caracterização gênica de ovinos nativos, da raça santa inês, para o ...

CARACTERIZAÇÃO GÊNICA DE OVINOS
NATIVOS, DA RAÇA SANTA INÊS, PARA O
GENE DA BMP15
Suzana Santino Nunes da Rocha 1 , Diogo Manoel Farias da Silva 1 , Carlos Adriano de Santana Leal 1 , Miguel Nunes da
Rocha Neto 2 , Ana Elysa Travassos Oliveira 3 , Manoel Adrião 4 , Áurea Wischral 5
Introdução
Os pequenos ruminantes ingressaram no Brasil
com os colonizadores e, ao longo dos anos, sofreram
um processo de seleção natural, adaptando-se às
condições adversas do meio [1].
Entre eles, várias raças Ibéricas de ovinos que, ao
longo desses cinco séculos, ficaram sob a ação de
seleção natural em determinados ambientes, adquirindo
características únicas como rusticidade, prolificidade
[2].
De acordo com o IBGE [3], o país possuía, em 2006,
um rebanho de 13.856.747 cabeças de ovinos,
demonstrando um aumento de 5,43% entre os anos
2000 e 2006.
Embora exista o reconhecimento do valor sócioeconômico
da ovinocultura para o Nordeste brasileiro,
a maior parte dos animais criados nesta região
apresenta baixos índices de desempenho reprodutivo e
produtivo [4]. A grande competição comercial
impulsiona a incessante busca de conhecimentos
tecnológicos direcionados para o aumento da
produtividade desses rebanhos. Tal exigência coloca os
aspectos reprodutivos em lugar de destaque, e a
prolificidade passa a ser um dos fatores de grande
importância nos programas de melhoramento e seleção
de animais nessa cultura [5].
Nesse contexto, o melhoramento genético animal
constitui-se como uma das ferramentas mais eficientes,
capaz de modificar os genótipos existentes e melhorar a
produtividade de um setor. A genética quantitativa e a
molecular são alicerces para o melhoramento dos
animais domésticos [6].
A existência de algumas linhagens de ovinos com
alta prolificidade, as quais apresentam mutações em
genes específicos, levanta o questionamento de que
outras raças específicas, como a Santa Inês, possam
apresentar uma proximidade genética até então
desconhecida. Essa constatação poderá criar a possibilidade
de identificação de linhagens brasileiras
portadoras dessas características, o que abre novos
caminhos para a pesquisa e a utilização efetiva deste
conhecimento poderá colocar a ovinocultura brasileira, de
forma competitiva, nesse emergente segmento da
economia.
O gene Inverdale
Nas ovelhas Inverdale, a prolificidade é resultante de
uma mutação no gene da proteína morfogenética do osso
15 (BMP-15), que está localizado no cromosoma X [7]. A
linhagem Inverdale, prolífica, foi gerada a partir de uma
família de ovinos da raça Romney. Essa linhagem
descendeu de uma ovelha com histórico de 33 crias em 11
partos [8]. Posteriormente, estudos de segregação em filhos
e netos dos carreadores desse gene demonstraram que o
lócus foi carreado no cromossoma X, denominado de lócus
da fecundidade Inverdale (FecX I ) [8, 9].
A mutação FecX I (Q239Ter) no gene BMP-15 foi
associada com um aumento na taxa de ovulação como
também à esterilidade em ovelhas Cambridge e Belclare
[10], dependendo de estar em hetero ou homozigose.
O gene Galway
A mutação FecX G (Galway - Q239Ter) também se
encontra no gene da BMP-15 e é caracterizada por uma
troca de nucleotídeos que resulta na inserção de ponto de
parada prematura na transcrição da proteína e que, em
heterozigose, foi associada com um aumento na taxa de
ovulação em ovelhas Cambridge e Belclare [10].. Este
aumento da taxa ovulatória pode ser devido à reduzida ação
da BMP-15 como inibidora do FSH e consequente maior
número de folículos produzindo estrógeno, com receptores
para LH [11].
________________
1. Graduando em Medicina Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária (DMV), Universidade Federal Rural de Pernambuco. R. Dom
Manoel de Medeiros, s/n, DMV , Recife, PE, CEP 52171-900. suzana_nunes737@hotmail.com
2. Graduando em Medicina Veterinária, Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco.
3. Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco.
4.Professor Adjunto do Departamento Morfologia e Fisiologia Animal (DMFA), Universidade Federal Rural de Pernambuco.
5. Professora Associada do Departamento Medicina Veterinária (DMV), Universidade Federal Rural de Pernambuco.

Este estudo foi realizado com o objetivo de
identificar mutações do tipo Inverdale ou Galway no
gene da BMP15 em ovelhas prolíficas da raça Santa
Inês.
Material e métodos
Foram colhidas amostras de sangue, de 102 ovinos
Santa Inês, em diferentes propriedades do estado de
Pernambuco. As amostras foram separadas em grupos
de acordo com o número de produtos (1,2 ou 3) por
parto, para cada animal.
Após a colheita das amostras de sangue, o DNA foi
extraído segundo o método de Fenol:clorofórmio de
acordo com a técnica descrita por MANIATIS et al
[12] (1989) com modificações.
O DNA extraído foi analisado em gel de agarose
(Invitrogen Life Technologies) a 1,0% corado com
Blue Green Loading Dye (LGC Biotecnologia), para
análise em luz ultravioleta e fotografado (Olympus –
Digital Câmara – C-7070 Wide).
Para visualizar a mutação no rebanho ovino, foi
empregada a metodologia no qual o produto da Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) conterá um ponto de
restrição para a enzima XbaI e outro para HinfI.
Para amplificar a região da mutação Inverdale foram
utilizados os primers F-5’-
GAAGTAACCAGTGTTCCCTCCACCCTTTTCT e
R- 5’ –CATGATTGGGAGAATTGAGACC. Para a
mutação Galway os primers foram ( 5’-
CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC
– 3’), 1 µL de primer Reverse ( 5’ -
GATGCAATACTGCCTGCTTG-3’).
As amplificações foram feitas em termociclador
(Eppendorf Mastercycler Personal). Os produtos de
amplificação foram analisados por eletroforese em gel
de agarose a 2%, corado com Blue Green Loading Dye
(LGC Biotecnologia) 0,25 µL, visualizados em
transluminador de ultravioleta (DNA Ladder,
Invitrogen Life Technologies) e fotodocumentados.
No PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction -
Restriction Fragment Lenght Polymorfism), a reação de
corte do DNA com a enzima de restrição XbaI e Hinf I
foram realizadas para um volume final de 15 L cada.
Após a digestão enzimática, o DNA digerido foi
analisado em gel de poliacrilamida 8% [13] (CHU et.
al, 2007) com marcador de peso molecular DNA-
Ladder FERMENTAS-Life Sciences 50 bp e 10bp
respectivamente, corado com Blue Green Loading Dye
(LGC Biotecnologia) 0,25 µL, visualizado em luz
ultravioleta e fotografado, para verificação dos alelos e
armazenamento de dados.
Resultados e Discussão
Inverdale
O protocolo de PCR realizado de acordo com [14]
Davis et al. (2006), amplificou o DNA apresentando
bandas de 154pb, sem necessidade de adequação deste.
Os produtos do RFLP que contém a mutação Inverdale
apresentam os fragmentos 124pb e 30pb, porém o produto
que não contém a mutação apresenta 154pb. No caso das
amostras estudadas todas apresentaram uma só banda de
154pb (Fig. 1). Portanto considera-se que a prolificidade
observada nestes animais não seja devida a este fator.
Galway
Adequação do Método:
Os protocolos de PCR realizados de acordo com [13]
Chu et al. (2007), apesar de amplificar o DNA
apresentando bandas de 141pb, resultaram em
amplificações inespecíficas. Portanto a metodologia
precisou ser modificada realizando vários testes, onde
foram alteradas as concentrações de Mg e dos DNTPs,
como apresentado a seguir:
Protocolos:
- Protocolo 1: 2,5 µL MgCl2, e 1,0 µL DNTP
- Protocolo 2: 2,5 µL MgCl2 e 1,5 µL DNTP
- Protocolo 3: 2,5 µL MgCl2 e 2,0 µL DNTP
- Protocolo 4: 2,5 µL MgCl2 e 3,0 µL DNTP
- Protocolo 5: 3,0 µL MgCl2 e 3,5 µL DNTP
- Protocolo 6: 3,0 µL MgCl2 e 4,0 µL DNTP
Após a tentativa da adequação dos protocolos para a
PCR, o protocolo 6 foi escolhido por mostrar o melhor
resultado, sem apresentar bandas inespecíficas, para a
amplificação do DNA e portanto foi utilizado para o total
das amostras que posteriormente fora, submetidas ao RFLP
(Fig. 2 e 3).
Os produtos que contém a mutação Galway apresentam
os fragmentos 111pb e 30pb, porém os produtos que não
contêm a mutação apresentam 141pb, que foram os
resultados obtidos nos animais deste estudo (Fig. 4).
Considerando que os animais deste estudo não
apresentaram evidências de mutações Inverdale ou Galway,
pela metodologia empregada, concluiu-se que a
prolificidade nestes casos se deva a outros fatores não
relacionados, que devem ser estudados com maior
profundidade na raça Santa Inês.
A detecção de mutações gênicas, relacionadas com a
prolificidade, em ovinos, poderá ser uma alternativa
adicionada aos programas de melhoramento genético,
aumentando a produtividade dos mesmos, e possibilitando
a investigação de fatores envolvidos na dinâmica folicular
dessa espécie.
Apesar das amostras serem provenientes de animais
bastante prolíferos no presente trabalho não foram
identificadas mutações no BMP-15 (Inverdale e Galway)
nos ovinos da raça Santa Inês, evidenciando a necessidade
do aprofundamento de estudo da prolificidade dessa raça.
Apesar de existirem muitas lacunas a serem investigadas,
experimentos nessa área já são realidade. Portanto são de
grande importância pesquisas nessa área no Brasil.
Agradecimentos
Agradeço a Professora Áurea Wischral, pela
disponibilidade, orientação e paciência, e também a todos
que ajudaram na elaboração desse trabalho.

Referências
[1] SILVA, F.L.R. et al. Parâmetros de conforto genéticos e
fenotípicos para pesos de caprinos nativos e exóticos criados no
Nordeste do Brasil, na fase de crescimento. Revista da Sociedade
Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v.22, n.2. p. 350-359. 1993.
[2] ALBUQUERQUE, H.C.C.C.; caracterização morfológicas de
ovinos no Brasil, Uruguai e Colômbia, Dissertação de mestrado,
Brasília, 2008. Disponível em:
http://bdtd.bce.unb.br/tedesimplificado/tde_arquivos/41/TDE-2008-
07-10T171317Z-
2856/Publico/2008_HelenaCristinaCCDeAlbuquerque.pdf
[3] IBGE, 2006. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística,
Censo agropecuário, Rio de Janeiro, p.1-146, 200
[4] BNB Relatório Social Banco do Nordeste do Brasil In: I
WORKSOHP SOBRE CAPRINOS E OVINOS TROPICAIS. BNB,
Fortaleza, p. 20-23, 1998.
[5] MCNATTY, K.P.; JUENGEL, J.L.; WILSON, T. et al. Genetic
mutations influencing ovulation rate in sheep. Reproduction,
Fertility and Development, Melbourne, v. 13, n.7-8, p. 549-55,
2001.
[6] LÔBO, A.M.B.O.; estudo genético de características de
importância econômica em uma população multirracial em ovinos de
corte: uma bordagem quantitativa e molecular, Dissertação de
mestrado, Fortaleza, fevereiro de 2008.
Disponível em:
http://www.zootecnia.ufc.br/dissertacoes/dissertacao2008_ana%20m
aria%20bezerra%20oliveira%20lobo.pdf
[7] GALLOWAY, S. M.; MCNATTY, K. P.; CAMBRIDGE, L.
M.; et al. Mutations in an oocyte-derived growth factor gene
(BMP15) cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-
sensitive manner. Nature Genetics, New York, v.25, n.3, p.279-283,
2000.
[8] DAVIS, G.H.; McEWAN, J.C.; FENNESSY, P.F. et al. Discovery
of the Inverdale gene (FecX).Proceedings of the New Zealand Society of
Animal Production. Mosgiel, v. 55, p. 289–290,1995.
[9] DAVIS, G.H.; McEWAN, J.C.; FENNESSY, P. F. et al. Evidence
for the presence of a major gene influencing ovulation rate on the Xchromosome
of sheep. Biology of Reproduction, Champaign, v.44, n.4,
p.620-624, 1991.
[10] HANRAHAN, J. P.; GREGAN, S. M.; MULSANT, P. et al.
Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and
GDF15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in
Cambridge and Belclare sheep (Ovis Aires). Biology of Reproduction,
Champaign, v.70, n.4, p.900-909, 2004.
[11] OTSUKA, F. S.; YAMAMOTO, G. F.; ERICKSON, S. et al. Bone
morphogenetic protein-15 inhibits follicle-stimulating hormone (FSH)
action by suppressing FSH receptor expression. Journal of Biological
Chemisty, Bethesda. v.276, n.14, p.11387-11392, 2001.
[12] MANIATIS, T.; FRITSCH, E. F.; SAMBROOK, J. (Eds). Molecular
cloning: a loboratory manual. New York: Cold Spring Harbot Laboratory
Press, 1989. 3v.
[13] CHU, M.X., LIU, Z.H.; JIAO, C.L. et al. Mutations in BMPR-IB
and BMP-15 genes are associated with litter size in Small Tailed Han
sheep (Ovis aries). Journal of Animal Science, Champaign, v. 85, p.
598-603, 2007.
[14] DAVIS, G.H.; BALAKRISHNAN, L; ROSS, I.K. et. al.
Investigation of the Booroola (FecB) and Inverdale (FecX I ) mutations in
21 prolific breeds and strains of sheep sample in 13 coutries. Animal
Reproduction Science, v 92, p 87-96, 2006.

A
B
154pb
154pb
Fig. 1 - A – Resultado de PCR com amplificação de 154pb, em gel de agarose 3,5%. Marcador de 50pb. B – Resultado
de PCR-RFLP com bandas de 154pb, em gel de poliacrilamida 8%. Marcador de 10pb.
Protocolo1 Protocolo2 M Protocolo3 Protocolo4
Fig. 2 – Resultados de PCR utilizando os protocolos 1, 2, 3 e 4, avaliados em gel de agarose 3,5%. Marcador de 50pb.
Protocolo 5 M Protocolo 6
141pb
Fig. 3 - Resultados de PCR utilizando os protocolos 5 e 6, avaliados em gel de agarose 3,5%. Marcador de 50pb
Amostras
141pb
141pb
Fig. 4 – Resultado de PCR-RFLP com bandas de 141 pb em gel de poliacrilamida 8% com marcador de 50pb.