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III.1. MATERIAL E MÉTODOS73III.1.1. Imunofenotipagem de linfócitos T CD4+ e CD8+ do sangue periférico delinfonodos poplíteos por citometria de fluxoIII.1.1.1. Obtenção do antígeno solúvel de taquizoítas de N. caninumO AgNc foi preparado a partir de taquizoítas derivados de cultivo celular. Ostaquizoítas coletados foram lavados 2 vezes em PBS, por centrifugação a 600 x g,durante 10 minutos. O sedimento de parasitos foi ressuspenso em 1 ml de PBS estéril esubmetido a 10 ciclos de congelamento a -80 ºC e descongelamento em banho-maria a37 ºC. Logo após a suspensão foi centrifugada a 15000 x g durante 1 hora a 4 ºC. Osobrenadante foi coletado e a concentração de proteína determinada pelo kit “BCAProtein Assay”. O AgNc foi então armazenado em freezer -80ºC, em alíquotas de 100 laté o momento do uso.III.1.1.2. Estimulação de células de linfonodos poplíteos in vitroOs linfonodos poplíteos dos cães do G1 e G2, além dos dois animais adultoscontroles, foram retirados por meio de ato cirúrgico aos 30 dpi, sendo os animaismantidos em analgesia e em condições assépticas. Após a excisão, uma parte doslinfonodos foi macerado em PBS estéril e centrifugado por 10 minutos, 600 x g, a 4 o C. Aseguir, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 10 ml de PBSestéril, e submetido à nova lavagem. A separação dos linfócitos foi realizada por meiode gradiente de densidade com Histopaque 1077, na proporção de 1:1 com PBS estéril,sendo centrifugados a 400 x g, por 30 minutos, a 4 o C. A fração contendo os linfócitos foiretirada e aproximadamente 1 x 10 6 células foram adicionados nos poços de uma placade cultivo celular, que continham meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino esubmetidos a três tratamentos distintos: 1.) sem estímulo exógeno (Meio – controlenegativo); 2.) estimulados com ConA (2,5 g/ml), uma lectina que se apresenta comopotente mitógeno de células T (controle positivo); e 3.) com adição de AgNc (25 g/ml),para se observar as respostas antígeno-específicas. Os linfócitos foram cultivados por72 horas, a 37 o C, com injeção constante de 5% de CO 2 .