Histologia Básica, Texto e Atlas - 12ª Edição - Junqueira & Carneiro

1 1 Métodos de Estudo em Histologia
técnica é chamada de hibridização in situ. Essa técnica é
excelente para averiguar se uma célula tem uma sequência
específica de DNA (p. ex., um gene ou parte de um gene), ou
para definir a localização de um gene em um cromossomo
ou identificar as células nas quais um gene específico está
sendo transcrito. Um trecho de DNA deve ser inicialmente
desnaturado por calor ou agentes desnaturantes, fazendo
com que as suas duas cadeias se separem. As cadeias (chamadas
de sondas) tornam-se, então, prontas para serem
ligadas a um segmento de cadeia simples de DNA ou a um
segmento de RNA que sejam complementares à sequência
que desejamos analisar. A sonda pode ser obtida por clonagem,
por amplificação da sequência por meio de PCR (reação
em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain
reactíon) ou por síntese se a sequência desejada for curta.
A sonda deve ser ligada a um marcador, normalmente um
isótopo radioativo (que pode ser localizado por radioautografia)
ou um nucleotídio modificado (digoxigenina), que
pode ser identificado por imunocitoquímica.
Na hibridização in situ as lâminas que contêm os cortes
de tecido, células ou cromossomos são inicialmente
aquecidas para separar as cadeias duplas de seu DNA.
Em seguida, uma solução contendo a sonda é colocada
sobre o espécime por um período necessário para hibridização.
Depois de lavar a lâmina, a localização da sonda
ligada a sua sequência complementar é revelada pelo
marcador utilizado (Figura l.26).
Hibridização pode também ser executada com DNA ou
RNA purificados, colocados em apoios sólidos. Trechos de
moléculas de DNA ou de RNA são separados por tamanho
por meio de eletroforese em gel de agarose ou em gel de
poliacrilamida. Em seguida, são transferidos a uma folha
de náilon ou de nitrocelulose por meio de um solvente em
que os ácidos nucleicos podem ser analisados por hibridização.
A técnica de identificação de DNA é chamada de
Southern blotting; quando a eletroforese é feita com moléculas
de RNA, a técnica é chamada Northern blotting.
As técnicas de hibridização são altamente específicas e
habitualmente utilizadas em pesquisa, diagnóstico clínico
e medicina forense.
..,. Problemas na interpretação de cortes
• Distorções e artefatos provocados pelo
processamento dos tecidos
Ao estudar e interpretar cortes de tecidos é importante
lembrar-se de que o que está sendo observado é o resultado
final de uma série de processos que começam com a fixação
e terminam com a coloração do corte. As várias etapas desse
procedimento podem distorcer os tecidos, fornecendo uma
imagem que pode diferir da que os tecidos apresentavam
quando vivos. Uma causa de distorção é a retração produzida
pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da parafina usada
para inclusão. A retração é atenuada quando os tecidos são
incluídos em resina.
Uma consequência da retração é o aparecimento de espaços
artificiais nas células e entre as células e outros componentes
de tecido. Outra fonte de espaços artificiais é a perda
de moléculas que não foram mantidas corretamente nos
tecidos pelo fixador ou que foram retiradas pelas soluções
de desidratação e clareamento. Exemplos de moléculas não
preservadas são o glicogênio e lipídios.
Todos esses espaços artificiais e outras distorções causadas
pelo procedimento de preparação dos cortes são
chamados artefatos de técnica. Outros artefatos podem
incluir pregas do corte (que podem ser confundidas com
capilares sanguíneos), precipitados de corantes ou de
sujeira (que podem ser confundidos com grânulos citoplasmáticos)
e muitos mais. Os estudantes devem estar
atentos para a existência de artefatos e precisam tentar
reconhecê-los para não serem enganados por eles.
• Totalidade do tecido
Uma grande dificuldade apresentada por cortes de
microscopia de luz é a impossibilidade de se corar diferencialmente
todos os componentes das células e tecidos
em um só preparado. Seria muito desejável, mas quase
impossível, observar células por um microscópio de luz e
enxergar os seus núcleos, as mitocôndrias, os lisossomos,
os peroxissomos, todos envolvidos por uma membrana
celular e, externamente, por uma membrana basal e por
matriz extracelular contendo fibras colágenas, elásticas e
reticulares. Para se conseguir essa imagem, é necessário
examinar várias preparações diferentes, cada qual corada
por outro método, e assim obter uma visão completa da
composição e estrutura de um tecido. Por outro lado, o
microscópio eletrônico de transmissão torna possível a
observação de células com todas as suas organelas e inclusões,
envolvidas pela membrana e pelos componentes da
matriz extracelular.
• Duas dimensões e três dimensões
Quando uma estrutura tridimensional é cortada em
secções muito delgadas, as secções parecem ter somente
duas dimensões: comprimento e largura. Isso frequentemente
conduz o observador a erros se ele não se conscientizar
de que uma esfera seccionada é vista como um
círculo e que um tubo seccionado é visto como um anel
(Figura l.27). Quando um corte é observado ao microscópio,
o estudante sempre deve imaginar que algo pode
estar faltando à frente ou atrás daquele corte, uma vez
que muitas estruturas são mais espessas que o corte.
Além disso, deve lembrar-se também de que os componentes
de um tecido ou órgão são geralmente seccionados
ao acaso.
Para entender a arquitetura de um órgão, é necessário
estudar secções feitas em planos diferentes. Às vezes,
somente a análise de secções consecutivas e a sua reconstrução
em um volume tridimensional tornam possível
compreender a organização de um órgão complexo.