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Resumo da tese de doutorado de Lucila Adriani Coral

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO TECNOLÓGICOPPGEA – Programa <strong>de</strong> Pós-Graduação emEngenharia AmbientalAVALIAÇÃO DA PRÉ-OZONIZAÇÃO NO CONTROLE DE CIANOBACTÉRIAS EDEGRADAÇÃO DE MICROCISTINASTESE<strong>Lucila</strong> <strong>Adriani</strong> <strong>Coral</strong>Orientador: Prof. Flávio Rubens Lapolli, Dr.Co-orientador(a): Fatima <strong>de</strong> Jesus Bassetti, Drª.Comitê examinador: Profª. Rosângela Bergamasco, Drª. (UEM)Prof. Marcio Barreto Rodrigues, Dr. (UTFPR)Prof. William Gerson Matias, Dr. (UFSC)Profª. Maria Ángeles Lobo Récio, Drª. (UFSC)Profª. Celia Regina Monte Barardi, Drª. (UFSC)Data <strong>de</strong> <strong>de</strong>fesa e aprovação: 03 <strong>de</strong> <strong>de</strong>zembro <strong>de</strong> 2012Florianópolis, Fevereiro <strong>de</strong> 2013


Sumário1 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 31.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................................. 31.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 32 PESQUISA BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................................... 33 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................... 64 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 74.1 Efeito <strong>da</strong> ozonização na liberação <strong>de</strong> COD <strong>da</strong>s células ..................................................... 84.2 Efeito do ozônio sobre a integri<strong>da</strong><strong>de</strong> celular <strong>de</strong> M. aeruginosa e A. flos-aquae ................. 94.3 Impacto <strong>da</strong>s cianobactérias e COD sobre o <strong>de</strong>caimento do ozônio ................................... 94.4 Formação <strong>de</strong> subprodutos a partir <strong>de</strong> células <strong>de</strong> cianobactérias ....................................... 94.5 Efeito <strong>da</strong> ozonização na liberação e oxi<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> toxina intracelular ............................... 105 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES ................................................................................... 116 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 121


<strong>Resumo</strong>Florações <strong>de</strong> cianobactérias potencialmente tóxicas em mananciais <strong>de</strong> abastecimento tem setornado uma preocupação em nível mundial. A pré-ozonização, embora seja um processoeficiente, tem como problemática a tendência à lise celular com a liberação dos constituintesinternos à célula. Entretanto, existem ain<strong>da</strong> limita<strong>da</strong>s informações sobre o nível <strong>de</strong>comprometimento celular e a influência <strong>da</strong> pré-ozonização na formação <strong>de</strong> subprodutos a partir <strong>de</strong>cianobactérias. Este estudo investigou o mecanismo <strong>de</strong> ação do ozônio em células <strong>de</strong> Microcystisaeruginosa e Anabaena flos-aquae cultiva<strong>da</strong>s em laboratório, em termos <strong>de</strong> viabili<strong>da</strong><strong>de</strong> celular;liberação <strong>de</strong> compostos intracelulares; estudo cinético <strong>de</strong> <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>da</strong> toxina intracelular; e apotenciali<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> formação <strong>de</strong> subprodutos. Diferentes doses <strong>de</strong> ozônio (0,5, 2 e 4 mgO 3·L -1 ),<strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> células (2,5x10 5 e 1,5x10 6 cel·mL -1 ) e pH (6 e 8) foram utilizados neste estudo. Osresultados obtidos indicaram uma rápi<strong>da</strong> e completa per<strong>da</strong> <strong>de</strong> viabili<strong>da</strong><strong>de</strong> celular para ambas asespécies após exposição ao ozônio (valor CT - concentração x tempo) ≤ 0,2 mg·min/L, embora nãosignificativa redução no número <strong>de</strong> células tenha sido observa<strong>da</strong>. O aumento <strong>da</strong> concentração <strong>de</strong>carbono orgânico dissolvido (COD) foi observado, principalmente para A. flos-aquae, indicando quealterações na permeabili<strong>da</strong><strong>de</strong> celular <strong>da</strong>s cianobactérias induz a liberação do conteúdo interno <strong>da</strong>scélulas. O pH po<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>scrito como uma variável importante no processo <strong>de</strong> ozonização, on<strong>de</strong> opH mais elevado favoreceria o aumento do COD extracelular e <strong>da</strong> formação <strong>de</strong> subprodutos <strong>da</strong><strong>de</strong>sinfecção (THM e HAA), sendo necessária, portanto, a adoção <strong>de</strong> processos <strong>de</strong> tratamentosubsequentes, visando a redução <strong>de</strong> precursores. A capaci<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistinaintracelular pelo ozônio foi verifica<strong>da</strong>, tendo-se uma <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção mais lenta em pH 8, o que sugereque a microcistina é mais reativa com o ozônio molecular, presente em maior quanti<strong>da</strong><strong>de</strong> em pH 6.Embora a pré-ozonização <strong>de</strong> cianobactérias aumente a probabili<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> formação <strong>de</strong> subprodutos,a efetivi<strong>da</strong><strong>de</strong> do oxi<strong>da</strong>nte na <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> toxinas torna esse processo atrativo, consi<strong>de</strong>rando-sea ausência <strong>de</strong> toxinas no final do sistema <strong>de</strong> tratamento. A adoção <strong>de</strong>sse processo, aplicado <strong>de</strong>forma a<strong>de</strong>qua<strong>da</strong>, compreen<strong>de</strong> um avanço no tratamento <strong>de</strong> águas com presença <strong>de</strong> cianobactériase seus metabólitos, uma vez que os processos convencionais <strong>de</strong> tratamento mostram-se limitadosnestas condições e processos avançados po<strong>de</strong>m tornar o tratamento mais oneroso.2


1 OBJETIVOS1.1 Objetivo geralEste estudo teve como objetivo geral avaliar a cinética <strong>de</strong> ação do ozônio na estrutura celular<strong>de</strong> cianobactérias e a <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> cianotoxinas por este oxi<strong>da</strong>nte, e avaliar a contribuição <strong>da</strong>matéria orgânica <strong>da</strong>s células na formação <strong>de</strong> subprodutos <strong>da</strong> <strong>de</strong>sinfecção em diferentes condiçõesoperacionais <strong>de</strong> pré-ozonização.1.2 Objetivos específicosMais especificamente, teve-se como objetivos:• Avaliar o impacto <strong>da</strong> ozonização na característica celular (morfologia e integri<strong>da</strong><strong>de</strong> celular)<strong>da</strong>s cianobactérias Microcystis aeruginosa e Anabaena flos-aquae.• Estu<strong>da</strong>r o comportamento <strong>de</strong> liberação <strong>de</strong> compostos intracelulares, em termos <strong>de</strong> carbonoorgânico dissolvido e toxinas, frente a crescentes exposições ao ozônio (CT - concentraçãodo oxi<strong>da</strong>nte x tempo).• Desenvolver um mo<strong>de</strong>lo cinético para <strong>de</strong>screver a reativi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>da</strong>s cianobactérias estu<strong>da</strong><strong>da</strong>scom o ozônio (O 3 ).• Estimar a formação <strong>de</strong> trihalometanos (THM) e ácidos haloacéticos (HAA) a partir <strong>da</strong> préozonização<strong>da</strong>s células <strong>de</strong> cianobactérias como cultivos isolados.• Determinar quantitativamente a eficiência <strong>da</strong> pré-ozonização na <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistinaintracelular e a sua cinética <strong>de</strong> <strong>de</strong>composição.2 PESQUISA BIBLIOGRÁFICAAs cianobactérias são um componente significativo do ciclo <strong>de</strong> nitrogênio marinho e sãoimportantes produtores primários nos oceanos (LI, 2009). Entretanto, a presença <strong>de</strong>stesmicrorganismos tem sido reporta<strong>da</strong> também em outros habitats, como lagos e reservatórios <strong>de</strong>água, o que causa preocupação tanto pelas alterações nas características físico-químicas e naca<strong>de</strong>ia trófica do ambiente, quanto pelas alterações operacionais nos sistemas <strong>de</strong> tratamento <strong>de</strong>água.3


Eventos <strong>de</strong> floração em lagos e reservatórios <strong>de</strong> água são frequentemente relatados naliteratura, inclusive no Brasil (COSTA et al., 2006; CARVALHO et al., 2008; SÁ et al., 2010). Aespécie Microcystis aeruginosa é uma <strong>da</strong>s cianobactérias formadoras <strong>de</strong> floração mais comuns emecossistemas <strong>de</strong> água doce, sendo largamente distribuí<strong>da</strong> em todos os continentes (STRAUB etal., 2011). No Brasil, as espécies M. aeruginosa e Cylindrospermopsis raciborskii, são normalmenteas mais encontra<strong>da</strong>s nos eventos <strong>de</strong> floração.Além <strong>de</strong> resultar em uma série <strong>de</strong> alterações no corpo d'água, limitando o seu uso recreacionale provocando perturbações em todo o ecossistema aquático, <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong>s eleva<strong>da</strong>s <strong>de</strong> células <strong>de</strong>cianobactérias no manancial resultam em problemas operacionais nos processos <strong>de</strong> tratamento <strong>de</strong>água, com reduzi<strong>da</strong>s carreiras <strong>de</strong> filtração e maior geração <strong>de</strong> lodo (BABLON et al., 1991a;BABLON et al., 1991b; DE JULIO et al., 2010).Além dos problemas operacionais em virtu<strong>de</strong> <strong>da</strong>s células, a produção <strong>de</strong> toxinas (cianotoxinas)é uma <strong>da</strong>s maiores preocupações associa<strong>da</strong>s à presença <strong>de</strong> cianobactérias em mananciais <strong>de</strong>abastecimento <strong>de</strong> água, uma vez que estas moléculas são altamente solúveis em água e não sãopassíveis <strong>de</strong> remoção por processos convencionais <strong>de</strong> tratamento (BARTRAM et al., 1999). Ashepatotoxinas, que compreen<strong>de</strong>m as microcistinas e nodularinas, são as toxinas maisfrequentemente encontra<strong>da</strong>s no ambiente e normalmente associa<strong>da</strong>s a eventos <strong>de</strong> intoxicação(AFSSA; AFSSET, 2006). A microcistina é altamente solúvel em água, tendo-se conhecimento <strong>da</strong>existência <strong>de</strong> mais <strong>de</strong> 80 variantes (HUMPAGE, 2008; WESTRICK et al., 2010), sendo a MC-LR avariante encontra<strong>da</strong> com maior frequência e em maior concentração em eventos <strong>de</strong> floração.Consi<strong>de</strong>rando que mais <strong>de</strong> 95% <strong>da</strong> toxina é caracteriza<strong>da</strong> como intracelular (NEWCOMBE,2002), a maior preocupação resi<strong>de</strong> em evitar que as mesmas sejam libera<strong>da</strong>s para a água, o quepo<strong>de</strong> ocorrer naturalmente, em virtu<strong>de</strong> do estado <strong>de</strong> senescência dos microrganismos ouartificialmente, através <strong>da</strong> lise celular, muitas vezes associa<strong>da</strong> à aplicação <strong>de</strong> algici<strong>da</strong>s (LAVOIE etal., 2007; WESTRICK et al., 2010). Quando a liberação <strong>da</strong> toxina é inevitável ou mesmo <strong>de</strong>sejável,torna-se então necessária a adoção <strong>de</strong> processos capazes <strong>de</strong> permitir a <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção ou a retenção<strong>de</strong>ssas substâncias.4


O ozônio é um agente com elevado po<strong>de</strong>r oxi<strong>da</strong>nte e bastante versátil quando <strong>de</strong> seu uso notratamento <strong>de</strong> águas. Na <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> cianotoxinas, o ozônio apresenta eleva<strong>da</strong> capaci<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong><strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> MC-LR, anatoxina (ANTX) e cilindrospermopsina (CYN) (RODRÍGUEZ et al.,2007b). Em moléculas <strong>de</strong> microcistina, a reativi<strong>da</strong><strong>de</strong> do ozônio com as duplas ligações <strong>da</strong> meta<strong>de</strong>Ad<strong>da</strong> <strong>da</strong> molécula e <strong>da</strong> porção amina no anel (Mdha), resultam na rápi<strong>da</strong> e efetiva eliminação <strong>de</strong>sua toxici<strong>da</strong><strong>de</strong>. Vários estudos <strong>de</strong>stacam a efetivi<strong>da</strong><strong>de</strong> do ozônio na <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistinadissolvi<strong>da</strong> (ONSTAD et al., 2007; RODRÍGUEZ et al., 2007b; MIAO; TAO, 2009; AL MOMANI;JARRAH, 2010). Na avaliação <strong>da</strong> eficiência <strong>de</strong> <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção, fatores como temperatura, dose <strong>de</strong>ozônio, pH e concentração <strong>de</strong> carbono orgânico <strong>de</strong>vem ser consi<strong>de</strong>rados, uma vez que irãoinfluenciar na efetivi<strong>da</strong><strong>de</strong> do oxi<strong>da</strong>nte.Embora avaliações quanto à <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> toxina intracelular, assim como os efeitos dooxi<strong>da</strong>nte na célula <strong>da</strong> cianobactéria sejam ain<strong>da</strong> reduzi<strong>da</strong>s, alguns estudos <strong>de</strong>stacam comoprincipal efeito <strong>da</strong> oxi<strong>da</strong>ção a liberação <strong>de</strong> compostos orgânicos intracelulares, além <strong>de</strong> toxinas,que ten<strong>de</strong>m a aumentar a formação <strong>de</strong> subprodutos. Estudos <strong>de</strong> pré-ozonização <strong>de</strong> células <strong>de</strong>cianobactéria indicam alterações na morfologia <strong>de</strong> células <strong>de</strong> cianobactéria, com redução no teor<strong>de</strong> clorofila-a e liberação <strong>de</strong> compostos intracelulares (HOEGER; DIETRICH; HITZFELD, 2002;HUANG; CHENG; CHENG, 2008; MIAO; TAO, 2009; LI et al., 2011), mas são restritivos quanto ainformações sobre o mecanismo <strong>de</strong> atuação.Embora alguns estudos tenham mostrado que a pré-ozonização é eficaz na redução <strong>de</strong> células<strong>de</strong> certas espécies <strong>de</strong> cianobactéria, limita<strong>da</strong>s informações são obti<strong>da</strong>s quanto à cinética <strong>de</strong><strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistina intracelular, a <strong>de</strong>man<strong>da</strong> <strong>de</strong> ozônio por células <strong>de</strong> cianobactérias, per<strong>da</strong><strong>de</strong> viabili<strong>da</strong><strong>de</strong> celular, e contribuição <strong>da</strong>s células <strong>de</strong> cianobactérias na formação <strong>de</strong> subprodutos <strong>da</strong><strong>de</strong>sinfecção. Assim, a avaliação <strong>de</strong>stes aspectos pelo presente estudo é relevante do ponto <strong>de</strong>vista <strong>da</strong> viabili<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> aplicação do ozônio como uma etapa <strong>de</strong> pré-tratamento para águasproce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> ambientes eutrofizados.5


3 MATERIAIS E MÉTODOSA parte experimental <strong>de</strong>ste estudo foi <strong>de</strong>senvolvi<strong>da</strong> no Departamento <strong>de</strong> Engenharia Civil, <strong>de</strong>Geologia e <strong>de</strong> Minas, <strong>da</strong> École Polytechnique <strong>de</strong> Montréal (EPM), Canadá.Uma cepa tóxica <strong>de</strong> Microcystis aeruginosa (CPCC 299) e uma cepa não tóxica <strong>de</strong> Anabaenaflos-aquae (CPCC 64), obti<strong>da</strong>s do Centro Cana<strong>de</strong>nse <strong>de</strong> Cultivo Ficológico (Canadian PhycologicalCulture Centre) foram cultiva<strong>da</strong>s em laboratório, em condições controla<strong>da</strong>s <strong>de</strong> luminosi<strong>da</strong><strong>de</strong> etemperatura. Para os ensaios <strong>de</strong> ozonização, os microrganismos em fase exponencial ouestacionária (aproxima<strong>da</strong>mente 20 dias <strong>de</strong> crescimento) foram isolados por meio <strong>de</strong> filtração equantifica<strong>da</strong>s por microscopia óptica, utilizando uma câmara <strong>de</strong> contagem Sedgewick-Rafter. Apartir <strong>de</strong>sta contagem, volume equivalente ao número <strong>de</strong> células <strong>de</strong>sejado era adicionado à água<strong>de</strong> estudo.Os experimentos <strong>de</strong> pré-ozonização foram realizados consi<strong>de</strong>rando-se estudos cinéticos <strong>de</strong>consumo <strong>de</strong> ozônio e avaliação do efeito do oxi<strong>da</strong>nte sobre as células, tendo-se como variáveis a<strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> celular ou turbi<strong>de</strong>z, dose <strong>de</strong> ozônio e pH inicial. O tempo <strong>de</strong> contato foi sempre igual a10 minutos. As condições avalia<strong>da</strong>s para os cultivos laboratoriais e para a água natural sãoindica<strong>da</strong>s na Figura 1.A concentração <strong>da</strong> solução estoque <strong>de</strong> ozônio, assim como a concentração <strong>de</strong> ozônio residualnas amostras foram <strong>de</strong>termina<strong>da</strong>s <strong>de</strong> acordo com o método colorimétrico 4500-O 3 (APHA, 2005)utilizando o reagente índigo trisulfonato (ɛ 600nm =20.000 M -1·cm -1 ). A avaliação <strong>da</strong> integri<strong>da</strong><strong>de</strong> celularantes e após a exposição <strong>da</strong>s cianobactérias ao processo oxi<strong>da</strong>tivo foi realiza<strong>da</strong> empregando-se okit colorimétrico BacLight TM (Molecular Probes, Inc.) (BOULOS et al., 1999; STOCKS, 2004;BERNEY et al., 2007), com a avaliação basea<strong>da</strong> na coloração <strong>da</strong>s células: ver<strong>de</strong>s (células viáveis);vermelhas (células <strong>da</strong>nifica<strong>da</strong>s).A quantificação <strong>de</strong> microcistina antes e após a oxi<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> M. aeruginosa por ozonização foirealiza<strong>da</strong> utilizando-se kit ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (ABRAXIS 520011) parato<strong>da</strong>s as condições avalia<strong>da</strong>s. A i<strong>de</strong>ntificação <strong>da</strong>s variantes <strong>de</strong> microcistina existentes na amostrafoi realiza<strong>da</strong> a partir <strong>de</strong> cromatografia líqui<strong>da</strong> segui<strong>da</strong> <strong>de</strong> espectrometria <strong>de</strong> massas por meio <strong>de</strong>extração em fase sóli<strong>da</strong> em modo on-line (on-line SPE e LC MS/MS).6


Figura 1. Fluxograma representativo dos experimentos <strong>de</strong> pré-ozonização com cultivo <strong>de</strong> células <strong>de</strong> cianobactérias efloração natural.Para a avaliação <strong>da</strong> formação <strong>de</strong> subprodutos (trihalometanos e ácidos haloacéticos), apóscloração <strong>da</strong>s amostras ozoniza<strong>da</strong>s ou não, alíquotas foram recolhi<strong>da</strong>s para extração líquido/líquidocom hexano, como <strong>de</strong>scrito no Stan<strong>da</strong>rd Methods 6232B (APHA, 1998) para THM e extraçãolíquido/líquido com éter metil terc-butílico (MTBE) seguido por <strong>de</strong>rivatização com metanol ácido, <strong>de</strong>acordo com o Método USEPA 552.2 (USEPA, 1995) para HAA. Todos os subprodutos foramanalisados por cromatografia gasosa (CP-3800, Varian) com <strong>de</strong>tecção por captura <strong>de</strong> elétrons(GC/ECD). Para as avaliações cinéticas foram consi<strong>de</strong>rados o fator CT (concentração residual <strong>de</strong>ozônio x tempo <strong>de</strong> contato) e o <strong>de</strong>senvolvimento <strong>de</strong> um mo<strong>de</strong>lo <strong>de</strong> predição <strong>de</strong> <strong>de</strong>man<strong>da</strong> inicial <strong>de</strong>ozônio e mo<strong>de</strong>lagem cinética <strong>de</strong> n-ésima or<strong>de</strong>m.4 RESULTADOS E DISCUSSÃOOs resultados obtidos a partir dos cultivos laboratoriais e <strong>da</strong>s amostras <strong>de</strong> água natural serãoapresentados <strong>de</strong> forma sequencial, consi<strong>de</strong>rando-se os efeitos do ozônio na estrutura <strong>da</strong>s célulase na liberação e oxi<strong>da</strong>ção dos constituintes intracelulares.7


COD extracelular (mg·L -1 )COD extracelular (mg·L -1 )4.1 Efeito <strong>da</strong> ozonização na liberação <strong>de</strong> COD <strong>da</strong>s célulasA ozonização <strong>da</strong>s suspensões <strong>de</strong> células <strong>de</strong> cianobactérias resultou em um aumentosubstancial na concentração <strong>de</strong> COD no meio como indicado na Figura 2 para a <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong>250.000 cel·mL -1 . Como observado, proporcionalmente, a maior quantificação <strong>de</strong> COD extracelularfoi observa<strong>da</strong> já no primeiro tempo <strong>de</strong> contato avaliado (0,5 min). Este comportamento po<strong>de</strong> seratribuído a duas condições distintas: uma rápi<strong>da</strong> reação entre o ozônio e a biomassa celular, com aformação direta <strong>de</strong> COD; ou uma reação indireta a partir <strong>da</strong> lise celular <strong>da</strong>s cianobactérias, levandoà liberação dos compostos intracelulares (MÜLLER et al., 2003; HAMMES et al., 2007; RAMSEIERet al., 2011).2,00,5 mgO3/L_pH6 0,5 mgO3/L_pH8(a)2,50,5 mgO3/L_pH6 0,5 mgO3/L_pH8(b)1,52,0 mgO3/L_pH6 2,0 mgO3/L_pH84,0 mgO3/L_pH6 4,0 mgO3/L_pH82,02,0 mgO3/L_pH6 2,0 mgO3/L_pH84,0 mgO3/L_pH6 4,0 mgO3/L_pH81,51,01,00,50,50,00,0 0,5 1,5 3,0 5,0 10,0Tempo (min)0,00,0 0,5 1,5 3,0 5,0 10,0Tempo (min)Figura 2. Liberação <strong>de</strong> COD para M. aeruginosa (a) e A. flos-aquae (b) para a <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> 2,5x10 5 cel·mL -1 ;dose <strong>de</strong> ozônio <strong>de</strong> 0,5, 2,0 e 4,0 mg·L -1 e pH <strong>de</strong> 6 e 8.Como mostrado na figura cita<strong>da</strong> acima, doses mais eleva<strong>da</strong>s <strong>de</strong> ozônio ten<strong>de</strong>ram a resultar emuma maior concentração <strong>de</strong> COD extracelular. A influência do pH na reativi<strong>da</strong><strong>de</strong> do ozônio emtermos <strong>de</strong> COD extracelular também foi observa<strong>da</strong>. Uma maior quanti<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> COD foi libera<strong>da</strong> empH 8 se comparado a pH 6. Um aumento na concentração <strong>de</strong> COD em maiores valores <strong>de</strong> pH (5,5a 9,0) foi também observado por Huang, Cheng e Cheng (2008). Em pH alcalino, a maiorconcentração <strong>de</strong> íons hidróxido (OH - ) promove a <strong>de</strong>composição do ozônio e a formação <strong>de</strong> radicaishidroxila ( • OH) (WIDRIG; GRAY; MCAULIFFE, 1996; VON GUNTEN, 2003).As mesmas consi<strong>de</strong>rações são atribuí<strong>da</strong>s a maior <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> células (1.500.000 cel·mL -1 ),tendo-se apenas uma proporcionalmente maior concentração <strong>de</strong> COD observa<strong>da</strong>.8


4.2 Efeito do ozônio sobre a integri<strong>da</strong><strong>de</strong> celular <strong>de</strong> M. aeruginosa e A. flos-aquaeO impacto <strong>da</strong> ozonização sobre a integri<strong>da</strong><strong>de</strong> celular foi verificado pelo método BacLight TM ,respectivamente. Como observado na Figura 3b e Figura 3d, uma per<strong>da</strong> imediata <strong>da</strong> integri<strong>da</strong><strong>de</strong>celular após a exposição ao ozônio para ambas as espécies <strong>de</strong> cianobactérias foi observa<strong>da</strong>: to<strong>da</strong>sas células apresentaram uma coloração vermelho/alaranjado mesmo para o menor tempo <strong>de</strong>contato (30 ± 5 s) e dose <strong>de</strong> ozônio <strong>de</strong> 0,5 mg·L -1 . Esses resultados indicam <strong>da</strong>nos imediatos àmembrana celular em valores <strong>de</strong> CT ≤ 0,2 mg·min/L para todos os experimentos <strong>de</strong> ozonização,para ambas as espécies <strong>de</strong> cianobactéria, os valores <strong>de</strong> pH e as <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong>s <strong>de</strong> célula adotados. Aredução no número <strong>de</strong> células após a ozonização foi reduzi<strong>da</strong> (M. aeruginosa em pH 6) ou nula(<strong>de</strong>mais condições).(a) (b) (c) (d)Figura 3. Impacto <strong>da</strong> ozonização sobre a viabili<strong>da</strong><strong>de</strong> celular a partir do método BacLight TM . Células <strong>de</strong> M.aeruginosa (a) antes e (b) após ozonização; células <strong>de</strong> A. flos-aquae (c) antes e (d) após ozonização (pH 6com 0,5 mgO 3·L -1 - 30 s <strong>de</strong> tempo <strong>de</strong> contato).4.3 Impacto <strong>da</strong>s cianobactérias e COD sobre o <strong>de</strong>caimento do ozônioPara ca<strong>da</strong> curva <strong>de</strong> <strong>de</strong>caimento, avalia<strong>da</strong> <strong>de</strong> forma individual, um mo<strong>de</strong>lo <strong>de</strong> pseudo-primeiraor<strong>de</strong>m foi ajustado por regressão não-linear. O perfil <strong>de</strong> <strong>de</strong>caimento do ozônio na ausência <strong>de</strong>células foi mais lento se comparado ao perfil <strong>de</strong> <strong>de</strong>caimento quando as células estavam presentes.Em pH 6 a taxa <strong>de</strong> <strong>de</strong>caimento mostrou-se mais estável, para as três doses aplica<strong>da</strong>s, do que empH 8. Os maiores <strong>de</strong>caimentos foram sempre observados para A. flos-aquae se comparado a M.aeruginosa, o que po<strong>de</strong> ser associado a uma maior biomassa para a espécie filamentosa.4.4 Formação <strong>de</strong> subprodutos a partir <strong>de</strong> células <strong>de</strong> cianobactériasOs resultados obtidos indicaram a formação predominante <strong>de</strong> clorofórmio (CHCl 3 ) e ácidodicloroacético (DCAA) nos ensaios com M. aeruginosa e <strong>de</strong> CHCl 3 , DCAA e ácido tricloroacético9


THM e HAA (µg·L -1 )THM e HAA (µg·L -1 )(TCAA) para A. flos-aquae. A legislação brasileira (Portaria 2.914) (BRASIL, 2011) preconiza umvalor total <strong>de</strong> 100 µg·L -1 para THM e 80 µg·L -1 como valor máximo permitido como padrão <strong>de</strong>potabili<strong>da</strong><strong>de</strong>. Os mesmos valores são adotados pela legislação cana<strong>de</strong>nse (CANADA, 2006; 2008).Os valores obtidos para a <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> células estu<strong>da</strong><strong>da</strong> (250.00 cel·mL -1 ) <strong>de</strong> até 38,4 e 62,7 µg·L -1 <strong>de</strong> THM e 13,5 e 23,9 µg·L -1 <strong>de</strong> HAA para M. aeruginosa e A. flos-aquae, respectivamente,indicam que a presença <strong>da</strong>s cianobactérias estu<strong>da</strong><strong>da</strong>s em águas superficiais po<strong>de</strong>riam,principalmente para o THM, aumentar a concentração final <strong>de</strong> subprodutos formados, <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ndo<strong>da</strong> quali<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>da</strong> água.Na Figura 4 tem-se representado o comportamento <strong>de</strong> formação <strong>de</strong> THM e HAA nas condições<strong>de</strong> pH (6 e 8) e <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> células (250.000 cel·mL-1) para ambas as espécies estu<strong>da</strong><strong>da</strong>s.706050403020100Sem ozônioTHMHAACOD extracelular0,5 mg O3/L2,0 mg O3/LpH 6 pH 84,0 mg O3/LSem ozônio0,5 mg O3/L2,0 mg O3/L4,0 mg O3/L2,01,51,00,50,0COD extracelular (mg·L -1 )(a)706050403020100Sem ozônioTHMHAADOC extracelular0,5 mg O3/L2,0 mg O3/LpH 6 pH 8Figura 4. Formação <strong>de</strong> THM e HAA após ozonização <strong>de</strong> M. aeruginosa (a) e A. flos-aquae (b) em pH 6 e 8 eapós 10 min <strong>de</strong> tempo <strong>de</strong> contato com 0,5, 2 e 4 mgO 3·L -1 para 2,5x10 5 cel·mL -1 .4,0 mg O3/LSem ozônio0,5 mg O3/L2,0 mg O3/L4,0 mg O3/L2,01,51,00,50,0COD extracelular (mg·L -1 )(b)4.5 Efeito <strong>da</strong> ozonização na liberação e oxi<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> toxina intracelularA imediata alteração na estrutura celular <strong>de</strong> M. aeruginosa foi novamente verifica<strong>da</strong> com oaumento <strong>da</strong> concentração <strong>de</strong> toxina extracelular após 0,5 min <strong>de</strong> tempo <strong>de</strong> contato empraticamente to<strong>da</strong>s as condições. As concentrações remanescentes <strong>de</strong> toxina, total e extracelular,após 10 min <strong>de</strong> exposição ao ozônio nas condições avalia<strong>da</strong>s são apresenta<strong>da</strong>s na Tabela 1. A<strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistinas mostrou-se mais efetiva a pH 6. Conforme <strong>de</strong>stacado por Al Momanie Jarrah (2010), a <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção mais lenta a pH alcalino sugere que a microcistina apresenta umamaior afini<strong>da</strong><strong>de</strong> com o ozônio molecular do que com os radicais hidroxila.A reação <strong>de</strong> oxi<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistina com o ozônio é <strong>de</strong>scrita como uma reação <strong>de</strong> segun<strong>da</strong>or<strong>de</strong>m, sendo <strong>de</strong> primeira or<strong>de</strong>m para ca<strong>da</strong> um dos reagentes, mas po<strong>de</strong> ser consi<strong>de</strong>ra<strong>da</strong> <strong>de</strong>pseudo-primeira em relação a <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>da</strong> toxina em virtu<strong>de</strong> dos curtos intervalos <strong>de</strong> tempo10


utilizados nos ensaios cinéticos (Eq. 1) (Al momani e Jarrah, 2010). A constante <strong>de</strong> veloci<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong>liberação é maior do que a constante <strong>de</strong> veloci<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>da</strong> toxina, sendo a constante <strong>de</strong><strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção superior a pH 6. d[Tox]kap [ Toxina ]dt on<strong>de</strong>, k ap é a constante cinética <strong>de</strong> pseudo-primeira or<strong>de</strong>m para a <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>da</strong> toxina.Tabela 1. Ozônio residual e <strong>da</strong>dos <strong>de</strong> <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistina após ozonização <strong>da</strong>s células <strong>de</strong> M.aeruginosaResidual <strong>de</strong> ozônio (mg·L -1 ) - pH 6Tempo (min)250.000 cel·mL -1 1.500.000 cel·mL -10,0 0,0 0,5 2,0 4,0 0,0 0,5 2,0 4,00,5 0,0 0,3 2,1 3,9 0,0 0,3 1,6 3,01,5 0,0 0,2 1,6 3,7 0,0 0,2 0,8 2,63,0 0,0 0,1 1,4 3,4 0,0 0,1 0,6 2,25,0 0,0 0,1 1,3 3,0 0,0 0,0 0,3 1,610,0 0,0 0,0 0,9 2,6 0,0 0,0 0,2 1,1Concentração <strong>de</strong> toxina (µg·L -1 )Total 8,1 0,3 (96%)* 0 (100%) 0 (100%) 27,1 7,4 (73%) 0 (100%) 0 (100%)Extracelular 0,0 0,2 0,0 0,0 0,2 5,7 0,0 0,0Residual <strong>de</strong> ozônio (mg·L -1 ) - pH 8Tempo (min)250.000 cel·mL -1 1.500.000 cel·mL -10,0 0,0 0,5 2,0 4,0 0,0 0,5 2,0 4,00,5 0,0 0,2 1,1 2,2 0,0 0,3 1,1 1,41,5 0,0 0,1 0,6 1,2 0,0 0,1 0,2 0,43,0 0,0 0,0 0,2 0,7 0,0 0,0 0,1 0,15,0 0,0 0,0 0,1 0,4 0,0 0,0 0,1 0,010,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0Concentração <strong>de</strong> toxina (µg·L -1 )Total 7,4 0,6 (92%) 0 (100%) 0 (100%) 30,1 16,9 (44%) 3,7 (88%) 0 (100%)Extracelular 0,0 0,6 0,0 0,0 0,2 7,1 2,6 0,05 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕESNas condições estu<strong>da</strong><strong>da</strong>s po<strong>de</strong>-se verificar que uma reduzi<strong>da</strong> dose <strong>de</strong> ozônio (0,5 mg·L -1 ) foisuficiente para causar uma completa per<strong>da</strong> <strong>de</strong> integri<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> M. aeruginosa e A. flos-aquae, paraambas as <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong>s <strong>de</strong> célula e valores <strong>de</strong> pH avaliados. Verificou-se que to<strong>da</strong>s as variáveisavalia<strong>da</strong>s, pH, <strong>de</strong>nsi<strong>da</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> células e dose <strong>de</strong> ozônio, exerce influência no processo e que a açãodo ozônio na célula, causando a liberação dos constituintes internos po<strong>de</strong> aumentar aconcentração <strong>de</strong> subprodutos formados na etapa <strong>de</strong> pós-cloração. No entanto, a ozonização <strong>da</strong>scélulas <strong>de</strong> M. aeruginosa foi efetiva na <strong>de</strong>gra<strong>da</strong>ção <strong>de</strong> microcistina intracelular, tendo-se ummelhor rendimento a pH 6 e 2 mgO 3·L -1 .De forma geral, po<strong>de</strong>-se consi<strong>de</strong>rar que a aplicação do ozônio como uma etapa <strong>de</strong> prétratamentopo<strong>de</strong> ser uma alternativa interessante para evitar que a presença <strong>de</strong> cianotoxinas e11


eduzir o número <strong>de</strong> células ao final do tratamento <strong>de</strong> águas superficiais oriun<strong>da</strong>s <strong>de</strong> ambien<strong>tese</strong>utrofizados e com presença <strong>de</strong> cianobactérias, <strong>de</strong>s<strong>de</strong> que sejam consi<strong>de</strong>ra<strong>da</strong>s etapassubsequentes a este processo, visando à redução dos precursores <strong>de</strong> THM e HAA. Este processose constitui em um avanço tecnológico no que concerne ao tratamento <strong>de</strong> águas, uma vez que osprocessos convencionais não se mostram efetivos na remoção <strong>de</strong> cianotoxinas e a presença<strong>de</strong>stes organismos e seus metabólitos é ca<strong>da</strong> vez maior e mais preocupante quando se consi<strong>de</strong>raa saú<strong>de</strong> <strong>da</strong> população atendi<strong>da</strong>.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. AL MOMANI, F. A.; JARRAH, N. Treatment and kinetic study of cyanobacterial toxin by ozone.Journal of Environmental Science and Health Part A, v. 45, p. 719-731, 2010.2. APHA. Stan<strong>da</strong>rd Methods for the Examination of Water and Wastewater. APHA, A., WEF.Washington, D. C.: American Public Health Association 1998.3. BERNEY, M. et al. Assessment and interpretation of bacterial viability by using theLIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and EnvironmentalMicrobiology, v. 73, n. 10, p. 3283-3290, 2007.4. BRASIL. Portaria N 2914. Brasília: Ministry of Health 2011.5. CANADA. Gui<strong>de</strong>lines for Canadian Drinking Water Quality: Gui<strong>de</strong>line TechnicalDocument - Trihalomethanes. Otawa: Fe<strong>de</strong>ral-Provincial-Territorial Committee on DrinkingWater of the Fe<strong>de</strong>ral-Provincial-Territorial Committee on Health and the Environment. 2006.6. ______. Gui<strong>de</strong>lines for Canadian Drinking Water Quality: gui<strong>de</strong>line technical document -Haloacetic acids. Otawa: Fe<strong>de</strong>ral-Provincial-Territorial Committee on Drinking water of theFe<strong>de</strong>ral-Provincial-Territorial Committee on Health and the Environment 2008.7. CARVALHO, L. R. et al. A toxic cyanobacterial bloom in an urban coastal lake, Rio Gran<strong>de</strong> doSul state, Southern Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 39, p. 761-769, 2008.8. COSTA, I. A. S. et al. Occurrence of toxin-producing cyanobacteria blooms in a braziliansemiarid reservoir. Braz. J. Biol., v. 66, n. 1B, p. 211-219, 2006.12


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