helicobacter pylori: mikrobiyolojik tanı yöntemleri - Hacettepe ...

DERLEME Hacettepe Tıp Dergisi 2004; 35:182-186
Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan›
yöntemleri
Yakut Akyön Y›lmaz 1
1 Öğretim Üyesi, Hacettepe
Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mikrobiyoloji ve
Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Ankara
H
elicobacter pylori, insan ve diğer primatların midesine yerleşen spiral şeklinde,
gram-negatif, mikroaerofilik bir bakteridir. Bu mikroorganizma vücuda bir defa
girdiğinde, tedavi edilmediği takdirde yaşam boyu varlığını devam ettirmektedir.
Yapılan ilk çalışmalarda bu bakterinin mide içerisinde normal flora üyesi olarak
bulunduğu iddia edilmiştir. Ancak günümüzde insanlarda ve hayvan modellerinde
yapılan çalışmalar, H. pylori’nin lokal inflamasyona ve sistemik olarak da humoral
bağışık yanıta neden olduğunu göstermiştir. Bu nedenle de bu mikroorganizmanın
mide içerisinde varlığı normal flora üyesi olamayacağını, patojen bir
mikroorganizma olarak kabul edildiğini göstermiştir [1].
Avustralya’da patolog olarak çalışan Robin Warren, ilk defa 1979 yılında histopatolojik
inceleme için gönderilen gastrik biyopsi örneklerinde kıvrık bakterilerin
varlığını gözlemiştir. Bu bakterilerin gastrik mukozada olmayıp, dokuyu örten mukus
tabakası içinde bulunduğunu saptamıştır [2]. Barry Marshall, 1981 yılında
Warren ile birlikte izolasyon çalışmalarına başlamıştır. İlk önceleri bu mikroorganizma
kıvrık ve gram-negatif bir basil şeklinde olduğu için Campylobacter cinsi
içinde değerlendirilmiş, bakteriye Campylobacter pyloridis adı verilmiştir [3]. Bu buluşun
yayınlanmasıyla birlikte bu konudaki çalışmalar yoğunlaşmış, yapılan tiplendirme
çalışmalarında mikroorganizmanın bazı özellikleri nedeniyle Campylobacter
cinsi olmadığı ve bakterinin Helicobacter pylori olarak adlandırılması gerektiği
vurgulanmıştır. 1984 yılında H. pylori infeksiyonunda gastrik inflamasyon (kronik
süperfisyal gastrit) ve polimorfonükleer hücre infiltrasyonu olduğu, yani kronik
aktif gastrit oluşturduğu belirlenmiştir. H. pylori’nin etyolojik ajan olarak peptik
ülser hastalığındaki rolü yapılan çalışmalarla gösterilmiştir [4].
1994 yılında Amerika Birleşik Devletleri’nde Ulusal Sağlık Enstitüsü (National
Institutes of Health), H. pylori’nin peptik ülser hastalığının başlıca nedeni olduğunu
ve infekte olan bireylerin organizmanın eradikasyonu için tedavi edilmesi gerektiğini
bildirmiştir [5].
1991 yılında H. pylori infeksiyonu ile gastrik kanser ilişkisi olduğu yönünde çalışmalar
yayınlanmıştır ve 1994 yılında Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ)’nün bir dalı
olan Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (International Agency for Cancer Research)
H. pylori’nin insanlarda karsinojen olduğunu bildirmiştir [6].
Kronik H. pylori infeksiyonunun gastrik non-Hodgkin lenfomaların ve gastrik
mukozada gelişen lenfoid doku lenfomasının (MALToma) gelişiminde rol aldığı
saptanmış ve MALT lenfomalı hastalarda H. pylori eradikasyonu ile tümörün gerilediği
bildirilmiştir [7-9]. Özet olarak, H. pylori’nin gastroduodenal dokuyla ilişkili
olarak gastritten ülser ve malignansilere kadar pek çok hastalıkta rolü olduğu bilinmektedir.
182 H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹

Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan› yöntemleri
Erken yaşlarda edinilen H. pylori’nin tanımlanması
için özefagogastroduodenoskopi gerektiren birçok invaziv
ve endoskopi gerektirmeyen invaziv olmayan yöntem
geliştirilmiştir.
‹NVAZ‹V YÖNTEMLER
H. pylori, özellikle daha az asit içeren bir ortam olmasından
dolayı, midede antrum bölgesine, düzensiz
yerleşme eğilimindedir. Bu nedenle endoskopi ile alınacak
biyopsi örnekleri mümkünse birden fazla ve antrumdan
alınmalıdır.
Kültür
H. pylori kültürde üretilmekte ve tanı için altın standart
sayılmaktadır. Bu yöntem en standart, en özgül ve
genellikle oldukça duyarlı bir yöntem olarak tanımlanmaktadır
[10]. Oksijene duyarlı olan bu bakterinin laboratuvara
ulaştırılması ve ekimi uygun koşullarda ve
hızlı olmalıdır. Taşıyıcı besiyeri olarak serum fizyolojik
ve ticari olarak hazırlanmış besiyerleri kullanılmaktadır.
H. pylori kültürünün başarısı biyopsi örneğinin alımıyla
ekimi arasındaki süreye ve oksijenle temasına
bağlıdır. Bu nedenle alınan örnekler en fazla dört saat
içinde ekilmeli, bu süre boyunca +4°C’de bekletilmelidir.
Örnek hemen ekilemeyecekse -70°C’de saklanabilir,
bu işlem kültürde üretmeyi %40 azaltacaktır. H. pylori
seçici (antibiyotik içeren) ve seçici olmayan besiyerlerinde,
mikroaerofilik ortamda 3-10 günde üretilmektedir.
%5-10 yalancı negatif sonuç alınmaktadır [11]. Kullanılacak
besiyeri beyin-kalp-infüzyon agar [Brain Heart
Infusion (BHI)], Columbia agar, Brucella agar gibi
zengin besiyerleri olmalı ve kan ya da serumla zenginleştirilmelidir.
Mikroaerofil ortam, çeşitli ticari kitler
kullanılarak, anaerop kavanozda sağlanabilir. Üreyen
suşlar, Gram boyama, üreaz, katalaz, oksidaz reaksiyonlarına
göre konvansiyonel yöntemlerle değerlendirilerek
tanı konur. Kültürde üretilen H. pylori’ye antibiyotik
duyarlılık testi uygulanabilir, tiplendirme yapılabilir,
bu suşlar -70°C’de skim-milk ya da %15-20 gliserol
içeren BHI sıvı besiyerinde saklanabilir. Tiplendirme
yöntemleri Tablo 1’de gösterilmiştir [12].
Uygulanacak antimikrobiyal duyarlılık testleri “The
National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS)” onaylı olan agar dilüsyon ve ülkemizde ve
Avrupa ülkelerinde kullanılan E-testtir. Bu testler rutin
olarak uygulanmamalı, belirli aralıklarla antibiyotik duyarlılık
paternini tanımlamak amacıyla yapılmalıdır.
Histopatolojik inceleme
Birçok araştırmacı histopatolojik incelemenin H. pylori
infeksiyonunun tanısında altın standart olduğunu
kabul etmektedir [13]. Bakteri mukus içinde, yüzey epiteline
tutunmuş olarak, kriptin içine doğru derinlerde
bulunur [11]. Antral biyopsi örneklerinin, rutinde kullanılan
hematoksilen-eozinle veya özgüllüğün arttığı
Warthin-Starry gümüşleme, akridin-oranj ve modifiye
Giemsa ile boyandıktan sonra histopatolojik değerlendirilmesi
oldukça iyi sonuçlar vermektedir [14,15]. Histopatolojik
inceleme ile gastroduodenal patolojinin düzeyi
ve premalign değişiklikler saptanabilir. Monoklonal
veya poliklonal floresan anti-H. pylori antikorları-
Tablo 1. Helicobacter pylori tiplendirme yöntemleri
Fenotipik yöntemler
DNA bazlı yöntemler
Biyotiplendirme
Restriksiyon endonükleaz kesme paternleri
Serotiplendirme
Geleneksel elektroforez
Hemaglutinasyon
“Pulsed field” jel elektroforez
Lektin tiplendirme
“Southern blot” hibridizasyon
Dış membran protein profili
Ribozomal RNA genleri
İmmünblotlama
Üreaz genleri
SDS-PAGE protein profili
Rastgele DNA parçaları
PCR bağlı RFLP analizi
Üreaz geni
Flagellin geni
Tekrarlayan ekstrajenik sekanslar
“Arbitrary” primer profilleri
Plazmid profilleri
SDS-PAGE: Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez, PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu, RFLP: Restriksiyon parça uzunluk analizi.
Cilt 35 • Say› 4 • 2004
183

Akyön Y›lmaz
nın kullanıldığı immünhistokimyasal boyama tanıda
özgül ve duyarlı bir yöntemdir, ancak maliyeti yüksektir
[13,16].
Hızlı üreaz testi
Endoskopi sırasında alınan antral biyopsi örneklerinden
uygulanan hızlı üreaz testi hem ucuz hem de
kolay bir tekniktir. H. pylori üreaz aktivitesi ile ortamdaki
üreyi amonyak ve bikarbonata parçalar ve ortamın
pH’sını yükselterek pH indikatörü ile ortamın rengini
değiştirir. Pozitif sonuçların %90’ı ilk yarım saatte görülür
ve geri kalanlarda ertesi gün okumayı gerektirir [11].
Ticari veya laboratuvarda hazırlanmış hızlı üreaz testleri
bulunmaktadır.
Moleküler tanı yöntemleri
Moleküler yöntemler, özellikle son yıllarda H. pylori
ve diğer Helicobacter türlerinin saptanmasında sıklıkla
kullanılmaya başlanmıştır [10]. Bu yöntemler tiplendirmede,
antibiyotik duyarlılık saptamada ve virülans
faktörlerinin belirlenmesinde önem kazanmışlardır.
Moleküler yöntemler mide biyopsi örnekleri dışındaki
örneklerden de H. pylori ve/veya diğer Helicobacter türlerini
saptamak için kullanılabilmektedir. Moleküler
bir yöntemle gösterilen Helicobacter’in canlı olup olmadığı
saptanamaz. Seçilecek DNA ekstraksiyon yöntemi
bu testlerin duyarlılığında çok önem taşır. DNA
ekstraksiyonunda inhibitörlerin uzaklaştırılması gerekmektedir,
doğru yöntem seçilmezse yanlış negatif sonuçlar
alınacaktır.
‹NVAZ‹V OLMAYAN YÖNTEMLER
Üre nefes testi
Bu testte oral yoldan C 13 veya C 14 (radyoaktif karbon)
işaretli üre alımını takiben, 20-30 dakika sonra solunan
hava örnekleri toplanmakta ve bunlar daha sonra
spektrometrik olarak veya sintillasyon cihazlarında
sayılmaktadır. İşaretli üre H. pylori ile infekte kişilerde
bakterinin üreaz enzimi ile parçalanır. Oluşan CO 2 solunum
havasında saptanmaktadır. Duyarlılığı ve özgüllüğü
çok yüksektir. Test, yalancı negatif sonuçlardan kaçınmak
üzere antibiyotik veya omeprazol tedavisi sırasında
uygulanmamalı, tedavi bitiminden en az bir ay
sonra uygulanmalıdır [11].
Serolojik yöntemler
184
Serolojik yöntemler H. pylori tanısında kullanılan
yaygın yöntemlerden biridir. Özellikle epidemiyolojik
çalışmalarda yararlıdır [11]. Enzim işaretli katı faz
immünassay (ELISA) yöntemi en sık kullanılan serolojik
yöntemdir [17]. H. pylori infeksiyonu sistemik ve
lokal antikor yanıtına neden olur. Özgül IgM antikorlar
kısa süreli olarak yükselir, IgG ve IgA infeksiyon
süresince artar ve tedavi edilmedikçe yüksek kalır. Tedaviyi
izleyen aylarda eradikasyon sağlandıysa IgG ve
IgA düzeyleri düşer. IgG düzeyi hiçbir zaman tamamen
negatifleşmez. Tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde,
tedavi öncesi ve tedavi bitiminden itibaren
üç-altı ay sonra olacak şekilde iki titrasyonun karşılaştırılması
gereklidir [18]. Bu testlerde kullanılacak antijenler
çok önemlidir. Genellikle üç tip antijen kullanılmaktadır;
1. Tam hücreler ve tam hücre parçaları gibi ham antijenler,
2. Glisin ekstraktları ve ısı değişken olmayan antijenler
gibi hücre parçacıkları,
3. Üreaz ve 120 kDa antijen gibi zenginleştirilmiş
antijenler [11].
Virülans genlerini saptamaya yönelik serolojik kitler
de geliştirilmiştir [19].
“Western Blot”, immünoblotlama, bakterinin çeşitli
bölümlerine karşı oluşan sıvısal bağışık yanıtı saptamada
kullanılan oldukça duyarlı ve özgül bir yöntemdir [20].
Serolojik olarak hasta başı testleri, bir damla kan ya
da serum ile uygulanabilen veya idrarda IgG saptayan
testler geliştirilmiştir ama bunların duyarlılık ve özgüllükleri
düşüktür [19,21,22].
Dışkı örnekleri için kullanılan tanı yöntemleri
Dışkı kültürü: H. pylori safraya duyarlı bir bakteridir.
Dışkı safra asitlerinin yüksek oranda bulunduğu bir ortamdır.
Dışkı aynı zamanda anaerop ve fakültatif anaerop
bakterilerden oluşan zengin bir normal floraya sahip
bir ortamdır. Bütün bu nedenlerden dolayı dışkı kültüründe
H. pylori üretmek oldukça zordur. Pasajın çok
hızlı olduğu diyareli olgularda dışkıda H. pylori üretilebilmiştir
[23].
Dışkı antijen testleri: Ticari olarak hazırlanmış poliklonal
ve monoklonal antikor testleri bulunmaktadır. Poliklonal
testlerin özgüllüğü oldukça yüksekken, duyarlılığı
değişken olarak saptanmıştır [24-26]. Monoklonal
testler yüksek duyarlılık ve özgüllük göstermiştir [27].
Hasta başı test olarak geliştirilen monoklonal antikor
test sonuçları oldukça duyarlı ve özgül olarak saptanmıştır
[28].
Dışkı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR): Dışkı PCR
inhibitörleri açısından çok zengindir. Bu nedenle uygulanacak
DNA ekstraksiyon yöntemi ve inhibitör
uzaklaştırılması dışkıda PCR uygulamasında çok
önemlidir.
H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹

Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan› yöntemleri
Tablo 2. Helicobacter pylori infeksiyonunun varlığını göstermek için kullanılan testler
Endoskopi
Test Duyarlılık (%)Özgüllük (%) gerekliliği Yorum
Histoloji 93-98 95-98 Evet Çok sayıda antral biyopsi örneği gerekir, özel boyalar
duyarlılığı arttırır.
Kültür 77-95 100 Evet Antibiyotik duyarlılık testleri için ve ayrıntılı tiplendirme
için gerekir.
Hızlı üreaz testi 89-98 93-98 Evet Endoskopik işlem sırasında tanı için kullanılır.
13 C-UBT* 90-95 90-95 Hayır Canlı bakteri ve infeksiyon varlığını gösterir, tedavi takibinde
yararlıdır.
14 C-UBT** 90-95 90-95 Hayır 13 C-UBT ile benzer mekanizma, düşük dozda radyoaktif madde
alınımı var, kısa dönemde antibiyotik tedavisinin takibinde
kullanılmaz, epidemiyolojik çalışmalar için idealdir.
Seroloji 88-95 86-95 Hayır Kısa dönemde antibiyotik tedavisinin takibinde kullanılmaz,
epidemiyolojik çalışmalar için idealdir.
PCR yöntemleri 85-96 90-100 Evet (biyopsi) H. pylori DNA’sının varlığını gösterir, ancak ölü bakterilerde
Hayır (tükürük) pozitif sonuç verir, H. pylori suşlarının farklılığını belirlemede
kullanılır.
Dışkı antijen 90-94 98-99 Hayır İnvaziv olmaması bir avantajdır.
testleri
(monoklonal)
* Üre soluk testi (UBT-Urea Breath Test). Karbon 13 ile işaretlenmiş üre.
** Üre soluk testi (UBT-Urea Breath Test). Karbon 14 ile işaretlenmiş üre.
Dışkı filtrasyon yöntemi inhibitörlerin uzaklaştırılmasında
kullanılan bir yöntemdir. Polipropilen membran
ile süzülen dışkı örneklerinde PCR inhibitörlerine
rastlanmamıştır [29].
İmmünmanyetik ayırma bir diğer inhibitör uzaklaştırma
yöntemidir. H. pylori yüzey antijenlerine karşı
antikorlarla kaplı manyetik boncuklar kullanılır.
Dışkıdaki H. pylori basil ve kok formları bu boncuklara
yapışır, örnekteki inhibitörler yıkamayla uzaklaştırılır
[30].
Biyokimyasal saflaştırma dışkıdan DNA ekstraksiyonu
için kullanılan bir başka yöntemdir [31].
Dışkıda H. pylori saptanması için PCR yöntemi kullanılacağı
zaman en az iki set primer kullanılması önerilmektedir
[32]. Ayrıca, reamplifikasyon, nested PCR
yöntemleri dışkıda H. pylori saptanmasında testin duyarlılığını
arttıracaktır.
SONUÇ
Tanı için, H. pylori varlığını göstermeye yönelik,
birbirinin alternatifi olabilecek pek çok yöntem vardır
(Tablo 2). H. pylori tanısında yöntem tanının konulacağı
laboratuvarın koşullarına (alt yapısına),
amaçlarına, maliyete ve uzman varlığına bağlı olarak
seçilmelidir.
Cilt 35 • Say› 4 • 2004
Kaynaklar
1. Blaser MJ. Helicobacter pylori: microbiology of a “slow” bacterial
infection. Trends Microbiol 1993; 1:255-60.
2. Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved bacilli on gastric
epithelium in active chronic gastritis. Lancet 1983; i:1273-5.
3. Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the
stomach of patients with gastritis and peptic ulceration.
Lancet 1984; i:1311-5.
4. Blaser MJ. Helicobacter pylori and the pathogenesis of gastroduodenal
inflammation. J Infect Dis 1990; 161:626-33.
5. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer
disease. NIH Consensus Development Panel on Helicobacter
pylori in peptic ulcer disease. JAMA 1994; 272:65-9.
6. Anonymous. Shistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori.
Monogr Eval Carcinog Risks Hum 1994; 61:1-241.
7. Parsonnet J, Hansen S, Rodriguez L, et al. Helicobacter pylori
infection and gastric lymphoma. N Engl J Med 1994; 330:
1267-71.
8. Eidt S, Stolte M, Fischer R. Helicobacter pylori gastritis and primary
non-Hodgin’s lymphomas. J Clin Pathol 1994; 47:436-9.
9. Bayerdoffer E, Ritter MM, Hatz R, et al. Regression of primary
gastric lymphoma of mucosa-associated lymphoid
tissue type after cure of Helicobacter pylori infection. Lancet
1995; 345:1591-4.
10. Makristathis A, Hirschl AM, Lehours P, Megraud F. Diagnosis
of Helicobacter pylori infection. Helicobacter 2004;
Suppl 1.
11. Dunn BE, Cohen H, Blaser MJ. Helicobacter pylori. Clin Microbiol
Rev 1997; 10:720-41.
12. Hirmo S, Shumakov Y, Utt M, Wadström T. Genetic heterogenety
of Helicobacter pylori and strain typing. In: Moran
185

Akyön Y›lmaz
AP, O’Morain CA (eds). Pathogenesis and host response in
Helicobacter pylori infections. Homburg Normed Verlag: International
Medical Publishers, 1997; 199-205.
13. Braden B, Caspary WF. Detection of Helicobacter pylori infection:
when to perform which test? Ann Med 2001; 33:91-7.
14. el-Zimaity HM, Graham DY, al-Assi MT, et al. Interobserver
variation in the histopathologic assessment of Helicobacter
pylori gastritis. Human Pathol 1996; 27:35-41.
15. Genta RM, Graham DY. Comparison of biopsy sites for the
histopathologic diagnosis of Helicobacter pylori: a topographic
study of H. pylori density and distribution. Gastrointest
1994; 40:342-5.
16. Monteiro L, Doermann HP, Megraud F. Non-serological diagnostic
tests for Helicobacter pylori infections. Homburg Normed
Verlag: International Medical Publishers, 1997; 215-29.
17. Taylor D, Parsonnet J. Epidemiology and natural history of
H. pylori infections. In: Blaser MJ, Smith PF, Ravdin J, Greenberg
H, Guerrant RL (eds). Infections of the gastrointestinal
tract. New York: Raven Press, 1995; 551-64.
18. Hirschl AM, Rotter ML. Serological tests for monitoring Helicobacter
pylori eradication treatment. J Gastroenterol 1996;
31:33-6.
19. Vaira D, Gatta L, Ricci C, Miglioli M. Review article: diagnosis
of Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol
Ther 2002; 16(Suppl 1):16-23.
20. Herbrink P, vanDoorn LJ. Serological methods for diagnosis
of Helicobacter pylori infection and monitoring of erad, ication
therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19:164-73.
21. Leodolter A, Vaira D, Bazzoli F, et al. European multicentre
validation of two new non-invasive tests for the detection
of Helicobacter pylori antibodies: urine-based ELISA and rapid
urine test. Aliment Pharmacol Ther 2003; 18:927-31.
22. Gatta L, Ricci C, Tampieri A, VairaD. Non-invasive techniques
for the diagnosis of Helicobacter pylori infection. Clin
Microbiol Infect 2003; 9:489-96.
23. Thomas JE, Gibson GR, Darboe MK, et al. Isolation of Helicobacter
pylori from human feces. Lancet 1992; 340:1194-5.
24. de Carvalho Costa Cardinali L, Rocha GA, Rocha AM, et al.
Evaluation of [ 13 C] urea breath test and Helicobacter pylori
stool antigen test for diagnosis of H. pylori infection in
children from a developing country. J Clin Microbiol 2003;
41:3334-5.
25. El-Nasr MS, Elibiary SA, Bastawi MB, et al. Evaluation of a new
enzyme immunoassay for the detection of Helicobacter pylori
in stool specimens. J Egypt Soc Parasitol 2003; 33:905-15.
26. Zambon CF, Basso D, Navaglia F, et al. Non-invasive diagnosis
of Helicobacter pylori infection: simplified 13C-urea breath
test, stool antigen testing, or DNA PCR in human feces in a
clinical laboratory setting? Clin Biochem 2004; 37:261-7.
27. Koletzko S, Konstantopoulos N, Bosman D, et al. Evaluation
of a novel monoclonal enzyme immunoassay for detection
for Helicobacter pylori antigen in stool from children.
Gut 2003; 25:804-6.
28. Wu IC, Ke HL, Lo YC, et al. Evaluation of a newly developed
office-based stool test for detecting Helicobacter pylori:
an extensive pilot study. Hepatogastroenterology 2003;
50:1761-5.
29. Cavallini A, Notarnicola M, Berloco P, et al. Use of macroporous
polypropylene filter to allow identification of bacteria
by PCR in human fecal samples. J Microbiol Methods
2000; 39:265-70.
30. Enroth H, Engstrand L. Immunomagnetic sewparation and
PCR for detection of Helicobacter pylori in water and stool
specimens. J Clin Microbiol 1995; 33:2162-5.
31. Gramley WA, Asghar A, Frierson HF, Powell SM. Detection
of Helicobacter pylori DNA in fecal samples from infected individuals.
J Clin Microbiol 1999; 37:2236-40.
32. Kabir S. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture,
PCR and enzyme immunoassay. J Med Microbiol 2001; 50:
1021-9.
186
H ACETTEPE T IP D ERG‹S‹