Tutorial Blast em linha de comando - Coccidia.icb.usp.br

Tutorial Blast em linha de comando<br />
Vamos aprender a baixar uma base de dados customizada e formatá-la para uso<br />
com BLAST local em linha de comando. Para isso, vamos obter todas as seqüências<br />
nucleotídicas e protéicas de vírus de dupla fita de RNA (dsRNA).<br />
1. Entre no site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. No canto superior esquerdo existe<br />
botão de escolha. Escolha o item Taxonomy. Digite viruses no formulário de<br />
busca e aperte ENTER<br />
2. Clique no link de Viruses. Uma lista de todos os grupos taxômicos de vírus será<br />
apresentada.<br />
3. Escolha dsRNA viruses e clique no link.<br />
4. Uma nova lista com todos os grupos taxonômicos de vírus dsRNA será<br />
apresentada.<br />
5. Clique no link dsRNA viruses da raíz.<br />
6. Uma tabela contendo o número de seqüências nucleotídicas e protéicas, entre<br />
outras, deverá aparecer do lado direito.<br />
7. Quantas seqüências estão disponíveis<br />
8. Clique no link de sequências nucleotídicas (ou de protéicas se for o caso).<br />
9. Vamos agora formatar a saída para o formato multifasta e salvar a base em um<br />
arquivo. Para isso, clique no link “Send to” no canto superior direito, e selecione<br />
o item “File”. O número de sequências a serem baixadas será apresentado.<br />
Escolha o formato FASTA e clique no botão “Create File”. O arquivo será salvo<br />
na área de transferência com o nome sequences.fasta.<br />
Renomeie o arquivo para virus-nt.fasta com o comando mv.<br />
10. Repita o procedimento para as sequências protéicas e salve o arquivo.<br />
Renomeie-o para virus-prot.fasta.<br />
11. Quantas sequências compõem cada um dos arquivos Use o comando abaixo<br />
para descobrir:<br />
grep “>” |wc –l<br />
12. Agora vamos copiar os arquivos FASTA para o diretório BLAST da sua pasta.<br />
13. Em seguida, vamos formatar essas bases de maneira que o BLAST possa usálas.

makeblastdb -in virus-nt.fasta -dbtype nucl -title "dsRNA<br />
virus DNAs" -out dsRNAnt -logfile log_nt.txt<br />
e<br />
makeblastdb -in virus-prot.fasta -dbtype prot -title "dsRNA<br />
virus proteins" -out dsRNAprot -logfile log_prot.txt<br />
14. Você recebeu os arquivos de dois virus de dsRNA:<br />
Ep-RV1.fasta e Emt-RV1.fasta<br />
Vamos agora fazer uma busca de similaridade entre o primeiro vírus e a base de<br />
sequências nucleotídicas de vírus de dsRNA:<br />
blastn -query Ep-RV1.fasta -db dsRNAnt -out saida_blastn.txt<br />
Vamos repetir a busca usando traduzindo a sequência nucleotídica do vírus e usando<br />
a base de sequências protéicas:<br />
blastx -query Ep-RV1.fasta -db dsRNAprot -out saidablastx.txt<br />
15. Ao final da busca, inspecione os arquivos de saída com o comando less.<br />
16. A busca com sequência nucleotídica não deu hits. Experimente rodar a busca<br />
com o arquivo teste.fasta. O que você observou<br />
17. Repita a busca com blastn e blastx usando as outras sequências de vírus.<br />
18. Agora vamos alterar a saída, gerando um formato tabular customizado:<br />
blastx -query Ep-RV1.fasta -db dsRNAprot -outfmt "6 length<br />
evalue bitscore sseqid" –out tabular.txt<br />
19. Vamos fazer uma busca de similaridade entre duas sequências nucleotídicas de<br />
vírus distintos:<br />
blastn -query Ep-RV1.fasta –subject Emt-RV1.fasta<br />
O Word Size padrão para essa busca é 28. Vamos mudar para 11:

lastn -query Ep-RV1.fasta –subject Emt-RV1.fasta –word_size<br />
11<br />
O que você observou<br />
20. Agora vamos comparar estas duas sequências a partir de suas proteínas<br />
traduzidas:<br />
tblastx -query Ep-RV1.fasta –subject Emt-RV1.fasta<br />
...e restringir a saída para apenas os alinhamentos com e-value inferior a 1x10 -300 :<br />
tblastx -query Ep-RV1.fasta –subject Emt-RV1.fasta –evalue<br />
1e-300