Clostridium Difficile, Enfeksiyonlarının Mikrobiyolojik Tanısında

Clostridium difficile
Enfeksiyonlarının Mikrobiyolojik Tanısında
Yenilikler
Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Yrd.Doç.Dr. Melda SINIRTAġ

Antibiyotikle iliĢkili diyareler
Antibiyotikle iliĢkili ishaller
Clostridium difficile
Salmonella spp
Clostridium perfringens Tip A
Staphylococcus aureus
Campylobacter jejuni
Candida albicans

Gram pozitif
Sporlu
Zorunlu anaerob
Kapsülsüz
Zayıf hareketlidir

Pozitif regülatör sitotoksin enterotoksin
Negatif regülatör

Pozitif regülatör sitotoksin enterotoksin
Negatif regülatör
NAP1/027
Kanada 2002/Ġngiltere 2005, Hollanda, Belçika,Fransa

Klinik
Klinik
Enterokolit/Psödomembranöz enterokolit (PME)
Antibiyotik kullanımından 5-10 gün sonra semptomlar baĢlar
DıĢkı
Kahverengi-sulu (%90-95)
Kanlı (%5-10)
PME mukuslu (%85)
Karın ağrısı-bulantı-kusma
AteĢ (%26-66)
Lökositoz (%40-50)

C. difficile enfeksiyonlarında tanı
Hasta için önemi :
etkili tedavi
Hastane için önemi:
çevreye yayılım ve salgınları
önlemek

C. difficile
Mikrobiyolojik Tanı
Kimden?
Ne zaman?
Nasıl?

2010
Zaman hastalıkların
karekteristiğini
değiĢtirdiği gibi
tanısal
yaklaĢımlarıda
değiĢtirmektedir

değiĢenler
• %42
Diyare
• %34
Antibiyotik kullanım
öyküsü – Genç (8 sağlıklı hafta içinde)
En • az Gebe 3 gündür hastanede
yatıĢ • Gençler
> 65 yaĢ
hastane
toplum
Kutty PK. Infect Control Hosp Epidemiol 2005;29:197-202.
Candiotto A. J Med Microbiol 2010; 59:124-6.

Clostridium difficile infection in Europe: the first pan-European
hospital-based survey
M.P. Bauer,1,2 D.W. Notermans,1 B.H.B. van Benthem,1 J.S.
Brazier3, M.H. Wilcox,4 M. Rupnik,5 D.L. Monnet,6 J.T. van
Dissel2 and E.J. Kuijper,2 on behalf of the ECDIS Study Group.
Turkey: B. Levent (N.C.), Refik Saydam National Hygiene Center,
Ankara; S. Kacar (L.C.), Yuksek Ihtisas Hospital, Ankara; G. Hascelik
(L.C.), Hacettepe University Medical Faculty, Ankara; B. Sener (L.C.),
Hacettepe University Medical Faculty, Ankara; O. Azap (L.C.),
Baskent University Hospital, Ankara; H. Arslan (L.C.), Baskent
University Hospital, Ankara; M. Sinirtas (L.C.), Uludag University,
Bursa; H. Akalin (L.C.), Uludag University, Bursa; N. Ulger (L.C.),
Marmara University, Kadikoy, Istanbul; G. Soyletir (L.C.), Marmara
University, Kadikoy, Istanbul;
19. ECCMID

Clostridium difficile infection in Europe: the first pan-European
hospital-based survey
M.P. Bauer,1,2 D.W. Notermans,1 B.H.B. van Benthem,1 J.S.
Brazier3, M.H. Wilcox,4 M. Rupnik,5 D.L. Monnet,6 J.T. van
Dissel2 and E.J. Kuijper,2 on behalf of the ECDIS Study Group.
Characteristic n/ N %
Epidemiological characteristics:
Female sex 287/ 509 56
Age ≥ 65 years 319/ 509 63
Age distribution [years]: median 71; IQR 56 – 81
Epidemiological association:
healthcare-associated 408/ 506 80
indeterminate association 28/ 506 6
community-associated 70/ 506 14
Explicit request to test for CDI 441/ 507 87
19. ECCMID

– Toksinotip V 078/NAP7/BK
• Hayvan+insan yemeklerinde saptandı
• Binary toksin pozitif
• Salgınlar?????

Mikrobiyolojik tanı için optimal koĢullar
Sadece sulu dıĢkı
Epidemiyolojik araĢtırmalar hariç
Eküvyon ile gelen örnek kabul edilmemelidir
Taze alınmıĢ dıĢkı örneği
Hızlı çalıĢılmalı
4°C’de saklanmalıdır (2-3 gün)
Uzun dönem saklamalarda -70°C
(-20°C’de değil)
Brazier JJ;Clinical Infectious Diseases 16:228-33,1993
Freeman J; J Clinical Pathology 56:126-8,2003

Hangi yöntem
Yöntem 2004 2008
Sitotoksin nötralizasyon %5 %1
Immunokromotografik testler %26 %46
(GDH ve/yada Toksin)
EIA toksin A %18 %2
EIA Toksin A/B %42 %43
Diğer %9 %8
College of American Pathology 2004, p:9
College of American Pathology 2008, p:9

Moleküler yöntemler
Enzim
immünoassay
(Toksin A/B)
Clostridium
difficile
Glutamat
dehidrogenaz
Toksijenik kültür
(Kültür+sitotoksin nötralizasyon)
Sitotoksin
nötralizasyon

TOKSĠJENĠK KÜLTÜR
SĠTOTOKSĠN
NÖTRALĠZASYON

TOKSĠJENĠK KÜLTÜR
Sikloserin Sefoksitin
Fruktoz Agar
(Cycloserine Cefoxitine
Fructose Agar) CCFA
Taze dışkı
ısı/alkol ile yapılan işlem
sonrası, selektif sikloserin
sefoksitin fruktoz anaerobik
agar besiyerine ekim

C. difficile : Koloni yapısı
2 mm çaplı, buzlu cam görüntüsü veren,
sarımsı-beyazımsı renkli koloniler oluşturur
Kültür at gübresi gibi kokar

365 nm UV’de yeşil floresan
beyin kalp infüzyon buyyona pasaj
24 saat 35-37 ºC’de inkübe edilir
Bu kültür invitro toksin araştırılması için kullanılır

• Toksijenik kültür
– Üreyen suĢların toksin yapıp yapmadığı kontrol
edilmelidir
– Sitotoksin nötralizasyon kadar spesifik değil
– Sonuçlanma süresi uzun
• 4 gün
– Tercih edilmiyor
• Amerika %77 tercih etmiyor 1
• Avrupa %55 tercih ediyor (2003) 2
1
Gilligan PH. Clin Micro Net 2008;Oct,31.
2
Barbut F. Clin Microbiol Infect 2003;9:989-96.

HeLa
SĠTOTOKSĠN NÖTRALĠZASYON
• 10 pg’lık sitotoksin düzeylerini saptayabilen bir
yöntemdir
• Sıvı dışkı örnekleri santrifüje edilir
• Süpernatan, filtrelerden geçirilir
• 1/40 bazı çalışmalarda 1/5 dilüe edilerek
hücre dizilerinin üzerine eklenir
• 37 ºC de 24-48 saat anaerob inkübasyondan
sonra ışık mikroskobunda sitopatik etki
(yuvarlaklaşma) aranır
• Nötralizan antikorlar (anti-C. sordellii
antiserum) eklendiğinde bu sitopatik etki ortadan
kalkar

• Sitotoksin Nötralizasyon
Testi
– Duyarlılık %80-100
– PPD %90’ın üzerinde
– Zaman
• Pozitif sonuç 24 saat
• Negatif sonuç 48 saat
– Tercih edilmemekte
• %1
Zaman alıcı
zor bir
teknik
CAP profciency test survey 2008

Moleküler yöntemler
Enzim
immünoassay
(Toksin A/B)
Clostridium
difficile
Glutamat
dehidrogenaz
Toksijenik kültür
(Kültür+sitotoksin nötralizasyon)
Sitotoksin
nötralizasyon

• Enzim immüno assay (EIA)
– Toksin A
– Toksin A+B
– Glutamat dehidrogenaz (GDH)
• Ġmmünokromotografik testler
– Toksin A+B
– GDH
– Toksin A+B+GDH

• HIZLI
• UCUZ
• KOLAY
• EKĠPMAN UCUZ
• TEK/BĠRDEN ÇOK
ÖRNEK
ÇALIġILABĠLĠR
test hedef zaman
toxA test
Oxoid
Immunocard
Meridian
ColorPAC tox A
BD
CdTox A OIA
Biostar
Vidas CDA II
BioMérieux
Premier toxin
A&B
C.diff tox A/B
Techlab
Immunocard A/B
Meridian
Triage
BMD
A 45'
A 20'
A 20'
A 20'
A 60'
A ve B 80'
A ve B 80'
A ve B 30
A ve GDH 20'
C.DIFF Quik
Chek Complete
B ve GDH 45’

EIA testlerinde duyarlılık nasıl?
dilüsyon sitotoksin
Premier
tox A/B
Techlab
tox A/B
Vidas
(A)
ColorPAC
rapid
tox A
Immuno
card (A)
Oxoid CD
toxin A
1 + + + + + + +
1/2 + + + + + + +
1/4 + - - - - - -
1/8 + - - - - - -
1/16 + - - - - - -
1/32 + - - - - - -
1/64 + - - - - - -
1/128 - - - - - - -

DUYARLILIK %32-98.7
ÖZGÜLLÜK %92-100
PPD %76.4-96
NPD %88-100
1-5
1.Stampe PD. J Clin Microbiol 2009;47:373-8
2.Musher DM. J Clin Microbiol 2007;45:2737-9
3.Sloan LM J Clin Microbiol 2008;46:1996-2001
4.Gilligan PH. J Clin Microbiol 2008;46:1523-25
5.Tirehurst JR. J Clin Microbiol 2006;44:1145-9

hasta yöntem pozitiflik (%) referans
diyareli EIA Toksin A 16 Büyükbaba Boral Ö; KLİMİK Derg 7:105-7,1994
diyareli EIA Toksin A 34 Öztürk R;5. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,1995
diyareli
kültür
5.2
(Toksin %0.8)
Karaer P;5. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,1995
diyareli EIA Toksin A 5 Kocazeybek B;Türk Mikrobiyol Cem Derg 31:69-72,2001
diyareli EIA Toksin A 18,4 Altuğlu İ; İnfeksiyon Derg 15:495-7,2001
diyareli EIA Toksin A 4.7
diyareli EIA Toxin A/B 12
Büyükbaba Boral Ö; Türk Mikrobiyoloji Cem Derg 32:220-
224,2002
Büyükbaba Boral Ö; Türk Mikrobiyoloji Cem Derg 32:220-
224,2002
diyareli EIA Toksin A/B 3.2 Aygün G;ANKEM Derg 16:82,2002
diyareli EIA Toksin A/B 9 Ercis S;Mikrobiyol Bült 38:45-50,2004

Toksin
• Toksinin dıĢkıda stabil kalmaması
• Mutasyon
– Toksin A - /B +
– Binary toksin +

Glutamat dehidrogenaz
• Hücre yüzey proteini
• Clostridium spp.
• Toksin A ve B den daha dayanıklı
(dıĢkıda)
• Tüm pozitif örneklerde doğrulama
gereklidir

Antijen temelli testlerin duyarlılığı
C. difficile ribotiplerinin saptanmasında
değişiyor mu?
Duyarlılık
Ribotip GDH PZR
027 %90.1 %90.1
027 dışındakiler %72.2 %91.7
Toksin A+B PZR
002 %15.4 %100
027 %78.4 %100
106 %18.8 %75
Tenover FC.

3
other
001 (9.3%)
002 (4.6%)
012 (4.3%)
14 28 19
014/020 (15.7%)
015 (3.3%)
017 (3.5%)
11
27
18
43
26
12
15
12
22
16
29
6
21
6
1
14
26
1
1
2
018 (5.8%)
023 (2.5%)
027 (4.8%)
078 (7.8%)
106 (5.1%)
126 (3.0%)
014
19
3
1

Moleküler yöntemler
Enzim
immünoassay
(Toksin A/B)
Clostridium
difficile
Glutamat
dehidrogenaz
Toksijenik kültür
(Kültür+sitotoksin nötralizasyon)
Sitotoksin
nötralizasyon

Moleküler Yöntemler
45
dakika
75-90
dakika
~3 saat 45
dakika
Cepheid BD GeneOhm Gen-Probe
Meridian

ALGORĠTMALAR

Algoritmalar
• Hızlı
• Kolay uygulanabilen
• Duyarlılığı yüksek
• Özgüllüğü biraz düĢük
+
• Özgüllüğü yüksek bir yöntemin

3’lü algoritma
GDH
(-)
Son rapor: C. difficile negatif
-
30 dakika
(+)
Toksin A+B
(+)
Son rapor: C. difficile pozitif
30 dakika
(-)
*Sitotoksisin
Nötralizasyon
*PZR
(+) Son rapor: C. difficile pozitif
(-)
Son rapor: C. difficile negatif
45 dakika-48 saat

2’li algoritma
(-)
test
(+)test
antijen,
toksin
GDH / Toksin
30 dakika
1.aĢama
GDH (+)/Toksin A+B (+)
GDH (+)/Toksin A+B (-)
GDH (-)/Toksin A+B (-)
Son rapor:
C. difficile pozitif
*Sitotoksisin
Nötralizasyon
*PZR
2 aĢama
Son rapor:
C. difficile negatif

ALGORĠTMALARDA DUYARLILIK
EIA
GDH+EIA
GDH+EIA+
sitotoksin
nötralizasyon GDH+Xpert Xpert
örnek sayısı 432 432 431 432 428
Duyarlılık 58.3 55.6 83.1 86.1 94.4
Özgüllük 94.7 98.3 96.7 97.8 96.3
PPD 68.9 87.0 83.1 88.6 84
NPD 91.9 91.7 96.7 97.2 98.8
Novak-Weekley SM. J Clin Microbiol 48:889-93, 2010

C DIFF Quik Check
Complete
GDH CDT VIDAS Xpert PZR BD PZR
Sitotoksin
nötralizasyon %Duyarlılık 100 73.3 53.3 100 100
% Özgüllük 94.8 100 100 97 97.8
% PPD 68.2 100 100 78.9 83.3
% NPD 100 97.1 95.1 100 100
Toksijenik
kültür %Duyarlılık 100 61.1 44.4 100 94.4
% Özgüllük 97 100 100 99.2 99.2
% PPD 81.8 100 100 94.7 94.4
% NPD 100 95 93 100 99.2
Swindells J. J Clin Microbiol 2010;48:606-8.

QUIK CHEK
COMPLETE TM
GDH pozitif (22) GDH negatif (128)
Son rapor:
C. difficile negatif
Toksin pozitif (11) Toksin negatif (11)
%7.3
(+)
%7.4
%85.3
(-)
Swindells J. J Clin Microbiol 2010;48:606-8.

• Algoritmaların dezavantajları
– GDH test duyarlılıklarındaki farklı
raporlar
– Zaman
– Birden çok yöntemi laboratuvar düzeninde
bulundurmak gerekliliği
– Maliyet

• Hangi hastalar test edilmeli?
• Hangi test laboratuvarda kullanılmalı?
• Testi tekrarlamalı mıyım, ne zaman?
Benim hastamda C. difficile
enfeksiyonu var mı?
Peterson LR. Ann Intern Med 2009;151:176-9.

C. difficile: Test tekrarı için kriterler
Negatif sonuç:
3 örnek (aynı günde birden fazla olmamalı)
Duyarlılığı düĢük bir yöntem/kit kullanıyorsanız,
klinisyenlerin tekrar taleplerini dikkate alın
Pozitif sonuç:
Tedavinin baĢarısını ölçmek için kullanılmamalı
Klinik=tedavide baĢarı
Barenfanger J, Khardori N: Clin Micro Newsl 18:142, 1996
Renshaw AA, et al: Arch Pathol Lab Med 120:49-52, 1996

Laboratuvarda ÇalıĢılacak Testlerin ve Malzemenin
Seçilmesi

• DOĞRULUK
• SONUÇLANMA
SÜRESĠ
• MALĠYET
• KULLANIM
KOLAYLIĞI

TOPLUMDAKĠ PREVALANS
Onlar kaçmak istesede
TARAMA TESTĠ,
DOĞRULAMA TESTĠ
Toksin üreten tüm
izolatları yakalayın
Prevalans düĢük ise
duyarlılığı yüksek
bir test kullanılmalı

• Firma var mı?
– Toksin A+B kit sayısı?
• Ücret
– 96 test/519,38 $
– 50 test/663,75 $
– 25 test/371,25 $
– 25 test/500,00 $
18.70 TL
• Parasını geri alabilecek misiniz?

2008 2010
905.810
Clostridium difficile
kültürü
36
21,20 21,20
907.180
Clostridium difficile
toxin-A
29
17,00 17,00
907.190
Clostridium difficile
toxin-A ve B
29
17,00 17,00
905810 "Clostridium difficile kültürü",
907180 "Clostridium difficile toxin-A"
907190 "Clostridium difficile toxin-A ve B“
den yanlızca biri ödenebilir

TeĢekkürler