Sinteza si evaluarea farmacologica a noi compusi, pentru

Proiect nr. 42 - 103
TITLUL PROIECTULUI:
SINTEZA SI EVALUAREA FARMACOLOGICA A NOI COMPUSI,
PENTRU IMPLEMENTAREA DE TERAPII MODERNE IN
TRATAMENTUL OBEZITATII SI/SAU DIABETULUI DE TIP 2:
CERCETARI PREPARATIVE, STRUCTURA, SCREENING
FARMACOLOGIC
COORDONATOR:
INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE
CHIMICO-FARMACEUTICA – ICCF
DIRECTOR DE PROIECT:
ING. CPII DOINA ANDREESCU

PARTENERI IN CONSORTIU
ADRESA WEB: www.ncpri.ro/diabet
PARTENER 1: CENTRUL DE CHIMIE ORGANICA C.D.NENITESCU AL
ACADEMIEI ROMANE;
RESPONSABIL DR. ING. MIRON TEODOR CAPROIU
PARTENER 2: UMF CAROL DAVILA FACULTATEA DE FARMACIE
RESPONSABIL CONF. DR. SIMONA NEGRES
PARTENER 3: USAMV FACULTATEA DE MEDICINA VETERINARA
RESPONSABIL: CONF. DR. EMILIA CIOBOTARU
PARTENER 4: INSTITUTUL DE BIOCHIMIE AL ACADEMIEI ROMANE
RESPONSABIL: DR. ELENA GANEA
BUGET : 1 850 000 LEI

Obiectiv final al proiectului:
Obţinerea unor substanţe chimice noi
(active farmacologic), cu efect potenţial
agonist pe receptorii beta 3 adrenergici,
utili în tratamentul diabetului zaharat şi/sau
obezităţii.

Schema de sinteza abordata pentru
obtinerea structurilor originale
R
OH
CH CH 2 NH 2
intermediar I
+ O C
CH 3
CH 2 Y Na[B(OAc) 3]; AcOH
intermediar II
OH
R
CH
CH 3
CH 2 NH CH CH 2
Y
in care:
R = H, alcoxi, halogen, dihalogen
Y = O
C O C 3 H 7
; O
(CH 2 )n C O CH 3
; n = 1, 2
O
O

Obiective generale:
I. Stabilirea cailor generale de sinteza pentru obtinerea
compusilor din clasa derivati de aril-etanolamina;
II. Elaborarea procedeelor de sinteza si caracterizare fizicochimica,
structurala si farmacologica a noilor structuri
III. Screening farmacodinamic pentru decelarea efectului
substanţelor nou sintetizate asupra metabolismului glucidic
şi lipidic
IV. Screening toxicologic privind toxicitatea acută şi subacută
(inclusiv examen histopatologic)
V. Determinarea eficacităţii în diabet zaharat indus
experimental: efectul asupra glicemiei, determinări enzimatice,
evaluarea alterarii structurii si functiei proteinelor prin
glicozilare neenzimatica

Rezultate finale ale proiectului
Obtinerea unor precursori noi sau cunoscuti necesari sintezei produşilor finali;
Obtinerea a cel putin 6 structuri noi, posibil agonisti ai receptorilor beta-3-
adrenergici, cu structura confirmata si cu activitate antidiabetica si/sau
antiobezitate;
Elaborarea de procedee de sinteza la nivel de laborator pentru precursori noi si
produsi finali originali, moderne, fezabile, cu elemente de originalitate;
Realizarea de modele experimentale pentru studiul efectelor biologice ale
agonistilor beta-3- pe animale de laborator; dozarea parametrilor biochimici:
glicemie, colesterol total, trigliceride, HDL-colesterol;
Realizarea de modele experimentale pentru determinarea toxicitatii acute şi
subacute pentru substantele care influenteaza profilul glucidic in sens favorabil
actiunii antidiabetice;
Testarea efectului compusilor originali obtinuti asupra formarii produsilor de
glicozilare avansata (AGEs) si a interactiei acestora cu receptori specifici (RAGE)
Articole publicate in reviste cotate ISI;
Cerere de brevet privind structurile originale si procedeele de sinteza ale
acestora;
Comunicari la manifestari stiintifice nationale si/sau internationale.

Elemente de originalitate:
I. Tematica şi obiectivele proiectului se încadrează în linia cercetărilor ce vizează o
abordare terapeutică nouă în diabetul zaharat şi în obezitate;
II. Utilizarea unor tehnici de lucru moderne (elemente de originalitate, de respectare a
standardelor de calitate si mediu, la nivel european) pentru obtinerea precursorilor si a
produsilor finali;
III. Utilizarea unor procedee de sinteza organica fina laborioase, ce implica traversarea
unui numar de 7-10 faze de sinteza pentru fiecare structura, urmate de purificari.
IV. Elaborarea si utilizarea unor metode moderne, performante de caracterizare fizicochimica
si structurala (spectroscopie IR-FT, 1 H si 13 C RMN, HPLC, GC-MS), metode
ce impun acuratete, precizie, siguranta si reproductibilitate;
V. Crearea unor modele experimentale validate pentru dereminarea toxicităţii (in
silico, in vitro, in vivo) şi pentru investigarea efectului asupra metabolismului
glucidic şi lipidic
VI.Crearea unor modele experimentale pentru investigarea altor efecte posibile ale
agoniştilor receptorilor beta 3 adrenergici (uter, vase de sînge);
VII. Elaborarea unor metode pentru detectarea unui efect inhibitor asupra formarii de
AGEs sau/si asupra interactiei receptor-ligand

Modalitati de valorificare
Potenţială contribuţie în ameliorarea stării de sănătate, prin dezvoltarea
unei clase terapeutice noi;
Creşterea competitivităţii ştiinţifice şi posibila integrare în circuite
internaţionale de cercetare, prin exploatarea rezultatelor ştiinţifice,
metodologice si tehnologice;
Susţinerea dezvoltării de produse medicamentoase româneşti
originale;
Extinderea competenţelor şi a abilităţilor în sinteza organică fină, în sinteza
de medicamente
Constituirea unui fond de informaţii ştiinţifice, metodologice şi
tehnologice ce se poate exploata şi pentru alte proiecte similare,
lucrari de licenta, de masterat, teze de doctorat;
Aplicarea rezultatelor cercetării va conduce la obţinerea unor produse
competitive, accesibile pieţii interne şi cu eventual potenţial de
export, utilizabile în unităţi producătoare de medicamente;
Obţinerea de produşi competitivi cu costuri mici, elaborarea unor
tehnologii de laborator fezabile, economice şi performante, atractive
pentru unele IMM-uri de profil, ceea ce poate genera noi locuri de muncă
în industria de produse farmaceutice.

Stadiul de realizare in 2010
(etapa II 11.12.2009 - 30.10.2010)
Buget de stat: 157 105 lei
(credit de angajament)
Cofinantare: -
Activităţi:
INCDCF-ICCF (coordonator)
Studii pentru obtinerea intermediarilor cheie din sinteza compusilor C1, C2
Elaborarea tehnologiei de sinteza la nivel de laborator a noilor compusi C1, C2
Obtinerea compusilor C1, C2 in cantitati necesare studiilor biologice si analizelor
fizico-chimice complexe
Elaborarea metodelor de analiza si caracterizare fizico-chimica a intermediarilor si
compusilor noi C1, C2 (Rf, p.t., analiza elementala, analiza functionala, solubilitati).
Elaborarea unei lucrari stiintifice in colaborare cu partenerii.
International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European
Countries “Chemistry-Beauty and Application – ICOSECS 7, Septembrie 15-17, 2010,
Bucuresti a fost prezentat posterul cu titlul:
“New phenylethanolamine derivatives potentially use in modern therapy for obesity
and/or type 2 -diabetes (II)”
Autori: Gabriela Putina, Rodica Guta, Doina Andreescu, Cristina Ghita, Corina Ilie, Horia Popescu,
Miron Teodor Caproiu, Simona Negres, Cornel Chirita. (in colaborare cu Partener 1 CCO si Partener 3
UMF Carol Davila).

Activităţi:
Partener 1 – CCO
Stabilirea structurii si puritatii compusilor C1, C2. Caracterizarea spectrala IR si 1 H si
13 C-RMN a compusilor C1, C2
Identificarea caracteristicilor moleculare pentru activitatea biochimica pt compusii
C1 si C2
• Partener 2 – UMF
Studii de toxicitate in silico, in vitro si in vivo:
• Studii toxicologice in silico. Elaborarea modelelor predictive pentru toxicitatea acuta a
compusilor nou sintetizati.
• Influentarea profilului glucidic bazal, pe sobolan nondiabetic, de catre compusii nou
sintetizati
• Studii toxicologice in vitro pentru compusii nou sintetizati, C1 si C2.
• Studii toxicologice in vivo. Determinarea toxicitatii dupa administrare de doze unice, pe
cale orala, la soarece, pentru compusii de interes, selectati dupa efectuarea testelor in
silico si in vitro. Stabilirea DL 50
pentru compusii C1, C2
Dozarea glicemiei dupa administrare de doze unice, din compusii nou sintetizati, la
sobolani nondiabetici pentru compusii C1 si C2
• Partenr 3 – USAMV
Examenul histopatologic al animalelor diabetice tratate cu substantele de cercetat la
doze eficace comparativ cu lotul martor / Examinare macroscopica. Recoltare probe.
Realizare tehnici histopatologice. Examinarea si microfotografierea preparatelor
histopatologice. Interpretarea rezultatelor pentru compusii C1 si C2

Activităţi:
Partener 4 – Institutul de Biochimie
Estimarea efectului inhibitor asupra glicozilarii neenzimatice a proteinelor in vitro
Capacitatea compusilor nou sintetizati de a proteja proteinele impotriva modificarilor
structurale induse de glicozilarea neenzimatica pentru compusii C1 si C2
Aprecierea posibilitatii de prevenire cu ajutorul compusilor nou sintetizati a inactivarii
enzimelor indusa de glicozilarea neenzimatica pentru compusii C1 si C2
Diseminare rezultate:
Participare la The Annual International Conference of the Romanian Society of
Biochemistry and Molecular Biology, Bucuresti, 23-25 Sept.2010, E.Ganea, I.
Goldner, I.Popa, Gabriela Putina “ The Function of a Novel Adrenoreceptor
Agonist, a Possible Anti-Diabetic Agent” si publicare in Rom.J.Biochem., 47,
Suppl., 90-91 (2010)
Achizitii in 2010 -

Numar de tineri cercetatori implicati in proiect:
12 (sub 35 ani) reprezentand 25% din personal
Modul de implicare a tinerilor cercetatori
Hau Ramona (INCDCF-ICCF Coordonator)
• Masterat finalizat in 2009 la Universitatea Bucuresti Facultatea de Chimie,
specializarea Chimie terapeutica cu lucrarea de dizertatie
• “Azoli cu potentiala actiune antidiabetica”
Goldner Ioana, Popa Ioana (Partener 4 Institutul de Biochimie) participare la
simpozionul international The Annual International Conference of the Romanian
Society of Biochemistry and Molecular Biology, Bucuresti, 23-25 Sept.2010,
E.Ganea, I. Goldner, I.Popa, Gabriela Putina “ The Function of a Novel
Adrenoreceptor Agonist, a Possible Anti-Diabetic Agent” si publicare in
Rom.J.Biochem., 47, Suppl., 90-91 (2010)
Asist. Univ. Emil Ştefănescu (Partener 2 UMF “Carol Davila” Bucureşti,
Facultatea de Farmacie), farmacist specialist - Laborator Farmaceutic
Teză de doctorat: „Cercetari experimentale asupra unor compusi noi de
sinteza, cu potential farmacoterapeutic antidiabetic si antiobezitate” (compuşi
potenţial agonişti beta3 adrenergici, antidiabetici sintetizaţi de colectiv, dinclasa
derivatilor de aril-etanolamina

Modul de implicare a tinerilor cercetatori
Asist. Univ. Bruno Ştefan Velescu (Partener 2 UMF “Carol Davila” Bucureşti,
Facultatea de Farmacie), farmacist specialist - Laborator Farmaceutic
Teză de doctorat:„Cercetari experimentale de farmacocinetica asupra unor compusi de
sinteza si asupra metabolitilor acestora” (compuşi potenţial agonişti beta3
adrenergici, antidiabetici sintetizaţi de colectiv, dinclasa derivatilor de ariletanolamina)
Asist. Univ. Zbârcea Cristina Elena (Partener 2 UMF “Carol Davila”
Bucureşti, Facultatea de Farmacie), farmacist specialist - Laborator Farmaceutic
Bursă studii Bruxelles: The effects of the new beta3 adrenergic agonists on the rat
thoracic aorta (compuşi potenţial agonişti beta3 adrenergici, antidiabetici sintetizaţi
de colectiv, dinclasa derivatilor de aril-etanolamina)

Modul de implicare a tinerilor cercetatori
Utilizarea modelului experimental de diabet aloxanic validat în alte
cercetări:
Proiect Nr. 61042/2007
“SINTEZA, CARACTERIZAREA SI EVALUAREA POTENTIALULUI TERAPEUTIC AL UNOR NOI
COMBINATII COMPLEXE ALE OXOVANADIULUI(IV) CU LIGANZI NATURALI”
Cerere brevet de inventie: A/01254/30.11.2010
Compusi de oxovanadiu(IV) cu flavanone, procedeu de obtinere si utilizare terapeutica
Lucrări de diplomă ce investighează tratamentul durerii neuropate la şobolan
diabetic:
Alexandra Georgiana Gheorghe -2010
„Cercetări farmacologice experimentale privind acţiunea carbamazepinei, gabapentinului şi a
asocierii carbamazepină – gabapentin, în testul formalinei la şobolan normoglicemic,
hiperglicemic şi diabetic”
Alexandra Andriu (2010-2011)
“Determinarea DE50 pentru asocieri de substanţe active utilizate în tratamentul durerii
neuropate la şobolan diabetic”

Indicatori de rezultat pe anul 2010
Documentatii (dosare de literatura): 4
Studii QSAR: 6
Metode de sinteza pentru intermediari: 3
Numar de intermediari originali: 3
Numar de produse originale: 2
Numar de tehnologii la nivel de laborator: 2
Metode de analiza si caracterizare fizico-chimica si structurala: 24
Metode pe baze moderne de investigatie in medicina: 2
(Estimarea efectului inhibitor asupra glicozilarii neenzimatice a proteinelor in vitro)
Examen anatomopatologic: 2 - ficat, rinichi,splină, creier
Studii farmacologice şi toxicologice:
in silico: 1 - (utilizarea programului BIOINFOQSAR, conceput şi validat în
Proiect nr. 61-037/2007)
in vitro (celulă vegetală): 2 - determinare CI100:
in vivo: 2 - determinare DL50
Numar de articole publicate in reviste : 2 din care 1 in revista cotata ISI
Comunicari stiintifice la manifestari in tara cu participare internationala: 2

Activitati prevazute pentru anul 2011
Etapa 3: Sinteza, analiza fizico chimică, testări farmacologice şi biochimice pentru compuşii: C3,
C4, C5, C6. Termen de predare: 30.04.2011
CO INCDCF – ICCF
I. Sinteza compusilor C3, C4, C5, C6
a. Studii pt obtinerea intermediarilor din sinteza compusilor noi C3 - C6
b. Definitivarea metodelor de purificare pentru compusii noi sintetizati
c. Elaborarea tehnologiilor de sinteza la nivel de laborator pentru compusii C3, C4, c5, C6;
II. Obtinerea compusului C3 in cantitati necesare studiilor biologice si analizelor fizicochimice
complexe(finalizare)
III.Obtinerea compusilor C4-C6 in cantitatile necesare studiilor farmacologice si
biologice si analizelor fizico-chimice complexe
IV. Elaborarea metodelor de analiza fizico-chimica a intermediarilor si a compusilor C3 -C6
V. Determinarea principalelor constante fizice pentru compusii originali C3-C6
P1 CCO
I. Analiza fizico-chimica complexa a compusilor C3, C4, C5, C6
II. Stabilirea structurii si puritatii compusilor C3, C4, C5, C6. Caracterizarea spectrala IR,
MS si RMN 1H si 13C a compusilor C3, C4, C5, C6
III. Diseminare rezultate - Elaborarea unei lucrari stiintifice in colaborare cu partenerii.
IV. Participare la manifestari stiintifice nationale si/sau internationale.

Activitati prevazute pentru anul 2011
P2 UMF
I. Studii de toxicitate in silico, in vitro si in vivo; influentarea profilului glucidic bazal, pe sobolan
nondiabetic, de catre compusii nou sintetizati/
a.Studii toxicologice in vitro pentru compusii nou sintetizati pt compusii C3-C6
b. Studii toxicologice in vivo.Determinarea toxicitatii dupa administrare de doze unice, pe cale orala, la soarece,
pentru compusii de interes, selectati dupa efectuarea testelor in silico si in vitro.
C. Stabilirea DL50 pt compusii C3-C6.
II. Dozarea glicemiei dupa administrare de doze unice din compusii nou sintetizati, la sobolan
nondiabetic pt compusii C3-C6
III. Determinarea efectului compusilor nou sintetizati asupra profilului glucidic, lipidic si
asupra activitatii enzimatice la sobolani diabetici
a. Crearea modelului animal de diabet aloxanic.
b. Administrarea compusilor de cercetat, în doze eficace, la animalele diabetice si dozarea
parametrilor biochimici: -glicemie -colesterol total, trigliceride, HDL-colesterol
c. Determinarea efectului compusilor nou sintetizati asupra profilului glucidic, lipidic si asupra
activitatii enzimatice la sobolani diabetici/
a.Determinarea activitatii enzimelor la animale diabetice, tratate cu compusii de cercetat
glucozo 6 fosfat dehidrogenaza, glucozo-6 fosfataza, hexokinaza)
V. Diseminare rezultate: Elaborarea unei lucrari stiintifice in colaborare cu partenerii.
VI. Participare la manifestari stiintifice nationale

Activitati prevazute pentru anul 2011
P3 USAMV
Examenul histopatologic al animalelor diabetice tratate cu substantele de cercetat la
doze eficace comparativ cu lotul martor/Examinare macroscopica. Recoltare probe.
Realizare tehnici histopatologice. Examinarea si microfotografierea preparatelor
histopatologice.Interpretarea rezultatelor (pt compusii C3-C6).
Diseminare rezultate/ Elaborarea unei lucrari stiintifice in colaborare cu partenerii.
Participare la manifestari stiintifice nationale si/sau internationale.
P4 Institutul de Biochimie
Estimarea efectului inhibitor asupra glicozilarii neenzimatice a proteinelor in vitro/
a. Capacitatea compusilor nou sintetizati de a proteja proteinele impotriva modificarilor
structurale induse de glicozilarea neenzimatica pt compusii C3-C6
b. Aprecierea posibilitatii de prevenire cu ajutorul compusilor nou sintetizati a inactivarii
enzimelor indusa de glicozilarea neenzimatica pt compusii C3-C6).

Activitati prevazute pentru anul 2011
P4 Institutul de Biochimie
Efectul compusilor nou sintetizati asupra formarii produsilor de glicozilare avansata
AGEs) si a interactiei acestora cu receptori specifici (RAGE).
a. Prepararea produsilor de glicare avansata (AGEs) prin incubarea proteinelor (ex. BSA) cu
glucide reducatoare (ex. Riboza, glucoza, fructoza) in conditii sterile, diferite intervale de timp (2
– 6 saptamani).
b. Separarea produsilor AGEs de proteina neglicata prin cromatografie de afinitate si
caracterizarea lor prin metode spectrofluorimetrice.
c. Studiul interactiei dintre AGEs si receptorul RAGE prin metode de fluorescenta
(folosind AGEs marcati cu FITC) sau prin metoda ELISA (folosind antiser specific anti-RAGE).
Diseminare rezultate/ Elaborarea unei lucrari stiintifice in colaborare cu partenerii.
Participare la manifestari stiintifice nationale si/sau internationale.

Etapa 4: Definitivarea studiilor de sinteza si purificare a noilor
structuri. Aprofundarea studiilor farmacologice. Elaborarea
Raportului final de cercetare. Termen de predare: 30.04.2011
CO - INCDCF-ICCF
Demonstrarea functionalitatii tehnologiilor de sinteza
• - Optimizarea procedeelor de sinteza pentru compusii noi selectati si verificarea reproductibilitatii
lor.
• - Prepararea cantitatilor de compusi necesare aprofundarii studiilor farmacologice si biochimice
Analiza, sistematizarea si prelucrarea datelor experimentale (de sinteza, farmacologice,
biochimice) si redactarea raportului final
• P1 - CCO
Caracterizarea fizico-chimica a compusilor sintetizati (C1-C6) necesari pt definitivarea studiilor
farmacologice si biochimice; Determinari FT-IR, GC-MS pentru compusii C1-C6
• P2 - UMF
• Activitati de farmacologie si toxicologie experimentala pt compusii C1-C6
• - Cercetarea actiunii asupra tensiunii arteriale
• - Cercetarea actiunii asupra muschiului uterin in vitro.
• - Studii de toxicitate subacuta pt substantele care influenteaza profilul glucidic
actiunii antidiabetice, selectate dintre compusii studiati în etapele anterioare
în sens favorabil
• CO, P1, P2, P4
• - Elaborarea unei lucrari stiintifice in colaborare cu partenerii. Participare la manifestari stiintifice
nationale si/sau internationale. Elaborarea unei cereri de brevet.

OBIECTIVE SI REZULTATE IN 2011
Elaborarea tehnologiilor de sinteza la nivel de laborator pentru inca cel putin 4
structuri originale, fezabile si performante, atractive pentru demararea unor
colaborari in viitoare proiecte nationale si europene.
Constituirea unui fond de informatii stiintifice metodologice si tehnologice
din domeniul sintezei organice, farmacologiei preclinice, biochimiei, ce
poate fi exploatat si valorificat in diferite lucrari de licenta, masterat, doctorat
si in alte activitati de cercetare.
Produsi de glicare, spectre de fluorescenta, cromatograme (HPLC),
activitate enzimatica.
Exprimarea interactiei receptor – ligand (RAGE /AGEs), in prezenta/ absenta
compusilor sintetizati, prin date de microscopie de fluorescenta sau ELISA.
Avansarea catre dezvoltare a structurilor cu activitate biologica remarcabila din
clasa receptorilor beta3-adrenergici ceea ce ar constitui o potentiala contributie
in ameliorarea starii de sanatate si in reducerea costurilor terapeutice.
Introducerea în terapia diabetului zaharat şi/sau tratamentul dislipidemiilor şi
al obezităţii a unei clase terapeutice noi cu potenţial farmacotoxicologic
limitat.
Elaborare 1-2 cereri de brevet si publicarea a 3 articole stiintifice in reviste
cotate ISI.
ESTIMAREA NECESARULUI DE FINANTARE PENTRU ANUL 2011
Tinand cont de volumul de activitati prevazute pentru anul 2011 la toti partenerii suma estimata
a fi necesara pentru anul 2011 este de 1 192 895 lei

Vă mulţumesc pentru atenţie!