
2010.
LÉVEILLÉ, F., EL GAAMOUCH, F., GOUIX, E., LECOCQ, M., LOBNER, D.,
NICOLE, O., BUISSON, A. Neuronal viability is controlled by a functional relation
between synaptic and extrasynaptic NMDA receptors. The FASEB Journal, v. 22
(12), pp. 4258-4271, 2008.
LIGUZ-LECZNAR, M., SKANGIEL-KRAMSKA, J. Vesicular glutamate
transporters (VGLUTs): The three musketeers of glutamatergic system. Acta
Neurobiologiae Experimentalis, v. 67, pp. 207-218, 2007.
LIU, Y. B., DISTERHOFT, J. F., SLATER, N. T. Activation of metabotropic
glutamate receptors induces long-term depression of GABAergic inhibition in
hippocampus. Journal of Neurophysiology, v. 69 (3), pp.1000-1004, 1993.
LIU, B., LIAO, M., MIELKE, J. G., NING, K., CHEN, Y., LI, L., EL-HAYEK, Y. H.,
GOMEZ, E., ZUKIN, E. S., FEHLINGS, M. G., WAN, Q. Ischemic insults direct
glutamate receptor subunit 2-lacking AMPA receptors to synaptic sites. The
Journal of Neuroscience, v. 26 (20), pp. 5309-5319, 2006.
92

MAGGESISSI, R. S., GARDINO, P. F., GUIMARÃES-SOUZA, E. M., PAES-DE-
CARVALHO, R., SILVA, R. B., CALAZA, K. C. Modulation of GABA release by
nitric oxide in the chick retina: different effects of nitric oxide depending on the cell
population. Vision Research, v. 49(20), pp. 2494-2502, 2009.
MAKAREWICZ, D., DUSZCZYK, M., GADAMSKI, R., DANYSZ, W.,
LAZAREWICZ, J. W. Neuroprotective potential of group I metabotropic glutamate
receptor antagonists in two ischemic models. Neurochemistry International, v. 48
(6-7), pp. 485-490, 2006.
MANOOKIN, M. B., BEAUDOIN, D. L., ERNST, Z. R., FLAGEL, L. J., DEMB, J. B.
Dishinibition combines with excitation to extend the operating range of the OFF
visual pathway in daylight. The Journal of Neuroscience, v. 28 (16), pp.4136-
4150, 2008.
MARTÍN, R., DURROUX, T., CIRUELA, F., TORRES, M., PIN, J. P., SÁNCHEZ-
PRIETO, J. The metabotropic glutamate receptor mGlu7 activates phospholipase
C, translocates munc-13-1 protein, and potentiates glutamate release at
cerebrocortical nerve terminals. The Journal of Biological Chemistry, v. 285(33),
pp. 17907-17917, 2010.
MARTINS, R. A. B., PEARSON, R. A. Control of cell proliferation by
neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Research, v. 4, pp.
37-60, 2007.
MASU, M., IWAKABE, H., TAGAWA, Y., MIYOSHI, T., YAMASHITA, M.,
FUKUDA, Y., SASAKI, H., HIROI, K., NAKAMURA, Y., SHIGEMOTO, R.,
TAKADA, M., NAKAMURA, K., NAKAO, K., KATSUKI, M., NAKANISHI, S.
Specific deficit of the ON response in visual transmission by targeted disruption of
the mGluR6 gene. Cell, v. 80, pp. 757-765, 1995.
MCKENNA, M. The glutamate-glutamine cycle is not stoichiometric: fates of
glutamate in the brain. Journal of Neuroscience Research, v. 85, pp. 3347-3358,
2007.
MCINTIRE, S. L., REIMER, R. J., SCHUSKE, K., EDWARDS, R. H.,
JORGENSEN, E.M. Identification and characterization of the vesicular GABA
transporter. Nature, v. 389(6653), pp. 870-876, 1997.
MONNERIE, H., LE ROUX, P. D. Glutamate alteration of glutamic acid
decarboxylase (GAD) in GABAergic neurons: The role of cysteine proteases.
Experimental Neurology, v. 213, pp. 145-153, 2008.
MORGANS, C. W., ZHANG, J., JEFFREY, B. G., NELSON, S. M., BURKE, N. S.,
DUVOISIN, R. M., BROWN, R.L. TRPM1 is required for the depolarizing light
response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of
93

Sciences of the United States of America, v. 106(45), pp. 19174-19178, 2009.
NAWY, S. The metabotropic receptor mGluR6 may signal through G(o), but not
phosphodiesterase, in retinal bipolar cells. The Journal of Neuroscience, v. 19,
pp. 2938-2944, 1999.
NEAL, S. A., SALT, T. E. Modulation of GABAergic inhibition in the rat superior
colliculus by a presynaptic group II metabotropic glutamate receptor. The Journal
of Physiology, v. 577(2), pp. 659-669, 2006.
NEGRETE-DÍAZ, J. V., SIHRA, T. S., DELGADO-GARCIA, J. M., RODRÍGREZ-
MORENO, A. Kainate receptor-mediated presynaptic inhibition converges with
presynaptic inhibition mediated by group II mGluRs and long-term depression at
the hippocampal mossy fiber-CA3 synapse. Journal of Neural Transmission, v.
114(11), pp. 1425-1431, 2007.
NEWMAN, E. A. Glial modulation of synaptic transmission in the retina. Glia, v.
47(3), pp. 268-274, 2004.
NICOLETTI, F., BRUNO, V., CATANIA, M. V., BATTAGLIA, G., COPANI, A.,
BARBAGALLO, G., CEÑA, V., SANCHEZ-PRIETO, J., SPANO, P. F., PIZZI, M.
Group-I metabotropic glutamate receptors: hypotheses to explain their dual role in
neurotoxicity and neuroprotection. Neuropharmacology, v. 38(10), pp. 1477-1484,
1999.
OHNUMA, T., AUGOOD, S. J., ARAI, H., MCKENNA, P. J., EMSON, P. C.
Expression of the human excitatory amino acid transporter 2 and metabotropic
glutamate receptors 3 and 5 in the prefrontal cortex from normal individuals and
patients with schizophrenia. Brain Research. Molecular Brain Research, v. 56(1-
2), pp. 207-217, 1998.
OLIVEIRA, J. F., KRÜGEL, U., KÖLES, L., ILLES, P., WIRKNER, K. Blockade of
glutamate transporters leads to potentiation of NMDA receptor current in layer V
pyramidal neurons of the rat prefrontal cortex via group II metabotropic glutamate
receptor activation. Neuropharmacology, v. 55, pp. 447-453, 2008.
ÖZKAN, E. D., UEDA, T. Glutamate transport and storage in synaptic vesicles.
Japanese Journal of Pharmacology, v. 77, pp. 1-10, 1998.
PALMADA, M., CENTELLES, J. J. Excitatory amino acid neurotransmission.
Pathways for metabolism, storage, and reuptake of glutamate in brain. Frontiers
in Bioscience, v. 3, pp. 701-718, 1998.
PELLEGRINI-GIAMPIETRO, D. E., PERUGINELLI, F., MELI, E., COZZI, A.,
ALBANI-TORREGROSSA, S., PELLICCIARI, R., MORONI, F. Protection with
metabotropic glutamate 1 receptor antagonists in models of ischemic neuronal
94

death: time-course and mechanisms. Neuropharmacology v. 38, pp. 1607–1619,
1999.
PERROY, J., RAYNAUD, F., HOMBURGUER, V., ROUSSET, M-C., TELLEY, L.,
BOCKAERT, J., FAGNI, L. Direct interaction enables cross-talk between
ionotropic and group I metabotropic glutamate receptors. Journal of Biological
Chemistry, v. 283(11), pp. 6799-6805, 2008.
PIN, J-P., BOCKAERT, J. L. Get receptive to metabotropic glutamate receptors.
Current Opinion in Neurobiology, v. 5, pp. 342-349, 1995.
PINHEIRO, P., MULLE, C. Kainate receptors. Cell Tissue Research, v. 326, pp.
457-482, 2006.
PRADA, C., PUGA, J., PÉREZ-MENDÉZ, L., LOPÉZ, R., RAMÍREZ, G. Spatial
and temporal patterns of neurogenesis in the chick retina. European Journal of
Neuroscience, v. 3(6), pp. 559-569, 1991.
QURAISHI, S., GAYET, J., MORGANS, C. W., DUVOISIN, R. M. Distribution of
group-III metabotropic glutamate receptors in the retina. The Journal of
Comparative Neurobiology, v. 501, pp. 931-943, 2007.
QURAISHI, S., REED, B. T., DUVOISIN, R. M., TAYLOR, W. R. Selective
activation of mGluR8 receptors modulates retinal ganglion cell light responses.
Neuroscience, v. 166(3), pp. 935-941, 2010.
RENAUD, J. EMOND, M., MEILLEUR, S., PSARROPOULOU, C., CARMANT, L.
AIDA, a class I metabotropic glutamate-receptor antagonist limits kainate-induced
hippocampal dysfunction. Epilepsia, v. 43(11), pp. 1306-1317, 2002.
ROCHA, M., MARTINS, R. A. P., LINDEN, R. Activation of NMDA receptors
protects against glutamate neurotoxicity in the retina: evidence for the
involvement of neurotrophins. Brain Research, v. 827(1-2), pp. 79-92, 1999.
RODIECK, R. W. The first steps in seeing, 1/e, Sinauer Associates, 1998.
RONESI, J. A., HUBER, K. M. Homer interactions are necessary for metabotropic
glutamate receptor-induced long-term depression and translational activation. The
Journal of Neuroscience, v. 28(2), pp. 543-547, 2008.
ROSE, M., DÜTTING, E., ENZ, R. Band 4.1 proteins are expressed in the retina
and interact with both isoforms of metabotropic glutamate receptor type 8. Journal
of Neurochemistry, v. 105, pp. 2375-2387, 2008.
SAMPAIO, L. F., PAES-DE-CARVALHO, R. Developmental regulation of group III
metabotropic glutamate receptors modulating adenylate cyclase activity in the
avian retina. Neurochemistry International, v. 33 (4), pp. 367-374, 1998.
95

SCHWARTZ, E. A. Transporter-mediated synapses in the retina. Physiological
Reviews, v. 82 (4), pp. 875-891, 2002.
SEEBAHN, A., ROSE, M., ENZ, R. RanBPM is expressed in synaptic layers of
the mammalian retina and binds to metabotropic glutamate receptors. FEBS
Letters, v. 582, pp. 2453-2457, 2008.
SEN, M., GLEASON, E. Immunolocalization of metabotropic glutamate receptors
1 and 5 in the synaptic layers of the chicken retina. Visual Neuroscience. v. 23
(2), pp. 221-231, 2006.
SINGER, J. H., DIAMOND, J. S. Vesicle depletion and synaptic depression at a
mammalian ribbon synapse. Journal of Neurophysiology, v. 95(5), pp. 3191-3198,
2006.
SPINSANTI, P., DE VITA, T., DI CASTRO, S., STORTO, M., FORMISANO, P.,
NICOLETTI, F., MELCHIORRI, D. Endogenously activated mGlu5 metabotropic
glutamate receptors sustain the increase in c-Myc expression induced by
leukaemia inhibitory factor in cultured mouse embryonic stem cells. Journal of
Neurochemistry, v. 99(1), pp. 299-307, 2006.
SPOOREN, W. P. J. M., GASPARINI, F., SALT, T. E., KUHN, R. Novel allosteric
antagonists shed light on mGlu5 receptors and CNS disorders. Trends in
Pharmacological Sciences, v. 22 (7), pp. 331-337, 2001.
STECKLER, T., OLIVEIRA, A. F., VAN DYCK, C., VAN CRAENENDONCK, H.,
MATEUS, A. M., LANGLOIS, X., LESAGE, A. S., PRICKAERTS, J. Metabotropic
glutamate receptor 1 blockade impairs acquisition and retention in a spatial Water
maze task. Behavioural Brain Research, v. 164 (1), pp. 52-60, 2005.
STEPHENSON, F. A. Structure and trafficking of NMDA and GABAA receptors.
Biochemical Society Transactions, v. 34 (5), pp. 877-881, 2006.
STERLING, P., LAMPSON, L. A. J. Molecular specificity of defined types of
amacrine synapse in cat retina. Neuroscience, v. 6(5), pp. 1314-1324, 1986.
TAKAO, M., MORIGIWA, K., SASAKI, H., MIYOSHI, T., SHIMA, T., NAKANISHI,
S., NAGAI, K., FUKUDA, Y. Impaired behavioral suppression by light in
metabotropic glutamate receptor subtype 6-deficient mice. Neuroscience, v. 97
(4), pp. 779-789, 2000.
TAKEUCHI, A. The transmitter role of glutamate in nervous systems. Japanese
Journal of Physiology, v. 37, pp. 559-572, 1987.
THORESON, W. B., WITKOVSY, P. Glutamate receptors and circuits in the
vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research, v. 18 (6), pp. 765-810,
96

1999.
TIAN, Y., LIU, Y., CHEN, X., KANG, Q., ZHANG, J., SHI, Q., ZHANG, H. AMN082
promotes the proliferation and differentiation of neural progenitor cells with
influence on phosphorylation of MAPK signaling pathways. Neurochemistry
International, v. 57 (1), pp. 8-15, 2010.
TU, J. C., XIAO, B., NAISBITT, S., YUAN, J. P., PETRALIA, P. B., BRAKEMAN,
P., DOAN, A., AAKALU, V. K., LANAHAN, A. A., SHENG, M., WORLEY, P. F.
Coupling of mGluR/Homer and PSD-95 complexes by the Shank Family of
Postsynaptic Density Proteins. Neuron, v. 23, pp. 583-592, 1999.
VERNON, A. C., ZBARSKY, V., DATLA, K. P., DEXTER, D. T., CROUCHER, M.
J. Selective activation of group III metabotropic glutamate receptors by L-(+)-2amino-4-phosphonobutryic
acid protects the nigrostriatal system against 6hydroxydopamine
toxicity in vivo. The Journal Pharmacology and Experimental
Therapeutics, v. 320, pp. 397-409, 2007.
WAHLIN, K. J., MOREIRA, E. F., HUANG, H., YU, N., ADLER, R. Molecular
dynamics of photoreceptor synapse formation in the developing chick retina. The
Journal of Comparative Neurology, v. 506(5), pp. 822-837, 2008.
WANG, G. Y., VAN DER LIST, D. A., NEMARGUT, J. P., COOMBS, J. L.,
CHALUPA, L. M. The sensitivity of light-evoked responses of retinal ganglion cells
is decreased in nitric oxide synthase gene knockout mice. Journal of Vision, v.
7(14), pp. 1-13, 2007.
WIERONSKA, J. M., SZEWCZYK, B., PALUCHA, A., BRANSKI, P., ZIEBA, B.,
SMIALOWSKA, M. Anxiolytic action of group II and III metabotropic glutamate
receptors agonists involves neuropeptide Y in the amygdala. Pharmacological
reports, v. 57 (6), pp. 734-743, 2005.
WONG, R. K., BIANCHI, R., CHUANG, S. C., MERLIN, L. R. Group I mGluRinduced
epileptogenesis: distinct and overlapping roles of mGluR1 and mGluR5
and implications for antiepileptic drug design. Epilepsy currents, v. 5 (2), pp. 63-
68, 2005.
YAZULLA, S. GABAergic mechanisms in the retina. In: Osborne, N.N., Chader,
G.J. (Eds.), Progress in Retinal Research, vol. 5. Pergamon, Oxford, pp. 1-52,
1986.
YOSHIDA, K., IMAKI, J., OKAMOTO, Y., IWAKABE, H., FUJISAWA, H.,
MATSUDA, A., NAKANISI, S., MATSUDA, H., HAGIWARA, M. CREB-induced
transcriptional activation depends on mGluR6 in rod bipolar cells. Molecular Brain
Research, v. 57(2), pp. 241-247, 1998.
97

ZEEVALK, G. D., NICKLAS, W. J. Activity at the GABA transporter contributes to
acute cellular swelling produced by metabolic impairment in retina. Vision
Research, v. 37(24), pp. 3463-3470, 1997.
ZHENG, F. JOHNSON, S. W. Dual modulation of GABAergic transmission by
metabotropic glutamate receptors in rat ventral tegmental area. Neuroscience, v.
119(2), pp. 453-460, 2003.
98