Doseamento do Tiocianato no plasma e na urina - Planeta Optimus ...
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TIOCIANATO<br />
Trabalho n.º 6<br />
<strong>Doseamento</strong> <strong>do</strong> <strong>Tiocia<strong>na</strong>to</strong> <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> e <strong>na</strong> uri<strong>na</strong><br />
CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO DE EXPOSIÇÃO AO TABACO<br />
É <strong>no</strong>rmalmente aceite que os riscos para a saúde associa<strong>do</strong>s ao tabaco,<br />
aumentam com o número de cigarros fuma<strong>do</strong>s por dia. A avaliação da<br />
exposição ao tabaco através da utilização de questionários, pressupõe que o<br />
consumo diário de cigarros seja um índice de exposição adequa<strong>do</strong>, em relação<br />
aos agentes tóxicos constituintes <strong>do</strong> fumo <strong>do</strong> tabaco. No entanto em estu<strong>do</strong>s<br />
efectua<strong>do</strong>s, verificou-se existirem indivíduos que fumam poucos cigarros por<br />
dia mas apresentam elevadas concentrações de monóxi<strong>do</strong> de carbo<strong>no</strong> <strong>no</strong><br />
sangue e tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong> <strong>plasma</strong>, e outros, que fumam mais <strong>do</strong> que um maço de<br />
cigarros por dia e obtêm baixos valores para os mesmos parâmetros. Podemos<br />
assim observar que o número de cigarros consumi<strong>do</strong>s é <strong>no</strong>rmalmente uma<br />
medida pouco correcta da <strong>do</strong>se. Isto sucede porque indivíduos que fumam o<br />
mesmo número de cigarros por dia não absorvem a mesma quantidade de<br />
fumo e portanto não estão expostos ao mesmo risco. A quantidade de fumo<br />
absorvida não é a mesma porque a absorção <strong>do</strong> fumo depende de vários<br />
factores, como: comprimento <strong>do</strong> cigarro, existência ou não de filtro, tipo de filtro<br />
(quan<strong>do</strong> existe), profundidade da i<strong>na</strong>lação, velocidade com que o cigarro é<br />
fuma<strong>do</strong>, mo<strong>do</strong> como cada individuo é capaz de metabolizar diferentes<br />
constituintes <strong>do</strong> fumo, idade <strong>do</strong> indivíduo e factores ambientais e nutricio<strong>na</strong>is.<br />
Apesar das razões mencio<strong>na</strong>das, o número de cigarros fuma<strong>do</strong>s por dia é um<br />
factor a considerar <strong>na</strong> indicação <strong>do</strong> risco potencial a que um fuma<strong>do</strong>r está<br />
exposto, mas são <strong>na</strong> realidade os testes biológicos que mostram quais os<br />
fuma<strong>do</strong>res que estão mais expostos ao fumo <strong>do</strong> tabaco devi<strong>do</strong> a uma maior<br />
absorção <strong>do</strong> mesmo, e, por conseguinte, colocam a sua saúde em maior<br />
perigo. Reconhece-se portanto, a necessidade de utilizar testes biológicos para
avaliar o grau de exposição de cada indivíduo aos diferentes constituintes <strong>do</strong><br />
fumo <strong>do</strong> tabaco.<br />
Indica<strong>do</strong>res biológicos de exposição ao tabaco<br />
Para podermos avaliar os níveis <strong>do</strong>s diferentes constituintes <strong>do</strong> fumo <strong>do</strong> tabaco<br />
que são absorvi<strong>do</strong>s pelo organismo, podem ser executadas vários tipos de<br />
análises <strong>no</strong>s flui<strong>do</strong>s biológicos. As amostras biológicas <strong>no</strong>rmalmente utilizadas<br />
para fazer estas análises são: o sangue total, o <strong>plasma</strong>, a uri<strong>na</strong>, a saliva e o ar<br />
expira<strong>do</strong>. É nestas amostras biológicas que podemos <strong>do</strong>sear determi<strong>na</strong>das<br />
substâncias tóxicas constituintes <strong>do</strong> fumo <strong>do</strong> tabaco, ou metabolitos delas<br />
deriva<strong>do</strong>s.<br />
De entre estas substâncias tóxicas referimos o CO que pode ser determi<strong>na</strong><strong>do</strong><br />
<strong>no</strong> ar expira<strong>do</strong> ou <strong>no</strong> sangue, o tiocia<strong>na</strong>to cuja concentração pode ser<br />
determi<strong>na</strong>da <strong>no</strong> <strong>plasma</strong>, uri<strong>na</strong> ou saliva, a nicoti<strong>na</strong> <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> ou uri<strong>na</strong>, e a<br />
cotini<strong>na</strong>, um metabolito da nicoti<strong>na</strong>, <strong>no</strong> <strong>plasma</strong>.<br />
Relativamente ao CO, verifica-se que o seu nível <strong>no</strong> sangue de fuma<strong>do</strong>res são<br />
mais eleva<strong>do</strong>s <strong>do</strong> que em não-fuma<strong>do</strong>res. Isto acontece, pois o CO é um <strong>do</strong>s<br />
constituintes <strong>do</strong> fumo <strong>do</strong> tabaco que é absorvi<strong>do</strong> através das vias respiratórias<br />
e penetra <strong>no</strong> sangue onde se vai ligar à hemoglobi<strong>na</strong> <strong>do</strong>s glóbulos vermelhos.<br />
Verificou-se haver um aumento progressivo de carboxihemoglobi<strong>na</strong> <strong>no</strong> sangue<br />
relacio<strong>na</strong><strong>do</strong> com o aumento <strong>do</strong> consumo de cigarros. O nível médio de<br />
carboxihemoglobi<strong>na</strong> <strong>no</strong> sangue de fuma<strong>do</strong>res é cerca de 4-5%, chegan<strong>do</strong> a<br />
atingir picos de 15%. Estes níveis em não-fuma<strong>do</strong>res que vivem <strong>na</strong> cidade vão<br />
de 0,5% até ao máximo de 2%, varian<strong>do</strong> portanto com as condições ambientais<br />
em que os indivíduos estão inseri<strong>do</strong>s. A semi-vida <strong>do</strong> monóxi<strong>do</strong> de carbo<strong>no</strong> é<br />
de 4 h. Assim, a sua concentração <strong>no</strong> sangue permanece elevada durante um<br />
espaço de tempo relativamente curto depois de se fumar um cigarro.<br />
Também relativamente ao tiocia<strong>na</strong>to se verificou serem os níveis deste <strong>no</strong><br />
<strong>plasma</strong>, uri<strong>na</strong> e saliva, mais eleva<strong>do</strong>s em fuma<strong>do</strong>res que em não-fuma<strong>do</strong>res. A<br />
semi-vida <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> é de 14 dias. Esta determi<strong>na</strong>ção se for<br />
comparada à da carboxihemoglobi<strong>na</strong> é mais conveniente para identificar um<br />
fuma<strong>do</strong>r que tenha esta<strong>do</strong> largas horas sem fumar. Alguns autores afirmaram
que para avaliar a exposição de um indivíduo ao fumo <strong>do</strong> tabaco, essa<br />
avaliação era mais correcta sempre que eram feitas juntamente <strong>no</strong> mesmo<br />
indivíduo a determi<strong>na</strong>ção da carboxihemoglobi<strong>na</strong> <strong>no</strong> sangue e a <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to<br />
<strong>no</strong> <strong>plasma</strong>. No entanto, o aumento <strong>do</strong>s níveis destes <strong>do</strong>is parâmetros <strong>no</strong>s<br />
flui<strong>do</strong>s biológicos, carboxihemoglobi<strong>na</strong> e tiocia<strong>na</strong>to, não é específico de<br />
indivíduos fuma<strong>do</strong>res, há pois outros factores para além <strong>do</strong> fumo <strong>do</strong> tabaco,<br />
que vão afectar os níveis destes <strong>do</strong>is parâmetros. O monóxi<strong>do</strong> de carbo<strong>no</strong>,<br />
aparece aumenta<strong>do</strong> <strong>no</strong> sangue sempre que se esteja em presença de uma<br />
combustão incompleta. É o que sucede por exemplo <strong>na</strong>s próprias habitações<br />
quan<strong>do</strong> existem aquece<strong>do</strong>res ou esquenta<strong>do</strong>res a gás, e <strong>na</strong>s ruas de grande<br />
tráfego, devi<strong>do</strong> ao monóxi<strong>do</strong> de carbo<strong>no</strong> liberta<strong>do</strong>, conjuntamente com os<br />
gases de escape <strong>do</strong>s veículos automóveis. Se excluirmos o tabaco, os factores<br />
que podem aumentar os níveis de tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong> organismo são, para além <strong>do</strong><br />
tipo de alimentação <strong>do</strong> indivíduo, a exposição industrial a cianetos e ao<br />
acrilonitrilo.<br />
Há ainda outros <strong>do</strong>is parâmetros que estão relacio<strong>na</strong><strong>do</strong>s com o consumo de<br />
tabaco e que são susceptíveis de serem a<strong>na</strong>lisa<strong>do</strong>s <strong>no</strong>s flui<strong>do</strong>s biológicos.<br />
Trata-se da nicoti<strong>na</strong> e de um seu metabolito, a cotini<strong>na</strong>. A nicoti<strong>na</strong>, alcalóide<br />
constituinte <strong>do</strong> tabaco, pode ser encontrada <strong>na</strong> uri<strong>na</strong> e sangue de fuma<strong>do</strong>res, e<br />
de não-fuma<strong>do</strong>res <strong>no</strong> caso de estes frequentarem ambientes em que se fuma.<br />
A nicoti<strong>na</strong> depois de absorvida é metabolizada <strong>no</strong> organismo dan<strong>do</strong> origem a<br />
vários metabolitos, sen<strong>do</strong> a cotini<strong>na</strong> o principal. Só cerca de 10% da <strong>do</strong>se<br />
absorvida de nicoti<strong>na</strong> é excretada sem sofrer metabolização. A restante<br />
nicoti<strong>na</strong> é rapidamente metabolizada, ten<strong>do</strong> uma semi-vida plasmática de<br />
me<strong>no</strong>s de 30 minutos. Uma vez que a velocidade de biotransformação da<br />
nicoti<strong>na</strong> é tão rápida, a determi<strong>na</strong>ção de um metabolito com uma semi-vida<br />
mais longa, tal como acontece com a cotini<strong>na</strong>, poderia ser mais vantajosa em<br />
estu<strong>do</strong>s epidemiológicos <strong>do</strong> que a própria nicoti<strong>na</strong>. Foi então desenvolvida uma<br />
técnica de radioimu<strong>no</strong>ensaio para a nicoti<strong>na</strong> e também para a cotini<strong>na</strong>,<br />
permitin<strong>do</strong> a análise destes parâmetros em extractos de teci<strong>do</strong>s e flui<strong>do</strong>s <strong>do</strong><br />
organismo até níveis da ordem das picomoles. Em ensaios de roti<strong>na</strong>, a nicoti<strong>na</strong><br />
pode ser determi<strong>na</strong>da por espectrofotometria <strong>no</strong> ultra-violeta. A nicoti<strong>na</strong> e a<br />
cotini<strong>na</strong> também podem ser determi<strong>na</strong>das por cromatografia gasosa utilizan<strong>do</strong><br />
diversos tipos de detectores.
Ião tiocia<strong>na</strong>to – indica<strong>do</strong>r biológico de exposição ao tabaco<br />
O ião tiocia<strong>na</strong>to é um constituinte <strong>no</strong>rmal <strong>do</strong>s teci<strong>do</strong>s e flui<strong>do</strong>s <strong>do</strong>s mamíferos.<br />
Os níveis de tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong> organismo podem variar dependen<strong>do</strong> da quantidade<br />
<strong>do</strong> ião e seus ésteres existentes <strong>na</strong> dieta, e de outros compostos precursores<br />
tais como cianetos, nitrilos e isotiocia<strong>na</strong>tos. Como exemplo de alimentos que<br />
vão origi<strong>na</strong>r um aumento <strong>no</strong>s níveis de tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong> organismo temos, <strong>na</strong>bo,<br />
rába<strong>no</strong>, alho, couve e amên<strong>do</strong>as, entre outros. É por esta razão que os<br />
indivíduos vegetaria<strong>no</strong>s apresentam níveis de tiocia<strong>na</strong>to ligeiramente<br />
superiores aos não-vegetaria<strong>no</strong>s, sen<strong>do</strong> <strong>no</strong> entanto este aumento inferior ao<br />
observa<strong>do</strong> em fuma<strong>do</strong>res.<br />
Nos indivíduos fuma<strong>do</strong>res, a concentração de tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong>s flui<strong>do</strong>s biológicos<br />
está mais elevada como consequência da existência de peque<strong>na</strong>s quantidades<br />
de cianeto de hidrogénio <strong>no</strong> fumo <strong>do</strong> tabaco.<br />
Depois de absorvi<strong>do</strong> pelo organismo, o cianeto vai sofrer uma<br />
biotransformação: cerca de 80% da <strong>do</strong>se absorvida vai ser destoxificada<br />
através da conversão a tiocia<strong>na</strong>to, por intermédio da roda<strong>na</strong>se, uma enzima<br />
existente <strong>no</strong> fíga<strong>do</strong>.<br />
Visto o tiocia<strong>na</strong>to ter me<strong>no</strong>s de 1% da toxicidade <strong>do</strong> cianeto, a reacção<br />
catalisada pela roda<strong>na</strong>se, pode ser considerada uma verdadeira reacção de<br />
destoxificação. O tiocia<strong>na</strong>to é por fim excreta<strong>do</strong> pela uri<strong>na</strong>. O restante cianeto<br />
segue outras vias me<strong>no</strong>res, incluin<strong>do</strong> excreção pulmo<strong>na</strong>r <strong>do</strong> próprio cianeto de<br />
hidrogénio. A semi-vida <strong>do</strong> cianeto de hidrogénio é de 44-66 horas.<br />
Méto<strong>do</strong>s de <strong>do</strong>seamento <strong>do</strong> ião tiocia<strong>na</strong>to em flui<strong>do</strong>s<br />
biológicos<br />
Há diversos méto<strong>do</strong>s que <strong>do</strong>seiam o ião tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong>s flui<strong>do</strong>s biológicos. Os<br />
méto<strong>do</strong>s colorimétricos usa<strong>do</strong>s para a determi<strong>na</strong>ção <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to baseiam-se<br />
em <strong>do</strong>is princípios diferentes: <strong>no</strong> “MÉTODO DE ALDRIDGE”, cianeto e<br />
tiocia<strong>na</strong>to são converti<strong>do</strong>s em brometo de cia<strong>no</strong>génio pela adição de água de
omo, obten<strong>do</strong>-se depois um complexo cora<strong>do</strong> entre o brometo de cia<strong>no</strong>génio<br />
e uma mistura de cloreto de piridi<strong>na</strong>-benzidi<strong>na</strong>.<br />
No “MÉTODO DE BOWLER”, o tiocia<strong>na</strong>to em filtra<strong>do</strong>s de soro desproteiniza<strong>do</strong>,<br />
reage com o nitrato férrico dan<strong>do</strong> origem ao tiocia<strong>na</strong>to férrico, que tem elevada<br />
absortividade. No “ MÉTODO DE WILLIAM BUTTS”é desenvolvida <strong>no</strong><br />
Autoa<strong>na</strong>lyer uma técnica baseada numa adaptação e melhoramento da<br />
reacção <strong>do</strong> nitrato férrico com o tiocia<strong>na</strong>to. No “MÉTODO DE BRABANDER E<br />
VERBEKE” faz-se a determi<strong>na</strong>ção <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to em teci<strong>do</strong>s e flui<strong>do</strong>s biológicos<br />
de animais por cromatografia gasosa. No “MÉTODO DE LUNDQUIST” faz-se o<br />
<strong>do</strong>seamento <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to em flui<strong>do</strong>s biológicos, basea<strong>do</strong> <strong>na</strong> grande afinidade<br />
<strong>do</strong> ião tiocia<strong>na</strong>to para uma resi<strong>na</strong> aniónica francamente básica (Lewatit MP<br />
7080). É através da resi<strong>na</strong> que o tiocia<strong>na</strong>to é separa<strong>do</strong> <strong>do</strong>s outros constituintes<br />
da amostra biológica e <strong>do</strong>sea<strong>do</strong> por intermédio de uma <strong>no</strong>va modificação à<br />
reacção de König, em que o hipoclorito de sódio é usa<strong>do</strong> como haloge<strong>na</strong>nte e o<br />
áci<strong>do</strong> barbitúrico como agente ligante. Este méto<strong>do</strong> não é específico <strong>do</strong><br />
tiocia<strong>na</strong>to pois o cianeto e alguns antibióticos interferem. No entanto, se<br />
pretendermos a elimi<strong>na</strong>ção destes interferentes podem ser incluí<strong>do</strong>s alguns<br />
passos adicio<strong>na</strong>is, passos estes que não são <strong>no</strong>rmalmente utiliza<strong>do</strong>s em<br />
análises de roti<strong>na</strong> porque a concentração de cianeto <strong>no</strong> soro e uri<strong>na</strong> é tão baixa<br />
que não justifica (Tabela seguinte). Uma vantagem desta técnica é que o soro<br />
não precisa de ser desproteiniza<strong>do</strong>.<br />
Cianeto<br />
(µg/mL)<br />
NÃO FUMADORES FUMADORES<br />
<strong>Tiocia<strong>na</strong>to</strong><br />
(µg/mL)<br />
Cianeto<br />
(µg/mL)<br />
<strong>Tiocia<strong>na</strong>to</strong><br />
(µg/mL)<br />
Plasma 0,004 1-4 0,006 3-12<br />
Uri<strong>na</strong> 0,067 1-4 0,174 7-17<br />
Níveis de cianeto e de tiocia<strong>na</strong>to <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> e uri<strong>na</strong> de indivíduos fuma<strong>do</strong>res e não-fuma<strong>do</strong>res.<br />
A técnica que os alu<strong>no</strong>s irão executar <strong>na</strong> aula prática é uma modificação <strong>do</strong><br />
méto<strong>do</strong> de ALDRIDGE e vai ser seguidamente apresentada.
<strong>Doseamento</strong> espectrofotométrico <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to em flui<strong>do</strong>s<br />
biológicos<br />
Como foi referi<strong>do</strong> anteriormente, há várias técnicas que <strong>do</strong>seiam o tiocia<strong>na</strong>to<br />
<strong>no</strong> soro, uri<strong>na</strong> e saliva, sen<strong>do</strong> algumas delas mais rápidas, sensíveis e<br />
precisas, mas exigin<strong>do</strong> outro tipo de aparelhagem. A técnica escolhida para ser<br />
executada <strong>na</strong> aula prática é uma técnica colorimétrica que necessita de um<br />
espectrofotómetro com regista<strong>do</strong>r e apresenta várias vantagens: é uma técnica<br />
rápida, pouco dispendiosa e aceitável para análise de roti<strong>na</strong>.<br />
Meto<strong>do</strong>logia a utilizar <strong>na</strong> aula prática<br />
A técnica a ser utilizada <strong>na</strong> aula prática é uma técnica colorimétrica que utiliza<br />
uma modificação, que consiste <strong>na</strong> substituição da benzidi<strong>na</strong>, uma ami<strong>na</strong><br />
carci<strong>no</strong>génica, pela p-fenile<strong>no</strong>diami<strong>na</strong> tal como foi sugeri<strong>do</strong> por “Bark e<br />
Higson”. A <strong>na</strong>tureza da reacção é tal que tanto o tiocia<strong>na</strong>to como o cianeto<br />
reagem para dar origem à formação <strong>do</strong> complexo cora<strong>do</strong>. O tiocia<strong>na</strong>to, assim<br />
como <strong>no</strong> cianeto vão regir com o bromo, obten<strong>do</strong>-se o brometo de cia<strong>no</strong>génio.<br />
Este reage com a piridi<strong>na</strong> origi<strong>na</strong>n<strong>do</strong> um aldeí<strong>do</strong> glutacónico, que se vai<br />
posteriormente ligar à ami<strong>na</strong> primária, a p-fenile<strong>no</strong>diami<strong>na</strong>, forman<strong>do</strong> um<br />
composto cora<strong>do</strong>. A absorvência desta solução é depois medida<br />
espectrofotometricamente, uma vez que é proporcio<strong>na</strong>l à concentração de<br />
composto. O arsenito de sódio tem como função remover o excesso de bromo.<br />
KSCN + 4 Br2 + 4H2O CNBr + 6HBr + H2SO4 + KBr<br />
HCN + Br2 CNBr + HBr<br />
CNBr + Mistura Piridi<strong>na</strong>/p-fenile<strong>no</strong>diami<strong>na</strong> Complexo Cora<strong>do</strong><br />
As leituras <strong>no</strong> espectrofotómetro são medidas num comprimento de onda<br />
conheci<strong>do</strong> como sen<strong>do</strong> o ponto isosbéstico para esta reacção.
Fig.1 – Determi<strong>na</strong>ção <strong>do</strong> ponto isosbéstico, a partir de soluções padrão de tiocia<strong>na</strong>to.<br />
Este comprimento de onda é determi<strong>na</strong><strong>do</strong> por análise qualitativa da reacção<br />
corada <strong>no</strong> espectrofotómetro, registan<strong>do</strong> os vários espectros de absorção com<br />
diferentes concentrações de soluções-padrão e a diferentes tempos.<br />
A leitura das absorvências é depois feita <strong>no</strong> comprimento de onda previamente<br />
determi<strong>na</strong><strong>do</strong>, sen<strong>do</strong> necessário determiná-lo <strong>no</strong>vamente sempre que forem<br />
feitos <strong>no</strong>vos reagentes. Estas leituras devem ser feitas, entre o 5º e o 15º<br />
minuto após a adição <strong>do</strong> reagente.<br />
Contribuição <strong>do</strong> cianeto existente <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> e uri<strong>na</strong> para a reacção<br />
colorimétrica<br />
Geralmente, a relação molar existente entre o tiocia<strong>na</strong>to e o cianeto <strong>no</strong> <strong>plasma</strong><br />
sanguíneo é de 50 de tiocia<strong>na</strong>to para 1 de cianeto. Para além deste facto,<br />
quan<strong>do</strong> o cianeto é adicio<strong>na</strong><strong>do</strong> ao <strong>plasma</strong> in vitro é pouco estável se
permanecer à temperatura ambiente. Assim sen<strong>do</strong>, a contribuição <strong>do</strong> cianeto<br />
para a intensidade de coloração desta reacção quan<strong>do</strong> executada <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> e<br />
em condições <strong>no</strong>rmais, deve ser insignificante, especialmente porque o<br />
processo envolve ainda uma diluição de 1 para 10.<br />
Para reforçar o argumento de que é realmente muito peque<strong>na</strong> a quantidade de<br />
cianeto existente <strong>no</strong> <strong>plasma</strong>, basta referir que, <strong>na</strong>s várias técnicas descritas<br />
para <strong>do</strong>sear o cianeto <strong>no</strong> <strong>plasma</strong>, em todas elas encontramos um passo<br />
adicio<strong>na</strong>l comum e anterior à execução da técnica propriamente dita e que é<br />
uma concentração prévia <strong>do</strong> cianeto existente <strong>no</strong> <strong>plasma</strong>. No entanto em<br />
virtude da instabilidade comprovada <strong>do</strong> cianeto <strong>no</strong> <strong>plasma</strong> e devi<strong>do</strong> a erros que<br />
se possam cometer durante o processo de concentração prévia, se a análise<br />
pretendida é realmente a determi<strong>na</strong>ção <strong>do</strong> cianeto, então há que actuar muito<br />
cuida<strong>do</strong>samente aquan<strong>do</strong> da realização dessa operação, ou então optar por<br />
fazer a análise <strong>no</strong> sangue inteiro em vez de <strong>plasma</strong>.<br />
A excreção <strong>do</strong> cianeto pela uri<strong>na</strong> é igualmente bastante baixa, e como a<br />
determi<strong>na</strong>ção <strong>do</strong> tiocia<strong>na</strong>to <strong>na</strong> uri<strong>na</strong> só é executada depois de feita uma<br />
diluição da amostra, pensa-se que devi<strong>do</strong> a estas duas razões, o cianeto não<br />
contribui significativamente para a intensidade da coloração da reacção.<br />
Podemos então concluir que, só praticamente o tiocia<strong>na</strong>to é calcula<strong>do</strong> através<br />
desta técnica colorimétrica quan<strong>do</strong> aplicada a amostras de sangue e uri<strong>na</strong>.