RAPORTUL ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC (RST)

RAPORTUL ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC
(RST)
Contract nr.: 32147/01.10.2009
Acronim: ECODIVERGEN
Titlul proiectului:
„Efectele poluării asupra dimensiunii populaţiilor naturale,
distribuţiei şi diversităţii genetice a speciilor genului
Rhizobium în diferite zone agricole din România şi rolul
acestora în remedierea solurilor”
Etapa de execuţie nr. 1
Titlul etapei:
“Evaluarea factorilor de risc şi a impactului acestora asupra
bacteriilor Rhizobium”
Obiectivul general al proiectului:
„... de a contribui, prin intermediul cunoştinţelor teoretice
fundamentate ştiinţific şi al soluţiilor tehnologice elaborate, la
protecţia şi reconstrucţia ecologică a zonelor critice şi la conservarea
ariilor protejate”.
Obiectivul etapei de execuţie:
„Evaluarea cantitativă a factorilor de risc, în special la nivelul
solurilor, în zonele luate în studiu, a impactului acestora asupra
proprietăţilor solului şi a surselor generatoare”.

I. CUPRINS
I. Cuprins ..............................................................................................
II. Rezumatul etapei ...............................................................................
III. Descrierea știinţifica și tehnică, cu punerea în evidenţă a rezultatelor
etapei și gradul de realizare a obiectivelor .........................................
1. Studiu privind factorii de risc și impactul acestora asupra
bacteriilor Rhizobium .......................................................................
2. Particularitătile genetice ale rhizobiilor si modalităţi de studiu al
acestora ...........................................................................................
2.1. Genomul speciilor de bacterii fixatoare de azot .................................
2.2. Metode de biologie moleculară folosite în vederea studierii bacteriilor
fixatoare de azot ...........................................................................
2.3. Metode bazate pe studierea ADN extracromozomal. Profilul plasmidial..
2.4. Metode de analiză a genomului rizobiilor bazate pe tehnologia PCR ......
3. Documentaţie privitoare la caracteristicile ecologice şi economice
ale zonelor luate în studiu și starea iniţială a terenurilor pe care se
vor desfășura experienţele în etapele următoare .............................
3.1. Perimetrul experimental Moara Domnească (terenuri arabile din
Câmpia Română) ..........................................................................
3.2. Perimetrul experimental cu terenuri/soluri contaminate cu metale grele
(Copşa Mică şi Neferal-Acumulatorul) ..............................................
3.3. Perimetrul experimental cu pajişti naturale (ICDP-Brașov) ..................
4. Protocoale experimentale și metode de lucru pentru etapa
următoare ........................................................................................
4.1. Protocol experimental pentru terenuri arabile (Moara Domnească) .......
4.2. Protocol experimental pentru terenuri contaminate cu metale grele
(ICPA-București) ...........................................................................
4.3. Metode de izolare a ADN din culturi de rhizobacterii ...........................
4.4. Protocol experimental pentru perimetrul cu pajiști naturale (ICDP-
Brașov) .......................................................................................
IV. Concluzii .............................................................................................
V. Bibliografie .........................................................................................
2
3
5
5
10
12
15
16
16
19
19
28
40
44
44
45
45
46
49
51
2

II. REZUMATUL ETAPEI
Contaminarea cu metale grele este larg răspândită în prezent. Solurile pot fi
contaminate cu metale grele ca urmare a unei largi varietăţi de surse antropice,
precum metalurgia, mineritul, industria energetică, aplicarea pesticidelor şi a
îngrşămintelor chimice, aplicarea nămolurilor de epurare pe solurile agricole şi
altele.
Poluarea solului, ca şi degradarea acestuia, pot afecta puternic funcţionarea lui,
atât ca suport esenţial al vieţii pe pământ, cât şi ca filtru pentru apă în percolarea ei
prin spre apa freatică sau în scurgerea ei spre apa de suprafaţă.
Poluarea/contaminarea solului poate afecta sau inhiba dezvoltarea plantelor sau
poate introduce elemente toxice în lanţul nutritiv prin absorbţia acestora de către
plante şi acumularea lor în ţesutul organic, cu consecinţe nedorite asupra omului şi
celorlalte vieţuitoare. În acelaşi sens, poate acţiona şi asupra microorganismelor din
sol.
Studiul bacteriilor Rhizobium și condiţiile de viaţă ale acestora în solurile din
România se impune, datorită rolului acestora în creșterea fertilităţii solurilor. În
acest proiect au fost prevăzute obiective care vizează studiul bacteriilor Rhizobium
în trei zone diferite ale ţării, pe tipuri de soluri diferite și în condiţiile cultivării unor
specii de plante leguminoase compatibile cu condiţiile ecologice ale fiecărei zone. Un
aspect important al cercetărilor este legat de evidenţierea efectelor unor factori
antropici, respectiv poluarea cu metale grele, asupra diversităţii genetice a acestui
gen de bacterii și asupra capacităţii lor de a nodula și a fi active în simbioza cu
leguminoasele.
Stadiul actual al cercetărilor privitoare la bacteriile Rhizobium și la relaţia lor cu
mediile poluate este diferit de la o ţară la alta. Totuși, apreciem că ţările care
întrunesc condiţii favorabile pentru culturi anuale de leguminoase sau pentru culturi
perene , în special S.U.A., Japonia, Franţa, India, Germania, U.K. și altele, acordă o
importanţă covârșitoare acestor specii.
Pe plan internaţional există preocupări constante referitoare la supravegherea
stării ecologice a solurilor şi a mediului înconjurător în ansamblul său. Cercetările
referitoare la biodiversitatea şi biologia solurilor au căpătat o mare amploare după
anii 1990, respectiv după summit-ul de la Rio de Janeiro privitor la problemele
mediului înconjurător, la care s-a adopat Convenţia Internaţională asupra
biodiversitărţii. Aceste cercetări au luat amploare datorită conştientizării riscurilor
indusrializării şi impactului acestora asupra solului, ca factor de stabilitate pentru
mediul înconjrător. Conservarea biodiversităţii solurilor şi ameliorarea acesteia acolo
unde s-au produs acţiuni cu impact negativ (poluarea solurilor cu contaminanţi
organici sau cu metale grele, degradarea fizică a solurilor cu implicaţii grave asupra
condiţiilor de viaţă ale organismelor vii din sol etc.) reprezintă teme de interes
major pentru oamnii de ştiinţă şi pentru specialişti în general, întrucât de acestea
depinde fertilitatea naturală a solurilor şi echilibrul ecologic al arealelor vizate.
Rhizobium spp. sunt bacterii gram-negative ale solului care au o semnificaţie
profundă din punct de vedere ştiinţific şi agronomic datorită abilităţii lor de a stabili
simbioze de fixare a azotului cu plantele leguminoase, care are o importanţă majoră
în menţinerea fertilităţii solului. Din această cauză şi luând în considerare
importanţa meguminoaselor pentru consumul uman şi animal este necesar să se
acordea tenţie efectelor pe care le exercită metalele grele asupra izolatelor de
3

Rhizobium ca organisme vii libere sau ca organisme asociate simbiotic cu
leguminoasele.
Pentru solurile din România, ca şi pentru cele din alte ţări, prezenţa azotului în
sol este foarte importantă, azotul fiind elementul mineral major cu rol definitoriu în
creşterea şi dezvoltarea plantelor, respectiv în realizarea obiectivului de randament
la fiecare cultură agricolă. Cu atât mai mult, în condiţiile crizei energetice, a creşterii
exigenţelor oameilor faţă de calitatea produselor agricole utilizate în alimentaţie şi în
furajarea animalelor, în condiţiile deficitului financiar al agricultorilor şi, mai ales, în
condiţiiile necesităţii creşterii preocupărilor pentru protecţia mediului înconjurător,
existenţa activă și diversitatea bacteriilor din genul Rhizobium este foarte
importantă.
In această ordine de idei se impune repunerea în cauză a importanţei acestor
bacterii pentru economia agricolă românească, pentru protecţia mediului şi pentru
calitatea produselor agricole.
Scopul acestui proiect este de a contribui, prin intermediul cunoştinţelor
teoretice fundamentate ştiinţific şi al soluţiilor tehnologice elaborate, la protecţia şi
reconstrucţia ecologică a zonelor critice şi la conservarea ariilor protejate.
Pentru realizarea acestui scop, respectiv pentru atingerea obiectivelor specifice
și, implicit, a obiectivului general al proiectului, s-a realizat un plan de realizare a
activităţilor pe etape. Obiectivul primei etape este de a evalua cantitativ factorii de
risc, în special la nivelul solurilor, în zonele luate în studiu și impactul acestora
asupra proprietăţilor solului, precum și evaluarea surselor generatoare. Pentru
aceasta s-a realizat o identificare a unor perimetre cu risc pentru
biodiversitatea solului și pentru mediul înconjurător, în general și perimetre
necontaminate. Au fost identificate sursele de poluare, s-a realizat o
caracterizare ecologică și economică a fiecărui perimetru experimental, s-
au efectuat analize chimice la sol pentru evidenţierea cantitativă a
contaminanţilor și s-au realizat protocoalele experimentale pentru etapele
în continuare.
Totodată, în această etapă au fost prelevate probe de sol din perimetrele
experimentale menţionate în vederea efectuării analizelor microbiologice utilizând
metode clasice și metode moderne pentru a caracteriza starea iniţială a solului din
punct de vedere al prezenţei bacteriilor Rhizobium. Probele au fost pregătite
corespunzător tehnicilor actuale pentru realizarea izolatelor specifice. Rezultatele
analizelor microbiologice obţinute pentru starea iniţială a solurilor (toamna anului
2008) urmează a fi comparate cu rezultatele ce se vor obţine în primăvara anului
2009 la analizele ce se vor realiza în absenţa plantei gazdă. Această comparaţie are
rolul de a evidenţia impactul factorilor climatici și al transformărilor ce se petrec în
sol pe parcursul iernii asupra microorganismelor Rhizobium.
Pentru izolarea ADN de la rhizobacterii poate fi utilizat kit-ul Wizard Genomic
furnizat de Promega sau pot fi aplicate și sisteme semiautomatizat de izolare a ADN
genomic, așa cum este sistemul Maxwell.
De asemenea, pentru a studia biodiversitatea comunităţii microbiene din sol nu
este obligatorie cultivarea bacteriilor ce populează asemenea mediu, fiind suficientă
izolarea ADN direct din probele de sol. Pentru a se realiza acest lucru se va testa
protocolul descris de Zhou și colab. (1996).
4

III. DESCRIEREA ȘTIINŢIFICA ȘI TEHNICĂ, CU PUNEREA ÎN
EVIDENŢĂ A REZULTATELOR ETAPEI ȘI GRADUL DE REALIZARE
A OBIECTIVELOR
1. Studiu privind factorii de risc și impactul acestora asupra
bacteriilor Rhizobium
Studiul bacteriilor Rhizobium și condiţiile de viaţă ale acestora în solurile din
România se impune, datorită rolului acestora în creșterea fertilităţii solurilor. În
acest proiect au fost prevăzute obiective care vizează studiul bacteriilor Rhizobium
în trei zone diferite ale ţării, pe tipuri de soluri diferite și în condiţiile cultivării unor
specii de plante leguminoase compatibile cu condiţiile ecologice ale fiecărei zone. Un
aspect important al cercetărilor este legat de evidenţierea efectelor unor factori
antropici, respectiv poluarea cu metale grele, asupra diversităţii genetice a acestui
gen de bacterii și asupra capacităţii lor de a nodula și a fi active în simbioza cu
leguminoasele. În acest scop s/au luat în considerare următoarele perimetre
experimentale:
• Perimetrul Moara Domnească reprezentat de Ferma didactică și
experimentală Moara Domnească a USAMV-București, situată în Câmpia
Română;
• Perimetrul Neferal, reprezentat de zona periurbană a orașului
București, direcţia Est în care s-au luat în considerare terenuri (susceptibile
de a fi poluate cu metale grele) învecinate întreprinderii Neferal-
Acumulatorul; acest perimetru experimental se află tot în Câmpia Română,
întrunind condiţii ecologice asemănătoare celor de la Ferma Moara
Domnească;
• Perimetrul Copșa Mică (terenuri poluate cu metale grele);
• Perimetrul ICDP-Brașov, care deţine terenuri acoperite de pajiști într-o
zonă ferită de riscuri de poluare a solurilor.
În toate aceste zone sau pe soluri importate din aceste zone se vor realiza
experienţe pentru a se pune în evidenţă diversitatea genetică și activitatea
bacteriilor Rhizobium. De asemenea, prin comparaţie vor fi evidenţiate riscurile
prezentate de metalele grele pentru aceste bacterii. Experienţele vor urma
realizarea obiectivelor propuse în acest proiect. Baza de date ce se va realiza ca
urmare a acumulărilor cantitative și calitative date va sta la baza realizării unei
ecotehlogii menită să permită remedierea solurilor contaminate
(bioremedierea) cu metale grele, atât în cazul celor două perimetre experimentale
poluate (Neferal și Copșa Mică), cât și în cazul altor zone în care solurile au suferit
astfel de procese dăunătoare.
Stadiul actual al cercetărilor privitoare la bacteriile Rhizobium și la relaţia lor cu
mediile poluate este diferit de la o ţară la alta. Totuși, apreciem că ţările care
întrunesc condiţii favorabile pentru culturi anuale de leguminoase sau pentru culturi
perene , în special S.U.A., Japonia, Franţa, India, Germania, U.K. și altele, acordă o
importanţă covârșitoare acestor specii.
Pe plan internaţional există preocupări constante referitoare la supravegherea
stării ecologice a solurilor şi a mediului înconjurător în ansamblul său. Cercetările
referitoare la biodiversitatea şi biologia solurilor au căpătat o mare amploare după
5

anii 1990, respectiv după summit-ul de la Rio de Janeiro privitor la problemele
mediului înconjurător, la care s-a adopat Convenţia Internaţională asupra
biodiversitărţii. Aceste cercetări au luat amploare datorită conştientizării riscurilor
indusrializării şi impactului acestora asupra solului, ca factor de stabilitate pentru
mediul înconjrător. Conservarea biodiversităţii solurilor şi ameliorarea acesteia acolo
unde s-au produs acţiuni cu impact negativ (poluarea solurilor cu contaminanţi
organici sau cu metale grele, degradarea fizică a solurilor cu implicaţii grave asupra
condiţiilor de viaţă ale organismelor vii din sol etc.) reprezintă teme de interes
major pentru oamnii de ştiinţă şi pentru specialişti în general, întrucât de acestea
depinde fertilitatea naturală a solurilor şi echilibrul ecologic al arealelor vizate.
Contaminarea cu metale grele este larg răspândită în prezent (Nriagu, 1990).
Solurile pot fi contaminate cu metale grele ca urmare a unei largi varietăţi de surse
antropice, precum metalurgia, mineritul, industria energetică, aplicarea pesticidelor
şi a îngrşămintelor chimice, aplicarea nămolurilor de epurare pe solurile agricole şi
altele (Giller et al., 1989; McGrath et al., 1995; Robinson et al., 2001).
În ultimele decenii au crescut îngrijorările privind contaminarea cu metale grele,
nu doar datorită toxicităţii lor pentru animale, plante şi microorganisme dar, de
asemenea, pentru că ele devin imobilizate irevesibil în componentele solului
(McGrath şi Lane, 1989). Nivelurile conţinuturilor solurilor în metale depind de
nivelurile emisiilor, de transportul metalului de la sursă la locul acumulării şi de
reţinerea acestuia odată ajuns în sol (Alloway, 1995). Câteva metale, precum Zn,
Cu, Ni şi Cr sunt micronutrienţi esenţiali sau benefici pentru plante, animale şi
microorganisme, în timp ce altele, precum Cd, Hg şi Pb au funcţii biologice şi/sau
fiziologice necunoscute. Oricum, toate aceste metale pot fi toxice la concentraţii
relativ reduse (Gadd, 1992). Atunci când au fost expuse unor concentraţii moderate
de metale grele, microorganismele solului s-au dovedit a fi foarte sensibile (Giller et
al., 1998). Numeroase studii au arătat că metalele influenţează negativ
microorganismele (Shi et al., 2002), afectându-le creşterea, morfologia şi activităţile
(Bååth et al, 1998; Lakzian at al., 2002; Khan şi Scullion, 2002), inclusiv fixarea
simbiotică a N 2 (McGrath et al., 1988). Aceste metale exercită o presiune selectivă
asupra organismelor, care determină apariţia de populaţii microbiene cu toleranţă
ridicată la metale dar au o diversitate scăzută în comparaţie cu ariile vecine
nepoluate (Bååth et al, 1992; Bååth et al, 1998).
Dintre metalele neesenţiale, cadmiul (Cd) este cel mai ameninţător datorită
mobilităţii sale foarte mari şi biodisponibilităţii. Prezenţa sa în solurile agricole se
datorează unor practici comune, precum aplicarea îngrăşămintelor fosfatice, a
nămolurilor industriale şi domesice, care exercită adesea un imact negativ asupra
comunităţilor microbiene ale solurilor. Studiul mecanismelor de detoxifiere a
bacteriilor din sol privitor la Cd este foarte important pentru creşterea abilităţii
acestora de a tolera concentraţii ridicate de metal în soluri. Întrucât bacterii ale
solului, precum Rhizobium, sunt foarte importante penru creşterea fertilităţii solului,
ele oferă un foarte bun sistem de studiu al interacţiunilor Cd-microorganisme în
sistemele agricole.
Biodiversitatea solurilor este dată de prezenţa în interiorul acestora a numeroase
forme de viaţă reprezentate de macrofaună, microfaună, flora şi microflora
adăpostite sol. Toate aceste forme de viaţă ce se regăsesc în sol fac obiectul de
studiu al biologiei solului dată fiind importanţa lor covârşitoare pentru fertilitatea
solului.
6

Flora solului, respectiv microflora sunt reprezentate de numeroase specii de
bacterii, ciuperci, actinomicete, alge, cianofite etc. Dintre speciile de bacterii
prezente în sol, o importanţă deosebită o au cele implicate în ciclul azotului, iar
dintre acestea, bacteriile aparţinând genului Rhizobium sunt foarte mult studiate
datorită rolului lor în fixarea azotului atmosferic (molecular) în simbioză cu specii de
plante superioare din familia Leguminosae. Importanţa acestor specii este foarte
mare şi, de aceea, foarte mulţi cercetători şi specialişti din întreaga lume întreprind
cercetări cu privire la impactul diferitelor activităţi antropice asupra lor.
Rhizobium spp. sunt bacterii gram-negative ale solului care au o semnificaţie
profundă din punct de vedere ştiinţific şi agronomic datorită abilităţii lor de a stabili
simbioze de fixare a azotului cu plantele leguminoase, care are o importanţă majoră
în menţinerea fertilităţii solului (Somasegaran and Hoben, 1994). Din această cauză
şi luând în considerare importanţa meguminoaselor pentru consumul uman şi
animal este necesar să se acordea tenţie efectelor pe care le exercită metalele grele
asupra izolatelor de Rhizobium ca organisme vii libere sau ca organisme asociate
simbiotic cu leguminoasele (Ibekwe et al., 1995).
Pentru solurile din România, ca şi pentru cele din alte ţări, prezenţa azotului în
sol este foarte importantă, azotul fiind elementul mineral major cu rol definitoriu în
creşterea şi dezvoltarea plantelor, respectiv în realizarea obiectivului de randament
la fiecare cultură agricolă. Cu atât mai mult, în condiţiile crizei energetice, a creşterii
exigenţelor oameilor faţă de calitatea produselor agricole utilizate în alimentaţie şi în
furajarea animalelor, în condiţiile deficitului financiar al agricultorilor şi, mai ales, în
condiţiiile necesităţii creşterii preocupărilor pentru protecţia mediului înconjurător,
existenţa activă și diversitatea bacteriilor din genul Rhizobium este foarte
importantă.
In această ordine de idei se impune repunerea în cauză a importanţei acestor
bacterii pentru economia agricolă românească, pentru protecţia mediului şi pentru
calitatea produselor agricole.
Aşa cum s-a arătat, numeroşi factori pot contribui la poluarea solurilor, ceea ce
implică efecte asupra biodiversităţii solurilor. Dat fiind că iformaţia privitoare la
starea solurilor din România din acest punct de vedere, respectiv al supravieţuirii, al
abilităţii de nodulare şi al diversităţii genetice a bacteriilor Rhizobium în diferite
condiţii de sol este mai puţin decât insufiecintă, prin acest proiect se urmăreşte, pe
de-o parte obţinerea de date referitoare la prezenţa bacteriilor în diferite condiţii de
sol, iar pe de altă parte elaborarea şi punerea în aplicare a unei ecotehnologii
capabile să contribuie la menţinerea şi ameliorarea prezenţei bacteriilor Rhizobium
în sol.
Schimbările ce ar putea interveni în comunitatea microbiană a solului ca urmare
a poluării pot influeţa ciclurile nutrienţilor şi, prin urmare, fertilitatea solului.
Poluanţii antropogeni emişi de activităţile industriale şi depozitaţi în mediul
înconjurător pot avea un impact negativ asupra activităţii, ecologiei şi dinamicii
populaţiilor microorganismelor indigene ale solurilor. Preocupările referitoare la
toxicitatea unor metale grele pentru microorganismele solului au crescut şi, deşi
multe metale, precum Zn, Cu, Ni, Co şi Cr sunt elemente esenţiale (oligoelemente
esenţiale) ele pot avea efecte toxice la concentraţiile întâlnite în mediile poluate.
Rezultate experimentale au arătat că numărul de microorganisme din sol şi
activitatea acestora sunt reduse în solurile contaminate cu metale grele (Brooks et
al., 1986a, 1986.b). Numeroşi cercetători au confirmat că toxicitatea metalelor grele
7

afectează în general supravieţuirea bacteriilor din genul Rhziobium (Redy et al.,
1983).
Microorganismele solului sunt sensibile la expunerea timp îndelungat la
concentraţii de metale grele în sol (Giller et al., 1998). Rezultate experimentale au
arătat că tulpini ale Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, bacterii fixatoare de azot
în simbioză cu trifoiul alb (Trifolium repens L.), au fost eliminate la concentraţii
destul de mici pentru a provoca toxicitatea plantelor (McGrath et al., 1988; Giller et
al., 1989). Aşadar, nu întotdeauna studiile de fitotoxicitate pot pune în evidenţă
riscurile pentru alte organisme vii, precum bacteriile din sol. Studii ale populaţiilor
de Rhizobium efectuate în Marea Britanie au demonstrat că doar o singură izolată
de Rhiobium a supravieţuit (Giller et al., 1989; Hirch et al., 1993), care a fost
tolerantă la metale grele (Chaudri et al., 1992a) dar nu a fost activă în fixarea N 2 în
simbioză cu trifoiul alb (Giller et al., 1989). Alte cercetări realizate în experienţe pe
termen lung în Germania au demonstrat pierderea completă a bacteriilor R.
Leguminosarum bv. trifolii (Chaudri et al., 1993) la concentraţii de metale grele
peste limitele de protecţia mediului ale Uniunii Europene (CEC, 1986). Aceasta a
condus la recomandări privind stringentă normelor şi a limitelor pentru prevenirea
acumulării Zn în solurile din UK pe care se aplică nămoluri de epurare.
Literatura de specialitate relatează că prezenţa metalelor poate cauza, prin
presiune selectivă, o creştere a proporţiei de tulpini rezistente la metalele grele în
cadrul unei populaţii de Rhizobium.
Metalele grele influenţează negativ microorganismele afectându-le creşterea,
morfologia şi activităţile. Metalele pot, de asemenea, exercita o presiune asupra
microorganismelor determinând apariţia de populaţii microbiene cu o mare toleranţă
la metalele grele. Dată fiind importanţa leguminoaselor pentru hrana oamenilor şi a
animalelor, precum şi datorită rolului acestora în creşterea fertilităţii solurilor este
necesar să se acorde atenţie efectelor metalelor grele asupra izolatelor de
Rhizobium.
Cercetări în care s-au folosit anumite tulpini, au arătat că unele particularităţi
genetice ale bacteriilor pot contribui la creşterea gradului de supravieţuire a acestor
microorganisme prin adaptarea lor la condiţiile de stres (Castro et al., 2003). Dar,
cum poluanţii din mediul înconjurător reprezintă un risc pentru populaţiile indigene
de bacterii, sunt necesare informaţii mai aprofundate, privitoare la răspunsurile
adaptative ale bacteriilor în mediile contaminate.
Pe plan internaţional există un interes foarte mare privind acumularea de noi
cunoştinţe referitoare la factorii de mediu care influenţează diversitatea şi structura
comunităţilor microbiene, mai ales odată cu conştientizarea faptului că
biodiversitatea poate garanta stabilitatea ecosistemelor, productivitatea şi rezilienţa
mediilor perturbate (Mader et al., 2002). Fixarea azotului prin simbioza dintre
bacteriile din sol (Rhizobium) şi plantele leguminoase are o importanţă foarte mare
pentru nutriţia cu azot a plantelor. Bacteriile Rhizobium sunt larg răspândite în
diferite medii terestre, atât în solul arabil, cât şi în rizosfera plantelor gazdă
(leguminoase) şi a celor care nu sunt gazdă (grâul, ovăzul şi porumbul) (Chelius și
Triplett, 2001; Clark et al., 2002; Hilali et al., 2001; Schmalenberger et al., 2001;
Schmalenberger et al., 2003). Pe plan naţional şi internaţional, chiar dacă
diversitatea şi compoziţia populaţiilor naturale de Rhizobium in interacţiunile
simbiodice au fost studiate de o manieră extensivă (Amarger, 2001), foarte puţine
informaţii sunt disponibile privitor la factorii care le afectează la nivelul solului.
8

Poluarea mediului înconjurător cu metale grele poate fi datorată aplicării, de-a
lungul timpului, pe solurile agricole a unor materiale reziduale în scopul reciclării
acestora (nămoluri de epurare, deşeuri menajere urbane compostate), utilizării
pesicidelor sau diferitelor altor activităţi antropice precum mineritul. Datorită
acestora se pot produce efecte dăunătoare asupra mediului, predominante fiind cele
cronice (Chaudri et al., 1992; Chaudri et al., 1993).
Rhizobium descrie o gamă largă de bacterii ale solului aparţinând genurilor
Rhizobium, Bradzyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium şi Azorhizobium, care
sunt capabile să intre în simbioză cu plante, predominant din familia Leguminosae
(Sprent, 2001; O’Hara et al., 2003). Leguminoasele, împreună cu bacteriile
Rhizobium fixează azotul atmosferic şi din această cauză sunt adesea introduse în
ecosistemele agricole pentru a creşte fertilitatea organică a solurilor, a realiza
economie de azot şi o anumită flexibilitate a sistemului de producţie agricolă. În
lume se fixează anual circa 44—66 milioane tone N 2 , iar aproape jumătate din acest
azot este valorificat de agricultură. Fixarea azotului prin intermediul leguminoaselor
are potenţialul de a contribui major la dezvoltarea unei agriculturi viabile din punct
de vedere economic şi respectuaoasă faţă de mediul înconjurător. Importanţa
cultivării leguminoaselor pentru boabe şi pentru furaje este subestimată. Aceste
specii ocupă 12-15% din suprafaţa arabilă a planetei şi asigură sursa proteică
pentru hrana a circa o treime din populaţie, în general şi pentru peste două treimi
din populaţia ce trăieşte în condiţii de subzistenţă (Graham și Vance, 2003).
Pe plan naţional, informaţia privitoare la populaţiile microbiene din solurile din
România nu numai că este foarte puţină dar nu acoperă zone care au fost afectate
de diferiți factori de risc, care trebuie supuse unor programe de reconstrucție
ecologică. Pe de altă parte, necesitatea unor informaţii de actualitate privitoare la
biologia populaţiilor de Rhizobium, la diversitatea genetică a acestora şi la efectele
pe care le au asupra lor diferţi factori antropici şi factori de mediu este dată de
interesul crescând al agricultorilor pentru agricultura ecologică şi de obiectivitatea şi
iminenţa unor eco-tehnologii ce trebuie puse la punct pentru reconstrucţia ecologică
şi pentru remedierea solurilor contaminate sau degradate.
Speciile Rhizobium sunt bacterii gram-negative care au o semnificaţie ştiinţifică
şi agronomică datorată abilităţii lor de a stabili simbioze cu plantele leguminoasele
pentru fixarea azotului, care are o importanţă majoră în menţinerea fertilităţii
solului.
Procesul de bioremediere presupune utilizarea unor organisme vii pentru
îndepărtarea din mediu a unor contaminanți. O definiție acceptată a acestui proces
se referă la eliminarea cu ajutorul microorganismelor a poluanţilor din mediu, ceea
ce asigură transformarea poluanţilor toxici în compuşi netoxici, fără afectarea
mediului. Acest proces ale loc în natură, în prezența microorganismelor indigene, și
include îndepărtarea contaminaților prin preluarea lor sau prin metabolizarea lor. Cel
mai frecvent tip de bioremediere presupune capacitatea unor microorganisme
indigene (ce populează solul) de a mineraliza compușii contaminanți, în special a
poluanților organici. Populațiile microbiene de la nivelul solurilor prezintă o mare
diversitate metabolică în special a bacteriilor și indică potențialul acestora de
utilizare ca instrumente de bioremediere.
Nutrienții, de tipul compușilor cu azot sau fosfor, sunt deseori adăugați pentru
a accelera procesul de bioremediere, asigurând necesarul pentru creșterea
microbiană (biostimulare). Dacă nu se adaugă asemenea substanțe, iar
9

microorganismele endogene realizează totuși îndepărtarea contaminanților, se
vorbește de bioremediere intrinsecă. In schimb, dacă în zona contaminată se
adaugă microorganisme capabile de decontaminare, se spune că s-a realizat un
proces de bioremediere stimulată.
In prezent există numeroase informații legate de implicarea
microorganismelor din sol în procesele de bioremediere a solurilor poluate mai ales
cu hidrocarburi. O atenție specială se acordă microorganismelor prezente la nivelul
rizosferei plantelor, ele fiind stimulate de exudate produse de plante astfel că
organismele capabile să metabolizeze contaminanții sunt stimulate. Se vorbește în
acest caz de fitoremediere sau rizoremediere.
Monitorizarea organismelor capabile de procese biodegradative ca și a
modificărilor la nivel populațional constituie o parte importantă a monitorizării
procesului de bioremediere. Dintre metodele frecvent folosite pentru acest lucru
sunt de menționat: tehnica DGGE („denaturing gradient gel electrophoresis”) în care
fragmente de ADN, în special provenite din amplificarea genei pentru ARNr 16S,
sunt separate în gel de electroforeză, în condiții speciale (denaturante), pe baza
mobilității diferențiate a benzilor ce au un conținut diferit de baze azotate;
amplificarea genei pentru ARNr 16S sau a secvențelor de tip ITS și analiza de
restricție a produșilor de amplificare rezultați; secvențierea parțială sau completă a
genei pentru ARNr 16S (Lindstrom și colab., 2003). Pentru studierea bacteriilor
simbionte fixatoare de azot atmosferic pot fi folosite metode moleculare variate,
rezultatele obținute până în prezent evidențiind o serie de diferențe, atât între specii
(polimorfism interspecific) cât în cadrul aceleiași specii (intraspecific). De asemenea,
cercetările comparative realizate între tulpini izolate din diferite tipuri de
soluri,poluate sau nu, au permis observarea unor modificări nu numai la nivelul
populațiilor existente, ci și al particularităților moleculare a izolatelor.
O direcție importantă de cercetare actuală este cea a utilizării bacteriilor
fixatoare de azot pentru eliminarea din sol a anumitor categorii de poluanți, prin
convertirea lor în forme nepoluante. Astfel, în acest scop pot fi folosite bacteriile
aparținând genurilor Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium și
Azorhiobium (MacLean și colab., 2007). Aceste bacterii diferă în privința mărimii
ceea ce determină unde anume pot fi folosite cel mai eficient. De asemenea,
localizarea lor la nivelul solului reprezintă un factor critic în dezvoltarea unui
ecosisteme, iar simbiozele dintre plantele leguminoase și rhizobii sunt cele ce pot fi
utilizate pentru restabilirea fertilității solurilor contaminate (de exemplu cu metale
grele).
2. Particularitătile genetice ale rhizobiilor si modalităţi de studiu
al acestora
Plantele leguminoase au reputația că mențin fertilitatea solului deoarece
asimilează azotul atmosferic prin intermediul bacteriilor simbionte aflate la nivelul
nodozităților de pe rădăcinile acestor plante. Cercetările realizate în ultimele decenii
asupra organismelor procariote capabile să fixeze azotul atmosferic, reducându-l la
amoniac, au arătat că ele sunt de mai multe tipuri: bacterii libere fixatoare de azot
(Azotobacter, Clostridium, Klebsiella), bacterii fixatoare de azot ce pot realiza
10

asociaţii cu diferite plante (Azospirillum), bacterii fixatoare endosimbionte
(Rhizobium, Bradyrhizobium, Synorhizobium etc).
Cea mai mare semnificație practică o au bacteriile simbionte fixatoare de azot,
astfel că ele au reprezentat obiectul de studiu pentru foarte mulți cercetători. Dacă
din punct de vedere taxonomic, până nu demult aceste bacterii erau grupate doar în
două genuri, Rhizobium și Bradyrhizobium, în prezent, pe baza metodelor
moleculare (studiul secvenței de nucleotide a ampliconilor corespunzători ADNr 16S)
aceste bacterii sunt separate în șase genuri ce includ mai mult de 27 specii:
Azorhizobium, Allorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium,
Sinorhizobium (Teamroog și Boonkerd, 2006). Cel mai bine caracterizat sistem de
fixare simbiotică a azotului molecular este simbioza dintre plantele leguminoase
(Leguminosae) şi bacteriile din genul Rhizobium. In cursul interacţiunilor dintre cele
două tipuri de organisme, la nivelul rădăcinilor plantelor se produc nodozităţi (fig.1)
la nivelul cărora sunt create condiţiile pentru ca bacteriile să convertească N 2 la NH 3 ,
astfel că plantele respective nu mai necesită alte surse suplimentare de azot pentru
creştere. De asemenea, bacteriile din genul Rhizobium aflate la nivelul nodozităţilor,
sub forma bacteroizilor, beneficiază de o serie de compuşi cu carbon şi de alţi
nutrienţi produşi de planta gazdă, necesari creşterii bacteriene.
Fig.1. Aspect macroscopic al nodozităţilor de pe rădăcinile de mazăre produse ca urmare
a simbiozei cu R.leguminosarum
Pe lângă importanţa economică şi ecologică a procesului de fixare simbiotică a
N 2 , analiza acestui sistem poate contribui la înţelegerea unor fenomene biologice
complexe, incluzând reglarea genelor implicate în dezvoltare, organogeneza
vegetală sau mecanismele interacţiunii celulă bacteriană-celulă vegetală (Michiels şi
Vanderleyden, 1994).
In condiţiile în care în sol există un deficit de azot, bacteriile din genul Rhizobium
„infectează” plantele leguminoase, determinând formarea de nodozităţi. Trebuie
precizat faptul că există o anumită specificitate a procesului de simbioză, deoarece
fiecare specie bacteriană este capabilă să infecteze doar o anumită specie vegetală,
sau grup de specii. Realizarea simbiozei are loc în mai multe etape, controlate atât
de gene bacteriene cât ale plantei gazdă. Studiile genetice şi citologice au evidenţiat
trei etape principale:
• ataşarea celulelor bacteriene la nivelul perilor radiculari (proces indus
de prezenţa flavonoizilor sintetizaţi de celulele vegetale), urmată de
deformarea şi răsucirea perişorilor
• pătrunderea bacteriei la nivelul ţesutului vegetal, multiplicarea sa şi
extinderea „infecţiei”
11

• inducerea unei activităţi meristematice la nivelul cortexului radicular în
care se formează bacteroizii (forma de diferenţiere a bacteriilor simbiotice
fixatoare de azot), culminând cu formarea nodozităţilor, sinteza nodulinelor
de către celulele vegetale (de exemplu, leghemoglobina) şi începerea
procesului de fixare a N 2 (Megias şi colab., 1993).
Fixarea biologică a azotului joacă un rol cheie în agricultura durabilă, iar
studierea acestor bacterii fixatoare de azot (denumite generic rizobii) din sol
contribuie la elucidarea posibilităţilor folosirii acestora în agricultură. Un prim
avantaj al folosirii acestor microorganisme ar fi promovarea fixării biologice al
azotului, şi atingerea unei producţii eficiente, în lipsa fertilizatorilor exogeni. Pentru
optimizarea fixării de azot în cazul plantelor de cultură, microorganismele trebuie să
fie competitive faţă de populaţiile indigene şi să fie eficiente în formarea nodulilor.
Competitivitatea pentru nutrienţii disponibili este unul dintre criteriile de selecţie,
deoarece solul nu oferă un mediu aşa de bogat în nutrienţi ca mediul de cultură
(Stephens şi Rask, 2000).
Studierea diversităţii bacteriilor fixatoare de azot joacă un rol important în
dezvoltarea strategiilor în vederea creşterii contribuţiei fixării biologice a azotului în
productivitatea plantelor de cultură. În ultimele decenii studierea acestor specii s-a
realizat pe baza examinării ADN (Alberton şi colab., 2006). Tehnicile moleculare
folosite în studierea bacteriilor fixatoare de azot sunt diverse, de la stabilirea
profilului plasmidial până la tehnici bazate pe PCR cu primeri arbitrari şi specifici.
2.1. Genomul speciilor de bacterii fixatoare de azot
Arhitectura genomului speciilor de bacterii fixatoare de azot variază considerabil.
In general, speciile de rizobii prezintă un genom format din mai mulți repliconi
(„multipartite genome”), alcătuit dintr-un cromozom circular şi plasmide simbiotice
şi criptice. Relativ recent, la R.meliloti a fost evidențiată prezența a 2 cromosomi
circulari (3,4 Mb și 1,7 Mb) și a unei megaplasmide de 1,4 Mb. Principalul criteriu
care a stat la baza ideii că a doua moleculă de ADN de dimensiuni mari reprezintă
un cromozom şi nu o megaplasmidă este prezenţa de gene esenţiale supravieţuirii
în condiţii normale (de exemplu, gene pentru ARNr sau pentru proteine ribosomale).
Dogma conform căreia bacteriile posedă un singur cromosom a căzut odată cu
dezvoltarea tehnicii electroforezei în câmp pulsatoriu care a permis separarea
moleculelor de ADN de dimensiuni mari, inclusiv a celor lineare.
Analiza genomului bacteriilor endosimbionte din genurile Sinorhizobium,
Rhizobium şi Bradyrhizobium a oferit surprize referitoare la evoluţia şi structura
genomului, procese care sunt strâns influenţate de relaţia plantă-bacterie. Această
organizare genomică este caracteristica speciilor care interacţionează cu o gazdă, şi
este considerat ca un avantaj evolutiv a acestor specii (Gonzales şi colab., 2006).
Genomul rizobiilor este foarte bogat în GC. Din analiza genelor nod, nif, fix s-a
observat că acestea prezintă regiuni bogate în AT, aşadar a fost presupus că aceste
gene fixatoare de azot au provenienţă diferită şi nu au fost în relaţii evolutive cu
genomul iniţial rizobial (Putnoky, 2003).
Genomul rizobiilor este în general mare. Diferenţa în mărimea cromozomului în
cazul speciilor de rizobii depinde de prezenţa şi mărimea ADN extracromozomal
(MacLean şi colab., 2007). O altă observație legată de genomul rizobiilor este aceea
că genele implicate în procesul de simbioză sunt prezente în mai multe exemplare şi
evidențiază secvenţe de inserţie (IS) între ele. De asemenea, s-a remarcat că
12

secvenţele repetitive din genomul rizobiilor sunt de aproximativ 200 de tipuri, se
repetă de câteva ori şi au o mărime de 3.5 kb (Martinez şi colab., 1990).
Studiile comparative efectuate la mai multe grupe de bacterii simbionte fixatoare
de azot au arătat că, la majoritatea speciilor de rizobii, genele esenţiale pentru
simbioză, în particular genele care determină specificitatea plantei gazde, sunt
prezente pe o plasmidă Sym. In plus, tulpinile de rizobii, pe lângă plasmida
simbiotică, prezintă alte plasmide criptice, care nu conțin gene care să determine un
fenotip decelabil. ADN plasmidial poate reprezenta, în mai multe cazuri, mai mult de
50% din ADN total al respectivelor bacterii fixatoare de azot (Laguerre şi colab.
1997). Aceste gene pot fi regăsite grupate la nivelul genomului, formând grupri
(clustere) care pot fi transferate între diferite tulpini bacteriene (transfer orizontal
de gene). Aceste clustere au mărimi de aproximativ 600-700 kb (Kaneko şi colab.,
2000). De asemenea, Stiens şi colab. (2006), studiind plasmida pSmeSM11 de la
S.meliloti a cărei secvență de nucleotide (144 kb) a fost determinată, au observat că
majoritatea genelor localizate la nivelul ei au rol în replicare, recombinare, în
procesele de reparare genetică, în diverse procese metabolice şi de transport, dar
nu și în procesul de simbioză sau în cel de fixare a azotului. De exemplu, pe această
plasmidă a fost identificată o genă care codifică enzima 1-amino ciclopropan – 1
acid carboxilic deaminaza care stimulează creșterea plantei prin scăderea nivelului
etilenei (Glick, 2005).
Genele ce codifică funcţiile necesare fixării N 2 sau pentru formarea nodozităţilor
sunt de obicei grupate (fig.2), ele fiind notate diferit, în funcţie de rolul produşilor
codificaţi. Astfel, genele pentru nodulare sunt: nod (genele pentru recunoaşterea
gazdei şi formarea nodozităţilor); nol (înrudite cu cele pentru nodulare); exo
(codifică pentru sinteza unor exopolizaharide sau lipopolizaharide); fix şi nif (codifică
funcţiile necesare realizării procesului de fixare a N 2 : nif sunt genele de la rizobii
care prezintă omologie cu genele implicate în fixarea N 2 la Klebsiella pneumoniae,
iar genele fix sunt specifice rizobiilor); hsn (determină specificitatea procesului de
nodulare la o anumită gazdă). De exemplu, în categoria genelor nod sunt grupate
16 gene cu funcţii diferite (gene structurale sau gene reglatoare). Dintre acestea,
gena nodD, prin produsul codificat, proteina NodD, controlează funcţionarea
celorlalte gene nod.
Genele implicate direct în fixarea N 2 sunt grupate pe cromosom sau pe plasmide
Sym şi sunt organizate în diferite unităţi transcripţionale. Astfel, genele nifHDK
codifică sinteza subunităţilor complexului nitrogenazic (enzimele ce realizează
fixarea N 2 ); nifA codifică un factor activator pentru genele nifHDK şi pentru alte
gene fix, activitatea sa fiind reglată de nivelul oxigenului (poate fi indusă în
microaerobioză şi inhibată de nivelul crescut al oxigenului); genele nifB, nifN şi nifE
sunt implicate în sinteza şi prelucrarea unui cofactor al nitrogenazei, iar genele nifF
şi nifJ codifică sinteza unor proteine transportoare de electroni (Megias şi colab.,
1993). Alături de genele nif există genele fix, grupate şi ele în unităţi
transcripţionale distincte: genele fixABCX sunt implicate în transportul de electroni
specific pentru sistemul nitrogenazic; genele fixLJ şi fixK sunt gene reglatoare, iar
fixNOQP şi fixGHIS codifică proteine membranare (fig.3).
13

Fig.2. Reprezentarea schematică a organizării genelor implicate în formarea
nodozităţilor şi fixarea N 2 (după Michiels şi Vanderleyden, 1994).
Fig.3. Organizarea genelor nif şi fix şi relaţiile funcţionale dintre acestea la
S.meliloti. Săgeţile îngroşate indică unităţile de transcriere (după Megias şi colab.,
1993).
Exprimarea genelor nif şi fix este controlată de o serie de proteine reglatoare,
activatoarea sau inhibitoare ale transcrierii lor. De asemenea, în ultimii ani s-au
acumulat o serie de date referitoare la procesul de formare a nodozităţilor şi la
evenimentele de recunoaştere specifică ce se realizează între bacterii şi celulele
vegetale gazdă. Cu toate acestea, factorii reglatori ce controlează inducerea sintezei
nodulinelor sau diferenţierea bacteriilor simbionte la bacteroizi rămân încă puţin
înţeleşi. Clarificarea mecanismelor interacţiunilor dintre cei doi parteneri în cursul
14

diferitelor etape ale procesului de simbioză va conduce la posibilitatea extinderii
spectrului de gazde ale bacteriilor din genul Rhizobium şi spre alte specii vegetale
de interes agricol, ceea ce ar putea conduce la creşterea producţiilor agricole cu
cheltuieli mai mici. De asemenea, studiul molecular al genelor nif și nod poate oferi
o serie de informații legate de particularitățile acestora la diferite specii bacteriene,
putând contribui drept criterii ajutătoare utile în taxonomie.
2.2. Metode de biologie moleculară folosite în vederea studierii
bacteriilor fixatoare de azot
Pentru caracterizarea tulpinilor de rizobii şi pentru analiza relaţiilor genetice
dintre acestea au fost propuse o serie de metode de studiu, în majoritate bazate pe
tehnologia PCR. Secvenţierea directă a genelor care codifică ARN ribosomal 16S
(regiunile ADNr)(Laguerre şi colab., 1993) şi analiza RFLP a acestor secvenţe
amplificate (Laguerre şi colab. 1994) au fost folosite pentru caracterizarea rizobiilor
la nivel de specie. Polimorfismul fragmentelor de restricţie (metoda RFLP) constă în
digestia produșilor de amplificare PCR cu enzime de restricţie (enzime care recunosc
situsuri specifice la nivelul ADN și clivează catenele polinucleotidice) rezultând
fragmente specifice, de lungimi diferite. Aceste fragmente de restrictie se analizează
în gel de agaroză, rezultând un profil caracteristic, în general specie-specific.
Secvenţa de nucleotide a ADNr 16S prezintă un caracter conservat în cazul
eubacteriilor astfel că analiza variaţiilor genetice din această regiune nu sunt
potrivite pentru studii legate de diversitatea intraspecifică, ci doar pentru
evidențierea diferențelor dintre specii. O variabilitate mai mare poate fi obţinută prin
analiza secvenţelor intergenice („intergenic spacer sequences” - IGS) dintre genele
16S şi 23S ribosomale (Laguerre şi colab. 1996, 2001). Metoda RFLP combinată cu
analiza regiunii IGS de la nivelul ADNr s-a dovedit a fi cea mai eficace dintre
metodele folosite în vederea diferenţierii speciilor şi tulpinilor bacteriene (Gürther şi
Stanisich, 1996).
Caracterizarea moleculară a tulpinilor de rizobii poate fi realizată prin aplicarea
unor metode bazate pe analiza directă a mai fragmentelor de ADN amplificate
simultan prin utilizarea unor primeri arbitrari. In prezent, pentru analiza RAPD a
tulpinilor de Rhizobium au fost propuși numeroși primerii arbitrari (Coutinho şi colab,
1993, Harrison şi colab., 1992, Ahmad şi colab., 1997, Thomas.-Oates şi colab.
2003). Dooley şi colab. (1993) au propus această metodă pentru identificarea şi
gruparea filogenetică a izolatelor de Rhizobium. Amprentarea genetică
(„fingerprints”) poate fi generată şi prin folosirea unor perechi de primeri care
provin din secvenţe repetitive extragenice palindromice (REP) sau din secvenţe
consens repetitive intergenice enterobacteriene (ERIC) (Versalovic şi colab. 1991).
De Brujin (1992) a demonstrat importanţa REP şi ERIC-PCR în identificarea şi
clasificarea unor specii de Rhizobium. Aceste metode de fingerprinting reflectă
variaţiile din secvenţele de ADN din tot genomul bacterian, dar nu permite
investigarea diversităţii plasmidelor simbiotice de la specii strâns înrudite privind
ADN cromozomal (Laguerre şi colab. 1996).
Divesitatea plasmidială se obţine prin analiza profilului plasmidial (Ahmad şi
colab., 1997, Hartmann şi colab. 1998, Thomas.-Oates şi colab. 2003, Vinuesa şi
colab. 2005) sau prin analiza variabilităţii genelor localizate pe plasmide simbiotice:
de exemplu, gena structurală a nitrogenazei (nif), respectiv regiunile intergenice
15

(IGS) dintre genele nifD şi nifK, care au fost analizate prin metoda RFLP (Jamann şi
colab., 1993).
2.3. Metode bazate pe studierea ADN extracromozomal. Profilul
plasmidial
Datorită dimensiunilor foarte mari ale plasmidelor de la diferitele specii de
rizobacterii, metodele „tradiționale” de izolare a ADN plasmidial s-au dovedit a fi
ineficiente deoarece, în cursul procesului de liză celulară, moleculele de ADN
plasmidial rămân asociate cu cele de ADN cromosomal, fiind eliminate în cursul
centrifugărilor ce au drept scop eliminarea resturilor celulare și a ADN denaturat. Din
acest motiv, de-a lungul timpului au fost propuse o serie de metode, dintre care
unele mai complicate ce presupun condiții speciale de liză controlată și numeroase
etape de lucru, dar cu eficiență scăzută. In anul 1978, Eckhardt a propus o metodă
relativ simplă ce presupune liza celulelor bacteriene direct în gelul de electroforeză,
urmată de separarea electroforetică a moleculelor de ADN de dimensiuni difeirte.
Această metodă precum și o serie de variante optimizate ale acesteia, s-au dovedit
a fi eficiente, astfel că s-a reușit evidențierea profilului plasmidial la numeroase
specii.
Analiza profilului plasmidial al tulpinilor speciei R.meliloti (azi Sinorhizobium) a
evidențiat o serie de diferenţe în privința numărului şi dimensiunilor plasmidelor mai
mici, criptice (30-200 MDa). Plasmida pSym de 1400 MDa era prezentă în toate
tulpinile bacteriene capabile de simbioză (Ahmad şi colab., 1997).
În cazul tulpinilor de rizobii specifice la soia (Bradyrhizobium, Mesorhizobium,
Sinorhizobium), studiile efectuate de Thomas-Oates şi colab. (2003) au evidențiat
prezența a unui număr variat de plasmide, în general 1-6 plasmide. Intre tulpinile
bacteriene analizate, cele care prezentau 2-3 plasmide au fost dominante ca număr
dar, în anumite cazuri a fost observată şi prezența unor plasmide mici.
Literatura de specialitate referitoare la profilul plasmidial conține o serie de
rezultate legate de variabilitatea acestora. Profilul plasmidial se poate schimba
datorită modificării condiţiilor de mediu, în special în cazul prezenței în mediu a unor
cantități crescute de metale grele (Lakzian şi colab. 2002, Lakzian şi colab. 2007).
Profilul plasmidial în cazul izolatelor speciei R. leguminosarum este mult mai variat,
prezentând un număr mare de plasmide la izolatele obţinute din soluri moderat
poluate (Lakzian şi colab. 2002). Studii recente au arătat că, prezența unor
concentrații ridicate de metale grele în sol poate cauza pierderea plasmidelor la
R.leguminosarum (Lakzian şi colab. 2007).
2.4. Metode de analiză a genomului rizobiilor bazate pe tehnologia PCR
Cea mai simplă metodă de studiu este metoda RAPD („randomic amplified
polymorphic DNA”) se bazează, așa cum s-a menționat anterior, pe utilizarea unor
primerii arbitrari care generează produși de amplificare cu dimensiuni variate
(polimorfe), care în urma analizei electroforetice în gel de agaroză, arată un profil
particular genomului ţintă. Metoda RAPD a fost folosită de mai mulţi autori pentru
caracterizarea izolatelor de bacterii fixatoare de azot. Richardson şi colab. (1995) au
folosit doi primeri arbitrari pentru diferenţierea diverselor tulpini de rizobii
(R.meliloti, R.leguminosarum bv trifolii, R.leguminosarum bv. viciae) (tabelul 1),
16

primeri ce s-au dovedit a fi adecvaţi în diferenţierea speciilor de rizobii. Studii
similare dar cu primeri diferiți au fost realizate și la Rhizobium leguminosarul bv
viciae (Handley şi colab.,1998). În cazul izolatelor speciei R. meliloti, Ahmad şi
colab. (1997), produșii de amplificare rezultați în urma reacţiei de PCR au evidenţiat
prezenţa unor grupuri genetic distincte între tulpinile izolate analizate.
Tabelul 1.
Primeri arbitrari folosiţi pentru caracterizarea tulpinilor de bacterii fixatoare de
azot
Specia Secvenţa primerului arbitrar Literatură
Rhizobium ssp. (R.
meliloti, R.l. bv trifolii,
R.l.bv viciae)
5’-GGAAGTCGCC-3’
5’-AGTCGTCCCC-3’
Richardson
şi colab., 1995
Rhizobium meliloti 5’TCGTTAATG(T/A)ACCACCCG3’ Ahmad şi
colab. 1997
Rhizobium
leguminosarum bv viciae
5'- GTAACGACGGCCAGT-3' Handley şi
colab. 1998
rizobii de la soia
5’-TCGGAGTGGC-3’
5’-GTTAGCGGCG-3’
5’-CCGAAGCCCT-3’
5’-CCAGGCGCAA-3’
Thomas-
Oates şi colab.,
2003
Pentru analiza unor tulpini de rizobii izolate din soia s-a folosit metoda RAPD:
utilizându-se patru primeri arbitrari au fost obținute profiluri electroforetice diferite
între rizobii originare din diferite regiuni şi între tulpinile de rizobii din regiuni
similare (Thomas-Oates şi colab., 2003).
Diversitatea genetică a rizobiilor poate fi studiată prin metoda analizei
polimorfismului lungimii fragmentelor de restricţie (analiza RFLP) a unor produși de
amplificare. De cele mai multe ori, în studiul diverselor tulpini bacteriene, inclusiv a
rizobiilor, se utilizează genele ce codifică diversele tipuri de ARNr. Această metodă a
primit denumirea de ARDRA („Amplified Ribosomal DNA Restiction Analysis”), ea
presupunând, așa cum s-a menționat, realizarea a două etape esenţiale:
amplificarea selectivă prin reacţii PCR, iar apoi digestia ampliconilor cu
endonucleaze de restricţie si analiza comparativa a profilurilor rezultate (RFLP).
Cel mai frecvent se studiază regiunea ADNr 16S (care codifică sinteza ARNr
16S). Analiza genelor ADN ribosomal 16S a fost folosită de către Herrera-Cervera şi
colab. (1999) în cazul speciilor de rizobii izolate din nodozități de la fasole (R.etli,
Sinorhizobium fredii, R.gallicum, R.giardinii, R.leguminosarum). Produșii de
amplificare rezultați prin utilizarea unor primeri specifici au fost supuși clivării cu mai
multe enzime de restricţie (AluI, CfoI, DdeI, HaeIII, HinfI, MspI, NdeII şi RsaI), iar
din profilul analizat s-au identificat 5 profile diferite.
O analiză recentă de tip ARDRA asupra genomului izolatelor bacteriene obținute
de la plante de Sesbiana sp. a fost prezentată de Vinuesa şi colab. (2005). Prin
17

amplificarea ADN ribosomal corespunzător ARNr 16S, respectiv 23S, s-au obţinut
doi amplicon cu mărimi diferite: unul de 1.5 kb (corespunzător ADNr 16S) şi de 2.2
kb (corespunzător ADNr 23S). Aceşti produşi au fost digeraţi cu diverse enzime de
restricţie: enzimele CfoI, DdeI şi MspI au fost folosite pentru a obţine profilul RFLP a
secvenţei ADNr 16 S, iar enzimele CfoI, HaeIII şi HinfI au fost utilizate pentru
ampliconul ADNr 23S. Rezultatele obținute au permis observarea unor diferențe
semnificative între izolatele analizate.
O altă secvență ţintă utilă pentru caracterizarea moleculară a rizobiilor poate fi
reprezentată de secvențele de tip ITS („internal transcribed spacer”) aflate între
regiunile codificatoare pentru diferitele tipuri de ARNr (fig.7). Aceaste secvențe
prezintă variabilitate în privința lungimii şi a ordinii nucleotidelor, astfel că oferă
posibilitatea de a fi folosite în diferenţierea speciilor. Analiza RFLP a ampliconilor ITS
este larg folosită pentru caracterizarea tulpinilor de rizobii (Laguerre şi colab. 1996,
Paffetti şi colab. 1996, Bala şi colab. 2001, Alberton şi colab. 2005).
Fig.7. Reprezentarea schematică a secvențelor ITS și IGS
Analiza ITS-PCR-RFLP a fost folosit în cazul studierii rizobiilor provenind de la
fasole şi soia. Ampliconii rizobiilor de la fasole au avut o mărime între 800-1900 pb,
iar ampliconii rizobiilor de la soia 1000-1200 pb. Aceste secvenţe au fost digerate cu
5 enzime de restricţie (HhaI, HinfI, MspI, RsaI, MboI), iar din analiza profilelor s-a
stabilit numărul tulpinilor de rizobii endosimbionte la aceste specii de plante
(Alberton şi colab. 2005).
O altă secvenţă ţintă poate fi reprezentată de regiunile spaţiatoare („intergenic
spacer”) ce separă clusterele de ADNr 16S şi 23S ADN ribosomal (IGS). IGS-PCR-
RFLP a fost folosit pentru diferenţierea unor tulpini de rizobii izolate din soia.
Ampliconul rezultat de aproximativ 2kb a fost tratat cu 3 enzime de restricţie, din
care două enzime de restricţie au arătat diferenţe dintre diferite tulpini (HaeIII şi
MspI), iar nu s-au observat diferenţe în cazul endonucleazei de restricţie (HinfI)
(Thomas-Oates şi colab. 2003).
Regiunea IGS a fost folosită în vederea diferenţierii diferitor tulpini de Rhizobium
leguminosarum. Pentru digestia enzimatică a ampliconilor de 1160-1400 perechi de
baze rezultați prin folosirea unor primeri specifici s-au folosit 7 enzime de restricţie,
dintre care enzimele HaeIII şi TaqI s-au dovedit a fi cele mai eficace (Laguerre şi
colab. 1996).
Tulpinile speciei Bradyrhizobium au fost studiate prin analiza RFLP a
ampliconului de 2,3 kb rezultat prin amplificarea ADNr 6S plus regiunea IGS dintre
genele ADNr 16S şi ADNr 23S. Pentru digestia enzimatică s-au folosit patru enzime
de restricţie: TaqI, CfoI, RsaI şi HaeIII, dintre care enzimele TaqI şi CfoI s-au
dovedit a fi cele mai discriminatorii (au permis evidențierea unui polimorfism
accentuat al fragmentelor de restricție)(Fremont şi colab., 1999).
18

Alte studii moleculare au fost realizate asupra genelor implicate în procesul de
fixare a azotului atmosferic şi formarea nodozităților care sunt localizate
extracromozomal, la nivelul unor megaplasmide. În cazul bacteriei Sinorhizobium
meliloti s-a dovedit că gena nfe care are rol în eficacitatea formării nodozităților este
localizată la nivelul unei plasmide de 212 kb (140 MDa). Prezenţa acestei gene a
fost monitorizată în cazul izolatelor prin metoda PCR, cu primeri specifici (P6 (5’-
AGC CGC TGG TTC AGA CGT AA-3’) şi F2 (5’-TCG ATA TCT TCG AGC ACA GA-3’):
rezultatul reacţiei de amplificare a fost un produs specific de aproximativ 1400 pb
(Hartmann şi colab., 1998).
Prezenţa genelor simbiotice în speciile de rizobii endosimbionte speciei Phaseolus
vulgaris din Spania au fost studiate prin metoda hibridării ADN genomic cu plasmide
care prezentau fragmente ale genelor nif şi nod. Pe baza analizei hibrizilor obținuți,
bacteriile au fost grupate în 2 categorii: grupul bacteriilor cu gene fixatoare de axot
și grupul bacteriilor fără gene fixatoare de azot (Herrera-Cervera şi colab. 1999).
In cazul studierii tulpinilor speciei Rhizobium leguminosarum, de către Laguerre
şi colab. (1996), secvenţele genelor nif şi nod au fost analizate prin metoda RFLP.
Prin metoda PCR s-a amplificat secvenţa IGS dintre genele nifD şi nifK, ampliconul
rezultat având mărimea de 1250 pb. Acest produs de amplificare a fost apoi digerat
cu 8 enzime de restricţie, dintre care enzima HaeIII s-a dovedit a fi cea care asigură
cel mai puternic polimorfism. Pe baza analizei polimorfismului rezultat s-au distins
15 tipuri de genă nif. In mod similar, produsul de amplificare corespunzător IGS
dintre genele nodD şi nodF a avut mărimea de 1450 pb, el fiind apoi clivat cu
enzime de restricţie. Dintre 8 enzime folosite, enzimele CfoI, HaeIII şi TaqI s-au
dovedit a fi cele care au dat cele mai clare diferențe. În urma analizei RFLP au fost
identificate 15 tipuri de gene nod (Laguerre şi colab., 1996).
Variaţia şi numărul plasmidelor simbiotice a fost studiată prin amplificarea
regiunii genei nifH cu primeri specifici regiunii promotor a genei în cazul rizobiilor
izolate de la specia Sesbiana sp. (Mohmmed şi colab., 2001). Această regiune face
parte dintr-o secvenţă repetitivă, care se regăseşte în 5-10 copii pe plasmide
simbiotice. Polimorfismul obţinut prin amplificarea acestei gene a însemnat
evidențierea a 2-11 benzi de mărimi diferite, cuprinse între 200-2600 pb. Această
metodă s-a dovedit mult mai sensibilă fată de metoda profilului plasmidial
(Mohmmed şi colab. 2001).
Cercetările efectuate pe parcursul acestei etape se referă, în primul rând, la
prelevarea de probe de sol, din diferite locații, în vederea izolării de tulpini
bacteriene aparținând genurilor implicate în fixarea simbiotică a azotului atmosferic.
3. Documentaţie privitoare la caracteristicile ecologice şi
economice ale zonelor luate în studiu și starea iniţială a
terenurilor pe care se vor desfășura experienţele în etapele
următoare
3.1. Perimetrul experimental Moara Domnească (terenuri arabile din
Câmpia Română)
Ferma didactică și experimentală Moara Domnească este situată în Câmpia
Română, la circa 15 km Est de București. Ferma are terenuri destinate activităţilor
19

de producţie agricolă, horticolă și zootehnică și terenuri pe care se efectuează
experienţe în domeniul agronomic, unele dintre acestea fiind de o valoare
extraordinară pentru cercetarea știinţifică dată fiind durata lor (peste 30 de ani).
În cadrul suprafeţelor aferente cercetării știinţifice există terenuri înierbate cu
plante de pajiști care vor fi folosite în experimentările ce se vor realiza pentru acest
proiect. De asemenea, o parte dintre experienţele necesare atingerii obiectivelor
proiectului se vor realiza prin înfiinţarea unor culturi experimentale cu plante
leguminoase anuale.
Caracteristicile ecologice ale acestui perimetru experimental permit extrapolarea
rezultatelor experimentale la o zonă vastă din Câmpia Română. De asemenea, acest
perimetru va fi folosit drept martor în vederea comparării rezultatelor experimentale
ce se vor obţine în perimetral Neferal-Acumulatorul.
Caracteristicile ecologice (clima pentru intervalul 2007-2008, solul etc.) ale
perimetrului experimental Ferma Moara Domnească se vor prezenta mai jos.
Datele climatice specific agroecosistemul Moara Domnească au fost înregistrate
cu ajutorul unei staţii meteo automate care este amplasată în cadrul Fermei Moara
Domnească, datele climatice fiind transferate în mod automat într-un computer.
Anul 2007 poate fi caracterizat din punct de vedere climatic ca fiind unul foarte
puţin favorabil plantelor de cultură în zona ecosistemului Moara Domnească, ca
urmare a secetei severe din lunile aprilie, mai, iunie şi iulie, care s-au continuat şi în
lunile de toamnă (fig. 8).
Fig. 8. Tempearturile medii lunare şi precipitaţiile lunare
înregistrate în ecosistemul Moara Domnească
20

Deficitul hidric ridicat a fost asociat cu temperaturi foarte de ridicate în lunile
mai, iunie şi iulie. Deşi precipitaţiile din luna martie au depăşit media multianuală,
totuşi acestea nu au acoperit deficitul din lunile de toamnă şi iarnă, astfel încât
rezerva de apă a solului în primăvară a fost redusă. Ca atare, din punct de vedere
climatic anul 2007 a fost considerat ca fiind cel mai secetos an din ultima jumătate
de secol, mai precis după marea secetă după cel de-al doilea război mondial, care s-
a înregistrat în anul 1947.
Seceta din anul 2007 s-a prelungit până în luna martie a anului 2008, după care
regimul pluviometric s-a ameliorat ca urmare a precipitaţiilor căzute în lunile aprilie
şi mai, care au depăşit valorile medii multianuale specifice zonei. După scurta
perioadă ploioasă, anul 2008 a continuat să fie secetos, precipitaţiile căzute în lunile
iunie şi iulie fiind cu mult sub valorile medii multianuale.
De-a lungul întregului an 2008, temperaturile medii lunare au fost mai mari
decât valorile medii multianuale.
Lunile din timpul perioadei de vegetaţie pot fi caracterizate astfel:
• Luna martie 2008 s-a caracterizat prin precipitaţii reduse comparativ cu
precipitaţiile medii multianuale, cu un deficit pluviometric de 15,2 mm.
Temperatura medie a aerului a fost de 8,9 o C, superioară valorii medii
multianuale de 4,4 o C şi cu limite de variaţie între 4,8 şi 13,4 o C. Valorile termice
extreme înregistrate în luna martie au fost de -2,8 o C şi, respectiv, 22,7 o C,
având o amplitudine de variaţie mare (tabelul 2).
• Luna aprilie 2008 s-a caracterizat prin precipitaţii în cantitate mai mare
comparativ cu precipitaţiile medii multianuale, cu un excedent pluviometric de
15,1 mm. Temperatura medie a aerului a fost de 13,3 o C, superioară valorii
medii multianuale de 11,2 o C şi cu limite de variaţie între 7 şi 18,4 o C. Valorile
termice extreme înregistrate în luna aprilie au fost de 3,8 o C şi, respectiv,
26,6 o C, având o amplitudine de variaţie mare (tabelul 3).
• Luna mai 2008 s-a caracterizat prin precipitaţii în cantitate mai mare
comparativ cu precipitaţiile medii multianuale, cu un excedent pluviometric de
5,7 mm. Temperatura medie a aerului a fost de 17,4 o C, superioară valorii
medii multianuale de 16,5 o C şi cu limite de variaţie între 12,7 şi 24,1 o C.
Valorile termice extreme înregistrate în luna mai au fost de 4,8 o C şi, respectiv,
32 o C, având o amplitudine de variaţie mare (tabelul 4).
• Luna iunie 2008 s-a caracterizat prin precipitaţii reduse comparativ cu
precipitaţiile medii multianuale, cu un deficit pluviometric de 57,3 mm.
Temperatura medie a aerului a fost de 22,2 o C, superioară valorii medii
multianuale de 20,2 o C şi cu limite de variaţie între 15,8 şi 28,1 o C. Valorile
termice extreme înregistrate în luna iunie au fost de 7,1 o C şi, respectiv,
37,8 o C, având o amplitudine de variaţie mare (tabelul 5).
• Luna iulie 2008 s-a caracterizat prin precipitaţii reduse comparativ cu
precipitaţiile medii multianuale, cu un deficit pluviometric de de 10,9 mm.
Temperatura medie a aerului a fost de 23,4 o C, superioară valorii medii
multianuale de 22,1 o C şi cu limite de variaţie între 19,3 şi 26,7 o C. Valorile
termice extreme înregistrate în luna iulie au fost de 12,8 o C şi, respectiv,
37,7 o C, având o amplitudine de variaţie mare (tabelul 6).
21

Tabelul 2
Datele meteo înregistrate în luna martie 2008 în agroecosistemul Moara
Domnească
Temperatura solului
Temperatura aerului
Precipi-
Ziua
Amplitutatii
Media Min. Max. Media Min. Max.
dinea
1 0,4 - - - 10,1 2,8 17,3 14,5
2 0,6 - - - 10,4 6,6 14,2 7,6
3 - - - - 12,2 4,6 19,7 15,1
4 - - - - 11,4 1,8 21,0 19,2
5 - - - - 5,8 3,7 7,9 4,2
6 - - - - 5,2 1,9 8,5 6,6
7 - - - - 7,7 0,7 14,7 14
8 - - - - 10,1 3,9 16,4 12,5
9 - - - - 9,9 2,4 17,3 14,9
10 0,2 - - - 7,8 1,3 14,3 13
11 - - - - 10,6 2,1 19,1 17
12 - - - - 10,7 2,4 18,9 16,5
13 1,2 - - - 8,9 4,9 12,9 8
14 - - - - 8,1 1,8 14,3 12,5
15 - - - - 10,5 3,1 17,9 14,8
16 - - - - 8,1 -0,8 17,0 17,8
17 - - - - 12,7 5,6 19,8 14,2
18 - - - - 10,4 2,7 18,0 15,3
19 - - - - 7,1 2,5 11,6 9,1
20 - - - - 4,8 -2,8 12,3 15,1
21 - - - - 6,7 2,5 10,8 8,3
22 - - - - 7,9 -0,5 16,3 16,8
23 - - - - 11,5 3,2 19,7 16,5
24 - - - - 13,4 4,1 22,7 18,6
25 0,8 - - - 9,2 4,9 13,5 8,6
26 11,0 - - - 5,2 -0,1 10,4 10,5
27 - - - - 7,4 -2,4 17,2 19,6
28 - - - - 7,5 1,1 13,9 12,8
29 - - - - 9,0 2,2 15,8 13,6
30 - - - - 9,5 2,9 16,1 13,2
31 2,2 - - - 5,9 2,5 9,3 6,8
Media - - - - 8,9 2,3 15,4 13,1
Suma 16,4 - - - - - - -
Limite de
variaţie
Valori
medii
multianuale
- - - -
4,8
–
13,4
-2,8
–
6,6
7,9
–
22,7
31,6 - - - 4,4 - - -
4,2
–
19,6
22

Tabelul 3
Datele meteo înregistrate în luna aprilie 2008 în agroecosistemul Moara
Domnească
Temperatura solului
Temperatura aerului
Precipi-
Ziua
Amplitutatii
Media Min. Max. Media Min. Max.
dinea
1 0,6 - - - 7,0 4,5 9,4 4,9
2 - - - - 8,7 4,3 13,1 8,8
3 0,2 - - - 9,9 6,7 13,1 6,4
4 3,0 - - - 10,7 5,9 15,5 9,6
5 0,6 - - - 11,4 4,9 17,9 13
6 20,2 - - - 10,1 8,4 11,9 3,5
7 8,8 - - - 12,7 7,7 17,9 10,2
8 - - - - 14,7 5,5 23,8 18,3
9 - - - - 16,4 10,0 22,8 12,8
10 - - - - 15,0 10,0 20,0 10
11 - - - - 17,8 12,0 22,5 10,5
12 - - - - 18,4 10,3 26,6 16,3
13 - - - - 17,3 13,4 21,2 7,8
14 7,2 - - - 12,1 8,9 15,4 6,5
15 7,6 - - - 8,4 6,1 10,8 4,7
16 3,2 - - - 11,3 6,7 15,8 9,1
17 - - - - 11,7 6,8 16,6 10,2
18 - - - - 14,2 6,3 22,1 15,8
19 0,2 - - - 15,5 9,7 21,3 11,6
20 - - - - 16,9 9,5 24,2 14,7
21 - - - - 17,1 8,9 25,3 16,4
22 9,2 - - - 17,9 12,0 23,8 11,8
23 - - - - 15,1 9,7 20,6 10,9
24 1,4 - - - 10,2 7,6 12,9 5,3
25 - - - - 12,6 7,0 18,3 11,3
26 - - - - 11,3 3,8 18,8 15
27 - - - - 14,4 9,8 19,0 9,2
28 1,0 - - - 12,3 8,5 16,1 7,6
29 - - - - 14,4 8,6 20,2 11,6
30 - - - - 14,8 7,7 21,9 14,2
31 - - - -
Media - - - - 13,3 8,0 18,6 10,6
Suma 63,2 - - - - - - -
Limite de
variaţie
Valori medii
multianuale
- - - -
7
-
18,4
3,8
-
13,4
9,4
-
26,6
48,1 - - - 11,2 - - -
3,5
-
18,3
23

Tabelul 4
Datele meteo înregistrate în luna mai 2008 în agroecosistemul Moara Domnească
Ziua
Temperatura solului
Temperatura aerului
Precipi-
Amplitutatii
Media Min. Max. Media Min. Max.
dinea
1 - - - - 17,5 10,6 24,3 13,7
2 0,8 - - - 15,6 9,3 21,9 12,6
3 32,0 - - - 13,5 9,5 17,4 7,9
4 5,6 - - - 14,2 10,2 18,1 7,9
5 0,2 - - - 13,6 8,1 19,1 11
6 - - - - 13,0 4,8 21,3 16,5
7 - - - - 13,4 6,7 20,1 13,4
8 4,8 - - - 14,1 8,7 19,5 10,8
9 0,6 - - - 12,7 8,4 17,0 8,6
10 2,6 - - - 13,7 8,6 18,9 10,3
11 0,2 - - - 13,3 5,3 21,3 16
12 3,8 - - - 13,4 6,8 20,0 13,2
13 - - - - 15,8 7,2 24,4 17,2
14 - - - - 17,0 8,2 25,8 17,6
15 - - - - 17,8 11,5 24,1 12,6
16 - - - - 18,5 10,2 26,7 16,5
17 - - - - 20,2 11,2 29,2 18
18 - - - - 22,0 13,2 30,7 17,5
19 - - - - 20,6 11,2 30,1 18,9
20 - - - - 21,1 11,8 30,4 18,6
21 5,8 - - - 22,0 13,7 30,2 16,5
22 0,6 - - - 19,5 13,9 25,0 11,1
23 7,2 - - - 18,8 14,6 23,1 8,5
24 9,0 - - - 19,6 13,4 25,7 12,3
25 0,2 - - - 19,6 12,0 27,2 15,2
26 - - - - 20,4 14,3 26,4 12,1
27 - - - - 20,0 12,4 27,6 15,2
28 - - - - 24,1 16,2 32,0 15,8
29 - - - - 17,9 11,8 24,1 12,3
30 - - - - 18,0 9,4 26,5 17,1
31 - - - - 19,2 10,3 28,1 17,8
Media - - - - 17,4 10,4 24,4 13,9
Suma 73,4 - - - - - - -
12,7 4,8 17 7,9
Limite de
- - - - - - -
-
variaţie
24,1 16,2 32 18,9
Valori medii
multianuale
67,7 - - - 16,5 - - -
24

Tabelul 5
Datele meteo înregistrate în luna iunie 2008 în agroecosistemul Moara Domnească
Ziua
Temperatura solului
Temperatura aerului
Precipi-
Amplitutatii
Media Min. Max. Media Min. Max.
dinea
1 2,2 - - - 20,2 15,4 24,9 9,5
2 - - - - 17,2 11,3 23,1 11,8
3 - - - - 15,8 7,1 24,5 17,4
4 - - - - 18,1 8,5 27,7 19,2
5 - - - - 18,5 10,2 26,8 16,6
6 - - - - 19,5 13,2 25,8 12,6
7 0,4 - - - 20,6 14,7 26,5 11,8
8 - - - - 18,0 13,5 22,6 9,1
9 - - - - 20,9 11,7 30,0 18,3
10 - - - - 20,9 12,9 28,8 15,9
11 - - - - 22,4 13,0 31,9 18,9
12 - - - - 22,5 14,2 30,8 16,6
13 - - - - 22,8 16,5 29,0 12,5
14 - - - - 21,1 15,2 27,1 11,8
15 4,4 - - - 18,9 13,7 24,2 10,5
16 - - - - 19,8 12,9 26,8 13,9
17 - - - - 20,8 11,6 30,0 18,4
18 - - - - 24,1 15,7 32,5 16,8
19 - - - - 22,0 14,8 29,1 14,3
20 - - - - 23,3 17,4 29,1 11,7
21 - - - - 24,4 16,5 32,3 15,8
22 - - - - 25,0 17,3 32,6 15,3
23 - - - - 26,3 17,3 35,4 18,1
24 1,2 - - - 28,1 18,3 37,8 19,5
25 - - - - 25,9 18,5 33,3 14,8
26 - - - - 27,2 18,7 35,7 17
27 - - - - 27,4 19,7 35,1 15,4
28 19,6 - - - 25,6 18,9 32,3 13,4
29 1,2 - - - 23,4 17,2 29,5 12,3
30 - - - - 25,0 17,4 32,5 15,1
31 - - - - - - - -
Media - - - - 22,2 14,8 29,6 14,8
Suma 29,0 - - - - - - -
15,8 7,1 22,6 9,1
Limite de
- - - - - - -
-
variaţie
28,1 19,7 37,8 19,5
Valori medii
multianuale
86,3 - - - 20,2 - - -
25

Tabelul 6
Datele meteo înregistrate în luna iulie 2008 în agroecosistemul Moara Domnească
Ziua
Temp. sol
Temp. aer
Precipi-
Amplitutatii
Media Min. Max. Media Min. Max.
dinea
1 - - - - 25,4 18,3 32,6 14,3
2 - - - - 25,0 19,6 30,3 10,7
3 - - - - 22,6 13,7 31,5 17,8
4 - - - - 24,6 15,1 34,0 18,9
5 - - - - 25,8 18,0 33,7 15,7
6 - - - - 22,6 14,9 30,4 15,5
7 - - - - 23,2 13,1 33,3 20,2
8 - - - - 26,7 15,7 37,7 22
9 18,8 - - - 22,3 17,2 27,4 10,2
10 - - - - 22,3 15,0 29,7 14,7
11 - - - - 21,7 12,8 30,7 17,9
12 - - - - 23,5 14,8 32,3 17,5
13 - - - - 24,6 15,2 33,9 18,7
14 - - - - 24,6 14,1 35,0 20,9
15 0,6 - - - 23,5 18,4 28,5 10,1
16 6,0 - - - 19,5 15,4 23,6 8,2
17 - - - - 23,5 16,7 30,4 13,7
18 - - - - 24,4 15,3 33,5 18,2
19 0,8 - - - 25,3 17,5 33,1 15,6
20 - - - - 25,1 16,1 34,1 18
21 - - - - 26,5 16,5 36,6 20,1
22 0,2 - - - 24,4 20,1 28,7 8,6
23 17,6 - - - 19,3 15,0 23,6 8,6
24 6,6 - - - 19,9 14,0 25,8 11,8
25 0,2 - - - 20,3 14,1 26,6 12,5
26 0,8 - - - 20,8 14,1 27,5 13,4
27 - - - - 21,9 13,4 30,4 17
28 0,2 - - - 24,3 17,7 30,9 13,2
29 0,4 - - - 24,2 16,5 31,8 15,3
30 - - - - 23,7 15,7 31,7 16
31 - - - - 24,3 15,9 32,7 16,8
Media - - - - 23,4 15,8 31,0 15,2
Suma 52,2 - - - - - - -
19,3 12,8 23,6 8,2
Limite de
- - - - - - -
-
variaţie
26,7 30,1 37,7 22
Valori medii
multianuale
63,1 - - - 22,1 - - -
26

Starea iniţială și caracteristicile solului de la Moara Domnească
O parte dintre cercetările destinate atingerii obiectivelor proiectului se vor realiza
în perimetrul experimental al Fermei didactice și experimentale Moara domnească.
Solul cqrqcteristic qcestui perimetru este preluvosolul roșcat și se caracterizează
printr-un conţinut de humus de 2,6 % în orizontul Ap (0-20 cm), textura pe profil
este luto-argiloasă, lut prăfoasă, ceea ce determină în perioadele cu precipitaţii
ridicate un exces temporar de umiditate datorat texturii fine de la nivelul orizontului
Bt (tabelul 7).
Tabelul 7
Nr.
profil
1
2
3
Adâncimea
cm
Variaţia texturii solului pe profil
Nisip Praf Argilă Simbol Interpretare
0-20 26,0 33,8 40,2 TP Lut argiloprăfos
20-40 33,9 26,9 39,2 TT Lut argilos
mediu
40-60 26,9 31,0 42,1 TT Lut argilos
mediu
0-20 32,8 34,8 32,4 LP Lut prăfos
20-40 33,3 33,3 33,4 TT Lut argilos
mediu
40-60 30,0 31,7 39,3 TT Lut argilos
mediu
0-20 29,6 34,1 36,3 TP Lut prăfos
20-40 30,7 32,6 36,7 TP Lut prăfos
40-60 28,2 35,4 36,8 TP Lut prăfos
Din punct de vedere chimic, preluvosolul rocat de la Moara domnească se
caracterizează prin conţinuturi variabile în azot nitric ale profilului cultural (tabelul
8) comparativ cu clasele de conţinut în azot nitric menţionate de MESP, 1987
(tabelul 9).
Tabelul 8
Principalele însuşiri chimice ale preluvosolului roşcat de la Moara Domnească
Nr.
profil
Adâncimea
cm
N-NO3 pH H2O V% SB
me/100 g sol
SH
me/100 g sol
0-20 11,1 5,45 66,25 15,88 8,09
1 20-40 4,2 5,80 71,67 17,10 6,76
40-60 2,9 6,56 83,35 19,98 3,99
0-20 7,8 5,40 65,22 13,82 7,37
2 20-40 6,0 5,70 71,59 14,44 5,73
40-60 3,8 6,52 83,39 20,58 4,10
0-20 3,5 5,56 71,64 15,26 6,04
3 20-40 4,4 5,66 77,19 15,26 4,51
40-60 2,1 6,42 78,19 20,18 5,63
27

Reacţia solului este moderat acidă în orizonturile superioare cu valori cuprinse
între 5,40 şi 5,80 iar la adâncimea de 60 cm reacţia solului este slab acidă.
Creşterea acidităţii în orizontul Ap al preluvosolului roşcat este datorată utilizării
unui timp îndelungat a îngrăşămintelor minerale cu reacţie acidă. La profilul 1
adâncimea 0-20 cm, azotul nitric prezintă valori ridicate de 11,1 ppm (conţinut
foarte mare) şi valori cuprinse între 2,1-7,8 (conţinut mare) la profilele 2 şi 3. Cu
toate acestea datorită texturii argiloase preluvosolul roşcat prezintă un risc scăzut la
poluarea cu nitraţi a apei freatice.
Profilul solului de la Moara Domnească semnalează conţinuturi, uneori, mari și
foarte mari în azot. Adesea, prezenţa azotului nitric la adâncimi mari în sol este
consecinţa fertilizării intensive cu îngrășăminte chimice și imposibilităţii de utilizare
eficientă a acestuia. Azotul, este un element indispensabil agriculturii durabile. Dacă
în stare liberă nu poate fi utilizat de către plante, prin fixare în sol şi mineralizare
sub acţiunea bacteriilor trece în forme accesibile de N-NO 3 şi N-NO 4 . O parte din
rezerva de azot este consumată de către plante iar o alta este supusă denitrificării şi
volatilizării iar anumite cantităţi poate pătrunde în apele freatice si de suprafaţă
devenind surse importante de poluare. O alternativă împotriva poluării solurilor
agricole şi a apei cu nitraţi proveniţi din fertilizarea intensivă cu îngrăşăminte
minerale o reprezintă conversia la metode ecologice de producţie agricolă cu risc
foarte scăzut pentru mediu şi sănătate, folosindu-se sub control strictul necesar de
îngrăşăminte organice şi produse pentru protecţia plantelor care ajută la menţinerea
fertilităţii solului, la sporirea biodiversităţii şi protecţia calităţii apelor. Una dintre
alternativele ecologice pentru menţinerea fertilităţii naturale a solului este cultivarea
plantelor leguminoase care realizează simbioză cu bacteriile Rhizobium.
Clase de conţinut de azot nitric (N-NO 3 )
(MESP,1987)
Tabelul 10
Nivelul de conţinut Limite N-NO 3
ppm
Extrem de mic ≤ 0,5
Foarte mic 0,6-1,0
Mic 1,1-2,0
Mijlociu 2,1-3,0
Mare 3,1-6,0
Foarte mare 6,1-25,0
Extrem de mare ≥25,1
3.2. Perimetrul experimental cu terenuri/soluri contaminate cu metale
grele (Copşa Mică şi Neferal-Acumulatorul)
Suprafețe întinse din apropierea unităților de producție din Copșa Mică și Neferal
– Acumulatorul sunt afectate de activitățile industriale. În aceste cazuri, sursele de
poluare sunt combinatul de produse metalurgice S.C. SOMETRA S.A. Copșa Mică
care are ca principală activitate extracția de Zn, Pb, Cd și Cu din minereuri și
28

combinatul de produse neferoase Neferal – Acumulatorul situat în apropierea
orașului București.
Platforma industrială Copşa Mică a luat fiinţa în perioada 1935–1939 când au
fost realizate primele instalaţii de fabricare a negrului de fum (1935) şi de
producere a zincului (1939). Pe parcursul timpului, cele două unităţi s-au dezvoltat
distinct, una cu profil chimic, cealaltă cu profil metalurgic, atingând o diversitate de
10 produse chimice şi 15 produse metalurgice din care 21 unice pentru economia
naţională. Principalele produse ale uzinei chimice au fost negrul de fum, metacrilatul
şi polimetacrilatul de metil. Din cauza pierderilor foarte mari de negru de fum în
atmosferă, la începutul anilor 2000, această întreprindere a fost închisă pentru
retehnologizare la început, dar apoi a fost dezafectată. Prezenţa negrului de fum
peste tot, pe acoperişul caselor, pe pomi şi plante, a creat o imagine de poluare
excesivă, ceea ce a făcut sa fie intens mediatizată şi a permis multor cercetători,
uneori mai puţin avizaţi, să observe gradul de extindere al poluării şi să accentueze
asupra riscului pentru populaţie. Şi astăzi se mai văd pe arbori şi case efectele
acestei poluări. Riscul mare venea însă de la poluarea cu metale grele, dar acest risc
nu se vedea cu ochiul liber, trebuiau efectuate cercetări specifice.
Din industria metalurgică principalele produse obţinute au fost: zincul, plumbul
şi aliajele aur-argint de înaltă puritate. Dacă poluarea cu negru de fum crea mai ales
o imagine negativă, aceste metale sunt deosebit de toxice pentru mediul
înconjurător.
Copşa Mică este un oraş care s-a dezvoltat în jurul a două unităţi industriale
SOMETRA şi CARBOSIN, ambele cu un potenţial poluant ridicat: SOMETRA –
producător de plumb, zinc, stibiu, bismut şi aliaje, iar CARBOSIN – producător de
negru de fum, produs utilizat în procesul de fabricaţie a anvelopelor. Emisiile
provenite de la cele două întreprinderi au afectat pentru o perioadă lungă de timp
zona, transformând oraşul Copşa Mică într-un oraş negru şi bolnav. Nu numai
împrejurimile au fost afectate, ci o mare suprafaţă de teren, estimată în anul 1993
la 180.750 ha.
Zona poluată se întindea de-a lungul Văii Târnavei Mari, de la localitatea
Dumbrăveni în est, la Blaj în vest, fiind mărginită în partea nordică de localităţile
Smig şi Cetatea de Baltă. iar în partea sudică de localităţile Mihăileni, Şeica Mare şi
Cenade.
Odată cu închiderea unităţii CARBOSIN, poluarea cu negru de fum a încetat iar
împrejurimile au început să-şi recapete aspectul normal. Stratul de negru de fum a
fost treptat îndepărtat de pe vegetaţie, construcţii, etc. iar astăzi urmele poluării cu
negru de fum se regăsesc numai la nivelul solului şi al scoarţei copacilor.
Însă dintre cei doi agenţi poluatori CARBOSINUL era cel mai puţin agresiv,
poluarea provocată de negru de fum fiind puternic intensificată dar mai puţin
periculoasă decât poluarea cu metale grele.
Pentru cealaltă unitate poluatoare, SOMETRA, s-a întocmit un plan de
retehnologizare care să limiteze emisiile poluante şi să reducă intensitatea poluării
în zonă. În anul 1998 unitatea a fost preluată de concernul Mytilineos S.A. din
Grecia. Într-un raport prezentat în anul 1999 de către acţionarul principal se
preconiza ca producţia de zinc şi plumb să crească de la 40000 t (în anul 1997) la
100000 (în anul 2001). Însă odată cu creşterea producţiei are loc o intensificare a
poluării cu metale grele înregistrată la nivelul solului, apelor şi vegetaţiei.
29

Principalii poluanţi care afectează solul şi vegetaţia sunt: metalele grele (Pb, Cd,
Zn) şi oxizii de sulf.
În ceea ce priveşte poluarea produsă cu dioxid de sulf la Copşa Mică s-au
raportat concentraţii medii pe 24 ore de 0,648 mg·m -3 ceea ce reprezintă o depăşire
de 2,6 ori a concentraţiei maxime admisibile (CMA).
Într-un material privind Starea Mediului în România 2000 sunt prezentate
localităţile în care s-au înregistrat depăşiri ale CMA în 24 ore la dioxid de sulf
precum şi frecvenţa de depăşire a CMA în 24 ore pentru acelaşi poluant. Astfel,
Copşa Mică este a doua localitate din ţară în ceea ce priveşte poluarea cu dioxid de
sulf a atmosferei fiind depăşită numai de Zlatna unde depăşirea concentraţiei
maxime admisibile de dioxid de sulf din atmosferă a fost de 5,8 ori.
În zona Copşa Mică, valoarea concentraţiei maxime a ionului sulfat în apele de
precipitaţii au fost în anul 2000 de 203,87 mg·l -1 . Ca urmare a prezenţei sulfaţilor în
concentraţii ridicate, precipitaţiile căzute în această zonă au fost predominant acide,
intervalul de variație anuală a pH-ului fiind 5,00-6,50.
În general, pulberile din atmosferă se clasifică, după dimensiuni, în două grupe
mari:
• Pulberi în suspensie – cu diametre mai mici de 20 µm, având în atmosferă un
comportament asemănător gazelor;
• Pulberi sedimentabile cu diametre mai mari de 20 µm, care după ce sunt
emise în atmosferă, se depun pe sol, vegetaţie, ape şi construcţii.
Societatea SOMETRA este principala sursă de poluare a atmosferei cu pulberi
sedimentabile şi pulberi în suspensie din judeţul Sibiu. În acest caz pulberile în
suspensie sau sedimentabile conţin metale grele (cadmiu, plumb, zinc) şi provin din
procesele tehnologice care au loc pe platforma industrială.
La Mediaş, în anul 2000, concentraţia medie, timp de 24 ore, pentru pulberile în
suspensie a depăşit de 2,89 ori CMA având o valoare de 0,455 mg·m -3 .
În anul 2000 s-au monitorizat plumbul şi cadmiul din pulberile în suspensie în
anumite localităţi (Zlatna, Mediaş, Copşa Mică şi Baia Mare). S-a constatat că pentru
Copşa Mică valoarea maximă a concentraţiei medii pe 24 ore pentru plumb a fost de
0,020 mg·m -3 , depăşind de aproximativ 3 ori CMA (0,0007 mg·m -3 ), iar valoarea
frecvenţei de depăşire a CMA pentru plumb a fost de 70,29%. Valori ridicate ale
acestor paramentri au fost înregistraţi şi la Mediaş (0,016 mg·m -3 şi 43,26%).
În ceea ce priveşte cadmiul, valoarea maximă a concentraţiei medii pe 24 ore a
fost de 0,0008 mg·m -3 , în condiţiile în care CMA pentru acest element este de
0,00002 mg·m -3 . Frecvenţa de depăşire a CMA înregistrată pentru cadmiu a fost de
83,11%.
Prin prisma acestor valori se poate contura o primă imagine asupra intensităţii şi
gradului de extindere a fenomenului de poluare cu metale grele din zona Copşa
Mică.
Condiții naturale
Zona de influență a unităţii de producţie SOMETRA, din Copşa Mică, judeţul
Sibiu, (în Nomenclatorul European al Unităţilor Teritoriale de Statistică având Cod
30

NUTS RO 126) se înscrie în complexul de vale Târnava Mare cu afluentul său Visa
(pe stânga) şi cuprinde terenuri din luncă şi de pe cele două maluri.
Relieful
Din punct de vedere geografic, teritoriul face parte din Podişul Târnavelor, situat
în marea unitate de relief Depresiunea Transilvaniei.
Sub aspectul altitudinii absolute, aceasta variază de la 270 m (în aval) şi 300 m
(în amonte) în cadrul luncii Târnavei Mari. Pe zonele limitrofe, înălţimile ating valori
de 375-472 m în lungul văii (pe direcţie SV-NE) pe malul stâng si de 448-517 m
altitudine absolută, pe malul drept.
Geomorfologic, teritoriul are un relief de luncă şi un relief de podiş fragmentat
(300-500 m), cu versanţi de lungimi, orientări şi pante variate, fiind prezente zone
cu alunecări şi prăbuşiri şi cu eroziune de la slabă la puternică.
Pe dreapta Visei se individualizează 1-2 niveluri de terase care, după confluenţa
cu Târnava Mare se prelungesc pe malul stâng al acesteia.
Litologia depozitelor de suprafaţă
În esenţă se disting două categorii de depozite care intră în alcătuirea
teritoriului:
- depozitele panoniene, din cadrul podişului, alcătuite dintr-o alternanţă de
argile, argile marnoase, marne şi luturi; textura lor variază de la lut nisipos-lut la lut
argilos-argilă, cu prezenţa carbonaţilor fie de la suprafaţă, fie la diferite adâncimi pe
profilul de sol;
- depozite fluviatile recente (halocene) prezente pe lunca Târnavei Mari şi a
afluenţilor acesteia, alcătuite din nisipuri, nisipuri lutoase uneori argile; ca atare,
textura variază de la nisip-nisip lutos la lut-lut argilos, în suprafaţă şi chiar pe profil.
Hidrografia şi apele freatice.
Apele de suprafaţă sunt reprezentate prin râul Tărnava Mare cu afluenţii săi cu
cursuri permanente sau intermitente (torenţiale) cum sunt: Visa, Carpenul,
Vorumlocul, Şeica, etc. Aceste ape se constituie în agenţi de vehiculare (de
transport) a materialelor, inclusiv a metalelor grele cantonate în stratul superior al
solurilor prin procese de şiroire, eroziune şi transport, ducând la contaminarea
apelor de suprafaţă şi a celor freatice.
Apele freatice au un regim de debit şi adâncime variat, după forma de relief.
Astfel, în luncă apele freatice sunt situate la adâncimi de 0,5-3 m şi de 2-5 m în
zona de contact luncă-versant, influenţând în diferite grade evoluţia solurilor.
Totodată, drenajul global (intern şi de suprafaţă)al terenurilor variază în aceste
condiţii de la slab – imperfect la moderat-bun, în funcţie de forma de microrelief.
În zona podişului, apele freatice sunt la adâncimi mari şi foarte mari (5-10 m şi
peste).
Clima
Teritoriul are o climă umedă cu veri răcoroase şi ierni aspre, cu precipitaţii tot
timpul anului, cu caracter torenţial vara.
Temperatura medie anuală variază între 8,1 şi 9,5 0 C.
Precipitaţiile medii anuale se situează între 500 şi 700 mm.
31

Elementele climei au unele variaţii în funcţie de configuraţia reliefului, ceea ce
conduce la o diversitate de microclimate.
Un element important al climei este vântul, prin rolul său de agent de transport
al particulelor din emisiile sursei de poluare la diferite distanţe, care depind de
intensitatea acestuia, umiditatea relativă, densitatea specifică şi a coeficientului de
dizolvare al particulelor. În arealul cercetat, direcţia dominantă a vântului este nordest,
sud-vest, canalizat pe valea Târnavei Mari şi de la nord la sud sau sud-nord,
coborând pe pantele din jur.
Vegetaţia.
Este variată în funcţie de folosinţa terenurilor şi condiţiile locale. Teritoriul
aparţine zonei pădurilor de foioase cu Quercus sp., Fagus silvatica, Carpinus
betulus şi Betula verucosa, ca speciile cele mai frecvente din terenurile forestiere.
Mai apar tufărişuri, în special pe ravene şi taluze cu vegetaţie specifica .
Terenurile arabile au o vegetaţie cultivată reprezentată prin cereale, plante
furajere şi industriale . În fâneţe şi păşuni se întâlneşte o vegetaţie alcătuită din
Lolium perene, Dactylis glomerata, Trifolium sp., Lotus sp., Plantago sp., iar pe
zonele cu exces de umiditate îşi fac apariţia Phragmites sp., Thypha sp., Carex sp.,
şi Juncus effusus.
Vegetaţia din zonă a fost şi este afectată de elementele poluante propagate difuz
(poluare difuză) din emisiile rezultate prin activitatea societăţii SOMETRA din Copşa
Mică.
Solurile
În condiţiile arătate, în perimetrul cercetat s-a format un înveliş de sol variat,
alcătuit din termeni care aparţin la patru clase de soluri: Protisoluri, Cernisoluri,
Luvisoluri şi Hidrisoluri.
Protisoluri
Această clasă cuprinde tipul Aluviosol cu subtipurile entic-calcaric, gleic şi coluvic
(ASenka, ASgc, ASco). Toate sunt formate pe depozite fluviatile recente, cu textură
variată şi cu apa freatică situată la adâncimi de 1-3 m. Subtipul coluvic s-a întâlnit
pe depozitele coluviale de la baza versantului, la contactul cu lunca, cu apa freatică
la peste 5 m.
Sunt soluri cu un profil de tipul Ao(ka)-Cka(gc), cu textură predominantă
lutonisipoasă-nisipolutoasă. Au un conţinut mic de humus (cca 2%), o reacţie slab
alcalină (pH=7,4 - 7,6), eubazice.
De asemenea în această clasă se cuprinde şi tipul Regosol, cu subtipul calcaric
(RSka), prezent pe versanţi slab - moderat înclinaţi (7-12…..15%), pe depozitele
caracteristice zonei de podiş, cu drenaj global bun şi apa freatică la peste 10 m
adâncime.
Solurile au un profil de tipul Aoka-Cn, slab dezvoltat, sunt soluri eubazice, cu un
conţinut mic-mijlociu de humus şi o reacţie alcalină.
Cernisoluri
Clasa cuprinde un singur tip de sol, Faeoziom, cu subtipurile tipic, calcaric, argicstagnic
şi clinogleic (FZti, FZka, FZarst, FZcl). Sunt întâlnite în zona podişului,
formate pe materialele care alcătuiesc geologia acestei zone.
32

Solurile au un profil de tipul Am-Bv(Bt)-Cn(ca), cu textură variind de la lut
nisipos la lut-lut argilos.
Conţinutul de humus este mijlociu (2,3-4,0%), reacţia variază de la slab acidă
(pH=5,9) la slab alcalină (pH=7,4 -7,6), iar gradul de saturaţie în baze variază de la
eubazic la submezobazic.
Luvisoluri
Sunt soluri întâlnite în cadrul podişului, formate pe materiale diverse (luturi,
argile, etc), în condiţii de drenaj bun la moderat, pe versanţi slab la moderat
înclinaţi (7-15%) sau pe suprafeţe plane (poduri de interfluvii). Suprafeţele sunt
afectate de procese de eroziune în suprafaţă şi adâncime sau exces de umiditate de
suprafaţă (stagnic).
Clasa cuprinde tipul Preluvosol, cu subtipurile tipic, tipic – marnic, molic (ELti,
ELti(xma), ELmo) şi tipul Luvosol cu subtipul tipic (LVti).
Profilul solurilor este de tipul Ao(m)-Bt-Cn sau Ao-El-Bt-Cn. Textura în orizontul
superior şi sub acesta variază de la lut nisipos-lut la lut-lut argilos.
Conţinutul de humus este mic-mijlociu, reacţia solurilor este slab-moderat acidă
(pH=5,2-6,1), fiind soluri mezobazice.
Hidrisoluri
Aceste soluri ocupă o suprafaţă mică în zona de luncă, legate de adâncimea
extrem de mică a apei freatice (0,5-1 m), ceea ce motivează prezenţa orizontului Gr
în primii 50 cm (limita superioară). În această clasă a fost cuprins tipul Gleiosol, cu
subtipurile molic şi calcaric ( GSmo, GSka).
Solurile au un profil de tipul Am(ka)Go-Gr-CkaGo.
Solurile sunt saturate (eubazice), cu un conţinut mic-mijlociu de humus, o
reacţie slab acidă-slab alcalină şi cu un drenaj slab.
3.3. Identificarea și evaluarea gradului de poluare a solurilor din
perimetrele Copșa Mică și Neferal-Acumulatorul
Zona Copșa Mică
Aceste activităţi s-au realizat în acord cu clasele de încărcare, respectiv
conţinutul în metale grele (forme totale), şi cu valorile care depăşesc pragurile de
alertă şi de intervenţie. (Ordinul 756/1997 al MAPPM, publicat în Monitorul Oficial al
României, partea I, nr. 303 bis/6.11.1997 – Reglementare privind evaluarea poluării
mediului.(tabelul 10).
Probe recoltate din 12 profile de sol situate la distanţe diferite faţă de sursa de
poluare şi analizate din punct de vedere al conţinutului de Cu, Pb, Zn şi Cd au fost
interpretate după valorile de referinţă.
33

Tabelul 10
Valori de referinţă privind concentraţia unor metale grele
(forme totale în sol)
(Ordinul nr.756/1997 al M.A.P.P.M. partea I, nr. 303/1997)
Pb Zn Cu Cd
(mg . kg -1 s.u.)
C.N. (Conţinut normal) 20
Tabelul 11 prezintă conţinuturile totale şi valorile care depăşesc pragurile de
alertă şi de intervenţie. Majoritatea valorilor depăşesc pragul de intervenţie, în
special pentru Pb, Cd şi Zn.
Ordinul Ministrului Apelor, Pădurilor şi Protecţiei Mediului nr. 756/1997 aprobă
Reglementările privind poluarea mediului şi arată în art. 9c că ”atunci când
concentraţia unuia sau mai multor poluanţi din soluri depăşesc pragurile de
intervenţie pentru folosinţa existentă a terenului se consideră că există impact
asupra solului. În aceste situaţii, utilizarea zonei afectate pentru folosinţe sensibile
nu mai este permisă şi vor fi realizate prevederile art. 10”, care arată că „pentru
stabilirea obiectivelor de remediere pe baza interpretării studiilor de evaluare a
riscului, autorităţile competente trebuie să decidă dacă:
a) pot fi dezvoltate în viitor obiective care implică utilizarea terenurilor
pentru folosinţa sensibilă sau mai puţin sensibilă;
b) terenul poate rămâne în continuare în folosinţă curentă, dar folosinţa
nu mai poate fi extinsă;
c) trebuie luate măsuri de remediere.
34

Conţinutul total de metale grele (Cu, Pb, Zn și Cd) în solurile afectate de
combinatul metalurgic S.C. SOMETRA S.A (Copsa Mica)
Tabelul 11
Distanţa faţă de Orizont*sau adâncime Cu Pb Zn Cd
sursă (km) de recoltare (cm)
mg/kg
0.5
0–20 574 ■ 3513 ■ 13560 ■ 155 ■
20–40 415 ■ 1126 ■ 5028 ■ 67 ■
1
0–20 390 ■ 2103 ■ 8558 ■ 66 ■
20–40 341 ■ 1507 ■ 6472 ■ 68 ■
1.5
0–20 308 ■ 2224 ■ 5250 ■ 50 ■
20–40 190º 1406 ■ 3052 ■ 36 ■
2
0–20 256 ■ 2475 ■ 5458 ■ 57 ■
20–40 158º 1764 ■ 3308 ■ 46 ■
3
0–20 224 ■ 2132 ■ 4406 ■ 45 ■
20–40 133º 1519 ■ 2645 ■ 33 ■
4
0–20 98 912 ■ 1450 ■ 32 ■
20–40 79 753 ■ 1246 ■ 20 ■
6
0–20 36 172 ■ 317º 4,2º
20–40 25 83º 232 2,5
Ol 61 1392 ■ 1655 ■ 37 ■
8
Of 77 1418 ■ 1184 ■ 22 ■
0–20 18 156 ■ 213 3,2º
20–40 8 31 103 1,3
Ol 33 1059 ■ 1319 ■ 43 ■
9
Of 79 1743 ■ 1757 ■ 41 ■
0–20 64 317 ■ 431º 7,5 ■
20–40 50 67º 187 1,8
12
0–20 87 61º 150 1,8
20–40 69 46 134 1,4
14
0–20 82 186 ■ 270 3,3º
20–40 38 46 163 1,9
15
0–20 26 222 ■ 472º 5,0 ■
20–40 24 221 ■ 412º 4,5º
* soluri forestiere, probele de sol au fost recoltate și din orizonturile Ol și Of
º – valori ce depășesc pragul de alertă
■
– valori ce depășesc pragul de intervenţie
Zona Neferal – Acumulatorul
Problemele de poluare ce apar pe platforma industrială din partea estică a
oraşului Bucureşti, S.C. NEFERAL S.A. şi S.C. ACUMULATORUL S.A. sunt încadrate la
surse antropice – metalurgia neferoasă: pulberi de plumb, zinc şi cupru.
Solurile caracteristice zonei aparţin în majoritate clasei Luvisoluri, reprezentate
prin Preluvosoluri (SRTS – 2003). Există, în același timp, o mare neuniformitate a
caracteristicilor solului datorate atât direcţiei dominante a curenţilor de aer ce
domină din direcţia NV spre SV şi care antrenează o serie de particule de diferite
35

provenienţe cât şi a intensificării în zonă a unor activităţi din domeniul construcţiilor.
Din acest motiv, în unele puncte solul a fost afectat de costrucţii şi prezintă un pH
ridicat ca de alfel, şi alţi parametrii care sunt modificaţi, ceea ce presupune
existenţa unei intervenţii antropice intense. (tabelul 13)
Textura solului este una din cele mai stabile însuşiri fizice ale solului, deoarece
se modifică sub acţiunea factorilor naturali şi antropici numai după lungi perioade de
timp şi are o importanţă deosebită întrucât determină atât celelalte proprietăţi, dar
şi diferitele regimuri şi procese din sol.
Pentru caracterizarea din punct de vedere textural a solurilor se iau în
considerare diferite fracţiuni granulometrice cum ar fi conţinutul de nisip, praf,
argilă separate între ele prin mărimea diametrului particulelor.
Solul luat în analiză (tabelul 14), pe ansamblu, a prezentat o textură fină, de lut
argilos mediu (cu un conţinut de argilă ce variază între 32,7 – 36,5% g/g, praf 27,6
– 32,4%g/g şi nisip 31,5 – 39,0% g/g) şi lut argilo – prăfos (cu un conţinut de
argilă ce variază între 32,8 – 43,7% g/g, praf 32,7 – 39,6% g/g şi nisip 21,6 –
34,3% g/g. Sunt însă câteva excepţii (probele cu nr. 12, 16, 20, 32, 38) în care
solul analizat are o textură mijlocie – lut mediu (cu un conţinut de argilă cuprins
între 29,5 – 32,1% g/g, praf 24,1 – 31,7% g/g şi nisip 36,6 – 46,4% g/g.
În tabelul 15 se prezintă gradul de încărcare cu Pb, Cu și Zn a probelor de sol
recolate pe adâncimea 0 – 20 cm, precum și conţinuturile normale (CN), limitele
maxime admisibile (LMA), pragul de alertă (PA) și pragul de intervenţie (PI) stabilite
prin reglementări legislative privind evaluarea poluării. S-a constatat că frecvenţa
probelor de sol în funcţie de clasa de încărcare este diferită atât între clasele de
încărcare pentru același element, cât și între cele trei metale grele între ele. Gradul
de încărcare cel mai ridicat s-a constatat la plumb, urmat de cupru și apoi zinc.
36

Nr.
probă
Tabel 13
Caracteristicile chimice ale probelor de sol recoltate din zona de influenţă a
uzinelor NEFERAL şi ACUMULATORUL Bucureşti
Identif.
pH
(H 2 O)
C
org.
%
Humus
%
N
total
%
C/N
P AL
mg/
kg
K AL
mg/kg
1 0-20cm,SE,Nef. 8.19 2.65 4.56 0.239 13 30 377
2 0-20cm,NE,Nef. 6.25 2.04 3.51 0.204 12 46 436
3 0-20cm,N,Nef. 7.82 1.24 2.13 0.130 11 10 168
4 0-20cm,N,incintă Acum. 5.99 2.55 4.39 0.273 11 14 466
5 0-20cm,N, Acum. 7.31 1.63 2.81 0.174 11 42 294
6 0-20cm,S,100m Acum. 7.52 2.93 5.05 0.179 19 153 1158
7 0-20cm,S,stâlp Î.T. 7.18 1.85 3.18 0.216 10 66 168
8 0-20cm,S,stâlp I.T. 7.48 1.90 3.27 0.185 12 21 145
9 0-20cm,S,stâlp I.T. 6.77 1.34 2.31 0.142 11 15 145
10 0-20cm,S,stâlp I.T. 6.70 1.37 2.36 0.161 10 21 145
11 0-20cm,S,şosea Cernica 6.38 1.32 2.27 0.159 10 58 436
12 0-20cm,N,intrare Acum. 7.98 1.73 2.98 0.112 18 21 349
13 0-20cm,N,centură 8.08 2.06 3.55 0.206 12 75 242
14 0-20cm,N,10m de şosea 6.46 1.63 2.81 0.194 10 41 168
15 0-20cm,E,100mNef.,DN3 7.92 2.61 4.49 0.214 14 55 349
16 0-20cm,E,200mNef.,DN3 7.78 3.37 5.80 0.246 16 67 466
17 0-20cm,E,300mNef.,DN3 8.15 2.37 4.08 0.102 7 53 294
18 0-20cm,E,500mNef.,DN3 8.13 2.02 3.48 0.204 11 30 268
19 0-20cm,E,1000mNef.,DN3 8.17 1.67 2.87 0.171 11 49 321
20 0-20cm,E,1500mNef.,DN3 8.15 1.50 2.58 0.171 10 45 268
21 0-20cm,E,2000mNef.,DN3 8.09 1.72 2.96 0.177 11 54 294
22 0-20cm,SE,100mNef. 6.80 1.42 2.44 0.159 10 14 145
23 0-20cm,SE,200mNef. 6.84 1.57 2.70 0.148 12 6 145
24 0-20cm,SE,300mNef. 6.47 1.58 2.72 0.169 11 22 168
25 0-20cm,SE,500mNef. 6.45 1.39 2.39 0.157 10 26 168
26 0-20cm,SE,750mNef. 7.25 1.13 1.92 0.134 10 30 145
27 0-20cm,SE, Neferal 6.64 1.38 2.37 0.137 12 16 145
28 0-20cm,SE,2000mNef. 7.97 1.36 2.34 0.164 10 65 349
29 0-20cm,S2000mAc.,centură 7.10 2.16 3.72 0.234 11 95 268
30 0-20cm,NE,100mNef. 6.12 1.60 2.75 0.183 10 10 192
31 0-20cm,NE,200mNef. 5.87 1.56 2.68 0.171 11 35 123
32 0-20cm,NE,300mNef. 6.15 1.22 2.10 0.144 10 57 626
33 0-20cm,NE,500mNef. 7.13 1.90 3.27 0.182 12 62 242
34 0-20cm,NE,750mNef. 6.35 2.07 3.56 0.181 13 11 217
35 0-20cm,NE,1000mNef. 6.36 1.53 2.63 0.118 15 68 192
36 0-20cm,NE,peste CF 6.38 1.70 2.93 0.151 13 22 168
37 0-20cm,NE,spre pădure 6.01 1.80 3.10 0.163 13 40 192
38 0-20cm,V,100mAcum,DN3 7.83 2.97 5.12 0.203 17 30 560
39 0-20cm,V Acum.,DN3 8.10 1.59 2.74 0.169 11 17 192
40 0-20cm,V Acum.,DN3 8.00 1.62 2.79 0.145 13 41 168
41 0-20cm,V Acum.,DN3 8.29 1.69 2.91 0.186 11 11 217
42 0-20cm,V Acum.,DN3 8.12 1.58 2.72 0.184 10 56 192
37

Nr.
proba
Tabelul 14
Compoziţia granulometrică a probelor de sol recoltate din zona
NEFERAL - ACUMULATORUL Bucureşti
Identificare
Nisip
grosier
2.0 – 0.2
mm
Nisip fin
0.2 – 0.02
mm
Praf
0.02 –
0.002
mm
Argilă
<
0.002
mm
% (g/g)
1 0-20cm,SE,Nef. 9.2 25.4 32.4 33.0
2 0-20cm,NE,Nef. 1.2 25.2 39.1 34.5
3 0-20cm,N,Nef. 1.5 20.1 34.7 43.7
4 0-20cm,N,incintăAcum. 3.1 25.0 35.8 36.1
5 0-20cm,N, Acum. 1.9 26.0 35.0 37.1
6 0-20cm,S,100mAcum. 4.4 29.9 32.9 32.8
7 0-20cm,S,stâlp Î.T. 1.0 24.7 34.9 39.4
8 0-20cm,S,stâlp I.T. 1.5 26.6 33.4 38.5
9 0-20cm,S,stâlp I.T. 0.6 22.0 37.4 40.0
10 0-20cm,S,stâlp I.T. 1.2 25.2 36.2 37.4
11 0-20cm,S,şosea Cernica 1.8 27.3 32.8 38.1
12 0-20cm,N,intrare Acum. 10.3 27.1 30.5 32.1
13 0-20cm,N,centură 3.1 26.4 34.8 35.7
14 0-20cm,N,10m de şosea 0.2 26.9 34.9 38.0
15 0-20cm,E,100mNef.,DN3 4.7 31.7 27.6 36.0
16 0-20cm,E,200mNef.,DN3 5.2 33.1 30.0 31.7
17 0-20cm,E,300mNef.,DN3 5.8 27.7 32.0 34.5
18 0-20cm,E,500mNef.,DN3 2.5 26.3 34.3 36.9
19 0-20cm,E,1000mNef.,DN3 3.3 27.5 33.1 36.1
20 0-20cm,E,1500mNef.,DN3 6.3 31.3 31.7 30.7
21 0-20cm,E,2000mNef.,DN3 3.9 28.5 32.7 34.9
22 0-20cm,SE,100mNef. 0.8 26.4 35.7 37.1
23 0-20cm,SE,200mNef. 0.4 26.6 37.2 35.8
24 0-20cm,SE,300mNef. 1.5 26.7 35.2 36.6
25 0-20cm,SE,500mNef. 1.2 22.9 39.6 36.3
26 0-20cm,SE,750mNef. 1.9 26.8 35.5 35.8
27 0-20cm,SE, Neferal 0.6 25.3 34.7 39.4
28 0-20cm,SE,2000mNef. 5.2 26.3 32.0 36.5
29 0-20cm,S2000mAc.,centură 10.8 28.2 28.3 32.7
30 0-20cm,NE,100mNef. 1.0 30.5 32.8 35.7
31 0-20cm,NE,200mNef. 0.8 24.8 37.2 37.2
32 0-20cm,NE,300mNef. 24.3 20.9 25.1 29.7
33 0-20cm,NE,500mNef. 3.7 21.2 34.5 40.6
34 0-20cm,NE,750mNef. 1.2 22.9 38.0 37.9
35 0-20cm,NE,1000mNef. 1.9 24.7 35.1 38.3
36 0-20cm,NE,peste CF 0.6 24.1 36.4 38.9
37 0-20cm,NE,spre pădure 0.0 26.0 35.3 38.7
38 0-20cm,V,100mAcum,DN3 21.4 25.0 24.1 29.5
39 0-20cm,V Acum.,DN3 7.3 25.5 31.2 36.0
40 0-20cm,V Acum.,DN3 2.1 28.5 35.0 34.4
41 0-20cm,V Acum.,DN3 5.0 25.0 33.4 36.6
42 0-20cm,V Acum.,DN3 6.2 30.1 28.6 35.1
38

Tabel 15
Gradul de încărcare cu Plumb, Cupru şi Zinc a probelor de sol recoltate din zona de
influenţă a uzinelor NEFERAL şi ACUMULATORUL Bucureşti
(CN-conţinut normal, LMA-limită maximă admisibilă, PA-prag de alertă, PI-prag de intervenţie)
Nr.
probă
Identif.
Pb
mg/kg
Cu
mg/kg
Zn
mg/kg
1 0-20cm,SE,Nef. 2260 420 790
2 0-20cm,NE,Nef. 810 310 480
3 0-20cm,N,Nef. 1320 890 1200
4 0-20cm,N,incintăAcum. 1280 480 750
5 0-20cm,N, Acum. 950 130 250
6 0-20cm,S,100mAcum. 1330 260 600
7 0-20cm,S,stâlp Î.T. 390 77 230
8 0-20cm,S,stâlp I.T. 350 69 210
9 0-20cm,S,stâlp I.T. 380 38 115
10 0-20cm,S,stâlp I.T. 135 30 89
11 0-20cm,S,şosea Cernica 100 25 67
12 0-20cm,N,intrare Acum. 1990 960 1560
13 0-20cm,N,centură 142 34 82
14 0-20cm,N,10m de şosea 86 23 55
15 0-20cm,E,100mNef.,DN3 732 121 254
16 0-20cm,E,200mNef.,DN3 907 159 392
17 0-20cm,E,300mNef.,DN3 540 86 215
18 0-20cm,E,500mNef.,DN3 292 69 121
19 0-20cm,E,1000mNef.,DN3 168 40 100
20 0-20cm,E,1500mNef.,DN3 140 37 85
21 0-20cm,E,2000mNef.,DN3 112 36 74
22 0-20cm,SE,100mNef. 330 81 185
23 0-20cm,SE,200mNef. 227 60 130
24 0-20cm,SE,300mNef. 215 51 100
25 0-20cm,SE,500mNef. 128 100 75
26 0-20cm,SE,750mNef. 84 37 80
27 0-20cm,SE, Neferal 45 33 37
28 0-20cm,SE,2000mNef. 54 37 50
29 0-20cm,S2000mAc.,centură 124 45 95
30 0-20cm,NE,100mNef. 435 178 285
31 0-20cm,NE,200mNef. 230 71 109
32 0-20cm,NE,300mNef. 155 35 57
33 0-20cm,NE,500mNef. 135 37 66
34 0-20cm,NE,750mNef. 115 45 49
35 0-20cm,NE,1000mNef. 96 27 44
36 0-20cm,NE,peste CF 95 36 65
37 0-20cm,NE,spre pădure 100 39 50
38 0-20cm,V,100mAcum,DN3 3350 410 226
39 0-20cm,V Acum.,DN3 585 150 229
40 0-20cm,V Acum.,DN3 355 110 160
41 0-20cm,V Acum.,DN3 135 52 73
42 0-20cm,V Acum.,DN3 195 60 105
CN* 20 20 100
LMA** 100 100 300
PA* 50 100 300
PI* 100 200 600
*Ordinul nr.756/1997 al M.A.P.P.M. ** după Kloke, 1980
39

3.3. Perimetrul experimental cu pajişti naturale (ICDP-Brașov)
Institutul de Cercetare – Dezvoltare pentru Pajişti, care este amplasat pe raza
municipiului Braşov, în partea de sud a acestuia. Teritoriul institutului se desfăşoară
pe două unităţi fizico-geografice de relief:
• Masivul Postăvarul (Munţii Poienii Braşov) 16,5 ha 2,9 %;
• Depresiunea Braşov, care face parte din marea unitate geografică Ţara
Bârsei, 531,5 ha. 97,1 %.
Sectorul montan al teritoriului se desfăşoară în partea inferioară a versanţilor
Vestici şi Nord-Vestici ai Postăvarului ce coboară în Depresiunea Braşov. Versanţii
sunt puternic înclinaţi (15-50%) iar altitudinea acestora este cuprinsă între 560 şi
675 m. Local sunt agroterasaţi. Sectorul depresionar are aspect general de câmpie
cuprinzând teritoriul arabil al institutului. Altitudinea este cuprinsă între 545 şi 590
m. Experinţele se vor amplasa pe teritoriul institutului în sectorul depresionar.
Prezentarea condiţiilor climatice
După Atlasul Academiei Române (1974), teritoriul Institutului de Cercetare şi
dezvoltare Pajişti Braşov se încadrează în sectorul de climă continentală moderată,
cu circulaţia dominantă a aerului la sol, din vest şi nord-vest.
● Temperatura aerului
Temperatura medie anuală din Ţara Bârsei oscilează între 7 şi 8 0 C
gradientul termic fiind de circa 0,54 0 C/100 m altitudine (0,32 0 C / 100 m iarna şi
0,63 0 C / 100 m vara).
Cele mai scăzute temperaturi medii se produc în luna ianuarie - 4,6 0 C, iar cele
mai ridicate în luna iulie 18,6 0 C. În lunile de iarnă temperatura medie scade uneori
sub – 6 0 C , când au loc frecvente invazii de aer rece anticiclonic, de origine
continentală. Tot în lunile de iarnă se produc însă şi situaţii de inversiuni termice,
când temperatura aerului atinge valori pozitive depăşind 2-3 0 C.
de
Numărul de zile cu îngheţ, când temperatura minimă scade sub 0 0 C este
128 de zile pe an.
Vara, repartiţia teritorială a temperaturilor medii ale aerului este mult mai
uniformă decât iarna. Valorile medii ale temperaturii aerului în zilele de vară
oscilează în jur de 17-18 0 C. Încălzirile şi răcirile din această perioadă au o
intensitate mult mai redusă. Invazia maselor de aer cald subtropical, este oprită de
obicei de bariera Carpaţilor Meridionali şi nu poate produce încălziri deosebite. Rar
se înregistrează temperaturi cu 3-4 0 C mai ridicate decât temperatura medie
multianuală a lunilor iulie şi august.
Începutul intervalului cu temperaturi pozitive se semnalează între 27 februarie şi
3 martie, iar sfârşitul intervalului între 2 şi 5 decembrie, durata intervalului fiind de
274 – 280 zile. Perioada de vegetaţie a pajiştilor este de 8-9 luni pe an.
Schimbările bruşte ale temperaturii primăvara au repercursiuni negative asupra
culturilor, încetinind sau accelerând brusc procesele biologice ale plantelor.
Datorită caracteristicilor depresionare care fac ca circulaţia aerului să fie
uneori foarte lent, în zonă se întâlnesc aşa numitele „găuri de frig”. Acestea au făcut
ca la data de 24.I.1952 să se înregistreze minima absolută de -38,5 0 C la Bod. Tot
40

pe fundalul depresiunii s-a înregistrat şi cea mai ridicată temperatură de 37,8 0 C,
ceea ce a făcut ca amplitudinea termică să depăşească 75 0 C. Aceasta imprimă un
grad ridicat de continenalism zonei. Amplitudinea termică anuală din Depresiunea
Braşov este în jur de 23 0 C.
● Precipitaţiile atmosferice
Depresiunea Braşov, fiind înconjurată de masive muntoase, imprimă
precipitaţiilor o serie de trăsături specifice. Masele de aer oceanic traversând judeţul
Braşov se descarcă în marea lor majoritate pe versantul vestic al Munţilor Perşani,
iar când ajung în Ţara Bârsei aceste mase de aer sunt mai sărace în precipitaţii.
Această circulaţie a maselor de aer face ca anual să cadă în Depresiunea Bârsei
cantităţi de precipitaţii cuprinse între 550 - 750 mm.
Cele mai mari cantităţi anuale de precipitaţii anuale depăşesc valorile medii
anuale cu 35 – 113 %, iar cele mai mici cantităţi reprezintă 35 – 40 % din
cantităţile medii anuale ale lunii respective. Precipitaţiile care cad în timpul
perioadei de vegetaţie reprezintă 70 – 75 % din totalul anual, ceea ce face ca
în anii normali cantitatea de precipitaţii din timpul perioadei de vegetaţie să fie
suficientă proceselor fiziologice ale plantelor.
Din analiza valorilor multianuale a precipitaţiilor rezultă că acestea nu sunt
repartizate uniform în toate lunile. Cantităţile cele mai mari de apă cad în timpul
perioadei de vegetaţie, aproximativ 60 %, iar cele mai mici în timpul lunilor de
iarnă, 40 % din cantitatea anuală.
Distribuţia inegală a precipitaţiilor scoate în evidenţă continentalismul regimului
pluviometric care se încadrează în tipul „ploilor de vară” în care precipitaţiile cresc
continuu din februarie până în iunie iar apoi scad relativ uniform până în ianuarie.
În zonă anii secetoşi sunt grupaţi câte 2–3, uneori chiar mai mulţi, observânduse
o periodicitate de 7–12 ani a perioadelor ploioase sau secetoase. Anii secetoşi
sunt mai frecvenţi decât cei ploioşi.
În cursul anului cel mai mare număr lunar de zile cu precipitaţii este de 14–17 în
luna iunie, iar cel mai mic de 8–10 zile în primele două luni ale toamnei. Numărul
mediu anual de zile cu precipitaţii în Depresiunea Braşov este de 135–148.
Prima zi cu strat de zăpadă se înregistrează în luna noiembrie, iar ultima zi
la sfârşitul primei decade a lunii aprilie. Numărul mediu anual de zile cu strat
de zăpadă fiind de 70 – 90 zile.
● Solul
Formarea şi răspândirea solurilor din cadrul institutului este legată predominant
de relieful câmpiei piemontane, de roca, constituită din depozite aluvio-proluviale
acoperite cu luturi şi cu un chimism dominant carbonic, de nivelul freatic coborât şi
de climatul specific depresiunilor intramontane cu topoclimat creat de apropierea de
zona montană. La acestea se mai adaugă şi modul de folosinţă al terenului şi
procesele antropice actuale.
Teritoriul se încadrează pedoclimatic în zona forestieră, cu precipitaţii suficiente
şi regim de apă de tip precolativ sau intens precolativ în sol, cu condiţii bioclimatice
care determină un circuit biologic activ şi o acidifiere moderată a solurilor. Condiţiile
locale de mediu determină formarea solurilor intrazonale şi azonale.
41

Experienţele vor amplasate pe un sol de tip cernoziomoid care prezintă
următoarele caracteristici ( analize chimice pe adâncimea de 0-30 cm ):
Roca mamă – luturi mijlocii scheletice/pietrişuri;
Apa freatică – mai jos de 10 m;
Textura – este dominant lutoasă, luto-nisipoasă, mijlociu-fină;
Reacţia solului ( pH ) – 6,5 slab acid;
Carbonaţi ( CaCO 3 ) – 0 ( necarbonic );
Gradul de saturare în baze ( V% ) – 84%, eubazic;
Conţinutul în humus – 3,84%, mijlociu aprovizionat;
Conţinutul în fosfor mobil – 109 ppm P, foarte bine aprovizionat;
Conţinutul în potasiu mobil – 361 ppm K, foarte bine aprovizionat;
Capacitatea de schimb cationic ( Tme% ) – 30;
Coeficientul de ofilire ( CO ) – 9,81, mijlociu;
Porozitatea totală ( PT ) – 43,8, mijlocie.
Pentru a pune în evidenţă activitatea bacteriilor din genul Rhizobium pe diferite
tipuri de sol experienţele vor fi amplasate şi în zona Făgăraş, pe un sol cu un pH
scăzut 5.2 – 5.6 unităţi. După cum este cunoscut aciditatea solurilor influenţează
negativ creşterea plantelor mai cu seamă în mod indirect, prin formele mobile de
aluminiu, iar uneori şi de mangan care, apar în solurile acide prin solubilizarea
hidroxizilor respectivi. Formele mobile de aluminiu din sol, constituite din ioni de
Al 3+ , Al(OH) 2+ şi Al(OH) + 2 , acţionează negativ asupra nutriţiei minerale a plantelor
prin numeroase căi. Ionii de aluminiu, când sunt prezenţi în soluţia solului,
înrăutăţesc mult condiţiile de nutriţie a plantelor cu potasiu, calciu, magneziu şi azot
amoniacal.
Creşterea concentraţiei active a ionilor de aluminiu în soluţia solului va
determina reducerea absorţiei cationilor nutritivi pe suprafaţa perişorilor radiculari şi
asimilarea acestora de către plante. Pentru a compensa acest efect depresiv pe care
îl au ionii de aluminiu (şi de hidrogen) din solul puternic acid, asupra asimilării
cationilor nutritivi, trebuie mărită concentraţia acestora din urmă în soluţia solului,
prin aplicarea de îngrăşăminte.
Aluminiul mobil, care este consecinţa directă a acidităţii solului, are un puternic
efect negativ asupra mobilităţii fosforului şi molibdenului din sol şi asupra asimilării
acestor elemente de către plante. Aluminiul mobil şi hidroxidul de aluminiu conferă
solului acid o capacitate sporită de fixare şi retrogradare a fosfaţilor solubili din
îngrăşăminte. Ionii de monofosfat H 2 PO -
4 - singurii care se pot forma din sărurile
acidului fosforic în solul puternic acid – sunt uşor absorbiţi la suprafaţa încărcată
electropozitiv a hidroxidului de aluminiu.
Când ionii de aluminiu depăşesc o concentraţie de numai câteva mg la litru de
soluţie a solului, ei devin toxici pentru plante. În plantele intoxicate cu aluminiu,
fosforul se acumulează în rădăcini de unde este slab vehiculat în tulpini şi frunze,
plantele prezentând simptome de insuficienţă a fosforului. În acest sens s-a
concluzionat că, ionii de aluminiu ar bloca fosforul în ţesuturile conducătoare ale
42

ădăcinii printr-un mecanism asemănător celui de retrogradare a fosfaţilor solubili în
sol.
Toxicitatea aluminiului poate fi mult atenuată prin aplicarea îngrăşămintelor
fosfatice, a gunoiului de grajd şi a unor îngrăşăminte cu reacţie fiziologică alcalină.
Desigur că mijlocul radical de prevenire al toxicităţii este amendarea cu var a
solurilor acide. Plantele diferă în ceea ce priveşte sensibilitatea şi toleranţa lor faţă
de aluminiu. Foarte sensibile la prezenţa aluminiului sunt lucerna, porumbul,
floarea-soarelui, mazărea, grâul şi orzul în timp ce lupinul, secara şi ovăzul suferă
mai puţin. Sensibilitatea faţă de aluminiu la plante este mult mai mare în prima
parte a perioadei de vegetaţie, iar la cerealele de toamnă în timpul iernii.
Anumite prejudicii ale creşterii plantelor pe solurile puternic acide aduce şi
manganul bivalent, care se poate acumula în aceste soluri până la niveluri toxice
pentru plante. Una dintre căile indirecte prin care aciditatea solului influenţează
negativ creşterea plantelor cultivate priveşte activitatea microorganismelor
folositoare. Reacţia acidă stânjeneşte puternic înmulţirea şi celelalte activităţi vitale
ale bacteriilor simbiotice fixatoare de azot (Rhizobium) şi a celor libere (Azotobacter
şi Clostridium), precum şi a bacteriilor care oxidează azotul amoniacal în acid azotic.
În mai mică măsură sunt afectate de către reacţia acidă microorganismele
amonificatoare. Reacţia acidă stimulează în schimb înmulţirea ciupercilor şi a
actinomicetelor, care pot produce în solurile acide unele substanţe organice cu
acţiune inhibitoare asupra plantelor.
Intervalele optime de reacţie (pH) a solului pentru unele dintre
microorganismele folositoare sunt următoarele:
• Bacterii Rhizobium în simbioză cu lucern, trifoiul, mazărea:....... 6,8 – 7,2;
• Azotobacter chroococum ...................................................... 6,5 – 7,5;
• Clostridium pasteurianum .................................................... 6,0 – 7,0;
• Bacteriile nitrificatoare ........................................................ 6,5 – 7,5;
• Bacteriile celulozolitice ........................................................ 6,2 – 7,0.
Rezultă că toate microorganismele folositoare găsesc condiţii optime de înmulţire
şi activitate în solurile cu reacţie slab acidă – neutră. În acest timp ciupercile şi
actinomicetele, a căror activitate este considerată ca dăunătoare plantelor cultivate,
se dezvoltă bine şi în solurile cu reacţie puternic acidă (pH = 4,0–5,0). Amendarea
cu var deplasează echilibrul biologic dintre microorganismele solului în favoarea
celor folositoare din punct de vedere agronomic.
Analizele de sol efectuate în toamna anului 2008 de către OSPA Braşov au
evidenţiat următoarele aspecte:
Caracteristici
Tipul de sol
pH Ah SB Ah Humus IN P-AL K- Nt
H2O
% %
AL %
me/100 gr
ppm
Cernoziomoid 6,3 3,2 26,8 89,3 4,87 4,34 97 101 0,250
Pentru speciile de leguminoase perene de pajişti Trifolium repens, Trifolium
pratense şi Lotus corniculatus solul prezintă condiţii favorabile de creştere pentru
43

specia Medicago sativa. pH –ul uşor acid crează unele probleme în primele faze de
cercetare.
4. Protocoale experimentale și metode de lucru pentru etapa
următoare
4.1. Protocol experimental pentru terenuri arabile (Moara Domnească)
Titlul experienţei: Comportamentul bacteriilor Rhizobium în culturi de
leguminoase perene pe terenuri arabile necontaminate cu metale grele în sisteme
de agricultură convenţională și ecologică.
Nr.
var.
1.
Sistem de producţie agricolă
convenţională
Tratamentul
Nr.
rep.
Sistem de producţie agricolă ecologică
Nr.
var.
Tratamentul
Trifolium pratense 1. 1. Trifolium pratense 1.
Trifolium pratense 2. Trifolium pratense 2.
Nr.
rep.
Trifolium pratense 3.
Trifolium pratense 3.
2.
Trifolium repens 1. 2. Trifolium repens 1.
Trifolium repens 2. Trifolium repens 2.
Trifolium repens 3.
Trifolium repens 3.
3.
Lotus corniculatus 1. 3. Lotus corniculatus 1.
Lotus corniculatus 2. Lotus corniculatus 2.
Lotus corniculatus 3.
Lotus corniculatus 3.
4.
Medicago sativa 1. 4. Medicago sativa 1.
Medicago sativa 2. Medicago sativa 2.
Medicago sativa 3.
Medicago sativa 3.
Factorii studiaţi:
• Impactul sistemului de cultură asupra creșterii bacteriilor Rhizobium;
• Impactul sistemului de cultură asupra diversităţii bacteriilor Rhizobium în
sol;
• Efectul diferenţiat al sistemului de cultură asupra bacteriilor Rhizobium
(creștere, capacitate de nodulare, diversitate);
• Evidenţierea capacităţii de nodulare a bacteriilor Rhizobium în funcţie de
specia cultivată;
44

• Nivelul concentraţiei azotului fixat pe parcursul perioadei de vegetaţie a
plantelor.
4.2. Protocol experimental pentru terenuri contaminate cu metale grele
(ICPA-București)
Titlul experienţei: Simularea riscurilor metalelor grele pentru creșterea și
dezvoltarea populaţiilor de Rhizobium în simbioză cu diferite specii de leguminoase
perene fără inocul de bacterii la sămânţă.
Tipul și condiţiile experienţei: Experienţă polifactorială în vase de vegetaţie
de tip Mitcherlich.
Factorii studiaţi:
• Nivelul concentraţiei metalelor grele în sol;
• Impactul metalelor grele asupra creșterii bacteriilor Rhizobium;
• Impactul metalelor grele asupra diversităţii bacteriilor Rhizobium în sol;
• Efectul diferenţiat al metalelor grele asupra bacteriilor Rhizobium
(creștere, capacitate de nodulare, diversitate);
• Nivelul concentraţiei azotului fixat pe parcursul perioadei de vegetaţie a
plantelor.
4.3. Metode de izolare a ADN din culturi de rhizobacterii
În această etapă au fost prelevate probe de sol din perimetrele experimentale
menţionate în vederea efectuării analizelor microbiologice utilizând metode clasice și
metode moderne pentru a caracteriza starea iniţială a solului din punct de vedere al
prezenţei bacteriilor Rhizobium. Probele au fost pregătite corespunzător tehnicilor
actuale pentru realizarea izolatelor specifice. Rezultatele analizelor microbiologice
obţinute pentru starea iniţială a solurilor (toamna anului 2008) urmează a fi
comparate cu rezultatele ce se vor obţine în primăvara anului 2009 la analizele ce
se vor realiza în absenţa plantei gazdă. Această comparaţie are rolul de a evidenţia
impactul factorilor climatici și al transformărilor ce se petrec în sol pe parcursul iernii
asupra microorganismelor Rhizobium.
Pentru izolarea ADN de la rhizobacterii poate fi utilizat kit-ul Wizard Genomic
furnizat de Promega sau pot fi aplicate și sisteme semiautomatizat de izolare a ADN
genomic, așa cum este sistemul Maxwell.
De asemenea, pentru a studia biodiversitatea comunității microbiene din sol nu
este obligatorie cultivarea bacteriilor ce populează asemenea mediu, fiind suficientă
izolarea ADN direct din probele de sol. Pentru a se realiza acest lucru se va testa
protocolul descris de Zhou și colab. (1996) care presupune următoarele etape:
• 1,5g de sol se resuspendă în tampon de extracție (Tris 100mM, pH – 8.0;
EDTA 100mM, pH – 8.0; tampon fosfat de sodiu 100mM, pH – 8.0; NaCl
1,5M., CTAB 1%).
• Distrugerea peretelui celular bacterian prin șocuri termice succesive:
alternarea incubării în azot lichid 10 minute cu incubarea la 65 o C timp de 10
minute; probele sunt apoi aduse la 37oC prin incubare pe baie de apă;
45

• Se adaugă 150μg/ml RN-ază și se incubează timp de o oră, cu agitare
orizontală de 100 rpm la 37oC;
• Pentru liza completă a celulelor bacteriene din sol se adaugă SDS până la o
concentrație finală de 2%, urmată de o incubare la 65oC timp de 80 minute,
pe baie de apă;
• Centrifugare la 5000 rpm pentru îndepărtarea resturilor și obținerea
extractului apos ce conține ADN;
• Deporeinizarea extractelor se realizează cu un amestec de cloroform-alcool
izolamilic (24/1, v/v), cu agitare puternică timp de 10 minute și apoi
centrifugare la 5000 rpm timp de 10 minute. Tratamentul se repetă de 3 ori;
• La supernatantul obținut în final se adaugă 0,6 volume alcool izopropilic
pentru precipitarea ADN și se menține la temperatura camerei timp de o oră;
• Pentru obținerea sedimentului de ADN se face o centrifugare la turație mare
(15.000 rpm) timp de 15-30 minute;
• Sedimentul obținute este spălat cu etanol 80% și apoi reluat în 100μl tampon
TE de păstrare (Tris-HCl 5mM, EDTA 0,5mM, pH 7,5-8,5).
Probele astfel obținute sunt examinate electroforetic pentru stabilirea gradului de
fragmentare al ADN, precum și spectrofotometric pentru a determina puritatea și
cantitatea de ADN. In final, ADN astfel izolat poate fi supus analizelor moleculare
(amplificare cu primeri specifici) pentru caracterizarea sa și, eventual, identificarea
speciilor bacteriene existente în sol.
4.4. Protocol experimental pentru perimetrul cu pajiști naturale (ICDP-
Brașov)
Titlul experienţei: Studiul populaţiilor naturale şi diversităţii genetice a
speciilor genului Rhizobium pe diferite soluri din zona colinară a jud Braşov.
Scopul experienţei: Evaluarea evoluţiei simbiozelor cu Rhizobium la unele
specii de leguminoase perene de pajişti (leguminoase perene), cultivate pe soluri
afectate de prezenţa metalelor grele.
Obiective urmărite:
• stabilirea influenţei pe care prezenţa în sol a metalelor grele o manifestă
asupra dezvoltării bacteriilor din genul Rhizobium şi a capacităţii acestora
de infestare a rădăcinilor unor specii de leguminoase perene de pajişti;
• evaluarea modificărilor structurale cantitative şi calitative ale covorului
vegetal în relaţie cu activitatea microbiologică a solului.
Factorii experimentali:
A. Leguminoase perene de pajişti în cultură pură
- Trifolium repens
- Trifolium pratense
- Lotus corniculatus
46

- Medicago sativa
B. Amestecuri de graminee şi leguminoase perene de pajişti
în diferite proporţii- Festuca pratensis
b 1 graminee 100% + leguminoase 0
b 2 graminee 85% + leguminoase 15%
b 3 graminee 70% + leguminoase 30%
b 4 graminee 60% + leguminoase 40%
Condiţii tehnice
Experienţa se amplasează pe două tipuri de sol:
a – favorabil culturii leguminoaselor perene de pajişti;
b– puţin favorabil sau nefavorabil culturii leguminoaselor perene de pajişti,
urmărindu-se în mod special aspecte referitoare la poluarea solului cu metale grele.
Experienţa este de tip bifactorial aşezată în câmp după metoda blocurilor
randomizate în trei repetiţii :
• o parcelă se menţine ogor negru pe toată durata experienţei;
• normele de semănat se stabilesc pentru fiecare specie de leguminoasă şi
graminee perenă în funcţie de modul de cultură;
• în anul I prima recoltare se realizează la înfloritul deplin al speciilor de
leguminoase în scopul stimulării dezvoltării sistemului radicular;
• nu se vor aplica fertilizanţi chimici sau organici;
• Exploatarea se face în regim de fâneaţă;
• Suprafaţa recoltabilă a parcelei este de 20 m 2 .
Determinări şi analize:
- determinarea în dinamică a ritmului de creştere şi uniformităţii covorului
vegetal;
- determinarea producţiei de masă verde şi substanţă uscată;
- determinarea compoziţiei botanice;
- analize chimice la plantă şi sol;
- analize microbiologice la sol.
47

R3
PROGRAMUL 4 “PARTENERIATE IN DOMENIILE PRIORITARE” 2007-2013
48
Trifolium pratense 100%
Fest.p. 85%-Tr.prat.15%
Fest.p70%-Tr.prat.30%
Fest.p. 60%-Tr.prat.40%
Medicago sativa 100%
Fest.p. 85%-Medicago
s.15%
Fest.p70%-Medicago s.
30%
Fest.p. 60%-Medicago s.
40%
Trifolium rep.100%
Fest.p. 85%-Tr.rep.15%
Fest.p70%-Tr.rep.30%
Fest.p. 60%-Tr.rep.40%
Lotus corniculatus 100%
Fest.p. 85%-Lotus c.15%
Fest.p70%-Lotus c. 30%
Fest.p. 60%-Lotus c. 40%
Festuca prat. 100%
Ogor
Lotus corniculatus 100%
Fest.p. 85%-Lotus c.15%
Fest.p70%-Lotus c. 30%
Fest.p. 60%-Lotus c. 40%
Trifolium rep.100%
Fest.p. 85%-Tr.rep.15%
Fest.p70%-Tr.rep.30%
Fest.p. 60%-Tr.rep.40%
Ogor
Festuca prat. 100%
Medicago sativa 100%
Fest.p. 85%-Medicago
s.15%
Fest.p70%-Medicago s.
30%
Fest.p. 60%-Medicago s.
40%
Trifolium pratense 100%
Fest.p. 85%-Tr.prat.15%
Fest.p70%-Tr.prat.30%
Fest.p. 60%-Tr.prat.40%
R2
R1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Ogor
Festuca prat. 100%
Trifolium rep.100%
Fest.p. 85%-Tr.rep.15%
Fest.p70%-Tr.rep.30%
Fest.p. 60%-Tr.rep.40%
Trifolium pratense 100%
Fest.p. 85%-Tr.prat.15%
Fest.p70%-Tr.prat.30%
Fest.p. 60%-Tr.prat.40%
Lotus corniculatus 100%
Fest.p. 85%-Lotus
c.15%
Fest.p70%-Lotus c. 30%
Fest.p. 60%-Lotus c.
40%
Medicago sativa 100%
Fest.p. 85%-Medicago
s.15%
Fest.p70%-Medicago s.
30%
Fest.p. 60%-Medicago s.
40%

PROGRAMUL 4 “PARTENERIATE IN DOMENIILE
PRIORITARE” 2007-2013
IV. CONCLUZII
În această primă etapă s-au realizat următoarele activităţi, conform planului de
realizare a proiectului:
Elaborarea documentatiei privitoare la caracteristicile ecologice si economice ale
zonelor luate in studiu; perimetru experimental terenuri arabile din Campia
Romana.
Elaborarea documentatiei privitoare la caracteristicile ecologice si economice ale
zonelor luate in studiu; perimetru experimental terenuri/soluri contaminate cu
metale grele din activitati antropice.
Elaborarea documentatiei privitoare la caracteristicile ecologice si economice ale
zonelor luate in studiu; perimetru experimental terenuri cu pasuni naturale.
Elaborarea protocolului experimental si pichetarea suprafetelor de interes
experimental in teren arabil din Campia Romana.
Elaborarea protocolului experimental si pichetarea suprafetelor de interes
experimental in teren/soluri contaminate cu metale grele din activitati antropice.
Elaborarea protocolului experimental si pichetarea suprafetelor de interes
experimental in teren cu pajisti naturale.
Evaluarea starii initiale a solurilor si a surselor generatoare de risc; teren arabil
din Campia Romana.
Evaluarea starii initiale a solurilor si a surselor generatoare de risc; teren/soluri
contaminate cu metale grele din activitati antropice.
Evaluarea starii initiale a solurilor si a surselor generatoare de risc; teren cu
pajisti naturale.
Luarea probelor de sol si pregatirea acestora conform tehnicii experimentale
pentru analize fizice si chimice: teren arabil din Campia Romana, in starea initiala.
Luarea probelor de sol si pregatirea acestora conform tehnicii experimentale
pentru analize fizice si chimice:teren/soluri contaminate cu metale grele din
activitati antropice, in starea initiala.
Luarea probelor de sol si pregatirea acestora conform tehnicii experimentale
pentru analize fizice si chimice: teren cu pajisti naturale, in starea initiala.
Analize fizice si chimice la sol; determinarea continutului in metale grele al
solurilor din toate perimetrele experimentale luate in studiu in starea lor initiala.
Luarea probelor de sol si pregatirea acestora conform tehnicii experimentale
pentru determinarea prezentei bacteriilor Rhizobium prin metode/tehnici clasice, in
toate perimetrele experimentale, in starea initiala a solurilor.
Luarea probelor de sol si pregatirea acestora conform tehnicii experimentale
pentru determinarea prezentei bacteriilor Rhizobium prin metode/tehnici moderne,
in toate perimetrele experimentale, in starea initiala a solurilor.
Prelucrarea statistica si interpretarea datelor rezultate de la analizele fizice si
chimice ale solurilor din perimetrele experimentale in starea lor initiala.
Elaborarea raportului stiintific corespunzator indeplinirii obiectivului specific
O.S.1 si etapei intai a proiectului.
Prin realizarea activităţilor menţionate mai sus s-a îndeplinit obiectivul
O.S.1. al proiectului, respectiv, ”evaluarea cantitativă a factorilor de risc, în
49

PROGRAMUL 4 “PARTENERIATE IN DOMENIILE
PRIORITARE” 2007-2013
special la nivelul solurilor, în zonele luate în studiu, a impactului acestora
asupra proprietăţilor solului şi a surselor generatoare” și obiectivul etapi 1.
Datele culese au permis realizarea unei baze de date care va permite
desfășurarea în continuare a activităţilor din planul de realizare a proiectului,
conform obiectivelor propuse. De asemenea s-a realizat raportul privind
îndeplinirea obiectivului etapei 1.
Din punct de vedere tehnic, în această etapă se dispune de următoarele
materiale date:
• Studiu bibliografic pe baza informaţiilor recente de pe principalul flux de
publicaţii (jurnale internaţionale ISI) privind factorii de risc și efectele
acestora asupra bacteriilor din genul Rhizobium, în special metalele grele;
• Studiu privind bacteriile Rhizobium și metodele actuale foloite pe plan
mondial în testarea supravieţuirii și diversităţii acestora;
• Raport privind caracteristicile ecologice și economice, precum și starea
iniţială a terenurilor din perimetrele luate în studiu;
• Protocoale experimentale pentru realizarea în continuare a experienţelor
în vederea atingerii obiectivelor următoare, până la finele proiectului.
50

PROGRAMUL 4 “PARTENERIATE IN DOMENIILE
PRIORITARE” 2007-2013
BIBLIOGRAFIE
Ahmad,D., Mehmannavaz, R., Damaj, M. 1997. Isolation and Characterization of Symbiotic N2-Fixing
Rhizobium meliloti from Soils Contaminated with Aromatic and Chloroaromatic Hydrocarbons:
PAHs and PCBs. International Biodeterioration & Biodegradation, 39(1):33-43
Alberton, O., Kaschuk, G., Hungria, M. 2006. Sampling effects on the assessment of genetic diversity
of rhizobia associated with soybean and common bean Soil Biology & Biochemistry 38:1298–1307
Amarger, N. (2001) Rhizobia in the field. Adv. Agron. 73, 109-167.
Bala, A., Murphy, P., Ken E. Giller, K.E. 2001. Genetic diversity of rhizobia from natural populations
varies with the soil dilution sampled, Soil Biology & Biochemistry 33:841-843
de Bruijn, F. J. 1992. Use of repetitive (repetitive extragenic palindromic and enterobacterial repetitive
intergenic consensus) sequences and the polymerase chain reaction to fingerprint the genomes of
Rhizobium meliloti isolates and other soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 58:2180–2187.
Bååth et al., 1998; Khan and Scullion, 2002. In: Pereira et al. 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium
leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal
contamination: Effects on protein expression. Applied Soil Ecology 33, 286-293.
Bååth et al., 1992; Bååth et al., 1998. In: Pereira et al. 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium
leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal
contamination: Effects on protein expression. Applied Soil Ecology 33, 286-293.
Brooks, P. C., McGrath, S. P., Heijnen, C., 1986a. Metals residues in soil previously treated with
sewage sludge and their effects on growth and nitrogen fixation by blue-green algae. Soil Biology
& Biochemistry 18, 345-353. In Castro et al. 2003. Soil Biology & Biochemistry 35, 49-54.
Brooks, P. C., Heijnen, C., McGrath, S. P., Vance, E. D., 1986b. Soil microbial biomass estimated in
soils contaminated with heavy metals. Soil Biology & Biochemistry 18, 383-388. In Castro et al.
2003. Soil Biology & Biochemistry 35, 49-54.
Redy, G. B., Cheng, C. N., Dunn, S. J., 1983. Survival of Rhizobium japonicum in soil-sludge
environment. Soil Biology & Biochemistry 15, 343-345. In Castro et al. 2003. Soil Biology &
Biochemistry 35, 49-54.
Castro, I. V., Ferreira, E. M., McGrath, S. P., 2003. Survival and plasmid stability of rhizobia introduced
into a contaminated soil. Soil Biology & Biochemistry 35, 49-54. . www.sciencedirect.com
Chaudry, P., Dudeja, S. S., Kapoor, K. K., 2004. Effectivity of host-Rhizobium leguminosarum
symbiosis in soils receiving sewage sludge water containing heavy metals. Microbiological
Research, 159, 121-127.
Chelius, M. K. and Triplett, E. W. (2001) The diversity of Archaea and bacteria in association with the
roots of Zea mays, L. Microb. Ecol. 41, 252-263. Depret et al., FEMS Microb. Ecol. 51 (2004), 87-
97. . www.sciencedirect.com
Clark, I. M., Mendum, T. A. and Hirch, P. R. (2002) The influence of the symbiotic plasmid pRLIJI on
the disribution of GM rhizobia in soil and crrop rhizospheres, and implications for gene flow.
Antoine Van Leeuwenhoek 81, 607-616. Depret et al., FEMS Microb. Ecol. 51 (2004), 87-97.
Chaudri, A. M., McGrath, S. P., Giller, K. E., 1992. Survival of the indigenous population of Rhizobium
leguminosarum biovar trifolii in soil spiked with Cd, Zn, Cu and Ni salts. Soil Biology &
Biochemistry 24, 625-632.
Chaudri, A. M., McGrath, S. P., Giller, K. E., Rietz, E., Sauerbeck, D. R., 1993. Enumeration of
indigenous population of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii in soil previously treated with
metal-contaminated sewage-sludge. Soil Biology & Biochemistry 25, 301-309.
Dumitru, M., Gamenţ Eugenia, Olanescu Georgiana, Ulmanu Mihaela, Vrinceanu Nicoleta, Anger Ildiko,
2006, Gradul de încărcare cu metale grele a solurilor și plantelor din zona Copșa Mică, Conferinţa
”Cercetare de excelenţă – Premiză favorabilă pentru dezvoltarea spaţiului românesc de cercetare”,
Brașov, 2006, vol. 1, pag. L2-9 (1-10).
Eckford, R, Cook, F.D., Saul, D, Aislabie, J, Foght, J., 2002, Free-living heterotrophic nitrogen-fixing
bacteria isolated from fuel contaminated antarctic soils. Appl. Environ. Microbiol., 68, 5181-5185.
Eckhardt, T. 1978. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria,
Plasmid. 1:584–588.
Fremont, M., Prin, Y., Chauviere, M., Diem, H.G., Pwee, K.H., Tan, T.K. 1999. A comparison of
Bradyrhizobium strains using molecular, cultural and field studies. Plant Science 141:81–91
Gadd, 1992. In: Pereira et al. 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium leguminosarum biovar viciae
isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal contamination: Effects on protein
expression. Applied Soil Ecology 33, 286-293.
Gamenţ Eugenia, Dumitru M., Ulmanu Mihaela, Anger Ildiko, Olănescu Georgiana, Tănase Veronica,
Enache Roxana, 2003, Studiu privind poluarea solului cu metale grele în vecinătatea uzinelor
51

PROGRAMUL 4 “PARTENERIATE IN DOMENIILE
PRIORITARE” 2007-2013
Neferal – Acumulatorul. Suprafaţa de teren afectată și impactul asupra vegetaţiei, Lucrările celei
de-a XVII – a Conferinţe Naţionale pentru Știinţa Solului, Timișoara, 23 – 30 august 2003, vol. 2,
p. 605 – 616
Giller et al., 1989; McGrath et al., 1995; Robinson et al., 2001. In: Pereira et al. 2006. Heavy metal
toxicity in Rhizobium leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different
sources of heavy-metal contamination: Effects on protein expression. Applied Soil Ecology 33,
286-293.
Giller et a., 1998. In: Pereira et al. 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium leguminosarum biovar
viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal contamination: Effects on
protein expression. Applied Soil Ecology 33, 286-293.
Graham, P. H., Vance, C. P., 2003. In: Alberton, O., Kaschuk, G., Hungria, M., 2006. Sampling effects
on the assessment of genetic diversity of rhizobia associated with soybean and common bean. Soil
Biology & Biochemistry 38, 1298-1307.
Harrison, S. P., L. R. Mytton, L. Skot, M. Dye, Cresswell, A. 1992.Characterization of Rhizobium
isolates by amplification of DNA polymorphisms using random primers. Can. J. Microbiol. 38:1009–
1015.
Hartmann, A., Giraud, J.J., Catroux, G. 1998. Genotypic diversity of Sinorhizobium (formerly
Rhizobium) meliloti strains isolated directly from a soil and from nodules of alfalfa (Medicago
sativa) grown in the same soil. FEMS Microbiology Ecology 25:107-116.
Herrera-Cervera, J.A., Caballero-Mellado, J., Laguerre, G., Tichy, H.V., Requena, N., Amarger, N.,
Martinez-Romero E., Olivares. J., Sanjuan, J. 1999. At least five rhizobial species nodulate
Phaseolus vulgaris in a Spanish soil. FEMS Microbiology Ecology 30:87-97
Hilali, A., Prevost, D., Broughton, W. J. and Antoun, H. (2001) Effects of innoculation with Rhizobium
leguminosarum biovar trifolii on wheat cultivated in clover crop rotation agricultural soil in
Morocco. Can. J. Microbiol. 47, 590-593. Depret et al., FEMS Microb. Ecol. 51 (2004), 87-97.
Howieson, J., Ballard, R., 2004. Optimising the legume symbiosis within southers Australia – some
contemporary thoughts. Soil Biology & Biochemistry 36, 1261-1273.
Ike, A., Sriprang, R., ono, H., Murooka, Y., Yamashita, M., 2007. Bioremediation of cadmium
contaminated soil using symbiosis between leguminous.
Jamann, S., Fernandez, M.P., Normand, P. 1993. Typing method for N2-fixing bacteria based on PCR-
RFLP-application to the characterization of Frankia strains. Mol. Ecol. 2:17–26.
Laguerre, G., M. R. Allard, F. Revoy, Amarger, N. 1994. Rapid identification of rhizobia by restriction
fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes. Appl. Environ.
Microbiol. 60:56–63.
Laguerre, G., Mavingui, P., Allard, M.-R., Charnay, M.-P., Louvrier, P., Mazurier, S.-I., Rigottier-Gois,
L., Amarger, N. 1996. Typing rhizobia by PCR DNA Fingerprinting and PCR-restriction fragment
length polymorphism analysis of chromosomal and symbiotic gene regions: application to
Rhizobium leguminosarum and its different biovars. Applied and Environmental Microbiology
62:2029-2036.
Lakzian, A., Murphy, Ph., Turner, A., beynon, J. L., Giller, K. E., 2002. Rhizobium leguminosarum bv.
viciae populations in soils with increasing heavy metal contamination: abundence, plasmid profiles,
diversity and metal tolerance. Soil Biology & Biochemistry 34, 519-529.
Lakzian, A., Murphy, M., Giller, K.E. 2007. Transfer and loss of naturally-occurring plasmids among
isolates of Rhizobium leguminosarum bv. viciae in heavy metal contaminated soils. Soil Biology &
Biochemistry 39: 1066–1077
Lindström,K., Jussila,M.M., Hintsa,H., Kaksonen,A., Mokelke,L., Mäkeläinen,K., Pitkäjärvi,J.,
Suominen,L.,2003, Potential of the Galega–Rhizobium galegae System for Bioremediation of Soil,
Food Technol. Biotechnol. 41 (1) 11–16
Mader, P., Fliessbach, A., Dubois, D., Gunst, L., Fried, P. and Niggli, U. (2002) Soil fertility and
biodiversity in organic farming. Science 296, 1694-1697. Depret et al., FEMS Microb. Ecol. 51
(2004), 87-97.
McGrath and Lane, 1989. . In: Pereira et al. 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium leguminosarum
biovar viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal contamination:
Effects on protein expression. Applied Soil Ecology 33, 286-293.
MacLean, A.M., Finan, T.M., Sadowsky, M.J. 2007, Genomes of the Symbiotic Nitrogen-Fixing Bacteria
of Legumes. Plant Physiology, 144: 615–622. Mohmmed, A., Sharma, R.S., Ali, S., Babu, C.R.
2001 Molecular diversity of the plasmid genotypes among Rhizobium gene pools of sesbanias from
different habitats of a semi-arid region (Delhi) FEMS Microbiology Letters 205: 171-178
52

PROGRAMUL 4 “PARTENERIATE IN DOMENIILE
PRIORITARE” 2007-2013
Metodologie de analiză agrochimică a solurilor în vederea stabilirii necesarului de amendamente și
îngrășăminte, Metode de analiză chimică a solurilor, 1981, ICPA, București Monitoringul Stării de
Calitate a Solurilor din România, 2000, ICPA București
Nicoleta Olimpia Vrînceanu, Motelică, D., M., Dumitru, M., Toti M., Gamenţ Eugenia, Tănase Veronica,
2002. Aspects Concerning Soil Pollution with Heavy Metals in the Copsa Mică Area,
Nriagu, J. O., 1990. Global metal pollution-poisoning the biosphere? In: Pereira et al. 2006. Heavy
metal toxicity in Rhizobium leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different
sources of heavy-metal contamination: Effects on protein expression. Applied Soil Ecology 33,
286-293.
O’Hara, G. W., : Howieson, J. G., Graham, P. H., 2003. In: Howieson, J., Ballard, R., 2004. Optimising
the legume symbiosis in stressful and competitive environments within southern Australia – some
contemporary thoughts. Soil Biology & Biochemistry 36, 1261-1273.
Ordinul 756/1997 al MAPPM, în Monitorul Oficial al României, partea I, nr.303 bis/6.11.1997
Paffetti, D., Scotti, C., Gnocchi, S., Fancelli, S., Bazzicalupo, M. 1996. Genetic diversity of an Italian
Rhizobium meliloti population from different Medicago sativa varieties. Applied and Environmental
Microbiology 62:2279-2285.
Pereira, S. I. A., Lima, A. I. G., Figueira, E.M.A.P, 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium
leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal
contamination: Effects on protein expression. Applied soil ecology 33, 286-293.
Prakash, R. K., Atherly, A. G. 1986. Plasmids of Rhizobium and their role in symbiotic nitrogen fixation.
Int Rev Cytol 104:1-24.
Preceedings, International Conference ”Soils under Global Change, Constanta, Romania, 3 – 6 sept.
2002”.
Reichman, S.M., 2007,.The potential use of the legume- rhizobium symbiosis for the remediation of
arsenic contaminated sites. Soil Biology and Biochemistry. 39, 2587-2593.
Schmalenberger, A., Schwieger, F. and Tebbe, C. C. (2001) Effect of primers hybridizing o different
evolutionarly conserved regions of the small-subunit rRNA gene in PCR-based microbial
community analyses and genetic profiling. Appl. Environ. Microbiol. 67, 3557-3563. Depret et al.,
FEMS Microb. Ecol. 51 (2004), 87-97.
Schmalenberger, A. and Tebbe, C. C. (2003) Bacterial diversity in maize rizospheres: conclusions on
the use of genetic profiles based on PCR-amplified partial small subunit rRNA genes in ecological
studies. Mol. Ecol. 112, 251-262. Depret et al., FEMS Microb. Ecol. 51 (2004), 87-97.
Shi et al., 2002. In: Pereira et al. 2006. Heavy metal toxicity in Rhizobium leguminosarum biovar
viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal contamination: Effects on
protein expression. Applied Soil Ecology 33, 286-293.
Sprent, J. I., 2001. In: Howieson, J., Ballard, R., 2004. Optimising the legume symbiosis in stressful
and competitive environments within southern Australia – some contemporary thoughts. Soil
Biology & Biochemistry 36, 1261-1273.
Ulmanu Mihaela, Theodora Matsi, Ildiko Anger, Eleonora Neagu, Eugenia Gamenţ, Dumitru, M.,
Georgiana Olănescu, Elisabeta Dumitru, 2003. Soil Pollution with Heavy Metals in the Vecinity of
Acumulatorul – Neferal Plants I Preliminary Tests. Lucrările celei de-a XVII – a Conferinţe
Naţionale pentru Știinţa Solului, Timișoara, 23 – 30 august 2003, vol. 2, p. 617 – 625
Versalovic, J., Koeuth, T., Lupski, J.R. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and
application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 19:6823–6831.
Vincent, J. M., 1970. A Manual for Practical Study of the Root Nodule Bacteria. Blackwell Publications,
Oxford, p.164.
Vinuesa, P., Silva, C., Lorite, M.H., Izaguirre-Mayoral, M.L., Bedmar, E.J., Martınez-Romero, E. 2005.
Molecular systematics of rhizobia based on maximum likelihood and Bayesian phylogenies inferred
from rrs, atpD, recA and nifH sequences, and their use in the classification of Sesbania
microsymbionts from Venezuelan wetlands. Systematic and Applied Microbiology 28:702–716
Zurkowski, W., Lorkiewicz, Z. 1978. Effective method for the isolation of non-nodulating mutants of
Rhizobium trifolii. Genet Res 32:311-314.
53