Hibridação de ácidos nucleicos

Hibridação de ácidos nucleicos
Hibridação de ácidos nucleicos
DNA de vírus da Peste suína africana

Tópicos
• Origem e características das sondas de hibridação
• Métodos de marcação de DNA
• Sondas de RNA
• Sondas homólogas, heterólogas e degeneradas
• Marcação não isotópica de DNA
• Sistema de detecção de hibridação baseado na afinidade biotinaestreptavidina
• Temperatura de desnaturação/temperatura de hibridação
• Tipos de sondas e condições de hibridação
• Hibridação ASO

Origem e características das sondas de hibridação

Marcação de DNA por nick-translation
Digestão parcial
Mg ++
α- 32 P dCTP

Marcação de DNA por primers aleatórios
α- 32 P dCTP

Marcação de extremidades 5’ do DNA
A marcação é fornecida na forma de 32 P na posição γ-fosfato do ATP( [γ- 32 P]ATP).
A cinase de polinucleótido catalisa uma reacção de troca com os fosfatos 5’
terminais.

Marcação de extremidades 3’ do DNA
Preenchimento de extremidades 3’ recuadas
α- 32 P dATP

Sondas de RNA (ribossondas)
As sondas de RNA são produzidas por transcrição run-off de insertos clonados em vectores
apropriados e terão de ter o sentido inverso ao da transcrição do transcrito em estudo.

Sondas degeneradas
Sondas homólogas; sondas heterólogas

Estrutura de fluoróforos utilizados na marcação directa não isotópica
O grupo de fluoresceína do dUTP-fuoresceína está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina por um
grupo espaçador, de modo que quando o nucleótido modificado é incorporado no DNA o grupo
fluoresceína fica acessível, facilitando a sua detecção.
A coumarina amino metil é
um corante fluorescente azul.
A fluoresceína é um corante
fluorescente verde claro.
A rodamina é um
corante fluorescente
vermelho.
Um fluoróforo é um grupo químico que fluoresce quando exposto a luz de um determinado
comprimento de onda.

Princípios gerais da marcação indirecta não isotópica

Estrutura de um nucleótido modificado com digoxigenina
Os grupos digoxigenina e biotina são grupos repórter: após
incorporação no ácido nucleico são ligados por ligandos específicos
acoplados a um marcador. Os marcadores podem ser fluoróforos ou
enzimas, tais como a fosfatase alcalina e a peroxidase.
O grupo digoxigenina está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina do
dUTP por um grupo espaçador de 11 átomos de carbono.
No sistema digoxigenina, a molécula de afinidade é um anticorpo
anti-digoxigenina.
A digoxidenina é um esteróide natural obtido a partir de Digitalis.

Estrutura de um nucleótido modificado com biotina
O grupo biotina está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina do dUTP
por um grupo espaçador de 16 átomos de carbono.
No sistema biotina-estreptavidina, a molécula de afinidade é a
estreptavidina.
A biotina é uma vitamina natural e a estreptavidina é uma proteína bacteriana.

Sistema de detecção de hibridação baseado na afinidade biotinaestreptavidina

Temperatura de desnaturação (Tm)
As bases dos ácidos nucleicos absorvem fortemente luz ultravioleta a 260 nm.
A absorção pelo DNA de cadeia dupla é consideravelmente menor do que pelos nucleótidos livres.
OD SS e OD DS indicam a
densidade óptica de DNA de
cadeia simples e de cadeia
dupla, respectivamente.
A Tm é uma medida útil da
estabilidade de um ácido nucleico de
cadeia dupla.
Corresponde ao ponto médio na
transição de densidade óptica da forma
de cadeia dupla para a forma de cadeia
simples.
As condições de hibridação são escolhidas de modo a promover a formação de heterodúplices,
sendo a temperatura de hibridação (65 a 68 0 C), em geral 25 0 C abaixo da Tm.

Tipos de sondas e condições de hibridação
> 100 nts.
15-20 nts.

ASO - Oligonucleótido alelo-específico
Hibridação ASO