Eletroforese em gel de agarose ATUAL

Protocolos – Sandro R. Valentini
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
(analítica e preparativa)
PREPARO DO GEL DE AGAROSE (0,8%):
1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.
2. Adicionar 100mL de TAE 1X.
3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar (aproximadamente 1 min
e 10 seg na potência máxima – evitar fervura).
4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando
as laterais com fita crepe ou na própria cuba.
5. Acrescentar 4µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação
leve. Obs.: Brometo de Etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas.
6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas.
7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. Obs.: Verificar o número
e o volume das
amostras para escolher o pente mais adequado.
8. Esperar a solução solidificar.
9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese. Adicionar tampão TAE
1X até cobrir a
superfície do gel.
ANALÍTICA:
1. Extrair 3µL da amostra de DNA.
2. Homogeinizar com 1µL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer).
3. Aplicar as amostras nos poços.
4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb).
5. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média
utilizada 80V).
6. Analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager).
7. Tirar foto dos resultados obtidos.
PREPARATIVA:
1. Adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X).
2. Aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para
evitar contaminação. Para volumes maiores, montar o gel com o pente de

dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o
pente no gel ainda líquido (morno).
3. Aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb).
4. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média
utilizada 80V).
5. Vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no
comprimento de onda longo.
6. Cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocá-la em um tubo de
microcentrífuga
previamente pesado.
7. Seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel.
SOLUÇÕES:
• Tampão de corrida: solução TAE 1X ( Tampão Tris-Acetate - Tris
40mM, Ac. Acetico 20mM,EDTA 1mM)
diluir a solução estoque 50x em água Milli-Q.
• TAE 50X
(Solução estoque) p/ 1L
Trizma-Base 242,0g
Ácido acético glacial 57,1mL
EDTA 0.5M pH 8.0 100,0mL
água q.s.p. 1000,0mL
• Tampão de amostra 5X
( Loading Buffer ) p/ 50mL
Glicerol (50%) 25,0mL
Azul de Bromofenol (0.125%) 0,0625g
Xileno Cianol (0.125%) 0,0625g
TE pH8,0 q.s.p. 50,0mL
• Padrão de tamanho molecular
( Ladder-1kb) (0,1µg/µL)
Protocolos – Sandro R. Valentini

Ladder 1kb (Gibco BRL - 1µg/µL) 100µL
Tampão (Tris 10mM pH7,5,
NaCl 50mM, EDTA 0,1mM) 500µL
Loading Buffer 5X 400µL
• Brometo de etídeo (10mg/mL)
Brometo de etídeo 1g
Água Milli-Q q.s.p. 100mL
Agitar durante 16 horas, guardar a 4°C.
obs.: concentração no gel: 5µg/mL
Protocolos – Sandro R. Valentini