kyushu07

新 規 キナーゼ 基 質 ペプチドと、
それを 用 いた 診 断 ・ 創 薬 のための 技 術
九 州 大 学 大 学 院 工 学 研 究 院
九 州 大 学 先 端 医 療 イノベーションセンター
九 州 大 学 未 来 化 学 創 造 センター
教 授 片 山 佳 樹

1
・キノーム 解 析 用 ペプチドアレイ
・ 迅 速 ・ 簡 便 なラベルフリーキナーゼアッセイ
・キナーゼ 応 答 型 遺 伝 子 送 達 システム
・キナーゼ 蛍 光 プローブ
九 州 大 学 , 2012

2
細 胞 内 プロテインキナーゼ 群 は、
細 胞 機 能 を 決 定 する 主 体 である。
すなわち、
細 胞 の 状 態 を 知 り( 診 断 ・ 創 薬 )
細 胞 を 識 別 する(ターゲティング)
ためには
細 胞 内 シグナルを 計 測 し、クロストークし、
利 用 し、 制 御 する 必 要 がある。
そこで、 本 発 表 では、
プロテインキナーゼを 測 定 し、 診 断 創 薬 に 画 期 的 なツール
を 提 供 する 手 法
と
プロテインキナーゼを 利 用 して、 病 変 細 胞 を 識 別 し、
正 常 細 胞 では 作 用 しない 遺 伝 子 送 達 法 をご 紹 介 する。
九 州 大 学 , 2012

キノーム 解 析 用 ペプチドアレイ
3
P P P P
O
HN
H
S
N
H
H
NH
O
細 胞 破 砕 液
HN O O
P O R
N
N N
Zn 2+ Zn 2+
N
O -
O -
O -
Phos-tagの 構 造
N
N
基 質 ペプチドアレイ
P P P P
Phos-tag
Cy3-
streptavidin
P P P P
Microarray scannerにて 蛍 光 シグナルを 検 出
九 州 大 学 , 2012

蛍 光 イメージング 検 出 の 定 量 性 評 価
4
Fluorescence intensity (a. u.)
2000
1500
1000
500
2-pY
2-Y , 2-F
0
0 50 100 150 200 250
Fluorescence intensity (a. u.)
2000
1600
1200
800
400
0.05 mM
0.02 mM
R2 = 0.9866
R2 = 0.9963
Peptide concentration (μM)
0
0 20 40 60 80 100
25.40 mm
840 spots
Percentage of 2-pY (%)
17.80
mm
2500
76.20
mm
2-pY
2-Y
9.25
mm
Fluorescence intensity (a. u.)
2000
1500
1000
500
2-pY
2-Y
2-F
0.25
mm
2-F
0
0 40 80 120 160 200 240 280
Spot number
九 州 大 学 , 2012

5
HepG2 細 胞 におけるPMA 刺 激 に 伴 うPKCα と ERK2 活 性 化 の 確 認
PMA - +
p-ERK1/2
804 種 類 の 基 質 を 固 定 したアレイ
actin
Cytosol
fraction
Membrane
fraction
PMA
- + - +
PMA(+)
PMA(-)
actin
PKCα
transferrin
receptor
1000
800
600
Activated with the
stimulation
PMA 刺 激 するとPKCαが 活 性 化 され、
それに 伴 いΕΡΚ2が 活 性 化
PMA(+)
400
200
Depression with
the stimulation
これがペプチドアレイで 確 認 できるか?
0
-200 0 200 400 600 800 1000
-200
PMA(-)
Top 30 was selected.
九 州 大 学 , 2012

(Dr. Osamu Okitsu)
6
刺 激 で 亢 進
4.000
2.000
0.000
刺 激 で 抑 制
-2.000
-4.000
1 ← ペプチドID 番 号 → 557
1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551
No
< 薬 剤 A 刺 激 による 細 胞 に 対 するリン 酸 化 変 化 のプロファイル>
刺 激 で 亢 進
4.000
2.000
0.000
刺 激 で 抑 制
-2.000
-4.000
1 ← ペプチドID 番 号 → 557
1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551
No
リン 酸 化 のフィンガープリントにより、 薬 理 活 性 を 表 現 できる!!
九 州 大 学 , 2012

PKA 基 質 ペプチドによるナノ 粒 子 の 凝 集
7
リン 酸 化 ペプチド
基 質 ペプチド
カチオン 性 基 質 ペプチド(+3)
リン 酸 化 された 基 質 ペプチド(+1)
金 コロイドを 凝 集
金 コロイドを 分 散
この 現 象 をリン 酸 化 測 定 ツールに 応 用
九 州 大 学 , 2012

種 々のキナーゼ 基 質 で 検 出 系 を 実 現
8
O.D. 650
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
PKCα (+6 to +4)
2
2'
O.D. 650
0.25
0.20
0.15
0.10
CaMK-II (+3 to +1)
2 2’ 3 3’
3
0.10
0.05
0.05
3'
0.00
0.01 0.1 1 10
Peptide conc. / μM
0.00
0.01 0.1 1 10
Peptide conc. / μM
0.35
0.30
MAPK-2 (+3 to +1)
0.30
0.25
MAPKAPK-2 (+4 to +2)
O.D. 650
0.25
0.20
0.15
0.10
4
4 4’ 5 5’
O.D. 650
0.20
0.15
0.10
5
0.05
4'
0.05
5'
0.00
0.01 0.1 1 10
Peptide conc. / μM
0.00
0.01 0.1 1 10
Peptide conc. / μM
九 州 大 学 , 2012

担 がんマウスとヒトの 摘 出 乳 がんのPKCα 活 性 検 出
9
がん 増 殖 活 性 の 指 標 である
PKCα 活 性 を 実 際 のがんで
検 出
Tumor
Normal
0.3
正 常 ( 皮 膚 )
(B16)
腫 瘍
0.25
0.2
inhibitor(μM) ‐ ‐ 0.5 5.0
OD
0.15
0.1
0.05
4 % 70 % 33 % 0 %
0
Tumor
Normal
九 州 大 学 , 2012

ヒト 肺 がん 保 存 血 清 サンプルでのPKCα 活 性
10
Case 臨 床 診 断 組 織 型 年 齢 性 別 臨 床 病 期 既 存 の 腫 瘍 マーカー 検 出
1 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 69 M 4 ProGRP 191.3 ○
2 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 63 M 3A ×
3 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 61 M 4 ProGRP 482.1 ○
4 原 発 性 肺 癌 腺 癌 57 M 4 CEA 40.7 ○
5 原 発 性 肺 癌 未 分 化 72 F 4 CEA 4.9 ○
6 原 発 性 肺 癌 未 分 化 54 M 4 CYFRA 96.4 ○
7 原 発 性 肺 癌 腺 癌 70 F 4 CEA 70.5 ×
8 原 発 性 肺 癌 腺 癌 58 M 4 CEA 9.8 ○
9 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 67 M 4 ○
10 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 55 M 4 ×
11 原 発 性 肺 癌 腺 癌 68 M 4 CEA 11.6 ×
12 原 発 性 肺 癌 扁 平 上 皮 癌 59 F 1A ×
13 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 71 M 4 ○
14 原 発 性 肺 癌 小 細 胞 癌 49 M 4 ×
がんバイオマーカー:○ → PKCα:○
6 / 8(75%)
がんバイオマーカー:× → PKCα:○
2 / 6(33%)
cutoff value
ProGRP < 46 pg/ml
CEA < 3.2 ng/ml
CYFRA < 3.5 ng/ml
九 州 大 学 , 2012

Protein kinse A inhibitors
H-89
種 々の 薬 剤 のキナーゼ 阻 害 能 評 価 例
p38 inhibitor (SB202190)
SB 202190 (nM)
3000 1000 300 100 30 10
active p38α +
inactive MAPKAPK-2
11
H-89 [μM]
0 30
IC 50 : 125 nM*
active MAPKAPK-2
OD 650
0.4
0.3
0.2
0.1
Rottlerin
0.0
10 1 10 2 10 3 10 4
[SB-202190] (nM)
IC 50 : 2.18 μM
OD 650
Src inhibitors
0.35 SU6656
PP2
Y27632
0.25
0.15
active p38α + inactive MAPKAPK-2
active MAPKAPK-2
J. Oishi et al, Anal. Biochem. 373, 161-163 (2008)
0.05
10 1 10 2 10 3 10 4
inhibitor (nM)
九 州 大 学 , 2012

キナーゼ 蛍 光 プローブ
12
カチオン 性 基 質
蛍 光 標 識 ポリアニオン
Lipid-
PK substrate
Polyanionfluorescent
dye
P
P
P
P
蛍 光 ON
高 分 子 イオン 錯 体
蛍 光 消 光
蛍 光 回 復
C14-PKC-S/pAsp-F3.7
O
H
N
O - Na +
HN
NH 2
HN
O
O
O
H
N
l N m n
H
O O
O
NH
+ Na - O
pAsp-F3.7
(l = 91.8, m = 4.5, n = 3.7)
O
+ Na - O
O a
H
N
N
N
l m n
O
O
N N
N
O
N
H ALRRASLGW
LPEI-Kemp-S10.3
(l=79.6, m=10.3, n=10.1)
O
H
N
O - Na +
HN
NH 2
HN
O
O
O
H
N
l N m n
H
O O
O
O
N
H
NH
LRRASLG NH2
Fluorescein
pAsp-F3.7 : l : m : n = 91.8 : 4.5 : 3.7
FKKQGSFAKKK-NH 2
C/A =1.5で 混 合
Quenched State
九 州 大 学 , 2012

プロテインキナーゼ 活 性 検 出 蛍 光 分 子 プローブ
13
P
キナーゼによるリン 酸 化 で
複 合 体 が 緩 み、 濃 度 消 光 が 解 消
P
P
P
PKCα 添 加 後 20 分 後 の 相 対 蛍 光 強 度
PKA 活 性 の 検 出 例
PKCα (+) PKCα (-) Inactivated
PKCα
高 分 子 錯 体 型
脂 質 型
九 州 大 学 , 2012

14
従 来 技 術 とその 問 題 点 (ペプチドアレイ)
既 に 実 用 化 されているもの
Pepchip (Pepscan 社 )
PamChip Array(PamGene 社 )
CelluSpot Array (Intavis 社 )
など
RI 検 出
定 量 性 に 乏 しい
すでに 分 かっている
シグナルの 再 確 認
新 技 術 の 特 徴 ・ 従 来 技 術 との 比 較 (ペプチドアレイ)
・ 従 来 技 術 の 問 題 点 であった、 定 量 性 を 改 良 することに 成 功 した。
・ 従 来 は 感 度 ( 非 特 異 吸 着 による 妨 害 )・ 定 量 性 の 点 ですでに 判 明 している
キナーゼ 活 性 化 の 再 確 認 の 目 的 に 限 られていたが、これらの 問 題 を 解 決 して
おり、 細 胞 でのキナーゼ 活 性 プロファイリングを 行 うことが 可 能 となった。
九 州 大 学 , 2012

15
従 来 技 術 とその 問 題 点 ( 金 粒 子 法 、 蛍 光 プローブ)
既 に 実 用 化 されているもの
アルファスクリーン 法 (キャリバー 社 )
QTL 法 (QTL Biosystems 社 )
ATP 測 定 法
FRET 法
高 価
定 量 性 に 乏 しい
細 胞 ・ 組 織 サンプルは 困 難
新 技 術 の 特 徴 ・ 従 来 技 術 との 比 較 ( 金 粒 子 法 、 蛍 光 プローブ)
・ 従 来 技 術 の 問 題 点 であった、 細 胞 や 組 織 サンプルへの 適 用 を 実 現 ( 金 粒 子 )。
・ 手 術 や 生 検 でのサンプルで 評 価 可 能 ( 金 粒 子 )。
・ 蛍 光 プローブ 法 は 従 来 よりも 高 感 度 化 を 実 現 。
九 州 大 学 , 2012

16
想 定 される 用 途 (ペプチドアレイ・ 金 粒 子 法 ・ 蛍 光 プローブ)
・ 薬 物 探 索 ( 機 能 面 からの 探 索 )
・ 薬 効 評 価
・ 投 薬 前 診 断
・ 疾 患 の 診 断 、 予 後 評 価
・ 植 物 ( 農 作 物 )の 品 種 改 良
・ 幹 細 胞 の 品 質 評 価 ・ 分 化 評 価
実 用 化 に 向 けた 課 題
・アレイ、 金 粒 子 法 は、 種 々の 細 胞 や 組 織 におけるキナーゼでの 定 量 的 なリン
酸 化 プロフィール 取 得 が 可 能 なところまで 開 発 済 み。しかし、さらに 微 量
のサンプルへの 適 用 のための 計 測 ツールなどが 必 要 。
・ 蛍 光 プローブ 法 は、 現 時 点 ではキナーゼ 阻 害 剤 探 索 などに 適 用 可 能 だが、 細
胞 内 への 適 用 は、さらなる 安 定 化 が 必 要 。
・ 今 後 、 細 胞 に 加 え、 臨 床 サンプルについて 実 験 データを 取 得 し、 診 断 や 薬 効
評 価 に 適 用 していく 場 合 の 条 件 設 定 を 行 っていく。
九 州 大 学 , 2012

標 的 細 胞 特 異 的 な 遺 伝 子 の 送 達
従 来 :アクティブターゲティング・・ 細 胞 特 異 的 な 目 印 を 利 用
増 殖 活 性 、 転 移 活 性
正 常 細 胞 との 機 能 差
17
細 胞 表 面 情 報 によるターゲティング
☆ 病 変 組 織 は 不 均 一 な 細 胞 集 団
➠すべてを 標 的 化 できない
☆ 標 的 部 位 への 蓄 積 のみに 注 力
➠ 蓄 積 は 最 大 で5%
正 常 臓 器 での 副 作 用
☆ 可 視 化
病 変 の 存 在 箇 所 を 可 視 化
( 正 確 な 予 後 判 定 困 難 )
☆ 治 療
ぜい 弱 な 細 胞 ほど 効 果
正 常 臓 器 での 副 作 用
キナーゼ 活 性 を 利 用 した 識 別
☆ 病 変 細 胞 特 異 的 亢 進 しているプロ
テインキナーゼの 利 用
➠ 機 能 変 化 を 利 用 して 細 胞 識 別
☆ 標 的 細 胞 以 外 では 活 性 を 抑 制
➠ 副 作 用 の 軽 減
病 変 の 機 能 ( 増 殖 活 性 など)を 可 視 化
( 正 確 な 治 療 効 果 、 悪 性 度 を 判 定 )
悪 性 度 の 高 い 細 胞 ほど 効 果
正 常 臓 器 では 作 用 なし
九 州 大 学 , 2012

I-k-kinase( 炎 症 細 胞 ) 応 答 型
18
CH 3
CH 2
CH m CH 2
n
O
O NH
[Link]
2 ALRRASLG 3
-KKKKERLLDDRHDSGL-NH A
2
NH 2
I-κ-kinase responsive
炎 症 反 応 特 異 的 に
遺 伝 子 発 現
Type
LPS (100 ng/mL)
Polymer
(naked) Ser Ser Ala
(-) (-) (+) (+)
(-) (+) (+) (+)
GFP
TexasRed
Phase-contrast
九 州 大 学 , 2012

PKCa 応 答 型 システム
19
PKCα 特 異 基 脂 質
:FKKQGSFAKKK
CPM
180,000
160,000
140,000
120,000
100,000
80,000
60,000
40,000
20,000
B16
Luciferase activity
(X10 5 RLU/mg protein)
10
8
6
4
2
0
PPC(S) PPC(A) PPC(S) PPC(A)
B16 melanoma
Normal skin
0
β I β II α βΙβΙΙ γ δ ε η θ ζ ι/λ
Isozymes
phosphoration
ratio / %
90
80
70
60
50
40
30
20
Luminescence intensity (p/s)
PPC(S) PPC(A) PPC(S) PPC(A)
normal tissue cancer tissue
10
0
A431
A549
B16
HeLa
HepG2
HuH-7
Neuro-2a
A431
B16
HepG2
HuH-7
brain
heart
kidney
liver
lung
muscle
pancreas
skin
spleen
tumor cell
tumor tissue
normal tissue
がん 組 織 がん 細 胞 正 常 組 織
Peptide, 30 μM; ATP, 100 μM; MgCl 2,
1 mM; protein concentration, 0.2 μg/μl.
Total volume : 30 μl
Kang et al, Proteomics 10, 2006‐11 (08)
すぐれたがん 特 異 性 !
Kang et al, J. Am. Chem. Soc 2008
Tomiyama et al, Cancer Sci. 2009
Toita et al, J. Control. Released
2009
九 州 大 学 , 2012

シグナル 応 答 性 、 遺 伝 子 活 性 化 能 を 向 上 させた 改 良 型
20
m
n
O NH 2
O R
PPC(S) or PPC(A)
LPEI(S) or LPEI(A)
従 来 型 では 適 用 できなかったがんにも
適 用 可
PPCタイプでは 最 大 10 倍 の 応 答 性 であったが、
LPEIタイプでは 最 大 500~1000 倍 に 向 上
九 州 大 学 , 2012

21
従 来 技 術 とその 問 題 点 ( 遺 伝 送 達 技 術 )
既 に 実 用 化 されているもの
ウイルスキャリヤー
カチオン 性 高 分 子
カチオン 性 脂 質
ポリイオン 錯 体 型 ナノ 粒 子
ポリ 乳 酸 型 カプセル
・・・・etc
正 常 組 織 での 遺 伝 子 抑 制 が 不 可 能 なため
治 療 では 副 作 用 を 回 避 できない。
また、 脆 弱 な 細 胞 ほど 効 果
イメージングでは、 正 常 臓 器 で 大 きなシグナル
病 変 部 の 場 所 は 分 かるが、 機 能 変 化 は 分 からな
い。
新 規 技 術 のメリット
・ 従 来 技 術 の 問 題 点 であった、 正 常 組 織 での 遺 伝 子 の 抑 制 を 実 現
・より 悪 性 度 の 高 い 細 胞 で 効 果 を 発 揮
・ 病 態 機 能 を 可 視 化 できる
九 州 大 学 , 2012

22
想 定 される 用 途
・これまでデリバリーの 問 題 で 断 念 された 治 療 遺 伝 子 の 復 活
・ 効 果 的 な 治 療 技 術
・ 動 物 レベルでの 正 確 な 薬 効 評 価
・ 正 確 な 予 後 評 価
実 用 化 に 向 けた 課 題
・ 血 中 投 与 にはさらなる 複 合 体 の 安 定 化 が 必 要
・ 遺 伝 子 発 現 効 率 のさらなる 改 善 が 理 想 的
企 業 への 期 待
・ 複 合 体 安 定 化 については、 糖 鎖 、 脂 質 等 による 被 覆 で 克 服 可 能 と 考 えている。
・ 一 度 、 遺 伝 子 医 薬 を 検 討 し 断 念 した、あるいは 検 討 中 の 企 業 には、 本 システ
ムによる 解 決 の 可 能 性 が 見 込 まれる。
・また、イメージングでは、 創 薬 効 率 化 技 術 を 開 発 中 の 企 業 、 診 断 分 野 、 再 生
医 療 分 野 への 展 開 を 考 えている 企 業 には、 本 技 術 の 導 入 が 有 効 と 思 われる。
九 州 大 学 , 2012

23
本 技 術 に 関 する 知 的 財 産 権
1.タンパク 質 キナーゼの 新 規 基 質 ペプチド
PCT/JP2011/063699
2.プロテインキナーゼの 検 出 及 び 活 性 測 定 法
PCT/JP2010/065721
3. 癌 診 断 用 マーカーとしてのプロテインキナーゼCα
PCT/JP2010/062252
4.プロテインキナーゼのリン 酸 化 酵 素 活 性 ならびに 脱 リン 酸 化
酵 素 活 性 の 測 定 方 法
特 開 2008-79610
5. 細 胞 シグナル 応 答 型 遺 伝 子 転 写 制 御 系
特 登 4290352( 出 願 人 : 独 立 行 政 法 人 科 学 技 術 振 興 機 構 )
九 州 大 学 , 2012

24
お 問 い 合 わせ 先
九 州 大 学 知 的 財 産 本 部
技 術 移 転 グループ
TEL 092-642 -4361
FAX 092-642 -4365
e-mail transfer@imaq.kyushu-u.ac.jp
九 州 大 学 , 2012