Apostila de Aulas Práticas - UFF

Universidade Federal Fluminense 

Instituto biomédico 

Departamento de Microbiologia e Parasitologia 

Apostila de Aulas Práticas 

Bacteriologia 

Nutrição 

Raquel de Souza Sant’Anna 

(Monitora da Disciplina de Bacteriologia em 2007) 

Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira 

(Professor Adjunto de Bacteriologia) 

2007




Apresentação 

O aprendizado teórico e prático de microbiologia, incluindo a bacteriologia, é muito 

importante para o profissional da área de nutrição. 

As áreas de atuação em controle microbiológico de alimentos, treinamento de 

manipuladores, tecnologia na produção de alimentos, entre outras, exigem um profundo 

conhecimento desta disciplina. 

A apostila é o material de apoio às aulas práticas disponibilizado aos alunos. Esta contém 

explicações teóricas e práticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma 

clara e didática. 

A disciplina já possuía uma apostila de aulas práticas desde 2001, mas é necessária 

constante renovação para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para 

despertar o interesse dos alunos. 

Cada assunto apresenta uma introdução contendo a teoria do tema abordado, assim como 

a sua aplicação e importância no exercício da profissão, objetivando o melhor entendimento do 

tema, dos materiais a serem utilizados, da execução e dos resultados obtidos. 

No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões da prática executada e 

encontrará algumas questões de fixação. A apostila apresenta, também, figuras ilustrando a 

atividade a ser realizada, facilitando a compreensão do aluno. 

Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada prática no contexto 

das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado. 

Esperamos que você, aluno, aproveite ao máximo este recurso didático! 

Lembre-se, qualquer dúvida, não hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores! 

Os autores.




Índice 

Como trabalhar no laboratório de microbiologia ................................................................. 1 

Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura ..................................................... 5 

Assunto 2: Bactérias no Ambiente .................................................................................... 15 

Assunto 3: Controle Microbiano ........................................................................................ 18 

Assunto 4: Coloração de Gram......................................................................................... 27 

Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA (Antibiograma) ................... 34 

Assunto 6: Cocos Gram positivos ..................................................................................... 41 

Assunto 7: Coloração de Zihel-Neelsen (Visualização de Bactérias Espiraladas)............ 52 

Assunto 8: Bacilos Gram-negativos .................................................................................. 59 

Assunto 9: Contagem em Placa e Técnica do Número Mais Provável (NMP).................. 69 

Bibliografia ........................................................................................................................ 80




Como trabalhar no laboratório de microbiologia 

É importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um 

laboratório de microbiologia em geral, não importando se o microorganismo estudado será uma 

bactéria, um fungo ou um vírus. 

Cuidados fundamentais 

Alguns experimentos que nós realizaremos podem ser perigosos se você manipular os 

materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente. 

São necessárias algumas medidas de segurança quando se trabalha com 

microorganismos e substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos 

cortantes e outros materiais. 

Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o 

professor ou o monitor para te auxiliar. 

Procedimentos de Precaução e Segurança 

O laboratório de microbiologia é um lugar onde culturas de microorganismos são 

manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas 

técnicas assépticas, num local de trabalho limpo e organizado. Também como técnicas 

assépticas, todos os materiais que serão utilizados serão esterilizados para eliminar todos os 

microorganismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para não haver recontaminação 

deste material com microorganismos do ambiente. 

Geralmente, os microorganismos estudados não são patogênicos, mas ainda assim, 

devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente 

patogênico, lembrando que muitos microorganismos que geralmente não são patogênicos podem 

causar doenças oportunistas. 

Cada estudante deve aprender e praticar as práticas assépticas no laboratório. Isto é 

importante para prevenir a contaminação de suas mãos, cabelos e roupas com material 

contaminado, além de evitar a contaminação do seu trabalho e proteger seus colegas que estarão 

trabalhando na bancada ao lado. 

A importância da assepsia e desinfecção apropriadas está descrita na apostila e será 

observada em uma das aulas práticas. 

Em geral, todos os procedimentos de segurança e precauções tomados no laboratório de 

microbiologia se resumem em: 

1 – restringir os microorganismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros 

ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubação) ou sua 

análise; 

2 – prevenir a contaminação com microorganismos ambientais (normalmente presentes 

nas mãos, cabelos, roupas, superfícies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode 

interferir nos resultados obtidos. 

Mãos e superficies devem ser higienizados e tratadas com anti-sépticos e desinfetantes 

corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trás, e as áreas 

de trabalho devem estar livres de objetos desnecessários. Lembre-se que na hora de transferir os 

microorganismos ou culturas não devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar). 

1




A conduta pessoal no laboratório de microbiologia deve ser sempre observada. 

O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema. 

Conduta geral no laboratório 

1 – Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratório. 

2 – Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados 

em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens que não serão utilizados na 

aula prática. 

3 – Para entrar no laboratório, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferência 

limpo e branco. 

4 – No início e no final de cada aula prática, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada 

com uma solução desinfetante própria. Este espaço deve ser mantido limpo e arrumado durante o 

decorrer de toda a aula prática. 

5 – Antes de começar devemos lembrar: 

- prenda seu cabelo comprido para trás, longe da chama do Bico de Bunsen; 

- não use jóias e acessórios durante a aula prática; 

- mantenha seus dedos, lápis, caneta e qualquer objetos longe da sua boca; 

- não fume, coma ou beba nada no laboratório; 

- não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar 

acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminação. 

6 – Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.) 

7 – Anote todos os detalhes da aula prática e faça os exercícios de fixação de cada assunto. 

8 – Se você está em dúvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dúvida persistir, 

chame o professor ou monitor. Evite tirar dúvidas com os colegas de outros grupos. 

9 – Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer, 

chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha 

desinfetante sobre o local (superfícies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha. 

10 – Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra. 

11 – Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratório em quaisquer circunstâncias. 

12 – antes de sair do laboratório, cuidadosamente lave e faça a anti-sepsia em suas mãos. 

Lembre-se de lavar seu jaleco para a próxima aula prática. 

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Como trabalhar com o microscópio 

Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios: 

- Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para 

mantê-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos (Obs: as 

capas devem ser lavadas periodicamente). 

- Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. 

- Jamais comer ou beber próximo ao equipamento. 

- Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na 

base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de 

trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o 

aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. 

- Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o 

risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com 

papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugar 

imediatamente com papel absorvente macio. 

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- Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para 

focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: 

à Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente 

no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para 

evitar o choque com a lamínula. 

à Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito 

lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com 

o micrométrico. 

à O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da 

objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada. 

à Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva 

de menor aumento. 

à Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e 

coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da 

objetiva; 

à Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa, 

até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com 

a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem 

aparecer, complete a focalização com o micrométrico. 

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Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura 

Introdução 

O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizados 

diversos meios de cultura diferentes. 

Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de 

microorganismos. 

A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias, 

clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios. 

Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos 

embrionados. 

Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência 

de um determinado número de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se 

desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios 

envolve várias técnicas de semeadura. 

Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) 

requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados 

técnicas assépticas. 

Fundamentação teórica 

® Meios de Cultura 

Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas: 

Quanto à composição 

Naturais 

Artificiais 

São aqueles encontrados na natureza, de origem 

vegetal (p.ex.: pedaço de batata, de abóbora) ou 

animal (p.ex.: gema de ovo, pedaço de carne) 

São aqueles fabricados em laboratório, constituído 

de substâncias químicas, podendo ser definidos ou 

indefinidos (complexos) 

Definidos 

Indefinidos 

Possui composição definida, ou seja, 

se conhece qualitativa e quantitativa 

sua composição. 

A sua composição real não é 

conhecida, apenas é feita uma 

estimativa qualitativa. 

Por exemplo: meios suplementados 

com sangue, gema de ovo, 

alimentos... 

Quanto ao estado Líquido São desprovidos de Agar à caldo 

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físico 

Quanto à finalidade e 

características 

Semi-sólido Apresentam em sua composição até 1% de Agar. 

Sólido Apresentam em sua composição de 1,5 a 2,5% de 

Agar. 

Simples Só possui os nutrientes básicos para o crescimento 

das bactérias em geral. 

Enriquecido 

De 

enriquecimento 

Seletivo 

Diferencial 

Indicadores 

De estoque 

® Técnicas de Semeadura 

Além dos nutrientes básicos possui elementos 

nutritivos a mais, como fatores promotores de 

crescimento (sangue...), mas não é específico. 

É suplementado com nutrientes específicos para o 

microorganismo que se deseja pesquisar. Além 

disso, possui nutrientes agentes inibidores de 

determinados microorganismos, mas não permite o 

isolamento da bactéria, pois é um meio líquido. 

Por exemplo: aminoácidos (lisina à Salmonella) 

Possui agentes inibidores de determinados 

microorganismos. Permite a identificação e 

isolamento da bactéria, pois é um meio sólido 

(permite a visualização de UFCs). 

Por exemplo: Agar EMB à inibe Gram+ 

Permite a diferenciação de diferentes 


Por exemplo: a diferenciação de bactérias 

fermentadoras e não fermentadoras da lactose no 

Agar EMB. 

Possuem agentes que indicam determinadas 

reações no meio, para a determinação do 

metabolismo das bactérias. 

Por exemplo: ferro no meio à pode indicar a 

produção de H2S pelo enegrecimento do meio. 

(sulfeto ferroso) 

*** geralmente o agente é um indicador de pH 

Meios onde são estocadas culturas puras para 

posterior utilização. Geralmente são meios semisólidos. 

As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um 

meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. 

Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, são utilizadas as 

técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de 

materiais, meios e culturas. 

As técnicas de assepsia incluem: 

è fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de 

qualquer trabalho. (1) 

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è trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da 

chama do bico de Bunsen. (2) 

è esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e 

DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. 

(3) 

è flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a 

contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo 

desejado será inoculado. (4) 

De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade 

da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. 

A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente 

como repique. 

A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação: 

Meio inclinado em 

tubos 

· Semeadura em meios sólidos 

ou 

Estria sinuosa: semear com alça ou agulha 

bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a 

extremidade do bizel (superfície inclinada do 

meio). 

Objetivo: obtenção de intensa massa de 

microorganismos 

Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, 

fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o 

Agar, partindo da base para a extremidade do bizel 

(superfície inclinada do meio). 

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Meio em camada 

alta 

Meio em placa de 

Petri 

Objetivo: obtenção de pequena massa de 


Picada Central: semear com agulha 

bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da 

finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo 

ou até o fundo deste. 

Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e 

motilidade em algumas técnicas. 

Picada em Profundidade: semear com agulha 

bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da 

finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo 

ou até o fundo deste. 

Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e 

motilidade em algumas técnicas. 

Pour-plate ou disseminação (método em 

profundidade): Transferir 1 ml da cultura para 

placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio 

fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a 

cultura e homogeneizar suavemente com 

movimentos circulares. 

Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado 

também para análise de microorganismos 

anaeróbios, adicionando uma outra camada de 

meio fundido após o endurecimento da primeira 

camada. 

Estria simples: transferir uma alçada da cultura 

para meio sólido em placa e estriar com a alça 

bacteriológica sobre o meio. 

A estria pode ser realizada em movimento de zigzag 

(estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre 

o meio (estria reta). 

Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para 

visualização de determinadas propriedades 

metabólicas, como a produção de enzimas 

hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - 

gema de ovo, sangue...), e produção de 

pigmentos. 

Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: 

transferir uma alçada da cultura para meio sólido 

em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre 

o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a 

inoculação pode ser feita de 2 tipos: 

à em 3 estrias: estriar em metade da placa, com 

movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, 

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ou 

· Semeadura em meios semi-sólidos 

girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da 

placa), girar mais 90° e estriar o meio restante. 

à em 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da 

placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante 

(1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do 

próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e 

estriar o restante do meio. 

Objetivo: obtenção de colônias isoladas. 

É importante não cruzar as estrias (não tocar a 

alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a 

cada estria e obter as colônias isoladas. 

Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as 

estrias e tocar a ponta da estria anterior, 

arrastando um pequeno inóculo para a próxima 

estria. 

Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da 

cultura para o meio sólido na placa e espalhar 

uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou 

alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky. 

Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou 

para contagem bacteriana. Esta técnica é muito 

utilizada na realização de antibiogramas. 

Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no 

centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve 

penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. 

Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em 

algumas técnicas. Além disso, o meio também é utilizado para 

estocar culturas puras. 

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Objetivos 

· Semeadura em meios líquidos 

Após a realização da atividade prática você será capaz de: 

Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura 

(de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com 

agitação da alça, para maior difusão dos microorganismos (da 

alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o 

tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o 

tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio. 

Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em 

meio líquido. 

è executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias em 

diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), tanto em tubos quanto em placas; 

è caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um; 

è identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório. 

Material 

Para a atividade prática serão utilizados: 

- Placa de Petri com Agar 

- Tubo com Agar inclinado 

- Placa de Petri estéril 

- Tubo com Agar semi-sólido 

- Tubo com Agar em camada alta 

- Cultura bacteriana em caldo e em Agar 

- Amostra de água em tubo (para a técnica do pour plate) 

- Pipetas estéreis 

- Alça e agulha bacteriológicas 

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Execução da prática 

® A partir de cultura em placa: 

- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça 

bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão. 

® A partir de cultura em caldo: 

- a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações: 

1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com caldo, através da 

técnica de difusão. 

2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar 

inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta). 

3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para a placa com Agar, através da 

técnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 

4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semisólido, 

através da técnica de picada central. 

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® A partir da amostra de água: 

- com o auxílio de uma pipeta estéril, transferir 1 ml da amostra de água para uma placa estéril e 

adicionar o meio fundido, realizando a técnica do pour plate. 

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Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 

Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no 

isolamento de colônias (esgotamento em estrias). 

Exercícios de fixação 

1. Qual a diferença entre os meios “de enriquecimento” e “seletivo”? 

2. Qual a finalidade da técnica do “spread plate” ou técnica do espalhamento? 

3. Por que não devemos cruzar as estrias na técnica do esgotamento em estrias? 

4. Por que devem ser realizadas as técnicas assépticas? 

5. Por que utilizamos diferentes meios durante a análise de um determinado material (p.ex.: 

alimento)? 

6. Para uma cultura que esteja guardada há muito tempo (sob refrigeração), qual o tipo de meio 

devemos utilizar para retornar a utilizá-la numa atividade prática? 

7. Para determinar a presença de um microorganismo específico num material que esteja muito 

contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar? 

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Observações 

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Assunto 2: Bactérias no Ambiente 

Introdução 

A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes. 

A exposição de alimentos, sua manipulação e conservação incorretas, são fatores que 

levam à sua contaminação por microorganismos. 

Os microorganismos podem ter relação com o alimento de três formas: 

è adicionados intencionalmente: são aqueles que provocam alterações desejáveis nos 

alimentos, como os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc). 

è deterioradores: durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam 

mudanças desagradáveis nos alimentos, tornando-os impróprios para o consumo, como os 

coliformes, que deterioram alimentos como queijos frescais, leite (etc). 

è patogênicos: podem colonizar o alimento e representam um risco à saúde de quem 

ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), como Salmonella 

sp., Staphylococcus aureus e outros. 


As bactérias estão presentes em todos os ambientes. 

Muitas vezes, sua presença não é prejudicial, como os microorganismos que colonizam a 

nossa pele e o nosso trato gastrintestinal. 

Algumas vezes esta presença é até benéfica, como a utilização de microorganismos na 

indústria de alimentos na produção de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem 

nunca ouviu falar em alimentos pré e pró bióticos? São alimentos que contém em sua composição 

microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reações benéficas (como 

auxiliar a regulação do trânsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa 

microbiota normal a exercer seu papel benéfico no nosso organismo (como a produção de 

vitamina K pelas bactérias do nosso trato gastrintestinal). 

Mas, nem sempre a relação alimento x microorganismos x homem é benéfica. Diversos 

microorganismos têm a capacidade de nos causar doenças, até mesmo os microorganismos da 

nossa microbiota normal (em casos de redução da atividade imunológica, causando doenças 

oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos. 

É importante ressaltar que os alimentos por si só não são fontes de contaminação, mas 

podem veicular esta contaminação adquirida, podendo causar doenças. As principais fontes de 

contaminação são o solo e a água, as plantas, os utensílios utilizados na preparação do alimento 

(contaminação cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os próprios 

manipuladores de alimentos, a ração animal, a pele dos animais, e até o ar. 

A indústria de alimentos vem crescendo e a preocupação com a obtenção de alimentos 

com qualidade tanto do ponto de vista tecnológico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo, 

aceitável no mercado, etc.) quanto microbiológico (segurança alimentar) está cada vez mais 

desenvolvida. 

O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulação, preparo e 

conservação inadequados estão freqüentemente associados a doenças (intoxicações ou 

infecções) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que não 

contamine o alimento com técnicas e hábitos anti-higiênicos. 

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É dever do nutricionista conhecer os riscos associados à precariedade no cuidado com os 

alimentos para melhor orientação e supervisão das atividades de qualquer UAN (Unidade de 

Alimentação e Nutrição), restaurante ou indústria, evitando a disseminação de doenças através 

dos alimentos. 

Objetivos 


è constatar a presença de bactérias no ambiente; 

è compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação de 

alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais ou por portadores 

de microorganismos patogênicos; 

è diferenciar fontes de contaminação e veículos de contaminação; 

è comentar sobre o papel de bactérias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos. 

Material 

- 2 Placas de Petri com Agar 

- swab estéril 


® Bactérias no ambiente: 

- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da área de segurança. Cada grupo deixará 

a placa em exposição por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos) 

- após o tempo de exposição, a placa deve ser tampada novamente. 

® Bactérias nas superfícies: 

- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes 

- em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificação de bactérias em 

diversas superfícies, de acordo com o diagrama representado a seguir: 

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Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 

Observar e interpretar o crescimento nos meios. 


1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiológica dos alimentos? 

2. Por que é necessário tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou 

manipulam alimentos? 

3. O que é contaminação cruzada? 

4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminação? 

5. Quais são as principais fontes de contaminação dos alimentos? 

Observações 

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Assunto 3: Controle Microbiano 

Introdução 

Como já vimos, as bactérias estão em quase todos os ambientes e superfícies, e não é 

desejável que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utensílios 

utilizados na sua preparação, medicamentos, e outros. 

Para tanto, podemos aplicar diversos métodos de controle microbiano. 

O crescimento microbiano é fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores 

extrínsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composição 

gasosa do ambiente. 

O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de 

reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicação de microorganismos existente em 

ambientes, utensílios, e superfícies vivas ou inanimadas. 

A conservação de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas empregadas 

no controle microbiano. 


Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu 

modo de ação, é importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos: 

è Desinfecção: redução do número de microorganismos em uma matéria inanimada (ambientes, 

superfícies, objetos, alimentos) 

è Sanitização: igual a desinfecção (termo utilizado na indústria de alimentos) 

è Esterilização: destruição total de microorganismos em um material 

è Anti-sepsia: redução do número de microorganismos em matéria viva (pele) 

è Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não contaminação de 

algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo) 

Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle 

microbiano, que pode ser feito através de agentes químicos ou físicos. 

® Controle Microbiano por Agentes Físicos 

· Calor 

Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor úmido. 

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É o método mais empregado para destruição de microorganismos devido ao seu baixo 

custo de aplicação, fácil aplicação, eficácia e praticidade. 

Calor 

seco 

Calor 

úmido 

Modo de ação: 

Oxidação de 

componentes 

celulares 

Modo de ação: 

Desnaturação de 

componentes 

celulares 

Flambagem 

- Definição: contato direto do material a ser tratado com o fogo. É 

esterilizante 

- Aplicação: materiais metálicos (p.ex.: alça bacteriológica) 

Forno ou estufa 

- Definição: o material é submetido a uma temperatura de 170 – 

180°C por 1 – 2 horas. É esterilizante 

- Aplicação: vidrarias e metais (material cirúrgico) 

Incineração 

- Definição: queima total do material. É esterilizante. 

- Aplicação: materiais descartáveis (principalmente materiais 

hospitalares) 

Pasteurização 

- Definição: aplicação de calor inferior a 100°C. É desinfetante (não 

elimina formas esporuladas). Pode ser classificada em: 

à lenta: 63°C / 30 minutos 

à rápida: 72°C / 15segundos 

- Aplicação: diversos alimentos são pasteurizados, como sucos, 

leite, etc. 

Fervura 

- Definição: aplicação de calor a 100°C por 15 minutos. É 

desinfetante (não elimina formas esporuladas). 

- Aplicação: alimentos em geral, p.ex.: leite 

Autoclavação 

- Definição: aplicação de calor a 121°C a uma pressão de 1 atm, 

por 15 – 30 minutos. 

- Aplicação: materiais, meios, utensílios. Diversos alimentos são 

tratados por este processo, p.ex.: alimentos enlatados 

(apertização). 

Esterilização 

- Definição: aplicação de calor maior que 100°C. Alimentos 

denominados UAT (UHT) são submetidos a uma temperatura de 

140 – 150°C por 2 – 4 segundos e rapidamente resfriados e 

acondicionados em recipientes estéreis. 

- Aplicação: diversos alimentos, como o leite UAT 

O calor úmido é mais eficaz que o calor seco, pois a água é melhor condutora de calor quando 

comparada com o ar. 

19




· Radiações 

Não ionizantes Luz Ultravioleta 

- possui atividade máxima num comprimento de onda de 260 nm 

- é desinfetante 

- geralmente é utilizado em ambientes 

- não é penetrante à desinfecção apenas superficial 

- a lâmpada tem vida útil de 200 horas (aproximadamente) 

- age no DNA microbiano, gerando mutações letais 

Ionizantes Radiação Gama 

- é esterilizante 

- mais energético que UV, atua num comprimento de onda menor 

- age ionizando componentes celulares, levando à morte 

- muito utilizado em produtos hospitalares descartáveis 

- seu uso nas indústrias de alimentos está crescendo 

- possui baixo poder de penetração à desinfecção apenas superficial 

· Filtração 

Clarificante - retém as impurezas grosseiras 

- é desinfetante 

Esterilizante - possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vírus. 

· Outros 

Pressão osmótica 

Adição de NaCl 

- também conhecida como salga 

- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo 

microbiano. Também pode causar lise osmótica da célula bacteriana. 

- muito utilizada em produtos cárneos (carne seca, pescado) 

Adição de outros sólidos (açúcares) 

- utilizado na fabricação de compotas e alimentos em calda 


microbiano 

- muito empregado para conservação de frutas e hortaliças 

Dessecação - retirada umidade do alimento em maior ou menor grau 


microbiano 

Liofilização - aplicação de dessecação em vácuo (pressão negativa) 


microbiano 

- seu emprego na indústria de alimentos é crescente 

Baixas temperaturas Refrigeração 

20




- temperatura entre 0 e 10°C 

- reduz a atividade metabólica de alguns microorganismos (mesófilos e 

termófilos) 

Congelamento 

- temperaturas inferiores a 0°C 

- impede a atividade metabólica da maioria dos microorganismos 

- em alguns casos, causa a morte dos microorganismos 

® Controle Microbiano por Agentes Químicos 

· Álcool Etílico 

É um dos métodos químicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo 

custo, relativa eficácia e fácil aplicação. Pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. 

Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 – 70%), pois nessa condição 

possui maior poder penetrante. 

O álcool absoluto possui poder bacteriostático, enquanto o álcool hidratado a 70% possui 

poder bactericida. 

São apontados diversos mecanismos de ação para o etanol: 

- ação detergente: solvente de lipídeos 

- ação desidratante: retira água das células 

- ação desnaturante: agindo sobre proteínas celulares 

· Fenóis e Derivados 

O fenol é um desinfetante fraco, porém é utilizado como um desinfetante de referência 

para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais 

ativo que o fenol. 

Atua como desnaturantes de componentes protéicos 

Dentre os cresóis, o mais importante é a creolina, uma mistura de cresóis muito utilizada 

para pisos e sanitários. 

O hexaclorofeno é muito utilizado na antissepsia cirúrgica. 

· Halogênios 

Os principais halogênios utilizados no controle microbiano são o Cloro e o Iodo. 

è Cloro: É usado como desinfetante de águas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ação é 

dado pela reação: 

Cl2 + H2O à HCl + HClO 

O ácido hipocloroso é instável, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminará 

os microorganismos através de oxidação de componentes celulares. 

è Iodo: reage de forma irreversível com aminoácidos aromáticos de proteínas celulares 

(fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido à grande possibilidade de alergias, seu uso 

21




como anti-séptico na prática cirúrgica vem diminuindo, sendo substituído por clorexidine e 

similares. 

· Detergentes catiônicos 

Alteram a permeabilidade da membrana. É mais ativo contra Gram negativos. 

Exemplo: compostos quaternários de amônio à cloreto de benzalcônio. 

· Sais de Metais Pesados 

Os metais pesados agem na inativação de enzimas, por sua alta afinidade por 

apoproteínas. Os principais metais pesados utilizados no controle microbiano são: 

è Mercúrio (Hg): já foi muito utilizado como anti-séptico, mas seu uso está decaindo devido ao 

risco de intoxicação por absorção cutânea. 

è Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para águas de recreação 

è Nitrato de Prata (AgNO3): é um anti-séptico altamente eficiente contra gonococos, que 

causam oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa. 

· Ácidos 

Tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos são muito utilizados na conservação de 

alimentos. São mais utilizados os ácidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior 

solubilidade. 

A atividade antimicrobiológica dos ácidos fracos é atribuída a sua forma não dissociada 

(HA), pois esta penetra através da membrana tornando-se ionizada após alcançar o interior da 

célula. A concentração intracelular destes ácidos orgânicos altera o funcionamento normal do 

gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular. 

A concentração da forma não dissociada do conservante químico no alimento é 

determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molécula está na forma dissociada) do ácido e do pH do 

meio, como mostra a fórmula a seguir: 

Portanto, a concentração da forma não dissociada aumenta com a elevação da acidez do 

alimento, ou seja, o pH do alimento deve ser menor que o pKa, de forma a garantir alta 

concentração da forma não dissociada. 

Os valores de pKa da maioria dos ácidos encontra-se na faixa de pH entre 3,0 e 5,0. 

O pKa é usado na medição de sua eficiência no alimento em determinado pH. 

Exemplos de ácidos orgânicos utilizados na indústria de alimentos: ácido tartárico (tartarato 

de sódio, tartarato potássio), ácido cítrico (citrato de sódio, citrato de potássio), ácido propiônico 

(propionato de cálcio). 

22




· Álcalis 

Os principais álcalis utilizados são o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente, 

está presente nos sabões, conferindo-lhes relativa ação anti-séptica. 

· Corantes básicos 

São mais eficiente contra Gram-positivos. 

Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno. 

· Redutores 

Reduzem compostos celulares, levando as células à morte. 

Aldeídos e derivados: formaldeído e formalina são utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas 

causam irritações cutâneas. 

· Oxidantes 

Oxidam componentes celulares levando à morte das células. São muito utilizados como 

desinfetantes. 

Exemplo: Ozônio, água oxigenada, permanganato de potássio, peróxido de zinco. 

Óxido de etileno (gás): é um agente alquilante, age inativando proteínas e ácidos nucléicos. À 

temperatura de 52°C o óxido de etileno passa do estado líquido para o gasoso. Seus vapores são 

utilizados para esterilização de materiais de borracha ou plástico. 

· Antimicrobianos 

Possuem ação seletiva contra microorganismos, ao contrário dos anteriores. São um 

método biológico de controle microbiano. Serão abordados num próximo assunto. 

Objetivos 


è conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiológico; 

è descrever os agentes físicos e químicos utilizados no controle microbiano; 

è entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilização, diferenciando calor úmido 

de calor seco 

è compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos de anti-sepsia 

utilizados. 

23




Material 

- Culturas bacterianas 

- 2 Placas de Petri com Agar 

- Soluções anti-sépticas 

- Gaze estéril 

- Tripé e tela de amianto 

- Recipiente com água em ebulição 


® Agentes Químicos 

- dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes 

- semear os 4 quadrantes da seguinte forma: 

- 1º quadrante: um aluno encosta o dedo suavemente no Agar 

- 2º quadrante: outro aluno lava o dedo com água e sabão por 1 minuto, seca com gaze estéril e 

faz a impressão do dedo 

- 3º quadrante: outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool etílico a 

70%, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo 

- 4º quadrante: um outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool 

iodado, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo 

24




® Agentes Físicos - calor 

- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espaço respectivo ao 

tempo 0 

- para os próximos espaços, colocar as culturas em banho-maria fervente até atingir o tempo 

especificado: 

- 5 minutos à reinocular 



- Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 

- Observar e interpretar o crescimento nos meios. 


1. Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia? 

2. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz? 

3. Qual é o tipo de calor mais utilizado para a indústria de alimentos? Por quê? 

4. Por que o álcool etílico utilizado como desinfetante e anti-séptico deve ser hidratado? 

5. Qual o mecanismo de ação dos ácidos utilizados na conservação de alimentos? 

6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou 

estufas de esterilização, também possuem ação esterilizante? 

25




Observações 

26




Assunto 4: Coloração de Gram 

Introdução 

Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso 

não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma 

coloração diferencial. 

Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, 

o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas 

seqüências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias 

em 2 grandes grupos. 

O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado 

Gram positivo. 

O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante 

utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo. 

Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um 

corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para 

a primeira etapa da coloração. 

Há também um agente descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se 

utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool 

etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. 

Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5), obtendo uma 

velocidade de descoloração intermediária. 

A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que 

são os únicos Gram negativos. 

Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos 

Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, 

Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram-negativos. 

A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das 

bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de 

material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria 

sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma. 


A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias 

e como estas serão coradas de forma distinta. 

As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína 

recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias 

lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de 

glicoproteína. 

Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia 

previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for 

utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%, 

homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da 

coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar 

27




o esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se 

perca durante as etapas da coloração. 

Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O 

corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram 

negativa. 

Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande 

complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. 

O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço 

corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias: 

à as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão 

desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e 

tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I). 

à as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima 

desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros 

componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada 

de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula 

descorada neste momento. 

É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum 

resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão 

ser alterados. 

O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram 

positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células 

Gram negativas, corando-as de vermelho. 

Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que não se coram 

por este método, como as micobactérias, as bactérias espiraladas e as bactérias que não 

possuem parede celular. Para estes, há outros métodos de coloração, como o método de Zihel- 

Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método de visualização em campo escuro. 

Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na coloração: 

à Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar resíduos (cristais) 

na lâmina. 

à Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciação da 

bactéria pelo álcool. 

à A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em 

culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas. 

Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à 

membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes. 

Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. 

Objetivos 


28




è executar a técnica da coloração de Gram; 

è utilizar a objetiva de imersão; 

è relacionar a composição química da parede celular das bactérias com os corantes de Gram; 

è compreender a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material submetido 

a exame microbiológico; 

è descrever as formas, arranjos e coloração das bactérias. 

Material 

- Lâminas 

- Culturas bacterianas em meio líquido e sólido 

- Alças e agulhas 

- Bateria da coloração de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, álcool, água) 

- Papel de filtro 

- Óleo de cedro (óleo de imersão) 

- Microscópio 

- Bico de Bunsen 


® Preparo e fixação do esfregaço 

Etapas Observações 

Transferir uma alçada da cultura ou uma colônia 

da placa para uma lâmina de microscópio limpa. 

Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. 

Se tiver sido colhida colônia da placa, adicionar 

salina estéril para facilitar o espalhamento. 

Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes 

culturas deve-se observar alguns detalhes: 

è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, 

espalhando-a pela lâmina à isso evitará a 

observação de colônias diferentes na lâmina e 

que seja coletado um inóculo muito carregado, o 

que dificultará a visualização das células 

coradas. 

è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada 

e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja 

coletado um inóculo muito carregado. 

Para o inóculo coletado de caldo não é 

necessário adicionar solução salina. Mas para 

colônia coletada de placa é necessário fazer a 

diluição na lâmina, evitando que o esfregaço 

29




Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama 

do Bico de Bunsen, até que este esteja 

completamente seco. 

® Coloração do esfregaço 

fique muito concentrado o que dificulta a 

visualização das células coradas ao 

microscópio. 

É importante fixar o esfregaço para que este não 

se perca durante as etapas de lavagem entre a 

utilização de um e outro corantes 

Etapas da Coloração O que está acontecendo na parede da bactéria? 

Cobrir o esfregaço com solução de Cristal 

Violeta por cerca de 1 minuto. 

A seguir, lavar em água corrente com o 

pissete. 

O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os 

tipos de células (Gram + e Gram -) 

A lavagem com água é importante após cada 

etapa para que uma substância utilizada não 

interfira na ação da próxima. 

Nesse caso, a lavagem serve para retirar o 

excesso de corante. 

30




Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco 

por cerca de 1 minuto. 

Novamente lavar com água, e então lavar com 

álcool absoluto até que não saia mais corante 

da lâmina (10 – 15 segundos). 

O Lugol é uma solução de Iodo e funciona como 

mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele 

fixa o corante Cristal Violeta na parede da célula, 

pois forma um complexo grande: o CV-I 

O álcool absoluto, ou solução de álcool-acetona, 

funciona como diferenciador da coloração: 

è nas Gram +, o álcool desidrata a matriz 

glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os 

poros da parede e impedindo a saída do 

complexo CV-I, corando a célula de roxo: 

è nas Gram -, o álcool dissolve a membrana 

externa, de caráter lipídico (lipoproteínas, 

fosfolipídeos, LPS), fazendo com que o 

complexo CV-I saia da parede, deixando a célula 

descorada e com os poros da matriz 

glicoproteica abertos: 

Lavar com água corrente em abundância, É importante prestar com bastante atenção nesta 

31




para que não reste álcool sobre a lâmina. 

Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de 

30 segundos. 

Lavar com água e secar suavemente com 

papel. 

Para decorar!!! 

Vi Lulu Ali A Fumar 

(Cristal Violeta) (Lugol) (Álcool) (Água) (Fucsina) 

etapa, pois se restar algum álcool na lâmina a 

coloração não prosseguirá, já que o próximo 

corante não se fixará na lâmina. 

A fucsina age de diferentes formas nas 

diferentes células: 

è nas Gram +, os poros estão reduzidos, 

impedindo que a fucsina penetre na parede 

celular, não alterando a cor roxa: 

è nas Gram -, os poros da camada de 

peptidoglicano estão abertos, permitindo que a 

fucsina penetre na célula, corando-as de 

vermelho: 

Após secar suavemente a lâmina, observar ao 

microscópio na objetiva de imersão (100x), com 

óleo de cedro/mineral e identificar a célula 

corada. 

32





1. Em que se baseia o método da coloração de Gram? 

2. Por que o álcool é considerado como agente diferenciador da coloração de Gram? 

3. Qual é o papel do mordente (lugol)? 

Observações 

33




Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA 

(Antibiograma) 

Introdução 

O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da 

sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de 

sensibilidade previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao 

desenvolvimento ou aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso 

adequado e criterioso de antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de 

amostras bacterianas multirresistentes. 

O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento 

objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no tratamento. 

O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo 

infeccioso, mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na 

terapia não seja previsível como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos não 

fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc. 

A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina deve seguir 

alguns princípios. Uma das estratégias adotadas é o reconhecimento que alguns agentes 

antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se no seu espectro de atividade. 

Assim, um só representante de classe necessita ser testado, a não ser quando dentro de uma 

mesma classe de antimicrobianos não exista a possibilidade de equivalência. 


Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é 

inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano 

atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias 

moderadamente resistentes) é dado por aquela cujo crescimento é inibido por concentrações 

intermediárias. Na interpretação dos resultados, consideramos as bactérias intermediariamente 

resistentes como resistentes. 

A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. 

A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de 

difusão em placa com discos impregnados com as drogas. 

- Método de Diluição (MIC): No método de diluição, concentrações variadas do 

antibiótico, obtidas pela diluição em Caldo ou Agar, são inoculadas com o microrganismo. A 

concentração mais baixa do antibiótico que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 

horas é a concentração inibitória mínima, é a medida da sensibilidade. 

- Método da Difusão do Disco: Nos testes pelo método de difusão, discos de papel 

impregnados com o antibiótico são colocados uniformemente na superfície do Agar semeado com 

o microrganismo. Forma-se, então, um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a 

partir do disco para o Agar com conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível 

ao determinado (os) antibiótico (os). 

Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de 

difusão com disco (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de 

rotina, mas é indispensável que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presença de algumas 

34




substâncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição. Para minimizar os riscos 

de resultados errôneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este é 

um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar 

que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma 

coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da cultura. 

A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem 

crescimento em volta dos discos de antibiótico). O tamanho do halo sozinho não é uma medida 

quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais 

potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos 

produzidos por antibióticos não relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se 

interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação 

aos dados da tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na 

terapêutica clínica. 

Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ação na célula bacteriana: 

Sítio de ação Mecanismo de ação Classes de antimicrobianos 

Antimicrobianos 

que atuam a nível 

da parede celular 



da membrana 

citoplasmática 



dos ribossomos 



do DNA 



do metabolismo 

intermediário 

- agem na etapa da síntese da parede que 

ocorre externamente à membrana plasmática 

- impedem a união de cadeias peptídicas 

- aumentam atividade das autolisinas 

- se ligam à face externa da membrana 

- possuem NH3 + (fica na superfície da 

membrana, formando poros) e Ag + (se insere 

na membrana) na sua molécula 

- desorganizam a membrana plasmática 

- provocam a saída de componentes 

celulares 

- aminoglicosídeos e tetraciclinas: se ligam à 

subunidade 30s do ribossomo, tornando-o 

não funcional, impedindo a incorporação de 

aminoácidos 

- cloranfenicol, lincomicina e clindamicina: se 

ligam à subunidade 50s do ribossomo, 

impedindo a união de novos aminoácidos 

- eritromicina: se liga à subunidade 50s do 

ribossomo e impede a translocação 

- metronidazol: é reduzido, se tornando tóxico 

e quebrando a molécula de DNA 

- rifampicina: combinam-se com RNApolimerases, 

bloqueando a transcrição do 

DNA 

- derivados quinolônicos: inibem a ação das 

girases 

- sulfonamidas: bloqueiam a síntese de ácido 

fólico (competem com o PABA) 

- trimetoprina: interfere na síntese de purinas, 

metionina, serina e timina 

- b-lactâmicos (penicilina, 

monobactâmicos) 

- Polimixinas (não reagem 

com fosfatídeos de colina 

das células animais) 

- Aminoglicosídeos 

(estrptomicina, gentamicina) 

- Tetraciclinas (tetraciclina, 

doxiciclina) 

- Cloranfenicol 

- Macrolídeos (eritromicina 

- Estreptograminas 

(lincomicina, clindamicina) 

- Metronidazol 

- Derivados quinolônicos 

(ácido naxadílico, 

ciprofloxacino) 

- Macrolídeos (rifampicinas) 

- Sulfonamidas 

- Trimetoprina 

35




Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os seguintes critérios: 

toxicidade seletiva, bactericida, amplo espectro, não deve ser alergênico, não deve provocar 

efeitos colaterais e não devem ter microorganismos resistentes. 

É necessário que se observe o tempo mínimo para uso do agente antimicrobiano, para 

evitar a seleção de microrganismos resistentes. Graças ao uso descuidado de agentes 

antimicrobianos, a taxa de casos de microrganismos multirresistentes vem aumentando nos 

últimos anos. Um exemplo é o tratamento da tuberculose, que consiste na administração de uma 

combinação de antibióticos (2 a 3) por um longo período (6 meses). O abandono precoce do 

tratamento acaba por selecionar cepas MDR (multi drug resistent). 

Durante a execução da prática utilizaremos a Escala Mac Farland, que consiste num 

método de quantificação de microorganismos através de turbidez. A escala é preparada com 

ácido sulfúrico e cloreto de bário em diversas concentrações, que reagem formando cloreto de 

bário obtendo diversos graus de turbidez. A concentração aproximada de microorganismos é dada 

conforme a leitura de absorbância realizada, de acordo com a tabela a seguir. 

Geralmente utilizamos uma concentração de microrganismos equivalentes ao padrão 0,5 

da escala MacFarland, ou seja, 1,5x10 8 /ml. 

Padrão da 

escala 

MacFarland 

Concentração 

aproximada de 

microrganismos 

(x10 6 /ml) 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 

300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000 

O Nutricionista deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos antibióticos 

que são utilizados para o tratamento de infecções a partir do conhecimento à sensibilidade das 

bactérias aos mesmos, para então acompanhar a dieta do indivíduo, fazendo as devidas 

modificações necessárias devido as inúmeras interações fármaco-nutrientes e a biodisponibilidade 

dos fármacos, sem esquecer as possíveis deficiências de vitaminas e minerais que podem vir a 

acontecer devido as introdução de alguns antibióticos. 

Objetivos 


è conceituar antibiograma (TSA) e identificar os grupos ou quadros clínicos nos quais o 

antibiograma é indicado; 

è diferenciar os métodos de diluição (CIM ou MIC) do método de difusão e descrever as etapas 

para a realização deste último; 

è compreender a influência de alguns fatores no diâmetro do halo e inibição; 

è ler e interpretar resultados possíveis de um antibiograma; 

è citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito através de outras técnicas. 

36




Material 

- Cultura bacteriana 

- Tubo com solução salina estéril 

- Swab estéril 

- Tubo n o 0,5 da escala de Mac Farland 

- Pipeta estéril 

- Placa de Agar Mueller-Hinton 

- 4 discos de antibióticos diferentes 

- Pinça 

- Régua graduada 


- ajustar a densidade do inóculo acrescentando a cultura à solução salina até esta se igualar à 

turvação do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste é feito por turbidez, e não 

pela cor que o caldo se apresenta). 

- embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de 

modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direções) 

37





1. Qual a diferença entre os métodos de difusão e impregnação em discos? 

2. Por que o método de impregnação do antimicrobiano em discos é mais utilizada? 

3. Qual a importância da inoculação ser realizada de modo correto, permitindo crescimento 

confluente? 

4. Podemos comparar os halos de inibição obtidos com antimicrobianos diferentes ou em 

diferentes concentrações? 

Observações 

40




Assunto 6: Cocos Gram positivos 

Introdução 

Os principais gêneros de Cocos Gram positivos de interesse na área de saúde são o 

Staphylococcus e o Streptococcus, membros da família Micrococcaceae. 

Em ambos os gêneros, podemos encontrar espécies que compõem a microbiota normal de 

diversas pessoas, como Staphylococcus epidermidis e Enterococcus (antigamente denominado 

Streptococcus faecalis), mas também existem espécies altamente patogênicas, como 

Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. É importante ressaltar que os enterococos não 

são considerados como estreptococos, mas um gênero à parte. Como este gênero foi por muito 

tempo estudado como sendo parte do gênero Streptococcus, ainda hoje é comum estuda-lo junto 

com este, identificando as principais diferenças entre ambos. 

São gêneros bastante parecidos, causadores de doenças denominadas piogênicas (com 

produção de pus), a principal diferença entre ambos é a produção de catalase por 

Staphylococcus. 

Ambos os gêneros, Staphylococcus e Streptococcus, são importantes na área de 

alimentos já que podem ser veiculados por alimentos. 


® Staphylococcus 

As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos, que quando vistos ao 

microscópio aparecem na forma de cachos de uva. São anaeróbias facultativas, com maior 

crescimento em condições aeróbias, quando produzem catalase. São amplamente distribuídos na 

natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves 

(encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). 

De todas as espécies existentes, as de maior interesse humano são Staphylococcus 

aureus, Staphylococcus epidermidis, e Staphylococcus saprophyticus. 

Para diferenciação d a espécie, utilizamos as provas de fermentação do manitol, da coagulase, 

DNAse, sensibilidade à novobiocina e redução de nitrato. 

A espécie S. aureus é a que está mais freqüentemente associada a doenças 

estafilocócicas, sendo de origem alimentar ou não, está geralmente envolvida em infecções 

humanas (de origem comunitária e hospitalar) e apresenta uma freqüência de 30 a 40% de 

portadores na população. 

São bactérias mesófilas, com crescimento na faixa de 7ºC a 47,8ºC, e as toxinas são 

produzidas entre 10ºC e 46ºC, com ótimo entre 40ºC e 45ºC. Quanto mais baixa for a 

temperatura, mais tempo será necessário para produzir enterotoxinas. 

São bactérias tolerantes a concentrações de 10% a 20% de NaCl, sendo este um fator de 

estimulação da produção da coagulase. Também são tolerantes a altas concentrações de nitratos. 

Crescem em faixa de pH de 4 a 9,8, com ótimo entre 6 e 7. E possuem capacidade de 

crescer em valores de atividade aquosa inferior à muitas bactérias, até entre 0,86-0,83. 

41




pressão osmótica (até 6,5 % de NaCl). São membros da microbiota normal do trato gastrintestinal 

de diversas pessoas. 

O gênero Streptococcus é composto de bactérias anaeróbias facultativas, com maior 

crescimento em atmosfera com 10% de CO2. 

Possuem atividade hemolítica, fator importante para a classificação das cepas patogênicas 

em a (hemólise parcial), b (hemólise total) e g (anemolítico). 

Os estreptococos a hemolíticos apresentam zonas de hemólise, possuindo hemácias 

íntegras na parte mais interna junto a colônia, e hemólise maior na parte mais externa. 

Freqüentemente, aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da 

hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana e conseqüente liberação de biliverdina 

e bilirrubina), que originou a qualificação "estreptococos do grupo esverdescente" ou 

Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de 

pneumonia, apresentam hemólise a, uma colônia puntiforme com um aprofundamento no ápice da 

colônia (parecendo um pequeno vulcão). 

Os estreptococos b hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se observando 

hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes 

apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio 

atmosférico e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar sangue. 

A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias 

crescidas na superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam 

hemolisina O, se torna necessária a semeadura do germe pela técnica em profundidade ("pourplate") 

, ou a realização de perfurações ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubação 

em atmosfera pobre em oxigênio (técnica da jarra com vela). 

Os estreptococos g não produzem hemólise, são anemolíticos, isso significa que não têm 

capacidade lítica nenhuma sobre as hemácias. Muitas das espécies saprófitas são deste grupo. 

Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento. 

O meio de seletivo específico para estreptococos mais usado é o Caldo Hitchens-Pike. 

Um meio alternativo para enriquecimento é o Caldo Tioglicolato de Sódio, adequado para o 

crescimento de bactérias, inclusive aquelas microaerófilas e anaeróbias. 

O meio clássico de isolamento de estreptococos é o Agar Sangue aonde pode-se observar 

o perfil hemolítico dos mesmos. 

As colônias de estreptococos isoladas em Agar Sangue são puntiformes (< 1mm de 

diâmetro), transparentes à luz transmitida e peroladas à luz refletida. 

Na identificação de estreptococos além do perfil hemolítico, utilizam-se outras provas 

auxiliares para a identificação das principais espécies. O esquema abaixo apresenta estas provas: 

43




Objetivos 


è compreender o papel dos manipuladores de alimentos como potenciais reservatórios de S. 

aureus produtores de enterotoxinas; 

è caracterizar e compreender o modo de ação dos meios utilizados para o isolamento de 

Staphylococcus (Chapman ou A. Manitol Salgado) e Streptococcus (Agar Sangue); 

è caracterizar e compreender as provas básicas de identificação e diferenciação de 

Staphylococcus e Streptococcus (catalase, coagulase e DNAse), compreendendo o mecanismo 

de ação destas. 

Material 

® Isolamento de anfibiontes das vias aéreas superiores 

- swabs estéreis 

- tubo com solução salina 

- Agar Chapman 

- Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike). 

® Identificação de Staphylococcus e Streptococcus I 

44




- Agar sangue 

- Caldo simples ou BHI 

- Agar inclinado 

- Agar DNAse 

- dessecador com vela. 

® Identificação de Staphylococcus e Streptococcus II 

- reativo para catalase (H2O2) 

- reativo para DNAse (HCl 1N) 

- reativo para coagulase (plasma sangüíneo) 

- tubo controle positivo 

- lâminas 

- conjunto de coloração de Gram. 


® Isolamento de anfibiontes das vias aéreas superiores 

- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxílio de swab previamente umedecido 

em solução salina estéril e inocular o meio Chapman com a técnica de esgotamento em estria e 

incubar a 37 o C por 24 horas, conforme o esquema a seguir: 

- colher material da orofaringe (tonsilas palatinas/amídalas) com o auxílio de swab previamente 

umedecido em solução salina estéril e inocular o meio de Tioglicolato e incubar a 37 o C por 24 

horas, conforme o esquema a seguir: 

45




® Identificação de Staphylococcus e Streptococcus I 

- observar o crescimento típico ou não de S.aureus no meio de Chapman e inocular colônia 

isolada em caldo BHI, Agar DNAse e Agar inclinado e incubar a 37 o C por 24 horas, conforme o 

esquema abaixo: 

- inocular por esgotamento o crescimento do meio Tioglicolato em placas de Agar sangue e 

incubar a 37 o C por 24 horas em microaerofila pela técnica da vela, conforme o esquema abaixo: 

® Identificação de Staphylococcus e Streptococcus II 

- utilizando os reativos próprios, fazer as leituras das provas de catalase (H2O2), DNAse (HCl 1N) 

e coagulase (plasma de coelho citratado) 

46




OBSERVAÇÃO: 

As principais provas bioquímicas utilizadas para a identificação de bactérias do gênero 

Staphylococcus são: 

à Fermentação do Manitol: a primeira prova a ser realizada, já na primeira etapa da prática. É 

verificada no meio de Chapman, ou Agar Manitol Salgado, que contém o indicador de pH 

vermelho de fenol. Quando o microorganismo utiliza o manitol como fonte de carbono 

(fermentando-o), produz ácido no meio, reduzindo o pH e alterando a cor do indicador de 

vermelho (laranja) para amarelo. Caso o microorganismo seja isolado em Agar Sangue, a prova 

pode ser realizada em Caldo Vermelho de Fenol suplementado com 1,0% de manitol. 

à Prova da Catalase: se destina a verificação da presença da enzima catalase, uma superoxidodismutase. 

A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio com formação de 

água e oxigênio molecular (H2O2 + catalase à H2O + ½ O2). A prova pode ser efetuada com o 

crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este 

possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A verificação da produção dessa enzima por 

determinada bactéria pode ser feita adicionando-se peróxido de hidrogênio (H2O2 a 30%) à cultura 

em meio sólido ou líquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Se o 

microorganismo produzir catalase, o resultado positivo será visto como desprendimento de gás 

sobre colônia (borbulhamento). 

Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento 

em Agar Sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de peróxido em uma 

área do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colônia a ser testada. 

Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rápido e intenso sobre a colônia. 

à Prova da Coagulase: Verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma através 

da enzima coagulase. A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas: coagulase ligada 

e coagulase livre. 

A coagulase ligada converte fibrinogênio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores 

de coagulação, e pode ser detectada em teste direto em lâmina, utilizando-se da suspensão de 

Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e 

observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 minutos. Pode se tornar mais sensível o 

47




teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de 

escolha. 

A coagulase livre reage com o fator de coagulação do plasma, o CRF, formando uma substância 

semelhante, mas não idêntica à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste 

utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído na proporção 1:5 em solução 

salina; a reação ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37º C. 

Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica quando o 

germe é crescido em meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-se a 

utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado (Chapman), este 

procedimento aumentaria a sensibilidade do teste. 

Semear uma alçada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diluído e incubar a 

37ºC. Devem ser feitas leituras periódicas a cada30 minutos por um período de até 4 horas e uma 

leitura final após 24 horas, pois algumas espécies produzem também fibrinolisina, que dissolve o 

coágulo formado. A menor coagulação é considerada prova positiva. Aconselha-se, também 

utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como 

comprovação do teste. 

à Prova da DNAse: Verifica a capacidade do microorganismo utilizar DNA como fonte 

energética, através da produção da enzima DNAse. O meio utilizado (Agar DNAse) possui DNA 

em sua composição. O microorganismo é semeado em forma de “spot” ou estria reta simples. 

Após o crescimento, adiciona-se ao meio HCl 1N, que vai revelar o resultado. O HCl precipitará 

todo o DNA presente no meio (lembrando que o DNA e proteína e desnatura em presença de 

ácidos). Se o microorganismo produzir DNAse, terá degradado todo o DNA ao redor do 

crescimento, e não haverá precipitação. Quando colocado contra o fundo escuro, pode-se ver 

claramente o meio turvo e um halo claro (translúcido) ao redor do crescimento. 

à Sensibilidade a Novobiocina: Este teste não será realizado na aula prática, mas é muito 

utilizado na rotina de laboratório. Esta prova é diferenciadora de espécie, pois apenas S. 

epidermidis é resistente a este antimicrobiano. O teste é realizado semelhantemente ao TSA 

(Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, 

de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Novobiocina com concentração de 

5 mg/ml. Após a incubação verificar o tamanho do halo de inibição e comparar com uma tabela 

específica. 

- caracterizar a presença de colônias típicas de Streptococcus e seu eventual padrão hemolítico 

no meio de Agar sangue. 

- preparar lâminas com esfregaço de amostra coletada do Agar Inclinado (Staphylococcus) e do 

Agar Sangue (Streptococcus), corar pelo método de Gram e observar em microscopia. 

48




OBSERVAÇÃO: Há provas bioquímicas que podem ser utilizadas na identificação de 

Streptococcus, embora nós não as utilizemos na aula prática. Estas são: 

à Sensibilidade a Optoquina: Esta prova é diferenciadora de espécie (S. pneumoniae e S. 

viridans). O teste é realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a 

Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter 

crescimento confluente e adicionar o disco de Optoquina. Após a incubação verificar o tamanho 

do halo de inibição. Considerar como sensível um halo de inibição de raio maior que 2 cm. 

à Bile solubilidade: Esta prova é utilizada para identificar se o microorganismo é capaz de 

resistir à presença de bile no meio. Dentre os estreptococos, apenas os enterococos são capazes 

de solubilizar a bile no meio. A prova é realizada conforme esquema que se segue: A 1,0 mL de 

cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 

com NaOH 0,1N (cor rósea). Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou 

bílis. Incubar juntamente com um tubo sem bílis a 37º C por 3 horas. 

à Sensibilidade a Bacitracina: Esta prova identifica os Streptococcus do grupo A, poisestes são 

sensíveis, enquanto outros Streptococcus não grupo A são resistentes a este antimicrobiano. O 

teste é realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se 

a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o 

disco de Bacitracina com concentração de 0,04U. Após a incubação em baixa tensão de O2, 

verificar o tamanho do halo de inibição. Considerar como sensível um halo de inibição de raio 

maior que 2 cm. 

à Crescimento a 56°C: Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus 

faecalis), submeter a cultura a um aquecimento de 56º C por 30 minutos. Somente os enterococos 

resistem a esse tratamento. 

à Crescimento em Agar Chapman: Esta prova também diferencia os enterococos, pois estes 

toleram a alta concentração de NaCl presente no meio, como acontece com os estafilococos. 

à Crescimento em Agar EMB: Outra prova para identificação de enterococos, pois estes 

suportam a presença de corantes como o azul de metileno (que é inibidor para a maioria dos 

Gram positivos). 

® Meios utilizados na prática 

Agar Chapman 

Composição do Meio (g/L) Observações 

Extrato de carne 

Peptona 

Manitol 

Cloreto de sódio 

Vermelho de fenol 

Agar 

1,0 

10,0 

10,0 

75,0 

0,025 

15,0 

pH do meio: 7,5 ± 0,2 

Este meio possui agentes seletivo (NaCl a uma 

concentração de 7,5%), indicador (vermelho de 

fenol) e diferencial (manitol). 

Ou seja, além de restringir o crescimento de 

49




Caldo Tioglicolato de Sódio 


Extrato de levedura 

Triptona 

Glicose 

Toglicolato de sódio 


L-cistina 

Resazurina 

Agar 

Agar Sangue 

5,0 

15,0 

5,5 

0,5 

2,5 

0,5 

0,001 

0,75 

bactérias não halófilas, permite a diferenciação 

de microorganismo fermentadores de manitol, o 

que é indicado pela viragem da cor do 

indicador de pH Vermelho de fenol, de laranja 

para amarelo. 

pH do meio: 7,1 ± 0,2 


Triptona 

Peptona neutralizada 



Sangue de carneiro 

Agar 

Caldo BHI (Brain Heart Infusion) 

14,0 

4,5 

4,5 

5,0 

7,0 

12,5 

Esse meio é adequado para o cultivo de 

microorganismos aeróbios e anaeróbios. A 

resazurina é um agente indicador de oxidação, 

em presença de O2 o meio adquire coloração 

avermelhada. 

pH do meio: 7,3 ± 0,2 


Sólidos de infusão de cérebro de 

bezerro 

Sólidos de infusão de coração de boi 

Proteose peptona 

Glicose 


Fosfato dissódico 

Agar DNAse 

12,5 

5,0 

10,0 

2,0 

5,0 

2,5 

O meio é altamente nutriente, além de ser 

suplementado com sangue, o que o torna um 

meio muito utilizado em etapas de 

enriquecimento e para visualização de 

propriedades hemolíticas de diversos 

microorganismos. Como na possui agentes 

seletivos, deve ser manipulado com bastante 

cuidado. 

pH do meio: 7,4 ± 0,2 

Este é um caldo de infusão tamponado, 

altamente rico em nutrientes e que não 

apresenta nenhum agente seletivo. É muito 

indicado para o crescimento de estafilococos 

para verificação de produção de coagulase, 

pois potencializa essa característica do 

microorganismo. 

50





Triptose 

Ácido deoxiribonucléico 


Agar 

20,0 

2,0 

5,0 

12,0 

pH do meio: 7,3 ± 0,2 

A produção da DNAse no meio é detectada 

graças ao DNA adicionado. Para a leitura, é 

necessário adicionar HCL 1 N sobre toda a 

superfície do meio e aguardar a precipitação. 

Esta prova é utilizada para identificar 

estafilococos patogênicos, por estar 

correlacionada à produção de coagulase. 

** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) são meios simples, sem nenhum nutriente de 

enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composições não 

serão estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos. 


1. Qual a finalidade do Agar Chapman na primeira etapa da aula prática? 

2. De que maneiras podemos diferenciar os estreptococos dos enterococos? 

3. Qual o método de classificação de estreptococos foi utilizada na aula? Em que estase baseia? 

4. Quais as principais provas para identificação bioquímica de estafilocococs e quais os seus 

fundamentos? 

5. Qual a finalidade da técnica da “Jarra com Vela”? 

Observações 

51




Assunto 7: Coloração de Zihel-Neelsen (Visualização de 

Bactérias Espiraladas) 

Introdução 

Algumas bactérias não se coram pelo método de coloração de Gram, pelo simples fato de 

apresentarem composição da parede celular diferenciada das bactérias Gram positivas e Gram 

negativas. 

Entre estas bactérias estão as micobactérias, como o Mycobacterium tuberculosis, um 

bacilo álcool-ácido resistente de importância médica, por ser o causador da tuberculose humana e 

o Mycobacterium bovis, de grande interesse na nutrição por causar tuberculose em bovinos, 

sendo esta uma zoonose veiculada por alimentos. As micobactérias penetram pela mucosa da 

orofaringe e do trato digestivo chegando aos nódulos mesentéricos e a partir daí pode se 

disseminar para outros tecidos e órgãos, quando inaladas podem provocar tuberculose pulmonar 

idêntica à causada pelo Mycobacterium tuberculosis. 

A coloração de Ziehl-Neelsen é a técnica mais utilizada na identificação das micobactérias 

e de bactérias álcool-ácido resistentes em geral, como as bactérias espiraladas.. 

Muitas bactérias espiraladas estão associadas a doenças humanas: Leptospira 

(leptospirose); Treponema (sífilis) e Borrelia (doença de Lyme). Como são microrganismos muito 

delgados e recobertos por uma bainha protéica, a coloração de Gram não é útil na sua 

visualização. Para tanto são empregados métodos de impregnação com sais de prata (método de 

Fontana-Tribondeau) que permite sua observação em microscopia de campo claro e a observação 

direta em microscopia de campo escuro. 

A presença de bacilos álcool-ácido resistentes no escarro é forte sugestão de tuberculose 

pulmonar. Além disso, sangue colhido do lóbulo da orelha ou material colhido da própria lesão 

indica o diagnóstico da lepra (Mycobacterium leprae). 

Faz parte da prática do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importância na 

orientação do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as 

infecções causadas por essas bactérias são graves. 


O gênero Mycobacterium contém grande número de espécies, as patogênicas de maior 

importância para o homem são Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e 

Mycobacterium bovis. Com exceção da Mycobacterium leprae (que só pode ser cultivado em 

cultura de células), as micobactérias podem ser cultivadas em laboratório (in vitro), em meio de 

cultura seletivo. 

As bactérias desse gênero são bacilos finos, diferentes das demais bactérias em várias 

propriedades, a começar pela parede celular que é composta de ácidos graxos de cadeia longa 

(ácidos micólicos) e ceras (ésteres de ácidos graxos). São aeróbias estritas, possuindo tropismo 

pela árvore respiratória. Não são produtoras de esporos e possuem crescimento lento, graças à 

composição de sua parede celular, de caráter altamente lipídico, dificultando a absorção de 

nutrientes. Por esse mesmo motivo as micobactérias não se coram pela Coloração de Gram. Sua 

parede celular rica em substâncias lipídicas, como ceras e ácidos graxos de cadeia longa, dificulta 

a penetração dos corantes utilizados neste método. A velocidade de crescimento e a temperatura 

ótima para seu crescimento são variáveis. 

52




São bactérias intracelulares facultativos que se proliferam no interior de macrófagos. São 

resistentes ao hidróxido de sódio, ácido sulfúrico e a certos anti-sépticos. 

Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra Tuberculose, a interpretação 

da lâmina pode ser: 

Negativo (-) Ausência de BAAR em 100 campos microscópicos 

Positivo (+) Menos de 1 bacilo/campo em 100 campos 

Positivo (++) 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos 

Positivo (+++) Mais de 10 bacilos/campo em 20 campos 

Na técnica da coloração de Ziehl-Neelsen, aliam-se a utilização de calor e agentes 

químicos mais fortes, como a fucsina fenicada e a solução de álcool etílico-ácido clorídrico (97:3), 

que possibilitam que a célula se core, podendo ser visualizada no microscópio. 

Além disso, a utilização destes fatores agressivos também elimina quaisquer 

contaminantes biológicos (outras bactérias) que possam existir no esfregaço, aumentando a 

possibilidade de visualização e confirmação das micobactérias. 

Para a visualização de bactérias espiraladas pode-se utilizar um artifício que aumenta a 

espessura das mesmas permitindo assim a sua observação. Isto é conseguido através da 

impregnação da superfície da bactéria com sais de prata que uma vez aquecidos sofrem oxidação 

e conseqüente escurecimento. 

A utilização de microscopia de campo escuro também permite a visualização direta das 

bactérias. O campo escuro é conseguido pelo uso de um condensador especial que faz com que 

os raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de modo que a iluminação das 

partículas se faça por reflexão e não transmissão. Desse modo apenas as partículas presentes 

são iluminadas contrastando com um findo escuro. Através desta visualização se faz possível 

inclusive a realização do diagnóstico por soroaglutinação microscópica (microaglutinação) na 

leptospirose. 

Objetivo 


è executar a técnica da coloração de Zihel Neelsen; 

è diferenciar a coloração de Zihel Neelsen da coloração de Gram; 

è relacionar a composição química da parede celular das micobactérias com os corantes de 

Zihel; 

è diferenciar BAAR e BNAAR; 

è compreender o princípio do método de Fontana Tribondeau; 

53




è diferenciar microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importância desta última 

na observação de espiroquetas. 

Material 

- Lâminas com esfregaços fixados de escarro de paciente com tuberculose 

- Fucsina de Zihel 

- Azul de metileno 

- Solução de álcool (97%) e ácido clorídrico (3%) 

- Água 

- Papel de filtro 

- Óleo de cedro 

- Microscópio 

- Bico de Bunsen 


® Preparo e fixação do esfregaço 

Etapas Observações 

Transferir uma alçada da cultura ou uma 

colônia da placa para uma lâmina de 

microscópio limpa. 

Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes 

culturas deve-se observar alguns detalhes: 

è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, 

espalhando-a pela lâmina à isso evitará a 

observação de colônias diferentes na lâmina e 

que seja coletado um inóculo muito carregado, o 

que dificultará a visualização das células 

coradas. 

è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada 

e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja 

coletado um inóculo muito carregado. 

54




Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se 

tiver sido colhida colônia da placa, adicionar 

salina estéril para facilitar o espalhamento. 

Passar a lâmina com o esfregaço sobre a 

chama do Bico de Bunsen, até que este esteja 

completamente seco. 

® Coloração do esfregaço 

Para o inóculo coletado de caldo não é 

necessário adicionar solução salina. Mas para 

colônia coletada de placa é necessário fazer a 

diluição na lâmina, evitando que o esfregaço 

fique muito concentrado o que dificulta a 

visualização das células coradas ao 

microscópio. 

É importante fixar o esfregaço para que este não 

se perca durante as etapas de lavagem entre a 

utilização de um e outro corantes 

Etapas da Coloração O que está acontecendo na parede da bactéria? 

Cobrir o esfregaço com solução fucsina 

fenicada. 

Aquecer intermitentemente até a emissão de 

vapores e manter por mais 5 minutos sem 

deixar que entre em ebulição. 

Nesse momento, a fucsina não penetra na 

parede da célula, pois sua composição 

altamente lipídica impede a difusão do corante. 

Esta coloração é muito mais agressiva que a 

coloração de Gram. Note que a fucsina utilizada 

é cerca de 5x mais concentrada que a utilizada 

no método de Gram. 

O aquecimento torna a parede lipídica mais 

fluida, permitindo a entrada do corante na parede 

da célula. 

55




Lavar rapidamente com água. 

Lavar a lâmina inclinada a 45° com solução de 

álcool etílico:ácido clorídrico (97:3) até que 

não haja mais desprendimento de corante 

(aproximadamente 2 minutos). 

Lavar o esfregaço com solução de álcool 

etílico:ácido clorídrico (97:3) até que não haja 

mais desprendimento de corante. 

Essa etapa é realizada para que não haja 

excesso de corante sobre o esfregaço na 

próxima etapa. 

A solução álcool-ácida é responsável por fixar o 

corante na parede da célula, impedindo sua 

saída. Como essas bactérias são álcool-ácido 

resistentes, não há dissolução da parede, 

mesmo esta tendo alto caráter lipídico. 

É importante que esta etapa seja realizada, pois 

se restar algum corante na lâmina, o próximo 

corante a ser utilizado não se fixará na lâmina, 

não cumprindo seu papel. 

56




Cobrir o esfregaço com corante Azul de 

Metileno por 30 segundos. 

Lavar com água e secar suavemente com 

papel. 

È importante que esta etapa seja realizada, pois 

se restar algum corante na lâmina, o próximo 

corante a ser utilizado não se fixará na lâmina, 

não cumprindo seu papel.. 

Após secar, observar no microscópio, objetiva de 

imersão (100x), com óleo de cedro/mineral. 

Comparando com a coloração de Gram: 

Coloração de Gram Coloração de Zihel Neelsen 

Principal corante Cristal violeta Fucsina fenicada 

Fixador do corante Lugol Álcool:ácido clorídrico 

Corante de contraste Fucsina Azul de metileno 


1. Em que se baseia o método da coloração de Zihel Neelsen? 

2. Por que os corantes desse método são mais agressivos que os utilizados no método de Gram 

(por exemplo, a fucisna é 5x mais concentrada)? 

3. Por que os BAAR não se coram bem pelo método de Gram? 

57




Observações 

58




Assunto 8: Bacilos Gram-negativos 

Introdução 

As bactérias Gram negativas são de grande importância, pois abrangem as 

enterobactérias, e dentro deste grupo podemos citar dois subgrupos de grande destaque na área 

de alimentos: os coliformes fecais e totais, que indicam contaminação do alimento por 

manipulação inadequada. 

A família Enterobacteriaceae é uma das mais importantes famílias bacterianas, a ela 

pertencem muitos dos patógenos mais importantes para o homem e para os animais. Estes 

patógenos estão entre os principais agentes de infecção hospitalar e constituem a principal causa 

de infecção intestinal em muitos países. 

Além disso, quando patógenos de animais, são importantes porque causam perdas 

econômicas e porque os animais se apresentam como reservatório de patógenos humanos 

São de grande importância na nutrição porque indicam contaminação de origem fecal, já 

que seu habitat é o Trato Gastrintestinal de animais e do homem, de onde, via alimentos e água, 

se disseminam no meio, contaminando homens e outros animais. 

Os gêneros de maior importância são: 

à Escherichia * 

à Shigella 

à Salmonella 

à Yersinia 

à Enterobacter * 

à Citrobacter * 

à Klebsiella * 

Os gêneros sublinhados são enteropatógenos (causadores de doenças intestinais) e os 

gêneros assinalados compõem o grupo dos coliformes fecais, indicadores de contaminação fecal. 

Dentre estes só E. coli tem como habitat primário o TI do homem e de animais. Os demais 

também estão presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo 

superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. 

A espécie E. coli é tão variável que existem sorotipos patogênicos e não patogênicos, e até 

da flora normal. 

Os principais microorganismos utilizados para indicar a qualidade microbiológica de 

alimentos são os coliformes fecais e totais. 

Visto a grande importância das enterobactérias na formação e atuação do nutricionista, 

enfocaremos estas bactérias na aula prática. 


O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminação de origem fecal foi proposto 

uma vez que este microorganismo é encontrado no trato intestinal do homem e de animais de 

sangue quente. O indicador ideal de contaminação fecal deveria ser de rápida e fácil detecção, ser 

facilmente distinguível de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hábitat 

exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em números muito altos nas 

fezes, entre outras características importantes. 

59




O grupo dos coliformes totais é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae 

capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. 

Deste grupo, apenas a E. coli tem como hábitat primário o trato intestinal do homem e de animais. 

A presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal 

recente ou ocorrência de enteropatógenos, já que outras espécies (Enterobacter, Citrobacter e 

Klebsiella) não são de origem fecal. 

O grupo dos coliformes fecais são microorganismos pertencentes ao grupo dos totais, 

diferenciando-se pela capacidade de fermentar lactose com produção de gás em temperatura de 

44-45ºC. Nessas condições, a maioria das cepas de E. coli são positivas, enquanto as outras 

bactérias possuem apenas algumas cepas com essa característica. 

A pesquisa de coliformes fecais ou de E. coli nos alimentos fornece informações sobre as 

condições higiênicas do produto e indicação da presença de patógenos. Quanto maior a 

concentração de coliformes fecais na amostra analisada, maior o risco de haver patógenos 

entéricos naquela amostra (água, alimentos, etc.). 

Em alimentos vegetais frescos, o único indicador válido de contaminação fecal é a E. coli, 

já que os demais indicadores de contaminação fecal são encontrados naturalmente nesse tipo de 

alimento. Em alimentos de origem animal, presença de coliformes indica manipulação sem 

cuidados higiênicos ou armazenamento inadequado. Em alimentos processados, a presença de 

um número considerável de coliformes indica processamento inadequado ou recontaminação pósprocesso, 

e a possível presença de microorganismos patogênicos e toxigênicos. 

É importante ressaltar que os alimentos não são fonte de contaminação, e sim veículos. A 

contaminação provém do TI do animal (POA) e do solo (POV - neste caso, sendo apenas 

superficial), por isso diz que as enterobactérias causam DVAs (Doenças Veiculadas por 

Alimentos). 

A pesquisa de enteropatógenos em alimentos normalmente requer várias etapas para que 

seja possível o isolamento do mesmo. Podemos citar a pesquisa de Salmonella. A legislação 

prevê a ausência deste patógeno em 25g da amostra, visto a sua alta virulência. 

Normalmente a pesquisa de Salmonella envolve as seguintes etapas: 

a) pré-enriquecimento: feito em meio líquido não seletivo, visa permitir a recuperação de 

bactérias injuriadas como conseqüência de algum processamento realizado no alimento 

(congelamento, salga, etc...): meio usado à caldo lactosado 

b) enriquecimento seletivo: feito em meios líquidos seletivos, visa aumentar a proporção 

de Salmonella em relação ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: meios 

usados à Caldo Tetrationato, Caldo Selenito-Cistina. 

c) plaqueamento seletivo: em meios seletivo-indicadores sólidos, é a fase de isolamento. 

Uma grande diversidade de meios foi desenvolvida para este fim. A maioria deles apresenta 

lactose como açúcar de diferenciação: meios usados à Agar EMB, Agar MacConkey, Agar 

Entérico de Hektoen, Agar SS, etc... 

d) triagem: visa uma identificação preliminar de colônias suspeitas selecionadas nos 

meios de isolamento, utilizando um ou dois meios que permitem a realilzação de 2 ou mais provas 

bioquímicas simultaneamente: meios usados à Agar TSI, Agar LIA. 

e) confirmação bioquímica: visa uma identificação completa do gênero através de uma 

série de provas bioquímicas: produção de urease em Caldo Uréia; determinação do tipo de 

fermentação da glicose - provas VM e VP em caldo glicosado; utilização do citrato em Agar Citrato 

de Simmons; produção de indol em Água Peptonada ou Triptonada; motilidade em meio semisólido; 

etc... 

f) confirmação sorológica: visa confirmar a identificação através de uma reação de 

aglutinação utilizando um anti-soro polivalente contra o antígeno O de Salmonella . 

60




Objetivos 


è Compreender o papel das enterobactérias como agentes de toxinfecções alimentares; 

è Caracterizar e compreender o modo de ação do meio EMB utilizado para o isolamento de 

bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e não fermentadores da 

lactose; 

è Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactérias; 

è Caracterizar as provas básicas de triagem e confirmação bioquímica para identificação e 

diferenciação de enterobactérias compreendendo seu mecanismo de ação. 

Material 

® 1º dia: isolamento de enterobactérias 

- tubo de caldo Triptona de Soja (TSB) com crescimento de enterobactéria 

- placa de Agar BEM 

® 2º dia: identificação bioquímica (IMVC e provas complementares) 

- tubo com Agar TSI; 

- tubo com Agar Citrato de Simmons 

- tubo com Meio SIM; 

- tubo com água peptonada ou caldo triptonado; 

- tubo com caldo CL ou MRVP; 

- tubo com caldo uréia; 

- tubos com para provas de fermentação (Vermelho de Fenol suplementado com Glicose – com 

tubo de Durhan, Lactose e Manitol) 

® 3º dia: interpretação das provas bioquímicas e complementares) 

- Reativo de Kovacs 

- Vermelho de Metila 

- a-naftol VM 

- solução de KOH 

61





® 1º dia: isolamento de enterobactérias 

- inocular o Agar EMB com a cultura pela técnica de esgotamento em estrias 

Após a execução da inoculação, incubar o meio a 37°C por 24 - 48 horas. 

® 2º dia: identificação bioquímica (IMVC e provas complementares) 

- observar o crescimento obtido e anotar as características das colônias, comparando com os 

dados da tabela abaixo: 

Característica colonial Gêneros (ou espécies) 

- colônias transparentes ou de cor âmbar Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia 

- colônias com brilho verde metálico à luz refletida 

e centro negro à luz transmitida 

- colônias maiores que as de E. coli , mucosas, 

confluentes, com centro escuro à luz transmitida 

Escherichia coli 

Enterobacter, Klebsiella 

- inocular os meios de triagem e confirmação bioquímica usando as seguintes técnicas: 

- Agar TSI: picada central até o fundo do tubo e estria no bizel; 

- Agar Citrato de Simmons: estria sinuosa ou reta na superfície; 

- Meio SIM: picada central até o meio do tubo; 

- Caldos Uréia, Glicose, Lactose, Manitol, Clark Louis (ou Caldo MRVP), e Água 

Peptonada (ou Água Triptonada): difusão. 

62




® 3º dia: interpretação das provas bioquímicas e complementares) 

- utilizando os reativos próprios, quando necessário, e segundo orientação do professor, fazer as 

leituras das provas bioquímicas. 

OBSERVAÇÃO: 

- os reativos necessários para a prática são: 

- Reativo para verificação de Indol: Reativo de Kovac’s à paradimetilaminobenzaldeído; 

- Reativo para prova de Vermelho de Metila (VM): Corante Vermelho de Metila; 

- Reativos para prova de Voges Proskauer (VP): VP1 à a-naftol e VP2 à KOH 

63




- conferir os resultados obtidos nas provas bioquímicas e compará-los com a tabela abaixo, 

caracterizando a bactéria analisada: 

Gênero GLI LAC MAN H2S MOT IND CIT VM VP URE 

Salmonella + - + + + - + + - - 

Escherichia + + + - + + - + - - 

Klebsiella + + + - - - + - + + 

Proteus + - - + + +/- +/- + - + 


Agar EMB (Eosina Azul de Metileno) 


Peptona 

Lactose 

Fosfato dipotássico 

Eosina Y 

Azul de metileno 

Agar 

Agar TSI (Tríplice Açúcar Ferro) 

10,0 

10,0 

2,0 

0,4 

0,065 

15,0 

pH do meio: 6,8 ± 0,2 




Peptona 


Lactose 

Sacarose 

Glicose 

Citrato de ferro 

Tiossulfato de sódio 


Agar 

3,0 

3,0 

20,0 

5,0 

10,0 

10,0 

1,0 

0,3 

0,3 

0,024 

12,0 

Neste meio a combinação de eosina e azul de 

metileno como indicadores promove uma 

diferenciação entre as colônias de 

microorganismos que fermentam a lactose e os 

que não fermentam. As colônias lactosepositivas 

são negras e possuem halo 

transparente, e as lactose-negativas são 

incolores. O meio é inibidor para 

microorganismos Gram-positivos, graças aos 

corantes presentes. As colônias apresentam 

coloração azul-esverdeada e algumas 

apresentam brilho metálico à luz refletida. 

pH do meio: 7,4 ± 0,2 

Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 

1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de 

fenol para detecção da fermentação de 

carboidratos, além de sulfato de ferro para 

detecção da produção de sulfato de hidrogênio 

(H2S), formando sulfeto ferroso. 

A fermentação é indicada pela mudança da cor 

do indicador de pH de vermelho para amarelo: 

os açúcares se depositam no fundo, se o 

microorganismo fermentar apenas a glicose 

(pequena concentração) a produção de ácido 

será pequena e apenas o fundo do tubo 

64




Agar Citrato de Simmons 


Sulfato de magnésio 

Fosfato monobásico de amônio 

Fosfato de amônio sódico 

Citrato de sódio tribásico 


Azul de bromotimol 

Agar 

Meio SIM (Sulfeto Indol Motilidade) 

0,2 

0,2 

0,8 

2,0 

5,0 

0,08 

15,0 

mudará de cor; se o microorganismo fermentar 

além da glicose a sacarose e/ou a lactose 

(concentrações 10x maiores que a glicose), a 

produção de ácido será maior e a viragem de 

cor será no fundo e no bizel. 

A produção de H2S é indicada pela cor preta no 

meio. 

Como o Agar é inclinado, ocorrem duas 

reações diferentes: no bizel há metabolismo 

aeróbio e no fundo há metabolismo anaeróbio, 

gerando uma série de combinações de 

resultados possíveis. 

pH do meio: 7,0 ± 0,2 


Triptona 

Peptona 

Sulfato férrico amoniacal 

Tiossulfato de sódio 

Agar 

20,0 

6,1 

0,2 

0,2 

3,5 

Nesse meio, o citrato é a única fonte de 

carbono disponível para o metabolismo da 

bactéria. Se o microorganismo descarboxilar o 

citrato, haverá viragem de cor do indicador de 

pH (azul de bromotimol) de verde para azul 

brilhante. 

pH do meio: 7,3 ± 0,2 

Este é um meio semi-sólido, com concentração 

de Agar muito baixa (3,5%, ao invés dos 15% 

que geralmente são adicionados ao meio), o 

que permite a verificação de motilidade do 

microorganismo, com crescimento além da 

área de inoculação. 

Além disso, a peptona e a triptona são fontes 

de triptofano, que pode ser metabolizado em 

indol pelo microorganismo. A produção de indol 

é verificada ao utilizar o reagente de Kovacs 

(para-dimetilaminobenzaldeído), com o 

aparecimento de um anel vermelho na parte 

superior do tubo. 

O meio também permite a detecção da 

produção de H2S, através da reação deste com 

o sulfato férrico, formando sulfeto ferroso (de 

cor negra). 

65




* Caldo CL: permite a realização das mesmas provas bioquímicas. 

Caldo para prova de fermentação – Caldo Vermelho de Fenol 


Peptona de caseína 

Peptona de carne 



5,0 

5,0 

5,0 

0,018 

(acetilmetilcarbinol) e 2,3-butanodiol (diacetil), 

que pode ser confirmado com a adição do 

reagente a-naftol seguida de alcalinização do 

meio com KOH. A coloração do meio muda 

para vermelho intenso. 

pH do meio: 7,4 ± 0,2 

Esse é um caldo simples utilizado em provas 

de fermentação de carboidratos, com 

suplementação do carboidrato específico em 

uma concentração que varia de 5 – 10%. Se o 

microorganismo for fermentador do glicídio em 

questão, haverá produção de ácidos e o pH 

será reduzido, alterando a cor do indicador de 

pH vermelho de fenol de salmon (laranja claro) 

para amarelo. 

* carboidratos adicionados para verificação de fermentação: glicose (10%), lactose (10%), manitol 

(10%) 


1. Por que não podemos dizer que os alimentos são fonte de contaminação? 

2. Quais são as provas que compõem o conjunto de provas IMVC? Qual o fundamento de cada 

prova? 

3. Por que o Agar EMB é utilizado na primeira etapa? Qual o seu mecanismo de ação? 

4. Por que é importante observar e registrar a cor de cada meio no momento da inoculação e após 

a incubação? 

67




Observações 

68




Assunto 9: Contagem em Placa e Técnica do Número Mais 

Provável (NMP) 

Introdução 

A quantificação de bactérias em alimentos, materiais, manipuladores, equipamentos, 

bancadas e águas é uma das formas de se avaliar a sua qualidade, permitindo a caracterização 

dos mesmos como apropriados ou não para consumo ou utilização. Representa, pois uma forma 

de avaliação do risco que estes representam à saúde. 

Podemos quantificar os microorganismos de forma direta ou indireta. 

A forma direta de quantificação é a contagem em placa, e a indireta mais utilizada é a 

técnica do NMP (Número Mais Provável). 

A contagem de colônias em placas é uma técnica quantitativa direta aonde cada colônia 

crescida numa placa de Agar corresponde a uma unidade formadora de colônia (UFC) 

proveniente do material. 

A técnica do número mais provável é um método indireto de contagem em meio líquido, 

onde a partir de uma evidência da presença de uma bactéria ou grupo de bactérias é possível se 

estimar o número mais provável desta no material analisado. 

Dentre os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total 

de bactérias, coliformes, Staphylococcus coagulase-positivos, Bacillus cereus, etc. 


® Contagem em Placa 

A contagem em placa consiste em nada mais que inocular o microorganismo que se 

deseja quantificar em um meio sólido não seletivo para que, após incubação adequada, possam 

ser contadas as colônias, que na verdade chamamos de UFC (unidade formadora de colônia). 

A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de microorganismos capazes 

de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob condições de 

incubação adequadas. Cada colônia desenvolvida é suposta ter sido originada a partir de uma 

unidade viável, a qual pode ser um organismo ou muitos. 

Como para uma maior precisão da análise somente deverão ser contadas as placas com 

número de colônias entre 30 e 300 e devemos fazer a contagem em placa sempre em duplicata 

ou triplicata. 

A contagem de bactérias mesófilas é muito utilizada para indicar a qualidade sanitária dos 

alimentos. Um número elevado de microorganismos indica que o alimento é insalubre, mesmo que 

haja ausência de patógenos e de alterações físicas (na textura, aroma, sabor) no alimento. É 

importante ressaltar que todas as bactérias patogênicas são mesófilas (lembrando que os 

patógenos são capazes de causar doenças no nosso organismo, ou seja, se multiplicar e manter o 

metabolismo funcionando a temperatura de 37°C – temperatura de mesófilos). 

Para água potável, a legislação brasileira determina o limite máximo de bactérias 

heterotróficas de 500UFC/ml. 

69




® Técnica do Número Mais Provável 

A técnica do NMP é um método de quantificação indireta de microorganismos. Na 

realidade, não podemos contar UFCs, já que a análise é realizada em meio líquido, o que se faz é 

comparar o resultado encontrado com tabelas pré-escolhidas, obtendo um resultado aproximado 

da quantidade de microorganismos na amostra analisada. Estas tabelas possuem são elaboradas 

a partir de dados estatísticos, com os respectivos intervalos de confiança (95%) para diversas 

combinações de número de tubos positivos em cada série de diluição. Significa dizer que existe 

uma probabilidade de 95% de que o número “verdadeiro” de bactérias presentes na amostra se 

encontre dentro dos intervalos mínimos e máximos em torno do NMP. Muito embora o método dos 

tubos múltiplos apresente sensibilidade elevada, permitindo a detecção de baixas densidades de 

bactérias, o NMP não é um valor preciso, e a precisão do teste depende do número de tubos 

utilizados e dos volumes de amostra inoculados. 

Este método é muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado para 

microorganismos em geral, pois o meio utilizado é adaptado ao microorganismo que se deseja 

quantificar, com agentes seletivos e indicadores. 

® Colimetria em amostra de água 

A água é elemento fundamental para a sobrevivência humana. Sua grande utilização no 

abastecimento público, na recreação, na indústria, no uso doméstico atesta essa importância vital. 

A água merece atenção especial, pois pode veicular diversos parasitos, como vírus, 

bactérias, fungos e protozoários, além, de contaminantes químicos. 

As principais espécies bacterianas não patogênicas veiculadas pela água são 

Flavobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella e Chromobacterium. 

Nas águas de países tropicais há uma maior variedade de microrganismos e o predomínio de 

mesófilos e termotolerantes. 

As espécies bacterianas patogênicas de maior importância veiculadas pela água são: 

Vibrio cholerae, Salmonella spp., Lepstospira sp., Shigella spp., Escherichia coli, Staphylococcus 

aureus, Yersinia enterocolítica, Vibrio parahaemolyticus e Aeromonas hydrophila. 

Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patógenos nas amostras 

de águas, uma alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de 

bioindicadroes, ou seja, organismos não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes 

de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrência de contaminação 

fecal, evidenciando o risco da presença de patógenos. Fezes humanas contêm de 20-30% de 

resíduos alimentares não digeridos, sendo o restante constituído de água e bactérias. No 

indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestino, onde a 

Escherichia coli é a representante característica. O número desses microrganismos pode atingir 

10 9 células/g de fezes. Assim, a presença de Escherichia coli em alimentos e água é indicativa de 

contaminação fecal e possibilidade de presença de patógenos entéricos. 

Microrganismos indicadores de poluição de água são utilizados para monitorar, classificar 

e restringir o uso das águas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critérios: 

- Ser aplicável a todos os tipos de água; 

- Estar presente simultaneamente com os microrganismos patogênicos, com um tempo de 

sobrevivência igual àquele patógeno entérico mais resistente; 

- Não reproduzir-se em águas contaminadas, para não resultar em valores aumentados. 

Não se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismos que atenda a todos esses 

requisitos, mas há vários que se aproximam das exigências referidas e que são muito úteis. 

70




As bactérias empregadas como indicadoras de poluição fecal em águas são: os coliformes 

totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. 

O indicador microbiológico mais empregado é o grupo dos coliformes. 

Este e outros indicadores de poluição orientam a margem de segurança sanitária de água 

potável, da água utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos 

comestíveis. 

A Organização Mundial de saúde (OMS) recomenda para águas de recreação um máximo 

de 100 coliformes fecais por 100 ml de água. 

· Coleta de Amostras 

A coleta de amostras para exame microbiológico deve ser feita em garrafas esterilizadas 

que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água destilada. 

è Água clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sódio 10% para cada 250 mL de 

água para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades 

desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação. 

è Água com alto teor de zinco e cobre: coletar na presença de um agente quelante, de 

forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada 

120 mL de água). 

Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa (a amostra 

deve ocupar 4/5 da garrafa) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas 

devem ser mantidas vedadas até o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os 

cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar-se contaminações secundárias. 

· Ponto de Coleta 

Água da torneira Abrir a torneira e deixar a água correr por 5 minutos, para eliminar as 

impurezas e a água acumulada na tubulação. 

Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em 

seguida flambar. 

Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. 

Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até 

cerca de ¾ do seu volume. 

Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório. 

Poços e Cisternas Preparação do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com 

um barbante para facilitar a descida no poço. 

Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados. 

Submergir o frasco completamente na água. 

Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para 

criar um espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente. 

Rios, Lagoas e 

Mares 

Coleta da amostra de água de rios e lagoas - nestes casos, deve-se 

mergulhar o frasco até uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada 

em direção contrária a corrente, a fim de evitar a contaminação da água com 

as mãos. 

Coleta da água do mar - a coleta deve ser feita na região onde as pessoas 

costumam banhar-se, que corresponde à profundidade aproximada de 1,0m, 

que é a região das praias mais utilizada para a recreação de contato 

primário, na maré baixa e 24 horas sem chuvas. 

71




· Acondicionamento e Transporte da Amostra para o Laboratório 

O ideal é a análise iniciar-se até 1 hora após a coleta. Caso isto seja impossível, a amostra deve 

ser transportada sob refrigeração. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10º C no prazo máximo 

de até 30 horas após a coleta. 

Amostras presumivelmente poluídas têm de ser inoculadas no máximo após 6 horas da coleta. 

Entre o recebimento da amostra e o início da inoculação, a mesma deve ser mantida em geladeira 

(cerca de 5ºC). 

· Exames Bacteriológicos da Água 

O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de bactérias 

heterotróficas viáveis na água e determinação e colimetria (estimativa do número de coliformes). 

A metodologia padrão empregada no exame bacteriológico da água, para medida do grupo 

coliforme, inclui a técnica dos tubos múltiplos (NMP). 

® Determinação de coliformes pela técnica dos tubos múltiplos - Número 

Mais Provável (NMP) 

A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos onde foram 

inoculados volumes diferentes de amostra. 

O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em fórmulas 

de probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande escala, indicam 

que este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o número real. As 

disparidades tendem a diminuir quando adota-se séries com maior número de tubos em cada 

diluição. Portanto, a sensibilidade do teste depende do número de tubos adotados. 

Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das 

características microbiológicas da amostra. 

Na aula prática, utilizamos o sistema de 3 séries de 3 tubos, com diluições decimais 

sucessivas. 

A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existência de 

coliformes na amostra analisada, através da fermentação de lactose com produção de gás; e o 

teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra são totais ou fecais. 

· Teste Presuntivo 

Inocular a amostra em 3 séries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose ou Caldo 

Lactose, de modo que cada série seja inoculada com um volume de amostra 10 vezes menor que 

a série anterior. Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos. Após incubação a 35 - 37ºC 

por 24 - 24 horas, o crescimento com formação de gás significa teste presuntivo positivo para 

coliformes. Os tubos que não apresentarem formação de gás com 24 horas de incubação, devem 

ser incubados até 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente 

inoculados nos meios de confirmação para se evitar que um crescimento muito abundante 

provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos. 

· Testes de Confirmação 

Para coliformes totais: A partir dos tubos com formação de gás obtidos na aula anterior, 

transferir uma alçada para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile Lactose. Após incubação a 

35 – 37º C por 48 horas, a formação de qualquer quantidade de gás constitui teste positivo para 

coliformes totais. 

Para coliformes fecais: A partir dos tubos com formação de gás obtidos na aula anterior, 

transferir uma alçada para tubos contendo caldo EC. Após incubação a 44,5 - 45º C por 24 horas, 

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a presença de gás no interior dos tubos de Durhan é considerada reação positiva, indicando 

contaminação de origem fecal. A ausência de gás, mesmo com evidência de crescimento indica a 

presença de coliformes de outra fonte que não intestinos de animais de sangue quente. 

Para completar o teste, podemos estriar uma alçada de cada tubo positivo na estapa 

confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com Agar EMB ], incubando a 35-37°C por 24 

horas e analisar a morfologia através da coloração de Gram e observação ao microscópio (bacilos 

pequenos, Gram negativos, não esporulados) 

Muitas vezes, a colimetria é seguida de provas bioquímicas para a confirmação e 

caracterização do coliforme em questão, as mais utilizadas são as provas do teste IMVC, já 

discutido no assunto anterior (Assunto 8 - Bacilos Gram Negativos). Para E. coli, podemos 

observar os seguintes resultados: ++-- ou -+--. 

Para uma explicação do fundamento destas provas veja a prática de identificação de 

Bacilos Gram negativos. 

® Tabela do número mais provável (NMP) 

Tubos Positivos por: NMP para 100 mL 

10 mL 1 mL 0,1mL 3 tubos 

0 0 0 < 3 

0 0 1 3 

0 1 0 3 

0 2 0 6 

1 0 0 4 

1 0 1 7 

1 1 0 7 

1 1 1 11 

1 2 0 11 

2 0 0 9 

2 0 1 14 

2 1 0 15 

2 1 1 20 

2 2 0 21 

2 2 1 28 

2 3 0 30 

3 0 0 23 

3 0 1 39 

3 0 2 64 

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Objetivos 

3 1 0 43 

3 1 1 75 

3 1 2 120 

3 2 0 93 

3 2 1 150 

3 2 2 210 

3 3 0 240 

3 3 1 460 

3 3 2 1100 

3 3 3 >2400 


è compreender os fundamentos básicos dos métodos de quantificação de bactérias em água e 

alimentos, diferenciando a contagem direta em placas da enumeração indireta em caldo (NMP); 

è citar grupos de microorganismos quantificados normalmente em alimentos; 

è definir colimetria e citar suas fases e aplicações; 

è compreender a denominação NMP e UFC; 

èexpressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta. 

Material 

- Frasco com amostra de água para análise 

- Tubos de Caldo Lactose com tubos de Durhan (3 CL Duplo e 6 CL Simples) 

- 1 pipeta de 10 mL 

- 1 pipeta de 1 mL 

- 1 tubo de 9,9 mL de diluente estéril 

- Placa estéril 

- 1 tubo com Agar Padrão de Contagem (PCA) previamente fundido 

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® Primeiro dia 

· Contagem em placa 

- Antes de realizar a técnica, devemos realizar diluições decimais da amostra, para que a chance 

de obtenção de placas com números de UFC contável (30 - 300) seja maior. 

- A técnica utilizada será a do pour plate, ou seja: transferir, com auxílio de uma pipeta estéril, 1 ml 

da amostra para uma placa de Petri vazia estéril. Adicionar o Agar PCA (padrão para contagem) 

fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares, 

conforme mostra a figura a seguir: 

- Deve-se fazer em duplicata a inoculação das diluições 10 0 (amostra não diluída) e 10 -1 , ou 10 -1 e 

10 -2 . 

· Técnica do NMP 

- Homogeneizar por agitação a amostra de água e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando 

as pipetas estéreis, da seguinte forma: 

- Na primeira série, note que a concentração do caldo é dupla, devemos inocular 10 ml de 

amostra; 

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- Na segunda série, devemos inocular um volume 10x menos, ou seja, 1 ml; 

- Na terceira série, devemos inocular um volume 10x menor que o da série anterior, ou 

seja, 1 ml. 

- Incubar as placas e os tubos a 35 – 37°C por 24 – 48 horas 

® Segundo dia 

- Contar as colônias no Agar, calcular o número médio de colônias obtidas, multiplicar pelo fator 

de diluição e expressar o resultado em UFC/mL. 

OBSERVAÇÃO.: No nosso caso, o fator de diluição, ou fator de correção, será 1, pois o volume 

inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correção é importante para a expressão do 

resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml. 

Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inóculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou 

utilizamos inóculos provenientes de diluições (10 -1 , 10 -2 , etc.). Nesse caso, para a expressão do 

resultado devemos multiplicar o número de UFCs obtido por um número que irá corrigir a 

distorção do resultado. 

Uma dica: se o inóculo utilizado for diluído decimalmente, o FD será o inverso da diluição utilizada. 

Ex.1: se o inóculo utilizado for 0,1ml, qual será o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra 

maneira: 1 ÷ 0,1 = 10. 

Ex.2: se o inóculo for 1ml da diluição 10 -2 , qual será o FD? 100, pois 100 x 10 -2 = 1, ou de 

outra maneira 1 ÷ 10 -2 = 100. 

Ex. 3: se o inóculo utilizado for 0,5, qual será o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra 

maneira 1 ÷ 0,5 = 2. 

- Proceder à leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para 

expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo). 

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- Inocular os tubos positivos na colimetria para caldos EC e VBBL através da técnica de difusão 

(teste confirmativo), conforme o esquema a seguir: 

- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 – 37ºC por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5 – 

45ºC por 24 – 48 horas. 

® Terceiro dia 

- Proceder à leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos 

os tubos com formação de gás no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais 

serão positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais serão positivos em ambos os 

caldos. 

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Caldo Lactose 



Peptona 

Lactose 

3,0 

5,0 

5,0 

pH do meio: 6,9 ± 0,2 

A lactose presente no meio é o indicador da 

presença de coliformes, através da verificação 

da fermentação com produção de gás no tubo 

de Durhan invertido introduzido no meio. 

* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a 

incubação e a leitura da mesma forma. 

Agar Padrão para Contagem (PCA) 


Triptona 


Glicose 

Agar 

Caldo EC (E. coli) 

5,0 

2,5 

1,0 

9,0 

pH do meio: 7,0 ± 0,2 


Peptona de caseína 

Lactose 

Sais biliares 


Fosfato de potássio dibásico 

Fosfato de potássio monobásico 

Caldo VBBL (Verde Brilhante Bile Lactose) 

20,0 

5,0 

1,5 

5,0 

4,0 

1,5 

Este meio é um meio simples, sem agentes 

seletivos, inibidores ou indicadores. Ideal para 

contagem de microorganismos em geral. 

pH do meio: 6,9 ± 0,2 


Peptona 

Lactose 

Bile de boi (purificada) 

Verde brilhante 

10,0 

10,0 

20,0 

0,0133 

Os sais biliares são responsáveis pela inibição 

do crescimento da microbiota acompanhante. 

Além disso, a temperatura de incubação 

(45,5°C) e a presença de lactose são 

indicadores para coliformes fecais, pois estes 

são capazes de fermentar a lactose com 

produção de gás a esta temperatura. 

O meio é tamponado para evitar que alterações 

no pH prejudiquem o resultado. 

pH do meio: 7,4 ± 0,2 

O meio contém 2 agentes seletivos: bile de boi 

e verde brilhante, que inibem o crescimento de 

Gram +. Além disso, a lactose tem o papel de 

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indicador, pois os coliformes são capazes 

produzir gás na fermentação da lactose. 

1. Qual a finalidade da colimetria? 

2. Qual a diferença entre os métodos diretos e indiretos de quantificação de bactérias? 

3. Qual a fundamentação da etapa confirmativa da colimetria? 

4. Como se realiza o cálculo das UFCs na contagem em placa? 

5. Por que devemos realizar diluições para executar as técnicas de contagem em placa e do 

NMP? 

Observações 

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Apostila de Aulas Práticas - UFF

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