UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE ... - UFF

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROCIÊNCIAS
DANIELLE DIAS PINTO FERREIRA
O BLOQUEIO DE RECEPTORES DE ADENOSINA A1
POTENCIALIZA A LIBERAÇÃO DE GABA INDUZIDA POR D-
ASPARTATO
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM NEUROCIÊNCIAS
ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª REGINA CÉLIA CUSSA KUBRUSLY
NITERÓI
2012

DANIELLE DIAS PINTO FERREIRA
O BLOQUEIO DE RECEPTORES DE ADENOSINA A1 POTENCIALIZA
A LIBERAÇÃO DE GABA INDUZIDA POR D-ASPARTATO
Trabalho desenvolvido no laboratório de Neurofarmacologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense.
Dissertação de mestrado submetida à
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Neurociências.
ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª REGINA CÉLIA CUSSA KUBRUSLY
Niterói
2012
II

DANIELLE DIAS PINTO FERREIRA
O BLOQUEIO DE RECEPTORES DE ADENOSINA A1 POTENCIALIZA
A LIBERAÇÃO DE GABA INDUZIDA POR D-ASPARTATO
Dissertação de mestrado submetida à Universidade
Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Neurociências
BANCA EXAMINADORA:
____________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Elizabeth Giestal de Araújo
UFF
____________________________________________________________
Prof. Dr. Ronald Marques dos Santos
UFF
___________________________________________________________
Dr. Bernardo Stutz Xavier
UFRJ
____________________________________________________________
Profª Drª Aline Araujo dos Santos Rabelo (Suplente e Revisora)
UFF
III

Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de Neurofarmacologia, do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, do Instituto Biomédico, ligado ao
Programa de Pós-Graduação em Neurociências, do Instituto de Biologia da
Universidade Federal Fluminense, sob a orientação da Professora Dra. Regina Célia
Cussa Kubrusly e na vigência dos auxílios concedidos pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), pela Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Programa de Apoio aos
Núcleos de Excelência (PRONEX/MCT) e pela Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-
Graduação e Inovação da Universidade Federal Fluminense (PROPPi/UFF).
IV

Ferreira, Danielle Dias Pinto
O bloqueio de receptores de adenosina A1 potencializa a liberação de GABA
induzida por D-aspartato. / Danielle Dias Pinto Ferreira. ________ Niterói: [s.n.],
2012.
XVIII; 94f.
Orientador: Dra Regina Célia Cussa Kubrusly.
Dissertação. Mestrado em Neurociências. Instituto de Biologia. Universidade
Federal Fluminense, Niterói, 2012.
1. GABA, 2. Receptor NMDA, 3. cafeína, 4. retina, 5.pinto
V

“O homem deve criar as oportunidades e não somente encontrá-las”
Francis Bacon
VI

Dedico este trabalho a todos aqueles que, de
alguma forma, contribuíram para a sua
realização e a todos aqueles que um dia
serão beneficiados com as informações aqui
contidas.
VII

AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus pela minha vida, por tudo que
sou e tenho, pois ele está sempre presente em toda e qualquer circunstância.
Agradeço aos meus pais, que não me deram apenas sustento e instrução,
mas principalmente o exemplo de trabalho, honestidade e dignidade, de tal forma
que eu me orgulho muito deles. Obrigada por todo o incentivo na minha vida
profissional e todo apoio de sempre. Amo vocês.
Agradeço ao meu namorado, que sempre me incentiva a correr atrás dos
meus sonhos, que faz de tudo para me ver feliz. Obrigada por sempre estar do meu
lado, em todos os momentos. Te amo.
À professora Regina, por ter acreditado em mim, pelos ensinamentos e pelas
oportunidades oferecidas. Obrigada por me fazer ver que qualquer coisa, por mais
simples ou mais difícil que seja, é um passo a frente para meu progresso.
Obrigada aos meus tão queridos amigos, que foram muito importantes
principalmente nessa fase final. Obrigada por toda ajuda mesmo! Sem vocês meus
dias não teriam nenhuma graça. Lívia e Isis, vocês são incomparáveis!
Ao pessoal do laboratório: Adriana, Maurício, Matheus, Isis, Mari, Gabi e por
que não João? Compartilhamos momentos que só nós sabemos o quanto são/foram
importantes. Alegrias e tristezas... e muitos momentos de tensão e bronca! (rs).
Crescemos juntos graças uns aos outros.
Meus agradecimentos ao pessoal do fundão, que me ajudou muito e me
acolheu. Carol, Bernardo e Luís, obrigada!
Agradeço aos professores do laboratório (Rachel, Ronald e Ney) e da pós-
graduação, que muito contribuíram para minha formação. Devo grande parte do meu
conhecimento a eles. À professora Aline que, com toda sua gentileza, aceitou revisar
a tese, e aos constituintes da banca.
VIII

SUMÁRIO
Página
Resumo XI
Abstract XII
Lista de Figuras XIII
Lista de Tabelas XV
Lista de Abreviaturas XVI
I Introdução 1
1. A retina 1
1.1 Organização da Retina 2
1.2 Neurotransmissores na Retina 6
2. GABA 6
2.1 Ações e Localização 7
2.2 Síntese e Metabolismo 8
2.3 Via Alternativa de Síntese 9
2.4 Comunicação GABAérgica 10
2.5 Receptores GABAérgicos 11
2.6 Excitatório no Desenvolvimento 12
2.7 Transportadores 13
2.7.1 Distribuição e Localização 14
2.7.2 Transporte 15
2.7.3 Moduladores do Transporte 17
3. Glutamato 20
3.1 Receptores Glutamatérgicos 20
4. Adenosina 25
4.1 Receptores de adenosina 26
4.2 Cafeína como agente modulador dos receptores de adenosina 30
II Objetivos 33
1. Objetivo Geral 33
2. Objetivos Específicos 33
III Materiais e Métodos 34
IX

1. Materiais 34
1.1 Animais e Coleta de Tecido 34
1.2 Drogas 34
1.3 Soluções Gerais 35
2. Métodos 36
2.1 Captação de 3 H-GABA 36
2.2 Liberação de Neurotransmissores 37
2.3 Ensaio de AMPc 39
2.4 Dosagem de Proteína 40
2.5 Análise Estatística 41
IV Resultados 42
V Discussão 55
VI Conclusão 62
V Referências 63
X

RESUMO
O presente trabalho investigou os efeitos modulatórios da exposição aguda de
cafeína na regulação da liberação de GABA por receptores NMDA em retinas de
embriões de galinha de 13 dias (E13). Retinas de E13 perfundidas com 500µM de D-
aspartato e 500µM de cafeína mostraram uma potencialização na liberação de 3 H-
GABA em relação à liberação controle induzida somente com 500µM de D-
aspartato. O tratamento com MK-801 (10µM), antagonista não competitivo do
receptor NMDA, ou com NNC 711 (10µM), inibidor do GAT-1, bloqueou
completamente a liberação de GABA induzida por D-aspartato. O efeito da cafeína
foi mimetizado por DPCPX (100nM), antagonista A1R, e por forscolina (10µM),
ativador de adenilil ciclase; e bloqueado por H-89 (1µM), inibidor da PKA, Ifenprodil
(10µM), inibidor da subunidade NR2B, genisteína (10µM), inibidor de proteína
tirosina quinase, e PP1 (3µM), inibidor da famíla src quinase. Os níveis de AMPc
foram reduzidos na presença do agonista A1R, CHA (100nM), indicando seu
acoplamento à via da PKA. Estes dados sugerem que a cafeína potencializa a
liberação de GABA induzida por D-aspartato via inibição de receptores A1, ativação
da via da PKA e da src, regulando a fosforilação da subunidade NR2B.
Palavras chave: GABA, receptor NMDA, cafeína, retina, pinto
XI

ABSTRACT
The present work investigated the modulatory effects of caffeine’s acute
exposition on the regulation of GABA release through NMDA receptors on 13-days-
old chick embryo retinas (E13). Retinas were superfused with D-aspartate 500µM
and caffeine 500µM, revealing a potentiation in 3 H-GABA release compared to the
release with D-aspartate only (control). Treatment with either MK-801 (10µM), a non-
competitive NMDA receptor antagonist, or NNC 711 (10µM), GAT-1 inhibitor,
completely blocked D-aspartate mediated GABA release. The effect of caffeine was
mimicked by DPCPX (100nM), A1R agonist, and by forskolin (10µM), adenylyl
cyclase inhibitor; and was blocked by H-89 (1µM), PKA inhibitor, Ifenprodil (10µM),
NR2B subunit inhibitor, genistein (10µM), protein tyrosine kinase inhibitor, and PP1
(3µM), src family inhibitor. cAMP levels were decreased in the presence of A1R
agonist, CHA (100nM), thus indicating its coupling to the PKA signaling pathway.
These results suggest that caffeine potentiates D-aspartate mediated GABA release
via inhibition of adenosine A1 receptor, activation of PKA and src, thus regulating
NR2B subunit phosphorylation.
Key words: GABA, NMDA receptor, caffeine, retina, chick
XII

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Localização da retina no fundo do globo ocular e nervo
óptico
Figura 2 Estrutura da retina em camadas, evidenciando seus tipos
celulares
Página
Figura 3 Síntese e metabolismo de GABA 9
Figura 4 Sinapse GABAérgica 11
Figura 5 Receptores GABAérgicos 12
Figura 6 Resposta do receptor GABAA em neurônios maduros e
imaturos
Figura 7 Modelo do transportador de GABA 16
Figura 8 Receptor NMDA e sítios para ligantes endógenos 23
Figura 9 Receptores de glutamato e subunidades 25
Figura 10 Receptores de adenosina 26
Figura 11 Metodologia da Captação de 3 H-GABA 37
Figura 12 Metodologia da liberação de neurotransmissores 38
Figura 13 Metodologia do Ensaio de AMPc 40
Figura 14 A liberação de GABA estimulada com D-asp em retina de
E13 é mediada por GAT-1
Figura 15 Cafeína potencializa a liberação de GABA induzida por
receptores NMDA
1
5
12
43
44
XIII

Figura 16 Cafeína não modifica a atividade do GAT-1 45
Figura 17 Cafeína não aumenta a liberação de D-asp 46
Figura 18 O bloqueio de receptores A1 facilita a liberação de GABA
mediada por D-asp
Figura 19 O bloqueio de receptores A2A não modifica a liberação de
GABA induzida por D-asp
Figura 20 A ativação da adenilil ciclase potencializa a liberação de
GABA
Figura 21 Receptores de adenosina A1 estão funcionais em E13 50
Figura 22 O bloqueio da via da PKA previne o efeito da cafeína 51
Figura 23 O bloqueio da fosforilação em resíduos de tirosina previne o
efeito da cafeína
Figura 24 A inibição da fosforilação por proteínas da família src
previne o efeito da cafeína
Figura 25 A inibição da subunidade NR2B previne o efeito da cafeína
na liberação de GABA
47
48
49
52
53
54
XIV

LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Nomenclatura dos transportadores de GABA em
diferentes espécies
Página
Tabela 2: Solução Hanks 4, pH 7,4 35
Tabela 3: Solução Hanks 4 sem Mg 2+ , pH 7,4 36
Tabela 4: Drogas utilizadas na liberação de neurotransmissores
e suas funções e concentrações
Tabela 5: Drogas utilizadas no ensaio de AMPc e suas funções e
concentrações
14
39
40
XV

LISTA DE ABREVIATURAS
3 H-D-aspartato D-aspartato tritiado
5-HTR receptor de serotonina
A1, A2(A-B), A3 subtipos de receptores de adenosina
AAE aminoácido excitatório
AC adenilil ciclase
AMPA ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico
AMPc adenosina 5’ monofosfato cíclica
ATP adenosina trifosfato
BDNF fator neurotrófico derivado do cérebro
BGT-1 transportador de GABA/betaína
CAF Cafeína
CCG camada de células ganglionares
CNE camada nuclear externa
CNI camada nuclear interna
CPE camada plexiforme externa
CPI camanda plexiforme interna
CREB elemento de ligação a proteínas em resposta a AMPc
D2 receptor de dopamina tipo 2
DAG diacilglicerol
D-asp D-aspartato
XVI

E# dia embrionário #
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
ERK quinase regulada por sinal extracelular
GABA ácido γ-aminobutírico
GABAA, B, C subtipos de receptores de GABA
GABA-T GABA transaminase
GAD Descarboxilase do ácido glutâmico
GAT1-4 subtipos de transportadores de GABA
GluR(1-8) subtipos de receptores de glutamato do tipo não-NMDA
HEPES (N-[2-hidroxietil]piperazina-N’-[2-ácido etanosulfônico])
IP3 inositol trifosfato
KA kainato
KCC2 cotransportador de K + -Cl -
MAP proteína ativada por mitógeno
MEK MAP quinase quinase
MEM meio essencial mínimo
mGluR receptor metabotrópico de glutamato
NBI nitrobenziltioinosina
NKCC1 cotransportador de Na + -K + -Cl -
NMDA N-metil-D-aspartato
NR1, NR2(A-D), NR3(A-B) subunidades de receptores NMDA
PDE fosfodiesterase
XVII

pH potencial hidrogeniônico
PI3K fosfatidilinositol 3-quinase
PIP2 fosfatidil inositol 4,5-bifosfato
PKA proteína quinase dependente de AMPc
PKC proteína quinase dependente de Ca 2+
PLC fosfolipase C
RNAm RNA mensageiro
SHR ratos espontaneamente hipertensos
SNC sistema nervoso central
SSADH desidrogenase do semialdeído succínico
TCA ácido tricloroacético
TDAH Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade
TrkB-t forma truncada do receptor TrkB de neurotrofinas
VGAT transportador vesicular de GABA
XVIII

I INTRODUÇÃO
1 A RETINA
A visão é um sentido que permite tanto a percepção quanto a interação dos
indivíduos com o ambiente. A informação visual é recebida pela retina, onde começa
a ser processada. A retina é um tecido localizado no fundo do globo ocular, e é
responsável pela transformação de um estímulo luminoso em um sinal
eletroquímico. Esses sinais são encaminhados, então, para estruturas encefálicas
através do nervo óptico (figura 1).
Figura 1: Localização da retina no fundo do globo ocular e nervo óptico. Modificado de KOLB, 2003.
A retina se origina a partir do ectoderma neural que possui diversas células
indiferenciadas chamadas neuroblastos. Elas têm potencial proliferativo e darão
origem a todos os tipos celulares retinianos (ALTSHULER et al., 1991). A
histogênese da retina de vertebrados ocorre pela diferenciação celular da camada
mais interna para a mais externa, seguindo um gradiente espacial. Além desse
gradiente interno-externo, há também um gradiente centro-periferia (MANN, 1964;
PROVIS & VAN DRIEL, 1985).
1

1.1 ORGANIZAÇÃO DA RETINA
A retina de vertebrados contém 7 tipos celulares principais, sendo 6 neuronais
e 1 glial e seu desenvolvimento é um processo conservado de gênese celular, com a
seguinte ordem de geração: células ganglionares, células horizontais,
fotorreceptores do tipo cone, células amácrinas, células bipolares, fotorreceptores
do tipo bastonete, e glia de Müller (DOH et AL., 2010). Similarmente a outras
estruturas do sistema nervoso central (SNC), a retina apresenta uma estrutura em
camadas (camada do epitélio pigmentado e camada sensorial).
O epitélio pigmentado, também chamado de epitélio retiniano, forma uma
camada única de células neuroepiteliais e está localizado posteriormente à retina, no
fundo do olho. Sua principal função é absorver a luz que não foi capturada pelos
fotorreceptores, evitando assim a degradação e distorção da imagem pela retina
neural por não permitir a reflexão da luz não absorvida (DOWLING, 1991). Já a
camada sensorial, também chamada de retina neural, é bem mais espessa e
abrange diversos neurônios e células gliais. Esta camada compreende basicamente
camadas nucleares, as quais contêm os corpos das células da retina, intercaladas
por camadas plexiformes, que contêm os prolongamentos celulares, e, portanto, é
onde ocorrem as sinapes.
A informação visual é transmitida na retina de forma vertical, na qual as
células fotorreceptoras transmitem a informação para as células bipolares, e estas
para as células ganglionares; e de forma horizontal, na qual as sinapses são
moduladas pelas células horizontais, na camada plexiforme externa, e pelas células
amácrinas, na camada plexiforme interna (KOLB, 2003).
2

A camada nuclear externa (CNE) é formada pelos corpos celulares dos
fotorreceptores, que são as células que transduzem energia luminosa em sinal
neural. Estas células são classificadas em dois subtipos, que são diferenciados
principalmente pela morfologia de seus segmentos externos: cones e bastonetes. Os
cones, que possuem um segmento externo curto na forma de cone, são sensíveis a
exposição à alta intensidade luminosa (visão fotópica). São também encarregados
pela visão de cores, pois as diferentes populações de cones possuem diferentes
fotopigmentos sensíveis a diferentes comprimentos de onda do espectro luminoso.
Já os bastonetes são responsáveis pela visão em baixa intensidade luminosa (visão
escotópica) e possuem apenas um tipo de pigmento visual, não apresentando
assim, resolução espectral. (DOWLING, 1987).
A camada plexiforme externa (CPE) é a camada onde são encontrados os
terminais sinápticos dos fotorreceptores e prolongamentos de células bipolares e de
células horizontais.
Na camada nuclear interna (CNI) encontram-se os corpos celulares de células
horizontais, bipolares, amácrinas e células ganglionares deslocadas. Os corpos das
células horizontais estão localizados na região mais externa da CNI, enquanto que
os corpos das células amácrinas e ganglionares deslocadas estão na região mais
interna desta camada; já os corpos das células bipolares localizam-se numa região
mais central da CNI. As células bipolares são classificadas em dois subtipos
principais, um que faz contato exclusivo com cones, e outro apenas com bastonetes
(RAMÓN Y CAJAL, 1893; KOLB, 1977). As células amácrinas, que não possuem
axônios, têm seus dendritos estratificados na camada plexiforme interna e tem uma
morfologia muito variada. Elas são encarregadas da modulação horizontal da
informação visual na CNI e fazem contato com dendritos de células bipolares,
3

ganglionares e com outras células amácrinas. Também há na CNI corpos celulares
de um tipo de célula glial chamado glia de Müller, cujos prolongamentos se
estendem por toda a retina.
A camada plexiforme interna (CPI) é composta pelos prolongamentos de
células bipolares, amácrinas e dendritos das células ganglionares. Os
prolongamentos das células bipolares tipo cone encontram-se na região mais
externa desta camada, enquanto que os das células bipolares tipo bastonetes, na
região mais interna.
Na camada de células ganglionares (CCG) estão localizados os corpos
celulares de células ganglionares e também corpos celulares de células amácrinas
deslocadas (RAMÓN Y CAJAL, 1893), que estão em mais de 50% nesta camada,
com seus dendritos estratificando na camada plexiforme interna. As células
ganglionares levam a informação visual através de seus axônios, que formam as
fibras do nervo óptico, seguindo para regiões superiores do SNC.
A glia de Müller atravessa todas as camadas da retina e expressa receptores
para neurotransmissores e fatores tróficos, além de produzir citocinas. Portanto, ela
desempenha um papel importante na sobrevida e na diferenciação neuronal (IKEDA
& PURO, 1995). Além disso, células gliais e neuronais fazem importantes interações
entre si, como por exemplo, apresentando vias de sinalização cooperativas, o que
possibilita a manutenção do sistema em equilíbrio (NEWMAN & REICHENBACH,
1996) (figura 2).
4

Figura 2: Estrutura da retina em camadas, evidenciando seus tipos celulares. Modificado de KOLB,
2003.
A localização anatômica da retina é favorável para a sua manipulação, sendo
de fácil obtenção e isolada de tecido conjuntivo adjacente e de outras populações
neuronais e gliais. Além disso, sua estrutura relativamente simples e bem definida,
organizada em camadas, possibilita a distinção das seqüências nucleares e
sinápticas, o que se assemelha ao observado em outras estruturas do sistema
nervoso. Portanto, a retina, que possui diversos sistemas neuroquímicos
semelhantes ao resto do sistema nervoso, constitui um bom modelo para o estudo
do desenvolvimento e funcionalidade desse sistema (CEPKO, 1993; DOWLING,
1991).
5

1.2 NEUROTRANSMISSORES NA RETINA
Estudos de imunomarcação mostram que o glutamato e o aspartato
apresentam um padrão amplo e difuso de expressão no tecido retiniano, marcando
diversas classes de neurônios (KALLONIATIS & TOMISICH, 1999). Praticamente
todas as células horizontais apresentam esses dois neurotransmissores, e a maioria
das células fotorreceptoras, células bipolares e amácrinas são duplamente
marcadas para eles, mostrando que há uma maior localização de aspartato e
glutamato nas camadas internas da retina, onde podem ter grande importância
fisiológica (SUN & CROSSLAND, 2000). O glutamato é o principal neurotransmissor
envolvido na codificação da informação sensorial. Já o ácido γ-aminobutírico (GABA)
e a glicina agem como elementos laterais na transmissão sináptica (KALLONIATIS &
TOMISICH, 1999). A expressão dos receptores desses neurotransmissores nas
células bipolares e ganglionares indica a sua distribuição (GRÜNERT, 2000). A
histamina também pode ser encontrada na retina (NOWAK, 1985; NOWAK, 1990),
assim como a dopamina (IUVONE & NEFF, 1981) e a acetilcolina (HUTCHINS,
1987), entre outros. A adenosina, que não é um neurotransmissor clássico, também
está presente e será discutida mais adiante (PAES-DE-CARVALHO, 2002).
2. GABA
A história do GABA começa por volta de 1910, quando verificaram sua
presença em tecidos biológicos (BOWERY & SMART, 2006, para revisão). Em 1950,
ROBERTS e AWAPARA identificaram o GABA no SNC de mamíferos, e a eles é
creditada atualmente a descoberta deste neurotransmissor. Em 1959, FLOREY &
MCLENNAN observaram que o GABA tinha um papel inibitório na atividade neural
6

de mamíferos e sugeriram que seria um neurotransmissor natural. Toda substância
deve atingir certos critérios para ser classificado como neurotransmissor. No entanto,
apesar desses critérios serem facilmente atingidos em crustáceos, os indícios de
GABA como transmissor no SNC de mamíferos eram negativos. Somente em 1967
ele foi definitivamente aceito como neurotransmissor inibitório, após estudos de
KRNJEVIC & SCHWARTZ em neurônios corticais cerebrais.
2.1 AÇÕES E LOCALIZAÇÃO
O GABA é o principal neurotransmissor inibitório do SNC de várias espécies
de vertebrados (MOSINGER et al, 1986; YAZULLA, 1986) e desempenha um papel
importante na regulação da excitabilidade neuronal durante o desenvolvimento. A
inibição GABAérgica é vista em todos os níveis do SNC, incluindo no hipotálamo,
hipocampo, córtex cerebral e córtex cerebelar. No neocórtex, a maioria dos
neurônios GABAérgicos são interneurônios locais, com poucos ou nenhum espinho
dendrítico (OWENS & KRIEGSTEIN, 2002). GABA também está presente na retina
em subpopulações de células horizontais, amácrinas, ganglionares e na glia de
Müller (AGARDH et al., 1986; SUN & CROSSLAND, 2000; DE SAMPAIO SCHITINE
et al., 2007). Além da função inibitória, GABA também pode agir como fator trófico
durante o desenvolvimento do sistema nervoso, influenciando eventos como
proliferação, migração, diferenciação, maturação sináptica e morte celular (OWENS
& KRIEGSTEIN, 2002). GABA também pode ter funções fora do SNC, visto que há
expressão de enzimas relacionadas à sua síntese e de subunidades de receptores
GABAérgicos em tecidos não neuronais (TANAKA & BOWERY, 1996).
7

2.2 SÍNTESE E METABOLISMO
A síntese de GABA está relacionada a um processo chamado GABA shunt,
que consiste de um ciclo fechado com o duplo propósito de produzir e conservar o
suprimento de GABA. In vivo, a glicose é o principal precursor da síntese de GABA,
porém o piruvato e outros aminoácidos também podem servir como precursores.
Proveniente do metabolismo do ciclo de Krebs, o α-cetoglutarato é transaminado
pela GABA-T (GABA transaminase) em L-ácido glutâmico ou L-glutamato. GABA é
então formado a partir da descarboxilação do glutamato pela enzima GAD
(Descarboxilase do ácido glutâmico) (figura 3) (ROBERTS & FRANKEL, 1951;
SIEGEL, 2006).
A GAD está expressa somente em células que utilizam GABA como
neurotransmissor. Há duas formas de GAD: GAD65 e GAD67, que apresentam
cinéticas próprias e distribuição celular distinta (MARTIN & RIMVALL, 1993). A
GAD65 está presente em terminais nervosos, onde o GABA é sintetizado para
vesículas sinápticas secretórias, portanto, está mais relacionada à neurotransmissão
dependente de influxo de cálcio. Já a GAD67 é predominantemente citosólica,
constitutivamente ativa e responsável pela produção GABA para estoques
citoplasmáticos (SOGHOMONIAN & MARTIN, 1998). Neste pool citosólico, o GABA
pode ser liberado através da reversão do sistema de transporte pela membrana
plasmática. Diante disso, pode-se dizer que a atividade da GAD está relacionada
com a homeostase do GABA em terminais GABAérgicos.
A metabolização do GABA ocorre pela sua transaminação, catalisada pela
enzima GABA-T e formação de semialdeído succínico. Essa reação ocorre quando o
α-cetoglutarato está disponível para receber o grupo amina que será removido do
8

GABA, reformando assim o glutamato. Uma molécula de GABA pode ser
metabolizada somente se uma molécula de precursor for formada, garantindo que o
suprimento disponível de GABA seja conservado. Além disso, o semialdeído
succínico pode ser oxidado pela desidrogenase do semialdeído succínico (SSADH)
em ácido succínico ou succinato e pode reentrar no ciclo de Krebs, completando o
circuito (SIEGEL, 2006) (figura 3).
Figura 3: Síntese e metabolismo de GABA. SIEGEL, 2006.
2.3 VIA ALTERNATIVA DE SÍNTESE
Além da via clássica de síntese, descrita anteriormente, há também uma via
alternativa de síntese de GABA que ocorre durante o desenvolvimento do sistema
nervoso, enquanto a GAD ainda não está expressa. GABA é formado a partir da
putrescina, um composto abundante no tecido indiferenciado, proveniente da
descaboxilação da ornitina (CALAZA et al., 2006). Em 1976, DE MELLO e
colaboradores descreveram que células retinianas de aves embrionárias
converteram putrescina radiomarcada em 3 H-GABA. Além de aves, esta via foi
9

descrita no sistema nervoso de peixes, camundongos e ratos (SEILER et al., 1973;
SOBUE & NAKAJIMA, 1978; YAMASAKI et al., 1999)
2.4 COMUNICAÇÃO GABAÉRGICA
Uma vez sintetizado, GABA pode ser armazenado em vesículas sinápticas
através do transportador vesicular de GABA (VGAT). Durante um potencial de ação,
onde ocorre a despolarização do neurônio pré-sináptico e um influxo de cálcio, ele
pode ser liberado para a fenda sináptica pela via clássica, ou então o GABA
citosólico pode ser liberado através da reversão do sistema de transporte pela
membrana. Uma vez na fenda, o GABA se difunde até alcançar os receptores alvos
que podem estar localizados nas superfícies pré e pós-sináptica (figura 4). O término
da ação do GABA ocorre através de um mecanismo de recaptação para terminais
pré-sinápticos ou células gliais circunjacentes. O GABA recaptado por terminais
nervosos pode ser reutilizado, porém o GABA recaptado pela glia é metabolizado
em semialdeído succínico pela enzima GABA-T e não pode ser ressintetizado a
glutamato neste compartimento, pois a glia não expressa GAD. Contudo, o GABA
pode ser recuperado desta via por um circuito envolvendo o ciclo de Krebs. Na glia,
GABA é convertido a glutamina, que por sua vez é transferida de volta pro neurônio,
onde é convertida a glutamato pela glutaminase (BRADFORD et al., 1983;
SONNEWALD et al., 1993). O glutamato entra, então, no processo de GABA shunt
(SIEGEL, 2006).
10

Figura 4: Sinapse GABAérgica. OWENS & KRIEGSTEIN, 2002.
2.5 RECEPTORES GABAÉRGICOS
Os receptores de GABA existem no SNC e em órgãos periféricos e diferem na
composição das subunidades e no arranjo. Pré-sinapticamente, os receptores de
GABA são metabotrópicos (GABAB) e medeiam um mecanismo de feedback
negativo na liberação de GABA. Pós-sinapticamente, os receptores GABAérgicos
podem ser metabotrópicos (GABAB) ou ionotrópicos (GABAA e GABAC), e
geralmente medeiam a hiperpolarização da célula (BORMANN, 2000; WATANABE
et al., 2002) (figura 5). Os receptores de GABA possuem diversos reguladores
alostéricos, como neuroesteróides, etanol, convulsivantes, barbituratos e
benzodiazepínicos (TIURENKOV & PERFILOVA, 2010).
11

Figura 5: Receptores GABAérgicos. OWENS & KRIEGSTEIN, 2002.
2.6 EXCITATÓRIO NO DESENVOLVIMENTO
Inicialmente, durante o desenvolvimento, GABA age como transmissor
excitatório. Tal fato foi observado na resposta excitatória produzida pela ligação do
GABA ao receptor GABAA (CHERUBINI et al., 1991). Isto ocorre devido à alta
concentração intracelular de cloreto mantida pelo co-transportador de Na + -K + -Cl -
(NKCC1) em neurônios imaturos. Já em neurônios maduros, a concentração
intracelular de cloreto é reduzida a certo nível devido à expressão do
cotransportador de K + -Cl - (KCC2), que transporta estes íons para fora da célula,
diminuindo o influxo de cloreto em resposta à ativação do receptor GABAA (OWENS
& KRIEGSTEIN, 2002; LI & XU, 2008) (figura 6).
Figura 6: Resposta do receptor GABAA em neurônios maduros e imaturos. OWENS & KRIEGSTEIN,
2002.
12

2.7 TRANSPORTADORES
Para garantir que a sinalização GABAérgica seja controlada e finalizada, o
GABA é rapidamente removido da fenda sináptica através de transportadores de
GABA de alta afinidade dependentes de Na + e Cl - (GATs), presentes nos terminais
pré-sinápticos e nos astrócitos circunjacentes (BORDEN, 1996; IVERSEN & NEAL,
1968). Os GATs pertencem à família SLC6, têm aproximadamente 80 kDa, e
possuem doze domínios transmembranas (WORRALL & WILLIAMS, 1994; Gether
et al., 2006; KRISTENSEN et al., 2011). Entre os domínios 2 e 4, os GATs
apresentam uma alça larga, que atua como alvo de glicosilação, importante para a
inserção do transportador na membrana plasmática (JURSKY et al., 1994). Além
disso, há três sítios de fosforilação pela PKC e um pela PKA na estrutura do GAT, o
que representa alvos de regulação da função do transportador (WORRALL &
WILLIAMS, 1994).
Foram identificados quatro tipos de transportadores, cuja nomenclatura pode
variar entre as espécies em que a proteína foi clonada (MADSEN et al., 2010). Na
tabela 1, podemos ter uma idéia de como a nomenclatura dos transportadores
GABAérgicos pode variar. Para galinha, geralmente é utilizada a mesma
nomenclatura que para camundongo, sendo os transportadores divididos em GAT-1,
GAT-2, GAT-3 e GAT-4 (LIU et al., 1993). Distinguem-se na sua distribuição,
especificidade e sensibilidade a inibidores. GAT-1 é predominantemente neuronal e,
GAT-3 e GAT-4, gliais (MADSEN et al, 2010).
13

Tabela 1: Nomenclatura dos transportadores de GABA em diferentes espécies. MADSEN et al,
2010.
2.7.1 DISTRIBUIÇÃO E LOCALIZAÇÃO
O GAT-1 é amplamente distribuído em todo o cérebro (DURKIN et al, 1995) e
sua expressão segue a via GABAérgica (RADIAN et al, 1990). Ele é localizado
quase que exclusivamente em terminais axonais que formam contatos sinápticos
simétricos, e, no neocórtex, podem ser encontrados em processos distais de
astrócitos com grande proximidade aos terminais axonais (MINELLI et al., 1995;
BORDEN, 1996; CONTI et al, 1998; MADSEN et al, 2010; CONTI et al, 2011). O
GAT-1 tem como um inibidor seletivo o NNC 711.
GAT-2 está presente no hipocampo e no córtex. Ele não se encontra próximo
de sinapses GABAérgicas, mas em uma região extra-sináptica envolvendo uma
grande quantidade de astrócitos (BORDEN et al., 1995; MADSEN et al, 2010). O
GAT-2 corresponde ao BGT-1, e há relatos de que ele não esteja localizado no SNC
(BORDEN, 1996; CONTI et al., 2004; CHERUBINI & CONTI, 2001). O GAT-2
14

também possui afinidade por betaina, porém o grau afinidade pelo GABA é maior
(BORDEN et al., 1995; MADSEN et al, 2010).
A expressão de GAT-3 é muito limitada. É encontrado nas leptomeninges e
no cérebro neonatal e, talvez em níveis muito baixos, no cérebro, na região pós-
sináptica de neurônios e astrócitos (LIU et al., 1993; BORDEN, 1996; CONTI et
al.,1999; MADSEN et al, 2010).
O GAT-4 está expresso em grande intensidade na retina, bulbo olfatório,
tronco cerebral, diencéfalo e, em baixos níveis, no hipocampo e no córtex. GAT-4 é
exclusivamente expresso em processos distais de astrócitos em contato direto com
neurônios GABAérgicos (DURKIN et al., 1995; MINELLI et al., 1996; MADSEN et al,
2010).
2.7.2 TRANSPORTE
O transporte de GABA pela membrana é dependente de temperatura e de um
gradiente eletroquímico envolvendo os íons Na + e Cl - . A estequiometria desse
sistema compreende 2 íons Na + e 1 íon Cl - para cada molécula de substrato
transportada. O Na + parece estar relacionado a alterações conformacionais do
transportador, que aumentaria sua afinidade ao GABA. Em contrapartida, o Cl -
parece facilitar a ligação do Na + a alguns subtipos de transportadores GABAérgicos
(MAGER et al, 1996). A recaptação do GABA ocorre através de um simporter com o
Na + (figura 7).
15

Figura 7: Modelo do transportador de GABA. RICHERSON & WU, 2004.
Normalmente, os transportadores de GABA atuam captando o
neurotransmissor do meio extracelular a favor do gradiente de Na + mantido pela
bomba Na + /K + ATPase. Entretanto, além da captação os GATs também são capazes
de liberar GABA por um mecanismo de reversão do gradiente de transporte
(BERNATH & ZIGMOND, 1988; PIN & BOCKAERT, 1989; SCHWARTZ, 2002;
RICHERSON & WU, 2004).
Essa liberação de GABA pela reversão do transportador ocorre de forma
semelhante ao que já foi descrito com outros neurotransmissores como dopamina,
glutamato, serotonina, glicina (NICHOLLS & ATTWELL, 1990; RUDNICK & WALL
1992; ROUX & SUPPLISSON 2000; RICHERSON & WU, 2003; LEVIEL, 2011). No
início dos estudos com a reversão do sistema de transporte, acreditava-se que este
mecanismo ocorria apenas em condições patológicas, como na epilepsia e na
isquemia (NICHOLLS & ATTWELL, 1990; LEVI & RAITERI, 1993). Posteriormente
foi demonstrada sua ocorrência em condições fisiológicas, como na despolarização
neuronal normal, no aumento de Na + intracelular ou em pequenos aumentos na
concentração extracelular de potássio (BERNATH & ZIGMOND,1988; GASPARY et
16

al, 1998, RICHERSON & WU, 2003). A eficiência dessa liberação está relacionada
com densidade de transportadores na membrana, concentração de íons Na+ e
voltagem (SCHWARTZ, 2002).
Na retina, um grande componente da liberação de GABA é a reversão de seu
transportador (DO NASCIMENTO et al, 1996). Em 1998, do Nascimento e
colaboradores observaram que em cultura de retina de galinha a liberação de GABA
dependente de sódio e induzida por glutamato e veratridina é mediada por um
transportador similar ao GAT-1, que apresenta algumas, mas não todas,
propriedades do GAT-1 propriamente dito.
2.7.3 MODULADORES DO TRANSPORTE
O sistema inibitório GABAérgico e o estimulatório glutamatérgico interagem
intimamente, especialmente no controle da excitabilidade neuronal. Com isso, é
significativa a influência do glutamato e outros aminoácidos excitatórios na regulação
do transporte de GABA.
Em retina de galinha, glutamato pode induzir a liberação de GABA (Tapia &
ARIAS, 1982; DO NASCIMENTO & DE MELLO, 1985; CALAZA et al., 2003). Essa
liberação ocorre através de transportadores de GABA e é via receptores ionotrópicos
NMDA e não-NMDA (PIN & BOCKAERT, 1989; KUBRUSLY et al., 1998; DO
NASCIMENTO et al., 1998b, CALAZA et al, 2006). Além do glutamato, é conhecida
a liberação de GABA induzida por aspartato, que é mediada pela ativação seletiva
de receptores NMDA (KUBRUSLY et al, 1998, CALAZA et al, 2001). Na retina em
desenvolvimento, a liberação de GABA mediada pelos receptores NMDA ocorre
principalmente pela retina interna, possivelmente através do GAT-1, devido à sua
17

localização exclusiva nesta região (CALAZA et al, 2003). Além disso, em cultura de
retinas de embrião de galinha, uma pequena fração da liberação de GABA induzida
pelos agonistas glutamatérgicos NMDA e kainato parece ocorrer por mecanismo
vesicular (FERREIRA et al, 1994; CARVALHO et al,1995).
Outros moduladores da liberação de GABA na retina de galinha incluem o
etanol, que aumenta, e a dopamina, que parciamente inibe, ambos por um processo
dependente de receptores NMDA (DO NASCIMENTO et al, 1998ª; POHL-
GUIMARÃES et al, 2009).
A PKC e a PKA também regulam o transporte de GABA. É descrito que o
bloqueio da PKC facilita a captação de GABA, enquanto que sua ativação inibe.
Todavia, quando a PKA está ativada, nem a ativação nem a inibição da PKC afetam
a captação de GABA (CRISTÓVÃO-FERREIRA et al, 2009). Neste âmbito, foi
demonstrado que receptores de adenosina também estão envolvidos na modulação
do transporte de GABA. Em ratos, receptores A2A, através da via de transdução
AC/AMPc/PKA, facilitam a captação de GABA mediada por GAT-1, através da
restrição da inibição tônica mediada por PKC (CRISTÓVÃO-FERREIRA et al, 2009).
O envolvimento do sistema purinérgico no transporte de GABA tem sido
bastante estudado. Trabalhos em ratos relataram que a ativação de receptores A2A
facilita a liberação de GABA em sinaptossomas de hipocampo (CUNHA & RIBEIRO,
2000). Entretanto, estes receptores também medeiam a inibição da liberação em
sinaptossomas de estriado (KIRK & RICHARDSON, 1994; KUROKAWA et al, 1994).
Outros trabalhos mostraram que a ativação de ambos receptores A1 e A2A inibe a
liberação de GABA em hipocampo de camundongos (SARANSAARI et al, 2005), ou
que receptores A1 não modulam a liberação de GABA diretamente, mas influenciam
18

a ação de outros neurotransmissores na liberação de GABA (CUNHA & RIBEIRO,
2000, CUNHA-REIS et al, 2008).
O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), através da ativação de
receptores TrkB-t, é capaz de aumentar a captação de GABA para astrócitos
corticais de ratos. Esse transporte requer a sinalização por receptor A2A de
adenosina e ocorre através da modulação da translocação do GAT-1 da membrana
plasmática (VAZ et al, 2008; VAZ et al, 2011). O BDNF medeia a fosforilação
dependente de tirosina quinase, aumentando a expressão de GAT-1 na superfície
de neurônios (LAW et al, 2000; WHITWORTH & QUICK, 2001). Em contrapartida, a
fosforilação dependente de PKC diminui a expressão de GAT-1 na superfície de
neurônios em cultura e em terminais nervosos isolados (BECKMAN et al, 1999;
WANG & QUICK, 2005; CRISTOVÃO-FERREIRA et al, 2009; VAZ et al, 2011).
O sistema serotoninérgico também modula o transporte de GABA. A ativação
de receptores 5-HT facilitatórios, como receptores 5-HT2A e 5-HT3, aumenta a
liberação de GABA, enquanto que a ativação de receptores 5-HT inibitórios, por
exemplo, receptores 5-HT1A e 5-HT1B, diminui a liberação por interneurônios
GABAérgicos (FINK & GÖTHERT, 2007).
Além dos moduladores já citados, há relatos de liberação de GABA, via
transportadores, estimulada por veratridina, ouabaina, monensina e quisqualato,
drogas que aumentam a concentração intracelular de sódio (PIN & BOCKAERT,
1989, DO NASCIMENTO et al, 1998b).
19

3. GLUTAMATO
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC e está
associado a várias funções cerebrais como cognição, memória e aprendizado. Ele
desempenha papéis relevantes no desenvolvimento do sistema, como a formação,
remodelamento e eliminação de sinapses (MCKINNEY, 2010), migração neuronal
(MANENT & REPRESA, 2007), proliferação e diferenciação (SCHLETT, 2006) e
morte celular (VECINO, 2004), além de ser encontrado em órgãos e tecidos
periféricos e células endócrinas (DANBOLT, 2001). Alguns estudos sugerem que as
concentrações extracelulares de glutamato variem de 1 a 10 µM, porém, tais
concentrações não refletem a quantidade real de glutamato na fenda sináptica, visto
que concentrações com poucos micromolares ativariam tonicamente e/ou
dessensibilizariam receptores (BUTCHER, et al, 1987; MORALES-VILLAGRAN &
TAPIA, 1996).
3.1 RECEPTORES GLUTAMATÉRGICOS
Os receptores de glutamato são classificados em duas grandes famílias:
receptores ionotrópicos e receptores metabotrópicos (figura 8). Os receptores
ionotrópicos são canais de íons que precisam da ligação de um agonista para serem
ativados. Eles se dividem em duas categorias, NMDA e não-NMDA. Os receptores
metabotrópicos, por sua vez, são receptores acoplados a uma proteína G.
(HOLLMANN & HEINEMANN, 1994; SCHOEPFER et al., 1994; NAKANISHI et al.,
1998; OZAWA et al., 1998; DINGLEDINE et al., 1999).
Os receptores ionotrópicos são formados por múltiplas subunidades
funcionais, sendo de forma geral tetrâmeros. Possuem três domínios
20

transmembrana e um domínio que se insere na membrana, mas não a atravessa
completamente, voltando então ao citoplasma. A organização diferenciada das
subunidades pode produzir canais diferentes com funções variadas. A presença ou
ausência de aminoácidos específicos carregados no interior do poro do receptor
pode modular a sua permeabilidade a Ca 2+ e a Na + , que estão em maior
concentração no meio extracelular, e os aminoácidos variam de acordo com as
subunidades encontradas em cada caso (WOLLMUTH, 1996). A ativação desse
receptor depende da ligação do agonista, que promoverá uma mudança
conformacional da molécula, permitindo que o canal se abra e ocorra um fluxo
iônico.
Os receptores NMDA foram descritos inicialmente por serem ativados pelo
análogo do glutamato N-metil-D-aspartato (NMDA). Diferentes subunidades que
podem compor este receptor já foram clonadas: NR1, NR2(A-D) e NR3(A-B). In vivo,
receptores NMDA são compostos principalmente pelas subunidades NR1 e NR2.
Eles formam complexos heterotetraméricos que contêm 2 subunidades NR1 e duas
subunidades NR2 (MONY et al, 2009). Embora a subunidade NR1 seja codificada
por um único gene, a subunidade NR2 existe como 4 subtipos codificados por 4
genes diferentes (NR2A-D), cada um com um padrão de expressão espaço-temporal
diferente. Cada composição com as diferentes subunidades implica em propriedades
biofísicas e farmacológicas diferentes (CULL-CANDY & LESZKIEWICZ, 2004;
PAOLETTI & NEYTON, 2007). A subunidade NR1 está amplamente distribuída no
SNC, enquanto que a NR2 apresenta diferentes padrões de expressão.
Em nível subcelular, receptores NMDA, incluindo os que contem NR2B, são
detectados em sítios sinápticos, perisinápticos e extrasinápticos (KÖHR, 2006). Na
21

maioria dos neurônios, entretanto, sua densidade é maior nos espinhos dendríticos,
e na densidade pós-sináptica.
Os receptores NMDA são ativados lentamente (10-50ms) e geram ações
duradouras, precisando de um tempo maior ainda para se desativarem. Sua
ativação ocorre a partir da ligação de alta afinidade de um agonista, que pode ser o
glutamato, o aspartato ou o NMDA, e de um co-agonista, glicina ou D-serina,
gerando um influxo de Ca 2+ , preferencialmente, e de Na + (WOLOSKER et al., 1999;
JOHNSON & ASCHER, 1987; MACDERMOTT et al., 1986) (figura 8).
A D-serina, liberada por células de Müller na retina (MILLER, 2004), é um
ligante endógeno do sítio modulatório da glicina no receptor NMDA e possui uma
potência até 3 vezes maior que a própria glicina, sendo necessária para a total
atividade dos receptores NMDA em células ganglionares (STEVENS et al., 2003)
A permeabilidade de íons Ca 2+ pode ser reduzida pela incorporação da
subunidade NR3 na formação do canal, devido à presença de um sítio de ligação de
glicina/D-serina. Para que haja ativação máxima do receptor são necessárias duas
moléculas de glutamato e duas de co-agonista em NR1 (DINGLEDINE et al., 1999).
Durante o repouso, o poro do receptor NMDA encontra-se bloqueado pelo íon
Mg 2+ . É preciso que haja uma prévia despolarização causada pela ativação de
receptores não-NMDA para deslocar o Mg 2+ do interior do poro, visto que esse
bloqueio é voltagem-dependente, para que então o receptor NMDA possa ser
completamente ativado.
Receptores NMDA são altamente regulados. Há pelo menos 6 sítios para
ligantes endógenos distintos, que influenciam na probabilidade da abertura do canal
iônico. Estes incluem os sítios para os agonistas e um sítio regulatório de
22

poliaminas, que promovem a ativação do receptor. Outros sítios como os para Mg 2+ ,
Zn 2+ e H + agem inibindo o influxo de íons pelo receptor que está ligado a agonistas.
Figura 8: Receptor NMDA e sítios para ligantes endógenos. Modificado de CNSforum.com
Receptores NMDA são essenciais para processos fisiológicos normais como
desenvolvimento cerebral, plasticidade sináptica, aprendizado e memória
(DINGLEDINE et al., 1999), e também estão envolvidos em diversas disfunções
cerebrais, o que leva a um grande interesse no seu potencial terapêutico. Além
disso, esses receptores têm um papel na excitotoxicidade, processo no qual sua
ativação excessiva por glutamato causa um acúmulo de cálcio intracelular, e,
eventualmente, morte neuronal. Excitotoxicidade ocorre durante varias disfunções
agudas (trauma cerebral, por exemplo) e degenerativas crônicas (Alzheimer,
Parkinson e Huntington).
A outra família é ativada pelo ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
isoxazolepropiônico (AMPA) e pelo kainato. Dependendo da sua preferência por
23

AMPA ou por kainato esses receptores podem ser subdivididos entre receptores
AMPA (GluR1-4) e receptores kainato (GluR5-8, KA1 e KA2) (figura 9), porém essa
ativação não é completamente seletiva, visto que o AMPA pode ativar alguns
receptores kainato e vice-versa (KEINÄNEN et al., 1990; PATNEAU AND MAYER,
1990; HERB et al,. 1992). Os receptores AMPA/KA estão amplamente distribuídos
no SNC e realizam a transmissão sináptica excitatória rápida. São receptores de
baixa afinidade, permeáveis principalmente a Na + ou Na + e Ca 2+ , abrindo seus poros
prontamente frente à exposição de glutamato. São rapidamente dessensibilizados
(TANG et al., 1989; TRUSSEL, 1993; PATNEAU E MAYER, 1990), porém
receptores AMPA se recuperam mais rapidamente da dessensibilização do que os
receptores KA, (TRUSSEL et al., 1993; FLETCHER E LODGE, 1996).
A família de receptores metabotrópicos de glutamato compreende oito
subunidades de receptores (mGluR1-8) que são divididos em três grupos: Grupo I
(mGluR1 e mGluR5), Grupo II (mGluR2 e mGluR3) e Grupo III (mGluR4, mGluR6,
mGluR7 e mGluR8). O grupo I é acoplado positivamente à fosfolipase C (PLC),
levando a um aumento de cálcio intracelular e à produção de inositol trifosfato (IP3)
e diacilglicerol (DAG), enquanto os grupos II e III estão acoplados negativamente à
adenilill ciclase (AC), causando uma diminuição dos níveis intracelulares de AMPc
(SCHOEPP et al., 1992; HASSEL E DINGLEDINE et al., 2006; PILC E OSSOWSKA,
2007).
24

Figura 9: Receptores de glutamato e subunidades. (Modificado de HASSEL E DINGLEDINE, 2006).
4. ADENOSINA
A adenosina é uma purina e é encontrada em todos os tecidos do corpo. Ela é
mais bem classificada como neuromodulador do que como neurotransmissor, devido
ao fato de não ser armazenada em vesículas sinápticas e ter sua liberação realizada
somente através de transportadores em vez do mecanismo de exocitose. Desta
forma, ela não é considerada um neurotransmissor clássico, como é o caso do
glutamato, da dopamina, entre outros; além da sua capacidade de regular a
liberação de neurotransmissores e modular a sinalização sináptica. A adenosina
possui também um efeito neuroprotetor, desempenhando um papel na regulação
homeostática do SNC frente a um quadro de dano tecidual e disfunções no
metabolismo, como por exemplo, uma isquemia, hipóxia ou uma deficiência
mitocondrial funcional (WARDAS, 2002; STONE, 2005). Esse efeito neuroprotetor
também foi observado por PAES-DE-CARVALHO et al, em 2003, ao mostrar que a
adenosina impede a morte celular de neurônios em cultura, induzida pela troca do
meio de cultura.
25

4.1 Receptores de Adenosina
A adenosina extracelular exerce suas funções modulatórias através da
ativação de seus receptores específicos. Até o momento, quatro subtipos de
receptores de adenosina foram clonados: A1, A2A, A2B e A3. Classicamente, os
receptores A1 e A3, que estão acoplados a uma proteína G0/Gi, possuem uma ação
inibitória na atividade da enzima adenilill ciclase, o que resulta numa diminuição dos
níveis intracelulares de AMPc (PEARSON et al., 2003). Os receptores A2A e A2B,
acoplados à proteína Gs, agem positivamente sobre a adenilil ciclase, tendo um
papel estimulatório sobre esta enzima e produzindo um aumento dos níveis de
AMPc intracelular (RIBEIRO et al., 2002) (figura 10).
Figura 10: Receptores de adenosina inibitórios (A1 e A3) e estimulatórios (A2A e A2B) da enzima AC,
que produz AMPc a partir de ATP. (http://www.aderis.com/img/art_adenosine.gif).
A ativação do receptor A1 está relacionada com a inibição da liberação de
neurotransmissores como o glutamato. Isso é importante em situações de isquemia
e hipóxia, durante as quais há uma rápida produção de adenosina, que ocorre a
partir da quebra do ATP intracelular e seu transporte para o espaço extracelular,
ativando os receptores A1 e promovendo uma ação neuroprotetora às células
26

(SAKAMOTO et al., 2004). Além disso, Os receptores A3 também estão envolvidos
com respostas neuroprotetoras (VON LUBITZ et al., 1994; LIU et al., 1994), mas
também com respostas inflamatórias (JIN et al., 1997).
A transdução do sinal pelos receptores A1 e A3 podem envolver várias vias.
Esses receptores podem ser acoplados a proteínas Gi/G0 e, quando ativados, inibem
a atividade da adenilill ciclase (VAN CALKER et al., 1979; ZHOU et al., 1992),
inibindo a produção de AMPc a partir de ATP. A redução dos níveis desse segundo
mensageiro faz com que a quinase que está logo abaixo na via, no caso a PKA, não
seja ativada.
Os receptores A1 e A3 também podem agir na via da PLC. O receptor A1,
acoplado à proteína Gi/G0, ativa a PLCβ, liberando a subunidade βγ (BIBER et al.,
1997). A PLCβ ativada quebra PIP2, que está na membrana, formando IP3 e DAG.
O IP3 se liga aos canais de Ca 2+ no retículo endoplasmático, ativando-os e liberando
o Ca 2+ para o citosol. Este aumento de Ca 2+ induz o ancoramento da PKC inativa,
que é realizado por meio do DAG. Este se liga à PKC, ativando-a, de forma
dependente de Ca 2+ . No entanto, dependendo da isoforma, a PKC também pode ser
ativada pelo DAG na ausência de Ca 2+ (OSADA et al., 1992). Os receptores A3
também podem ativar a via da PLC, seja pela proteína Gi/G0, liberando a subunidade
βγ, ou pela proteína Gq (ABBRACCHIO et al., 1995; PALMER et al., 1995).
Há ainda uma via de transdução de sinal por canais iônicos, em que os
receptores A1 ativados podem promover a abertura de canais de K + , aumentando a
condutância desse íon, e podem promover o fechamento de canais de Ca 2+ do tipo
N (MOGUL et al., 1993). Ambos os efeitos contribuem para a inibição da liberação
de neurotransmissores promovida pelos receptores A1 pré-sinápticos.
27

O sinal ainda pode ser transduzido pela via da MAP quinase, que pode ser
ativada por receptores acoplados à proteína G, como o A1 e A3, além da clássica
ativação por receptores tirosina quinase (LUTTRELL et al., 1997). Os receptores A1
e A3 podem levar à ativação da ERK1/2 através da subunidade βγ da proteína Gi/Go
(FAURE et al., 1994). Ativação pelo receptor A1 é dependente de dose, de tempo e é
sensível a IP3 (SCHULTE & FREDHOLM, 2000; DICKENSON et al., 1998),
enquanto que a ativação pelo receptor A3 depende de PI3K, Ras e MEK (SCHULTE
& FREDHOLM, 2002).
Os receptores A1 são distribuídos por todo o SNC, tendo uma maior
concentração no córtex, cerebelo e hipocampo (área com maior vulnerabilidade à
isquemia). Eles são encontrados tanto em neurônios, quanto em astrócitos, microglia
e oligodendrócitos (BIBER et al., 1997; GEBICKE- HAERTER et al., 1996; OTHMAN
et al., 2003), e localizam-se abundantemente nos terminais pré e pós-sinápticos
(TETZLAFF ET al., 1987). Esses receptores também são expressos nas glândulas
adrenais e salivares, tecido adiposo e muscular esquelético, além de esôfago,
pulmão, pâncreas, fígado e rins (FREDHOLM et al., 2001).
Já os receptores A3 estão localizados no córtex, hipocampo, cerebelo e
estriado, em baixas concentrações, e estão expressos em neurônios, astrócitos e
microglia (FREDHOLM, et al., 2001; BRAND et al., 2001; WITTENDORP et al., 2004;
HAMMARBERG et al., 2003). Eles são também encontrados no coração, pulmão,
glândulas adrenais, tireóide, rins, fígado e intestino (FREDHOLM et al., 2001).
Os receptores A2A, quando bloqueados, inibem a liberação de
neurotransmissores, principalmente o glutamato, conferindo neuroproteção às
células em situações de isquemia e hipóxia (LATINI et al., 1999). O glutamato é
28

capaz de promover a morte celular em culturas purificadas de neurônios da retina
(FERREIRA e PAES-DE-CARVALHO, 2001). Tal efeito é bloqueado por
antagonistas de receptores de glutamato do tipo NMDA e não-NMDA. A pré-
incubação das culturas por 24 horas com adenosina bloqueia a morte induzida pelo
glutamato. E este efeito pode ser reproduzido por agonistas de receptores A2A, mas
não de receptores A1. A troca do meio de cultura também leva à morte neuronal,
porém, este efeito é bloqueado também com a pré-incubação com adenosina,
agonistas de receptores A2A ou NBI (PAES-DE-CARVALHO et al., 2003). Tais
resultados corroboram com o papel neuroprotetor da adenosina, que via receptores
A2A, bloqueia a morte celular causada pelo glutamato ou pela troca de meio de
cultura.
Quando ativados, os receptores A2A e A2B, acoplados à proteína Gs,
estimulam um aumento na produção de AMPc a partir de ATP, o que ativa a
proteína quinase A. A PKA ativada pode migrar pro núcleo da célula, ativando a
transcrição gênica da CREB (GONZALEZ et al., 1989).
Esses receptores também são capazes de sinalizar através da PLC (GAO et
al, 1999), além da via da MAP quinase. (FEOKTISTOV et al., 1999).
Receptores A2A podem formar homodímeros com receptores A1 na membrana
celular. Eles podem também formar complexos com outros tipos de receptores,
como com receptores de glutamato mGluR5 (FERRE et al., 2002) e receptores D2
de dopamina (CANALS et al., 2003).
Os receptores A2A estão localizados em neurônios, astrócitos e microglia (Li et
al., 2001). Eles estão expressos no estriado, nas sinapses hipocampais,
principalmente no terminal pré-sináptico (REBOLA et al., 2005), e nas regiões pós-
29

sinápticas e nas espinhas dendríticas dos gânglios da base (HETTINGER et al.,
2001; RODRIGUES et al., 2005). Pode-se encontrar receptores A2A também no
coração, plaquetas, timo, leucócitos e no pulmão.
A distribuição dos receptores A2B não é muito bem caracterizada. Sabe-se
que eles são expressos em astrócitos (ALLAMAN et al., 2003), e seu RNAm foi
encontrado na microglia (HAMMARBERG et al., 2003).
Experimentos com células transfectadas demonstraram que o receptor A1 é
capaz de formar heterômeros com os receptores A2A e esse complexo receptor pode
ser bioquimicamente identificado em terminais striatais glutamatérgicos, o que pode
permitir uma modulação da liberação de glutamato. O complexo receptor A1-A2A
promove um mecanismo de troca dependente de concentração, pelo qual altas e
baixas concentrações de adenosina sináptica produzem efeitos opostos na liberação
de glutamato (FERRE et al., 2008).
Estudos recentes em ratos mostraram que receptores A1 e A2A podem regular
a captação de GABA por GAT-1 e GAT-3 em astrócitos, através de um complexo de
heterotetrâmeros de A1R-A2AR (interação de dois homodímeros), que sinaliza por
dois tipos de proteína G diferentes, Gs e Gi/0, podendo aumentar ou inibir a captação
de GABA (CRISTÓVÃO-FERREIRA et al, 2011).
ADENOSINA
4.2 CAFEÍNA COMO AGENTE MODULADOR DOS RECEPTORES DE
A cafeína é a substância psicoativa mais amplamente usada no mundo inteiro
e age em todos os sistemas do corpo através do SNC (SOMANI & GUPTA, 1988).
30

Ela está presente no café, chá, guaraná, bebidas a base de cola e tem sido usada
terapeuticamente para tratar narcolepsia, asma e apnéia, além de ser encontrada
como aditivo em analgésicos (LONGENECKER, 1998). Sua função e mecanismos
de ação têm sido estudados com perspectiva para uma possível estratégia
terapêutica no tratamento de doenças neurodegenerativas (ARENDASH & CAO,
2010; MENDONÇA & CUNHA, 2010). A cafeína estimula o sistema psicomotor
(FISONE et al., 2004), pode modular a função da rede de atenção (BRUNYÉ et al.,
2010), tem ação diurética e cardiotônica. (Longenecker, 1998), entre outros.
A cafeína, por ser uma xantina, farmacologicamente, pode inibir a enzima
fosfodiesterase de nucleotídeos cíclicos, mobilizar cálcio, inibir as enzimas
monoamina oxidase e cicloxigenase e também pode afetar a captação de adenosina
(WILLIAMS & JARVIS, 1988). No entanto, muitas das suas ações terapêuticas são
atribuídas à sua atividade como antagonista não seletivo dos receptores de
adenosina (FREDHOLM et al., 1999), principalmente os receptores A1 e A2A.
A manipulação farmacológica do sistema purinérgico, através de antagonistas
de receptores de adenosina, como a cafeína, representa uma forma de estudo que
pode revelar possíveis alvos terapêuticos para o tratamento de várias doenças. Em
modelos experimentais de roedores, a cafeína e antagonistas seletivos dos
receptores A2A podem promover proteção contra disfunções na memória causadas
por velhice, doença de Alzheimer, Doença de Parkinson e em ratos
espontaneamente hipertensos (SHR), um suposto modelo genético de Transtorno de
Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) (TAKAHASHI et al., 2008).
Na isquemia, a pré-administração crônica de cafeína aumenta a afinidade e o
número de receptores A1, atenuando os danos isquêmicos cerebrais, mas tanto os
31

eceptores A1 quanto os receptores A2A possuem efeito neuroprotetor (RUDOLPHI et
al., 1992).
32

II OBJETIVOS
1. Objetivo Geral:
O trabalho tem como objetivo investigar se a exposição aguda de retinas
embrionárias de aves à cafeína altera a atividade do receptor NMDA e modifica a
comunicação GABAérgica.
2. Objetivos específicos:
Avaliar as características da liberação de GABA induzida por D-aspartato, um
agonista endógeno do receptor NMDA, em retinas de aves de 13 dias
embrionários.
Investigar o efeito da cafeína no sistema de transporte de GABA e as vias de
sinalização que podem estar regulando este processo.
Investigar potenciais sítios regulatórios do receptor NMDA que poderiam estar
sendo modulados pelo tratamento com cafeína.
33

III MATERIAIS E MÉTODOS
1 MATERIAIS
1.1 Animais e coleta de tecido
Todos os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo de uso e
cuidados com os animais em pesquisa da Universidade Federal Fluminense.
Ovos de galinha da raça Leghorn (Gallus gallus domesticus) fertilizados foram
obtidos de uma granja local. Foram utilizados embriões de galinha de 13 dias (E13)
estagiados de acordo com HAMBURGUER E HAMILTON (1951). Para cada
experimento foram utilizados de 3 a 4 animais. Eles foram rapidamente decaptados
e seus olhos foram enucleados. As retinas foram dissecadas, isoladas e mantidas
em meio ou solução salina para a utilização em diferentes protocolos experimentais.
1.2 Drogas
Foram utilizadas as seguintes drogas: 1,3,7-Metilxantina (Cafeína), 7β-
Acetoxi-8,13-epoxi-1α,6β,9α-trihidroxilabd-14-en-11-one (Forscolina) provenientes
da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Ácido hidroclorídrico 1- [2-
[[(Difenilmetileno)imino]oxi]etil]-1,2,5,6-tetrahidro-3-piridinocarboxílico hidroclorídrico
(NNC 711), 3-dipropilo-8-ciclopentilxantina (DPCPX), N6-ciclohexiladenosina (CHA),
(5R,10S)-(+)-5-Metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciclohepteno-5,10-imina-
hidrogeno maleato (MK-801), 5-amino-7-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-
triazolo[1,5-c]pirimidina (SCH 58261), N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-
isoquinolinesulfonamida.2HCl (H-89) também foram utilizados nos experimentos.
34

O agonista do receptor A2A, 2-p-(2-Carboxietil) fenetilamino-5'-N-hidrato de
cloridrato etilcarboxamidoadenosina (CGS21680), o inibidor da família src, 4-Amino-
5-(metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo-(3,4-d)pirimidine (PP1) foram cedidos gentilmente
pelos professores doutores Roberto Paes-de-Carvalho e Elizabeth Giestal,
respectivamente, da Universidade Federal Fluminense. O antagonista de receptores
NMDA que contêm a subunidade NR2B, α-(4-Hidroxifenil)-β-metil-4-benzil-1-
piperidineethanol (+)-tartrate salt (Ifenprodil), proveniente da Sigma-Aldrich, foi
cedido pelo Laboratório de Neuroquímica do IBCCF, da UFRJ. Foram utilizados em
nossos experimentos 3 H-D-aspartato proveniente da PerkinElmer, com atividade
específica de 12,2 Ci/mol e 3 H-GABA (Sigma-Aldrich; atividade específica: 35
Ci/mmol).
1.3 Soluções Gerais
Tabela 2: Solução Hanks 4, pH 7,4:
Soluto Concentração Final
NaCl 128mM
KCl 4mM
MgCl2
CaCl2
1mM
3mM
Hepes 20mM
Glicose 4mM
35

2 Métodos
Tabela 3: Solução Hanks 4 sem Mg 2+ , pH 7,4:
Soluto Concentração final
NaCl 128mM
KCl 4mM
EDTA 1mM
CaCl2
3mM
Hepes 20mM
Glicose 4mM
Meio MEM (EARLE) com 2,2g de bicarbonato de sódio 5,6% por litro.
2.1 Captação de 3 H-GABA
Retinas de embrião de galinha (E13) foram dissecadas e incubadas em
solução salina Hanks 4 sem magnésio a 37°C na presença de 1µCi de 3 H-GABA. O
grupo experimental controle foi incubado com o radioativo por 60 minutos em banho-
maria, enquanto que o grupo experimental tratado foi incubado na presença de
cafeína a 500µM por 30 minutos antes da adição do radioativo. Em seguida, o tecido
foi submetido a sucessivas lavagens com 1ml de salina gelada a fim de interromper
36

a reação e lavar o neurotransmissor que não foi incorporado. Após esta etapa, foi
adicionado 1 ml de água para o rompimento das membranas celulares e avaliação
dos níveis de 3 H-GABA captado por cintilação líquida. A normalização dos
resultados foi feita pela quantificação de proteína (figura 11).
Figura 11: Metodologia da Captação de 3 H-GABA.
2.2 Liberação de Neurotransmissores
Retinas de embrião de galinha (E13) foram dissecadas e incubadas com
solução salina Hanks 4 a 37°C na presença de 1µCi de 3 H-GABA ou 3 H-D-aspartato
em banho-maria por 60 minutos. Em seguida, todas as retinas foram submetidas a
sucessivas lavagens com 1ml de solução Hanks 4 sem magnésio (ou com
magnésio, quando indicado) a 37°C a fim de lavar o neurotransmissor que não foi
incorporado. Após esta etapa, o tecido passou pelo processo de superfusão com
trocas sucessivas de 0.5ml da solução Hanks 4 sem magnésio a 37°C com adição
de reagentes farmacológicos, os quais estão indicados na tabela 4. As superfusões
foram realizadas com quatro pulsos de dez minutos cada, sendo os dois primeiros
37

para compor o resultado basal e os dois últimos, o resultado estimulado, para cada
ponto. Ao tecido foi adicionado 1ml de água para o rompimento das membranas
celulares. Os níveis de radioatividade tanto das superfusões quanto do extravasado
celular foram analisados por cintilação líquida e os resultados foram normalizados
pela porcentagem de neurotransmissor liberado em relação ao total. (figura 12)
Figura 12: Metodologia da liberação de neurotransmissores.
38

Droga Função Concentração
Aspartato Agonista Glutamatérgico 500µM
Cafeína Antagonista A1R / A2AR 50µM, 500µM, 2mM
DPCPX Antagonista A1R 100nM
Forscolina Ativa Adenilil Ciclase 10µM
Genisteína Inibe proteína tirosina quinase 10µM
H-89 Inibe PKA 1µM
Ifenprodil Antagonista NMDA-NR2B 100nM, 1µM, 10µM
MK-801 Antagonista NMDAR 10µM
NNC 711 Bloqueia GAT-1 5µM
PP1 Inibe família src quinase 3µM
SCH 58261 Antagonista A2AR 100nM
Tabela 4: Drogas utilizadas na liberação de neurotransmissores e suas funções e concentrações.
2.3 Ensaio de AMPc
Retinas de embrião de galinha (E13) foram incubadas por 5 minutos a 37°C
em um meio mínimo essencial tamponado com 20mM de HEPES a um pH de 7,3
contendo 0,5mM de Rolipram, um inibidor de fosfodiesterase. Em seguida, a
39

incubação prosseguiu por 60 minutos com a adição de drogas como estímulo para o
AMPc (tabela 5). A reação foi parada com TCA 10%. O AMPc foi purificado e
analisado por métodos descritos previamente (DE MELLO et al, 1982; GILMAN,
1970; MATSUZAWA E NIRENBERG, 1975). Os níveis de AMPc foram corrigidos por
dosagem de proteína. (figura 13).
Figura 13: Metodologia do Ensaio de AMPc.
Droga Função Concentração
CHA Agonista A1R 200 µM
Forscolina Ativa Adenilil Ciclase 25 µM
Tabela 5: Drogas utilizadas no ensaio de AMPc e suas funções e concentrações.
2.4 Dosagem de Proteína
As proteínas foram dosadas pelo método de LOWRY (1951).
40

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram processados pelo programa Graphpad – Prism como médias
e erros padrões da média. Foi então realizada uma ANOVA, com pós-teste de
Bonferroni, ou teste t. Os valores foram considerados de acordo com níveis de
significância: p

IV RESULTADOS
Dados na literatura mostram que em retina de pinto, aspartato é capaz de
liberar GABA pela reversão do transportador de GABA (KUBRUSLY et al, 1998).
Neste estudo, em um microambiente de cultivo celular, a liberação foi inibida em,
aproximadamente, 80% na presença de NNC 711 (KUBRUSLY et al, 1998).
Para identificar se o mecanismo de liberação de GABA ocorre em tecido
intacto similarmente ao de células em cultura, promovemos a liberação de 3 H-GABA
na presença de D-aspartato (D-Asp) (500µM) ou de D-Asp e NNC 711 (5 µM). Na
figura 14 observamos que a liberação de 3 H-GABA aumentou com D-Asp cerca de
quatro vezes em relação à liberação basal e que, na presença de NNC 711, a
liberação com D-Asp foi completamente inibida. Sendo assim, no tecido, a liberação
de GABA é prioritariamente neuronal, conforme descrita em cultura.
42

Figura 14: A liberação de GABA estimulada com D-Asp em retina de E13 é mediada por GAT-1.
A liberação foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. No grupo D-Asp
500µM, os níveis de GABA liberado foram de 9,94%, enquanto que no grupo NNC 711 + D-Asp foram
de 2,42%, o que demonstra a atividade de GAT-1 nesta idade. O n de animais por experimento variou
de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de p

estimulada por D-Asp e sua modulação por cafeína dependem de receptores do tipo
NMDA. (figura 15).
Figura 15: Cafeína potencializa a liberação de GABA induzida por receptores NMDA. A captação
foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. O grupo D-Asp 500µM liberou
9,94%, o grupo Caf + D-Asp, 16,10% e a liberação de GABA pelo grupo MK-801 + Caf + D-Asp foi de
3,17%. A liberação de GABA evocada por D-Asp é potencializada pela cafeína e depende de NMDAR.
O n de animais por experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de
p

Como o aumento da liberação de GABA por cafeína pode ser resultado de
uma atividade elevada do transportador GAT-1, promovemos a captação de 3 H-
GABA na presença de cafeína (500µM). Conforme observamos na figura 16, não
houve alteração nos níveis de GABA captado entre o grupo controle e grupo tratado
com a droga, descartando a possibilidade de alterações funcionais do GAT-1 pela
cafeína.
Figura 16: Cafeína não modifica a atividade do GAT1. A captação foi realizada de acordo com os
procedimentos descritos em Métodos. Assumimos como 100% a quantidade de GABA captada pelo
grupo controle. No grupo Cafeína 500µM, não houve alteração significativa. O n de animais por
experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de p>0.05.
Dados não publicados do nosso grupo demonstraram que a cafeína em retina
de ratos pode induzir um aumento na liberação de 3 H-D-aspartato. Para investigar se
a cafeína estimula a liberação de AAE em retina de aves, mensuramos a liberação
de 3 H-D-aspartato na ausência ou na presença de cafeína nas concentrações de
50µM, 500µM e 2mM. Observamos na figura 17 que a cafeína, mesmo em diferentes
45

concentrações, é incapaz de aumentar a liberação de D-Asp com ou sem íons
magnésio.
Figura 17: Cafeína não aumenta a liberação de D-Asp. A liberação foi realizada de acordo com os
procedimentos descritos em Métodos. Os níveis de 3 H-D-aspartato liberado com magnésio foram de:
1,42 (sem caf); 0,73 (caf 50µM); 2,03 (caf 500µM); 0,79 (caf 2mM). Sem magnésio, os valores da
liberação foram de: 1,61 (sem caf); 0,49 (caf 50µM); 1,37 (caf 500µM); 0,53 (caf 2mM). O n de
animais por experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de p>0.05.
Sabendo que a cafeína pode antagonizar receptores A1 e A2A e para
discriminar qual destes estaria modulando a liberação de GABA, utilizamos,
inicialmente, antagonistas específicos. DPCPX (100nM), antagonista seletivo A1R,
potencializou a liberação de 3 H-GABA estimulada por D-Asp. Este aumento foi de,
aproximadamente, 120%, revelando um efeito ainda maior que o da cafeína (figura
18). Esse resultado mostra que o bloqueio de receptores A1 facilita a liberação de
GABA estimulada por D-Asp e que o efeito da cafeína provavelmente ocorre pela
modulação destes receptores.
46

Figura 18: O bloqueio de receptores A1 facilita a liberação de GABA mediada por D-Asp. A
liberação foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. O grupo D-Asp
500µM liberou 9,94%, Caf + D-Asp, 16,10% e, DPCPX + D-Asp, 21,95%. DPCPX aumentou a
liberação de GABA evocada por D-Asp. O n de animais por experimento variou de 3 a 4 animais e
consideramos o nível de significância de p

Figura 19: O bloqueio de receptores A2A não modifica a liberação de GABA induzida por D-
Asp. A liberação foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. Os níveis de
GABA liberado foram: 9,94% para D-Asp 500µM; 12,27% para SCH100nM + D-Asp. Não houve
diferença significativa entre os grupos D-Asp 500µM e SCH100nM + DAsp. O n de animais por
experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de p>0.05.
Como as respostas de receptores purinérgicos podem estar vinculadas a via
de transdução AC/AMPc/PKA, quantificamos a liberação de 3 H-GABA estimulada
com D-Asp na presença do ativador direto da adenilill ciclase, forscolina (10µM).
Observamos na figura 20 que a forscolina foi capaz de aumentar a liberação de
GABA em 88%. Este resultado vai de acordo como o dado do bloqueio de A1R
facilitando a liberação de GABA.
48

Figura 20: A ativação da adenilill ciclase potencializa a liberação de GABA. A liberação foi
realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. O grupo D-Asp 500µM liberou
9,94%, enquanto que o grupo Forscolina + D-Asp liberou 18,76%. Forscolina aumentou a liberação
de GABA. O n de animais por experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de
significância de p

Figura 21: Receptores de adenosina A1 estão funcionais em E13. O ensaio de AMPc foi realizado
de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. Os níveis de AMPc no grupo Forscolina
25µM foram de 2317 pmol/mg/hora, enquanto que no grupo Forscolina + CHA foram de 1094
pmol/mg/hora. CHA reduziu os níveis de AMPc estimulados com forscolina. O n de animais por
experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de p

capaz de prevenir o efeito da cafeína, levando a liberação de GABA aos níveis
controle com D-aspartato (figura 22).
Figura 22: O bloqueio da via da PKA previne o efeito da cafeína. A liberação foi realizada de
acordo com os procedimentos descritos em Métodos. Os níveis de GABA liberado foram de: 9,945%
para D-aspartato 500µM; 16,10% para Caf + D-Asp; e 11,58% para H-89 + Caf + D-Asp. H-89
preveniu o efeito da cafeína na liberação de GABA evocada por D-aspartato. O n de animais por
experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de p

inibidor de proteína tirosina quinase, Genisteína, a 10µM na liberação de 3 H-GABA
estimulada com D-aspartato na presença de cafeína 500µM. Observamos que a
genisteína preveniu o efeito da cafeína na liberação de GABA, com valores de
porcentagem de GABA liberado similares aos do controle com D-aspartato (figura
23).
Figura 23: O bloqueio da fosforilação em resíduos de tirosina previne o efeito da cafeína. A
liberação de GABA foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. O grupo D-
aspartato 500µM liberou 9,945%, Cafeína + D-Asp, 16,10%, e o grupo Geni + Caf + D-Asp liberou
9,187%. Genisteína preveniu o efeito da cafeína na liberação de GABA evocada por D-aspartato. O n
de animais por experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de
p

Posterior ao experimento com genisteína, utilizamos outro inibidor de proteína
tirosina quinase. Desta vez, um inibidor específico da família src, PP1, na
concentração de 3µM. Verificamos que o PP1 também foi capaz de inibir o efeito da
cafeína, levando a liberação de 3 H-GABA aos níveis controle observados com D-
aspartato (figura 24).
Figura 24: A inibição da fosforilação por proteínas da família src previne o efeito da cafeína. A
liberação foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. Os níveis de GABA
liberado foram de: 9,945% para D-aspartato 500µM; 16,10% para Caf + D-Asp; e 9,763 para PP1 +
Caf + D-Asp. PP1 preveniu o efeito da cafeína na liberação de GABA evocada por D-aspartato. O n
de animais por experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de
p>0.05.
53

Dados na literatura têm demonstrado que, em neurônios, a fosforilação de
subunidades NR2 induzida por src aumenta tanto a frequência das correntes
sinápticas quanto o tempo de abertura do canal NMDA (SALTER & KALIA, 2004).
Utilizando diferentes concentrações de um inibidor específico da subunidade NR2B,
ifenprodil (100nM, 1µM e 10µM), verificamos que somente as concentrações de 1µM
e 10µM geraram inibição significativa no efeito facilitatório da cafeína (figura 25).
Figura 25: A inibição da subunidade NR2B previne o efeito da cafeína na liberação de GABA. A
liberação foi realizada de acordo com os procedimentos descritos em Métodos. O grupo D-aspartato
500µM liberou 10,65%; Cafeína + D-Asp, 16,10%; Ifenprodil 100nM, 13,14%; Ifenprodil 1µM, 11,88%;
e Ifenprodil 10µM, 8,785%. Ifenprodil, nas concentrações mais altas, preveniu o efeito da cafeína. O n
de animais por experimento variou de 3 a 4 animais e consideramos o nível de significância de
p>0.05 (D-Asp + Caf 500µM x Ifenprodil 100nM), p

V DISCUSSÃO
Estudos farmacológicos revelaram que 80% da liberação de GABA mediada
por AAE em cultura de retina de embrião de galinha é mediada por reversão de
transportador (KUBURSLY et al, 1998, DO NASCIMENTO et al, 1998b, CALAZA et
al, 2006). Além disso, DO NASCIMENTO e colaboradores (1998) sugeriram que
essa liberação fosse mediada por um transportador similar ao GAT-1, que apresenta
algumas, mas nem todas as propriedades farmacológicas do carreador GAT-1.
Nossos resultados mostraram uma inibição quase que completa da liberação de
GABA estimulada com D-aspartato na presença de NNC 711. Isso indica que a
ativação de receptores NMDA induz uma liberação de GABA em retinas de E13 via
reversão de GAT-1 ou de transportador semelhante.
A liberação de GABA evocada por L-glutamato pode ser detectada a partir de
E7/E8, um pouco antes dos circuitos sinápticos serem estabelecidos no tecido
(CALAZA et al, 2006). Na retina madura intacta, cálcio não é necessário para a
liberação de GABA por nenhum AAE, mas íons sódio são importantes. Além disso,
foi mostrado que o sistema carreador de L-glutamato em células de retina
embrionária é relativamente inespecífico, com D- e L-aspartato sendo captados pelo
mesmo sistema (mas não o D-glutamato) (KUBRUSLY et al, 1998; CALAZA et al,
2006).
Dados na literatura mostraram que a liberação de GABA induzida por
glutamato é maximizada quando íons magnésio são retirados do meio e EDTA é
acrescentado, pois favorece a ativação de receptores NMDA. (KUBRUSLY et al,
1998; DO NASCIMENTO et al, 1998ª, CALAZA et al, 2006). Com base nisso, nossos
experimentos foram realizados seguindo o mesmo protocolo experimental.
55

Já foi descrita a modulação do transporte de diversos neurotransmissores
pelo sistema purinérgico (SARANSAARI & OJA, 2005; CRISTÓVÃO-FERREIRA et
al, 2009). Neste trabalho, investigamos a modulação da liberação de GABA por um
antagonista de receptores de adenosina, cafeína, que é capaz de potencializar a
liberação estimulada com D-aspartato em cerca de 60%.
O sistema de transporte de GABA parece não ter sido alterado com o
tratamento de cafeína, visto que não houve alterações na captação de GABA entre o
grupo controle e o grupo experimental. Entretanto, há trabalhos que mostram
alterações na atividade do transportador mediadas por agentes purinérgicos
(CRISTÓVÃO-FERREIRA et al, 2009; RIBEIRO & SEBASTIÃO, 2010).
Como descrito na introdução, diversos trabalhos mostram que a liberação de
GABA pode ser induzida por AAE (KUBRUSLY et al, 1998). Nossos resultados
mostraram que a cafeína, mesmo em concentrações crescentes, não aumentou a
liberação de 3 H-D-aspartato. Portanto, o efeito potencializador na liberação de GABA
não envolve um aumento na concentração extracelular de AAE.
As evidências de interações entre os receptores de adenosina e o receptor
glutamatérgico NMDA não são poucas e as respostas variam dependendo do
modelo de estudo e localização. Há relatos de que a ativação de receptores NMDA
pode inibir as ações dos agonistas A1 em terminais pré-sinápticos e que, em
neurônios hipocampais e estriatais, adenosina, atuando em receptores A1 ou A2A,
pode deprimir a ativação de receptores NMDA. Neste caso, sugere-se que a direção
das interações dos receptores é revertida nos sítios pós-sinápticos (STONE et al,
2009). Receptores A1 já foram descritos sobre a sua capacidade de regular a
liberação de neurotransmissores em diversos trabalhos (WU & SAGGAU 1997;
56

LATINI & PEDATA, 2001, STONE et al, 2009). Ao investigar a participação dos
subtipos de receptores de adenosina na liberação de GABA em tecido intacto de
retinas embrionárias, observamos que o bloqueio de receptores A1 produziu efeitos
similares ao da cafeína, potencializando a resposta do receptor NMDA em liberar
GABA ao ser estimulado com D-aspartato. No entanto, não observamos o mesmo
efeito com o antagonista de receptores A2A. Além disso, na idade de E13, os
receptores A2A, apesar de estarem expressos na retina em cultura, não estão
funcionais (PAES-DE-CARVALHO & DE MELLO, 1982). O acúmulo de AMPc
induzido por adenosina é observado em retina intacta de embriões de galinha a
partir de E14 (PAES-DE-CARVALHO, 2002 para revisão). Dados não mostrados
neste trabalho mostraram que o agonista A2A (CGS 21680) não produziu efeito em
aumentar os níveis desse segundo mensageiro, comprovando a sua falta de
acoplamento na via da AC/AMPc/PKA. A funcionalidade de receptores A1 em retina
de embrião de galinha foi demonstrada em 1985 por PAES-DE-CARVALHO E DE
MELLO, através da inibição do acúmulo de AMPc induzido por dopamina, sendo
esta resposta detectada a partir de E10. No nosso modelo de tecido intacto estes
receptores também apresentam funcionalidade, o que foi demonstrado no
experimento de AMPc utilizando o agonista do receptor A1, CHA, que foi capaz de
reduzir a resposta da forscolina nos níveis de AMPc.
SANTOS e colaboradores (2000) descreveram o efeito do bloqueio de
receptores A1 por DPCPX em retina de galinha em cultura (E8C5) na liberação de
GABA por vesículas sinápticas. Ao contrário dos nossos resultados, o bloqueio
desses receptores não potencializou a liberação de GABA.
Receptores NMDA têm sua função e atividade regulada por diversos
mecanismos, dentre eles a fosforilação. Já foram descritos sítios de fosforilação em
57

todas as subunidades do NMDAR por diversas proteínas quinase (CHEN & ROCHE,
2007).
Fosforilação regula vários processos celulares, incluindo atividade,
localização e mobilidade protéica, além de ser um importante regulador de várias
interações entre proteínas. Sabe-se que a fosforilação direta de receptores
ionotrópicos de glutamato é um mecanismo-chave na regulação da função do canal
e da localização do receptor nas sinapses (LEE, 2006; CHEN & ROCHE, 2007) e
que a função de receptores NMDA pode ser regulada por proteínas tirosina quinase
(SALTER & KALIA, 2004; CHEUNG & GURD, 2001). Correntes do receptor NMDA
são potencializadas ou reduzidas pelo aumento ou diminuição da atividade dessas
proteínas, respectivamente (CHEN & ROCHE, 2007). O bloqueio de proteínas
tirosina quinase, com a Genisteína, preveniu o efeito da cafeína na liberação de
GABA. Além disso, as proteínas tirosina quinase src e Fyn são importantes
moduladores dos receptores NMDA (SALA & SHENG, 1999; SALTER & KALIA,
2004). Utilizando um inibidor específico da família src, observamos também uma
inibição do efeito da cafeína, o que sugere que a fosforilação em resíduos de tirosina
no receptor NMDA tem um papel importante na liberação de GABA mediada por
este receptor.
A subunidade NR2B do receptor NMDA é a principal proteína fosforilada em
tirosina na densidade pós-sináptca (MOON et al, 1994; CHEN & ROCHE, 2007) e
pode ser fosforilada por proteínas tirosina quinase. O inibidor específico da NR2B,
ifenprodil, preveniu o efeito da cafeína, o que indica que, possivelmente, a
fosforilação da subunidade NR2B por proteína tirosina quinase da família src esteja
envolvida na modulação da liberação de GABA pelo antagonismo de receptores A1.
Assim, podemos sugerir que a modulação da liberação de GABA pelo bloqueio de
58

eceptores de adenosina A1 envolve receptores de glutamato do tipo NMDA e sua
fosforilação.
Há várias explicações na literatura para a seletividade do ifenprodil pelo
receptor formado pelas subunidades NR1/2B. Uma delas é que o sítio de ligação do
ifenprodil pode estar localizado na subunidade NR2B e estar ausente ou possuir
baixa afinidade pelas outras subunidades. Outra possibilidade é que o sítio de
ligação do ifenprodil esteja localizado na subunidade NR1 e suas propriedades e/ou
mecanismos de transdução sejam influenciados por subunidades NR2, sendo
necessária a subunidade NR2B para a inibição de alta afinidade do receptor. A
terceira possibilidade é que o sítio de ligação do ifenprodil envolva ambas as
subunidades NR1 e NR2B. No entanto, o peso das informações e evidências
disponíveis sugere que o ifenprodil se ligue na subunidade NR2B. De forma
interessante, muitos resíduos do sítio de ligação proposto do ifenprodil em NR2B
são idênticos aos resíduos correspondentes no NR2A. Isso sugere que apenas um
ou dois resíduos-chave influenciam a seletividade do ifenprodil (WILLIAMS, 2009,
para revisão).
NR2B contém 3 sítios de fosforilação em tirosina (Y1252, Y1336 e Y1472)
(CHEN & ROCHE, 2007). Os sítios envolvidos no efeito da cafeína neste trabalho
ainda precisam ser elucidados. Além da fosforilação da NR2B por proteínas tirosina
quinase, ela também pode ser fosforilada por CaMKII, PKC e caseína quinase II
(CKII), que serão investigadas futuramente.
A subunidade NR2B medeia a sinalização por ERK induzida por receptores
NMDA em neurônios corticais de ratos, e dependendo do estágio do
desenvolvimento, essa sinalização pode ser positiva ou negativa (SAVA et al, 2008).
59

Além disso, há relatos de que a receptores NMDA que contêm a subunidade NR2B
medeiam o aumento na concentração intracelular de cálcio, que regula a tirosina
fosfatase, STEP, e a sinalização por ERK MAP quinase em neurônios striatais e
corticais de ratos (PAUL & CONNOR, 2010)
A principal via de transdução de sinal acoplada a receptores de adenosina é a
via AC/AMPc/PKA, porém já foi relatada a sinalização por receptores A1 acoplada a
outras vias, por exemplo, PKC (BIBER et al, 1997). Vimos que a via envolvida no
efeito da cafeína é a da AC. Visto que sua ativação pela forscolina produziu os
mesmo efeitos, em aumentar a liberação de GABA. Comprovando este resultado, a
presença do inibidor da PKA, H-89, preveniu o efeito da cafeína. Os níveis da
liberação de GABA com H-89 foram similares aos níveis basais com D-aspartato.
Sendo assim, é bem provável que algum alvo fosforilado pela PKA participe dessa
modulação. Nos receptores NMDA, a PKA pode fosforilar sítios de serina/treonina
nas subunidades NR1, NR2C e, talvez, NR2A (Chen & Roche, 2007).
A ativação de receptores NMDA tem sido implicada em várias formas de
plasticidade sináptica dependendo do subtipo do receptor envolvido. Segundo LI e
colaboradores (2011), a indução de LTD em neurônios piramidais da camada II/III do
córtex visual de ratos jovens é dependente de receptores NMDA que contenham a
subunidade NR2B (mas não NR2A).
Como perspectiva deste trabalho, pretendemos desenvolver estudos acerca
da fosforilação do receptor NMDA regulando a liberação de GABA, avaliando os
sítios de fosforilação e as subunidades do receptor NMDA envolvidos. Pretendemos
investigar a regulação da liberação de GABA por outros agentes purinérgicos e
possíveis interações entre vias de sinalização distintas, em diferentes fases do
60

desenvolvimento. Além disso, desejamos investigar, através de imunohistoquímica,
quais tipos celulares retinianos estão participando desta modulação, assim como a
co-localização entre os receptores A1 e NMDA nas células GABAérgicas retinianas.
61

VI CONCLUSÃO
Em retinas de galinha de E13, a liberação de 3 H-GABA induzida por D-Asp
ocorre pela reversão do transportador GAT-1, sendo completamente bloqueada
pelo antagonista do receptor NMDA.
Cafeína potencializa a liberação de 3 H-GABA estimulada por D-Asp em
retinas de E13.
A cafeína não modifica a captação de 3 H-GABA nem a liberação de AAE.
O efeito da cafeína na liberação de 3 H-GABA induzida por D-Asp não
envolve receptores A2A, mas receptores A1, que estão acoplados à adenilill
ciclase em retinas de E13.
A cafeína teve seu efeito mimetizado pela ativação da adenilill ciclase, e
prevenido com o bloqueio da PKA.
A inibição da fosforilação de resíduos de tirosina, da fosforilação por src e da
fosforilação da subunidade NR2B do receptor NMDA previnem o aumento da
liberação de 3 H-GABA por cafeína.
62

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