ENSÜÜMID JA BIOTEHNOLOOGIA
ENSÜÜMID JA BIOTEHNOLOOGIA
ENSÜÜMID JA BIOTEHNOLOOGIA
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
<strong>ENSÜÜMID</strong> <strong>JA</strong> <strong>BIOTEHNOLOOGIA</strong><br />
TÖÖSTUSLIKUD <strong>ENSÜÜMID</strong><br />
Käesolevaks ajaks on kirjeldatud kaugelt üle<br />
2000 ensüümi, siiski pole tööstuses<br />
rakendatavaid ensüüme eriti palju. Põhjused on<br />
järgmised: Ensüümid täidavad oma rolli in vivo<br />
kuid nende kasutamisel mitteoptimaalsetes<br />
tingimustes (mittefüsioloogilises keskkonnas<br />
näit. orgaanilised lahustid, kõrgendatud<br />
temperatuur, pH jne.) siis võivad nad<br />
denatureeruda ja kaotada oma aktiivsuse.<br />
Tööstuslike ensüümide puhul on põhieesmärk<br />
suurendada nende stabiilsust<br />
efektiivseks tööks nn. mittefüsioloogilistes<br />
tingimustes, luua ensüümid millel oleks<br />
tööstuslike protsesside tingimustes pikem<br />
“eluiga” ja leida võimalusi nende efektiivseks<br />
immobiliseerimiseks.<br />
Tööstuslike ensüümide jaoks on sageli tähtsam<br />
ensüümi pikaajaline stabiilsus kui suurendatud<br />
katalüütiline aktiivsus.<br />
75% kogu ensüümide tööstuslikust kasutamisest<br />
langeb:<br />
1. Detergentidele,<br />
2. Toidu- ja tärklisetööstusele.<br />
Senini on suurtööstuse jaoks toodetud esmajoones<br />
ekstratsellulaarseid ensüüme. Eelkõige<br />
hüdrolaasid: α-amülaasid, glükoamülaas,<br />
invertaas, laktaas, proteaasid, mikrobioloogiline<br />
laap, glükanaasid, lipaasid).<br />
Ca 90% praegu kasutatavatest ensüümidest on<br />
rekombinantsed.<br />
Samuti tõuseb mittehüdrolüütiliste ensüümide<br />
osakaal. Praegu moodustab see ca 10% kogu<br />
ensüümide turust. Siia kuuluvad eelkõige<br />
ensüümid, mida rakendatakse mitmesugustel<br />
diagnostilistel ja analüütilistel eesmärkidel ja<br />
farmaatsiatööstuses. Toiduainetetööstuse seisukohalt<br />
tähtsad mittehüdrolaassed ensüümid on:<br />
glükoosi oksüdaas ja glükoosi isomeraas<br />
(mõlemad reeglina intratsellulaarsed) samuti<br />
pektiin- ja pektaatlüaas (pektinolüütilised<br />
ensüümid).<br />
Pektinolüütilised ensüümid<br />
Puu- ja juurviljade pektiinse fraktsiooni lahustamiseks.<br />
Vastavalt kasutatavale tehnoloogiale<br />
võib saada väga erinevaid produkte. Näit. puu-<br />
ja juurvilja matseraadid, kus pektinaaside<br />
kasutamisel hüdrolüüsitakse osaliselt taimekoe<br />
kesklamell, nii et kude langeb rakususpensiooni,<br />
kuid nii rakukestad kui rakud ise jäävad<br />
terveks. Kui lõhkuda rakud täielikult, st.<br />
lüüsida ka rakukestad saadakse nn. hüdrolüsaadid<br />
(näit. puu- ja juurviljade veeldamine)<br />
Erinevad efektid ensüümide rakendamisel:<br />
1. Puuviljamahlade selitamine (näit. õunamahla<br />
depektiniseerimine enne kontsent-<br />
reerimist, pressimissaagise suurendamine<br />
(marjad, porgand)<br />
2. Matseraatide tootmine (nii joodavad<br />
suspensioonid, kui ka kuivproduktid)<br />
3. Puu- ja juurvilja totaalhüdrolüsaadid<br />
(jääkideta vedeldamine)<br />
4. Uued tooted (majoneesid, mehud,<br />
pulbrid)<br />
Totaalhüdrolüsaatide tootmisel kasutatakse<br />
lisaks pektinolüütilistele ensüümidele ka<br />
täiendavalt tsellulaase.<br />
Proteaasid<br />
Peptiidsidemete lõhkumisel valgumolekulis<br />
võib saavutada erinevaid toiduainete tehnoloogia<br />
ja toitumisfüsioloogia alaseid efekte .<br />
Nisujahu valk – gluteen moodustab tainas<br />
gluteenivõrgustiku, mis määrab taina edaspidised<br />
funktsionaalsed omadused (elastsus,<br />
plastilisus, sõtkutavus, gaasisisaldusvõime<br />
jne.) 1-2% valgu peptiidsidemete lõhkumine<br />
põhjustab juba jahususpensiooni omaduste<br />
tugevat muutumist.<br />
Hüdrolüüsides rohkem (10-25%) on võimalik<br />
kõiksugu tootmise kõrval- ja jääkproduktide<br />
ümbertöötamine toiduks või söödaks. Näit.<br />
kondijahus sisalduvad lihaosakesed lähevad<br />
lahusesse ja saab vürtsimaitsega produkti.<br />
Dieet- ja raviotstarbel kasutatakse ka valkude<br />
veel täielikumat hüdrolüüsi (30-40%). On<br />
teada, et näiteks aminohapped seoses madalmolekulaarsete<br />
pepetiididega (di- ja tripeptiidi)<br />
on vähemalt niisama hästi kui mitte isegi<br />
paremini absorbeeruvad kui vabad aminohapped.<br />
Kasutatakse teraapias. Puudus valguhüdrolüsaatide<br />
juures tekib kibedus niipea kui<br />
hüdrolüüsida rohkem kui 10%. See on nn.<br />
“off-flavour” aste. Kasutatakse maitset<br />
korrigeerivaid lisandeid.<br />
Tsellulaasse kompleksi ensüümide rakendamine<br />
tekstiilitööstuses – “kivipesu” teksad on<br />
bioloogiline mitte “geoloogiline” produkt.<br />
Trichoderma tsellulaasse kompleksi erinevate<br />
komponentide (endoglukanaaside, tsellobiohüdrolaaside<br />
ja glükosidaaside) kloonimine on<br />
võimaldanud paremini mõista tsellulaasse<br />
aktiivsuse olemust erinevate tselluloosi<br />
polümeeride suhtes. Selle baasil on välja<br />
arendatud “kivipesu” tehnoloogia.<br />
Vt: ülevaade ensüümide tööstusliku<br />
rakendamise kohta. Kirk et al., (2002)<br />
Industrial enzyme applications. Curr. Op. In<br />
Biotech. 13: 345-351.<br />
<strong>ENSÜÜMID</strong>E STRUKTUURI MUUT-<br />
MINE<br />
Põhiliseks meetodiks ensüümide struktuuri ja<br />
omaduste modifitseerimisel on suunatud<br />
1 http://www.biotech.ebc.ee/
mutagenees. Kuigi varem on kasutatud (ja<br />
kasutatakse osaliselt ka veel praegu) valkude<br />
keemilist modifitseerimst ja mitmesuguseid<br />
manipulatsioone lahustiga, pole need meetodid<br />
spetsiifilised ja on tihti liialt karmid. DNA<br />
tasemel on võimalik muuta spetsiifilisi aluseid<br />
teatud ensüümi kodeerivas geenis ja seeläbi<br />
asendada spetsiifilisi aminohappelisi järjestusi<br />
ensüümi polüpeptiidahelas teistega. Kasutades<br />
seejärel rekombinantsete DNA-de tehnoloogiat<br />
on võimalik saada suurtes kogustes<br />
modifitseeriud ensüümi.<br />
Suunad:<br />
1. Ensüümide katalüütilise aktiivsuse<br />
suurendamine ja substraadi afiinsuse<br />
tõstmine.<br />
2. Substraadispetsiifilisuse muutmine, konstrueerides<br />
eksisteerivatest ensüümidest uusi<br />
ensüüme (näiteks selliste ensüümide<br />
loomine, mida looduses ei leidu, et<br />
katalüüsida uusi reaktsioone)<br />
3. Muudetud pH profiiliga ensüümide<br />
loomine, et saada ensüüme, mis töötaksid<br />
mittefüsioloogiliste pH väärtuste juures.<br />
4. Ensüümide loomine, mis oleksid stabiilsed<br />
oksüdeerivate agensite suhtes; lihtsalt<br />
oksüdeeritavate aminohappejääkide Cys,<br />
Trp ja Met asendamine steeriliselt sarnaste<br />
mitteoksüdeeritavate aminohapetega nagu<br />
Ser, Phe, Glu (vastavalt). Näiteks taoliste<br />
pesupulbri ensüümide loomine, mis<br />
töötaksid pleegitaja juuresolekul.<br />
5. Stabiilsuse tõstmine raskemetallide suhtes<br />
asendades Cys ja Met jäägid ja eemaldades<br />
ensüümi pinnal olevad karboksüülrühmad.<br />
6. Proteolüütilise degradatsiooni resistentsete<br />
ensüümide loomine (Paljudes reaktsioonisegudes<br />
esineb proteinaasne saastus, mis<br />
võib meid huvitava(d) ensüümi(d)<br />
lõhkuda).<br />
7. Ensüümid, mis oleksid stabiilsed ka mitte<br />
vesikeskkonnas.<br />
8. Allosteeriliste saitide kõrvaldamine, mis<br />
osalevad feedback inhibitsioonil.<br />
9. Erinevate biokeemiliste radade ensüümide<br />
liitmine, nii et multi-ensümaatilist protsessi<br />
saaks läbi viia ühe valguga.<br />
Seega on eesmärgiks luua ensüümid, mis<br />
oleksid võimelised katalüüsima iga soovitud<br />
reaktsiooni kui vajalik ka ekstreemsetes<br />
tingimustes<br />
Probleemid:<br />
1. Röntgenkristallstruktuuride puudumine<br />
paljude ensüümide puhul, mistõttu pole<br />
teada ensüümide kolmedimensionaalne<br />
struktuur.<br />
2. Puudulikud teadmised ensüümi aktiivtsentris<br />
toimivate täpsete interaktsioonide<br />
kohta (vesiniksidemed, elektrostaatilised<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
sidemed ja hüdrofoobsed interaktsioonid).<br />
ensüümi ja substraadi vahel.<br />
3. Me ei tea täpseid faktoreid, mis osalevad<br />
valkude stabilisatsioonil.<br />
Kõik ensüümide insenergeneetikat puudutav<br />
on üle kantav ka muudele valkudele.<br />
Valkude insenergeneetika strateegiad:<br />
1. Ratsionaalne disain. Valkude insenergeneetika<br />
vanem suund, mida kasutatakse<br />
laialdaselt ka praegu soovitud omaduste<br />
viimiseks valkudesse.<br />
Põhineb valkude struktuuri ja funktsiooni<br />
seoste mõistmisel ja kasutamisel, sageli<br />
kasutatakse molekulaarset modelleerimist. Edu<br />
sõltub valkude struktuuri määramise meetodite<br />
arengust, arvutisimulatsioonide ja molekulaarse<br />
modelleerimise meetodite arengust ja<br />
uutest andmetest struktuuri ja funktsiooni<br />
vahelistes suhetes.<br />
Meetod eeldab tavaliselt sisestatud mutatsioonide<br />
kontrollimist sekveneerimisel ja<br />
samuti ka mutantse ensüümi puhastamist peale<br />
igat mutageneesi tsüklit, et mõõta ensüümi<br />
kineetilised ja funktsionaalsed omadused. See<br />
muudab kogu meetodi suhteliselt töömahukaks<br />
ja kalliks.<br />
3. Suunatud evolutsioon.<br />
Vt. Turner (2003) Directed evolution of<br />
enzymes for applied biocatalysis. Trends in<br />
Biotech. vol 21, No.11, pp.474-478.<br />
Selle meetodi puhul ei ole vaja teada eelnevat<br />
informatsiooni ensüümi struktuur ja<br />
funktsiooni seoste kohta. Paljude, eelkõige<br />
tööstuslike ensüümide osas on raske leida seost<br />
ensüümis soovitud omaduste ja tema disaini<br />
võimaluste vahel.<br />
Suunatud evolutsiooni nim. ka molekulaar<br />
evolutsiooniks ja in vitro evolutsiooniks<br />
Selle puhul valmistatakse valgu variandid<br />
geenifragmentide in vitro rekombineerimisel<br />
PCR-i abil; ekspresseeritakse ja selekteeritakse<br />
või skriinitakse muutunud omaduste<br />
osas.<br />
Suunatud evolutsioon on eriti kasulik kui on<br />
vaja ensüümi funktsiooni “timmida” (fine<br />
tuning), sest kui teatud aktiivsus on olemas,<br />
siis saab kombineerida omadusi mida üksikul<br />
kujul looduses ei esine.<br />
Meetodid:<br />
Single sequence shuffling. (JOONIS)<br />
Kui kasutada üht stardijärjestust, siis tuleneb<br />
fragmentide erinevus PCR-i käigus (“errorprone<br />
PCR”) DNA polümeraasi vigade tõttu<br />
sisseviidud juhuslikest punktmutatsioonidest.<br />
Kuna enamus punktmutatsioone on neutraalsed<br />
või kahjulikud, siis peab mutatsioonide hulk<br />
olema väike. Seetõttu on kasulike mutatsioonide<br />
kogunemise kiirus ja vajaliku tunnuse<br />
evolutsioon aeglased<br />
2 http://www.biotech.ebc.ee/
Sequence family shuffling. (JOONIS)<br />
Seetõttu on hoopis parem kasutada looduses<br />
esinevaid homoloogilisi järjestusi, mis on juba<br />
eelnevalt looduse poolt rikastatud kahjulike<br />
variantide välja selekteerimisel.<br />
Tsefalosporinaas C geeni näide Vt. Crameri et<br />
al,. (1998) DNA shuffling of a family of genes<br />
from diverse species accelerates directed<br />
evolution. Nature vol. 391 p.288-291.<br />
Neljast mikroobiliigist valitud geenid, järjestuse<br />
homoloogia DNA tasemel oli 58-82%.<br />
Originaalse DNA järjestuse alusel sünteesiti<br />
geenid sünteetilistest oligotest ja kasutati neid<br />
shufflinguks.<br />
Incremental Truncation for the Creation of<br />
Hybrid Enzymes (ITCHY) (JOONIS)<br />
Vt. Lutz & Benkovic (2000) Homology<br />
independent protein engineering. Curr. Op. in<br />
Biotech, vol 11, p.319-324.<br />
Eelpooltoodu tehnoloogia peamine puudus on<br />
sõltuvus DNA järjestuste homoloogiast.<br />
Seetõttu on tegeldud homoloogiast sõltumatute<br />
meetoditega. ITCHY meetodit on kasutatud<br />
kui shuffling ei ole võimalik madala<br />
homoloogia tõttu. Luuakse kombinatoorsed<br />
fusion klonoteegid erinevate amino- ja<br />
karboksüterminaalsete geenifragmentide vahel.<br />
TERMOSTABIILSED <strong>ENSÜÜMID</strong><br />
Termostabiilsust defineeritakse sageli kui<br />
temperatuuri, mille juures 50% vastava valgu<br />
struktuurist on denatureerunud; denaturatsiooni<br />
astet jälgitakse valgu tsirkulaarse dikroismi<br />
järgi lahuses.<br />
Eelised mida annab ensümaatiliste reaktsioonide<br />
läbiviimine kõrgemal temperatuuril<br />
võrreldes tavalisega.<br />
1. Vähenenud saastuse oht ja lahuste<br />
viskoosus (Sterilisatsioon)<br />
2. Ensüümide aktiivsuse ja ka reaktsioonikiiruse<br />
suurenemine vastavalt van’t Hoffi<br />
reeglile.<br />
3. Produktide saagise suurenemine kuna<br />
a) paljude substraatide lahustuvus on<br />
kõrgemal temperatuuril parem<br />
b) reaktsiooni termodünaamilise tasakaalu<br />
nihkumine produktide tekke suunas<br />
4. Suurenenud stabiilsus teiste denatureerivate<br />
tingimuste suhtes.<br />
5. Protsessi kulgu on kõrgemal temperatuuril<br />
suhteliselt lihtsam kontrollida. Näiteks<br />
protsessi katkestamine allajahutamisel.<br />
Toiduainete tööstuses rakendatakse tänapäeval<br />
laialdaselt ensüüme protsessides, mille temperatuur<br />
on 50-60°C (näit. glükoamülaas, glükoosi<br />
isomeraas) ja isegi 85-110°C (bakteriaalsed<br />
α-amülaasid) TABEL.<br />
Kõik ensüümid kaotavad temperatuuri<br />
tõstmisel oma katalüütilist aktiivsust.<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
Eristatakse pöörduvat ja pöördumatut<br />
termoinaktivatsiooni. Ensüüm võib olla kolmes<br />
vormis:<br />
Natiivne N – denatureeritud D – pöördumatult<br />
denatureeritud I<br />
N ↔ D → I<br />
Pöörduvad ja pöördumatud mehhanismid<br />
ensüümide denaturatsioonil<br />
Kuumutamisel toimivad konformatsioonilised<br />
ja kovalentsed protsessid.<br />
Konformatsioonilised protsessid<br />
Pöördumatu termoinaktivatsioon toimub isegi<br />
kontsentratsioonidel, millistel ei esine<br />
agregatsiooni.<br />
1. “Ebakorrektne “voltimine”, mis<br />
põhjustab “segiläinud” struktuuri. Esineb<br />
kõrgetel pH väärtustel lähenedes ensüümi<br />
(valgu) isoelektrilisele punktile. Näiteks<br />
lüsotsüüm (i.p 11) ja ribonukleaas (i.p. 9.6)<br />
pH 8 juures on inaktiivses struktuuris, kuid<br />
pH 4 ja 6 juures eriti ei mõju. Seega on<br />
tõenäoline, et ensüümi kogulaengu vähenemine<br />
soodustab ebakorrektse struktuuri<br />
moodustumist kuumutamisel.<br />
2. Mitmesuguste agregaatide teke.<br />
Agregatsiooni ja teisi bimolekulaarseid<br />
protsesse saab blokeerida elimineerides<br />
valgu difusiooni st. tuleb valk immobiliseerida.<br />
Kovalentsed protsessid<br />
1. Polüpeptiidahela hüdrolüüs vahetult<br />
aspartaathappe jäägi kõrvalt põhjustab<br />
pöördumatu termoinaktivatsiooni lüsotsüümil<br />
ja RNaasil pH-4 juures.<br />
Peptiidsideme hüdrolüüs toimub eelistatult<br />
aspartaathappe karboksü-terminuse juures.<br />
2. Disulfiidsillad ja nende lõhkumine<br />
aluselistes tingimustes. Intramolekulaarsete<br />
cross-linkide lõhkumine<br />
3. Asparagiini (ja võib-olla ka Glu)<br />
deamiinimine)<br />
Termostabiilsete ensüümide saamine<br />
1. Termofiilsetest organismidest kandes nende<br />
geenid insenergeneetiliselt üle mesofiilsetele<br />
organismidele. Kahjuks iga<br />
ensüümi termofiilidel ei ole. Raske on ka<br />
saavutada ensüümide üleproduktsiooni<br />
2. Vee eemaldamine süsteemist<br />
3. Protein engineeing<br />
Vee eemaldamine süsteemist.<br />
Kuna vesi on reagendiks peptiidide hüdrolüüsil<br />
ja deamiinimisel, mediaatoriks tsüsteiini ßeliminatsioonil<br />
ja lahustiks, mis hõlbustab<br />
liikuvust ja viib ebakorrektse struktuuri tekkele<br />
on loogiline, et vee asendamine mingi teise<br />
keskkonnaga mõjub ensüümile stabiliseerivalt.<br />
Näiteks lüsotsüüm, kus ensüümi t1/2 on<br />
3 http://www.biotech.ebc.ee/
võimalik tõsta paar suurusjärku kasutades vee<br />
asemel orgaanilisi lahusteid.<br />
Ka teised ensüümid: türosinaas, peroksidaas,<br />
kolesterooli oksüdaas omavad aktiivsust<br />
peaaegu veeta orgaanilises keskkonnas.<br />
Protein engineering<br />
1. Disulfiidsildade lisamine, stabiliseerib<br />
valgumolekuli kõrgendatud temperatuuridel.<br />
Lisaks sellele on taoliselt modifitseeritud<br />
ensüümid sageli ka resistentsed denaturatsioonile<br />
orgaaniliste lahustitega ja mittefüsioloogilistes<br />
tingimustes nagu näiteks<br />
ekstreemsetel pH väärtustel.<br />
2. Asparagiini asendamine teiste aminohapetega<br />
Kõrgel temperatuuril võib valgus toimuda<br />
asparagiini (ja glutamiini) jääkide deamiinimine,<br />
st. reaktsioon, mille käigus vabaneb<br />
ammoniaak. Aminorühma kadumisel<br />
muutuvad need aminohapped vastavalt<br />
asparagiin- ja glutamiinhappeks, mis kutsuvad<br />
esile peptiidahela foldingu muutuse ja võivad<br />
viia valgu aktiivsuse kadumisele.<br />
Kui asendada Asn aminohappejäägiga, mis<br />
vastab ligikaudselt tema omadustele ja<br />
suurusele (näit. isoleutsiin (Ile) või treoniin<br />
(Thr), siis taoline asendus stabiliseerib<br />
ensüümi.<br />
3.Vabade sulfhüdrüülrühmade arvu vähendamine.<br />
4. Ensüümi “rebuilding”<br />
Ensüümide termostabiilsus on suuresti<br />
ensüümi “tuumas” asetleidvate hüdrofoobsete<br />
interaktsioonide tulemus. Üks võimalik tee<br />
ensüümide termostabiliseerimiseks on nende<br />
interaktsioonide suurendamine.<br />
Komplekssed lahendused<br />
Subtilisiin<br />
1. Oksüdatsioon<br />
Valkude ebastabiilsuse peamisi põhjusi on<br />
vastuvõtlikus oksüdatsioonile. Eriti valkude<br />
puhul, mis sisaldavad metioniini, tsüsteiini või<br />
trüptofaani jääke kas aktiivtsentris või selle<br />
vahetus läheduses. Taoliste ensüümide<br />
tööstuslikul rakendamisel on põhiprobleemiks<br />
nende oksüdatiivne inaktivatsioon.<br />
Bacillus ssp eraldatud subtilisiin on põhiline<br />
detergentide koostisse kuuluv ensüüm.<br />
Positsioonis 222 asuv metioniin, mis esineb<br />
kõigil Bacillus ssp.’st eraldatud subtilisiinidel,<br />
asub vahetult aktiivstentris asuva seriini jäägi<br />
lähedal, mis on vajalik katalüüsiks. Selle Met<br />
oksüdatsioon viib ensüümi inaktivatsioonile<br />
takistades substraadi pääsu aktiivtsentrisse.<br />
Tänapäeval takistab see oluliselt valgendajate<br />
kasutamist detergentide koostises.<br />
Lahendus: Met kõrvaldamine.<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
Konstrueeriti mutandid, mis sisaldasid kõik 19<br />
võimalikku asendust selles 222 positsioonis ja<br />
määrati kõigi mutantide spetsiifiline aktiivsus<br />
wild-type Met sisaldava ensüümi suhtes (wildtype=100%).<br />
Cys mutandi eriaktiivsus oli pisut<br />
suurem 138% kuid ta oli sarnaselt wild-type<br />
ensüümile H2O2 manulusel inaktiveeritav<br />
(kuigi veidi vähem). Kui kõigil teistel<br />
mutantidel oli mingi aktiivsus olemas, siis Ala<br />
ja Ser mutantide eriaktiivsus oli suurim (53%<br />
ja 35%) ja taoliselt modifitseeritud ensüümid<br />
palju vastupidavamad H2O2 suhtes. Seega on<br />
taoliselt võimalik teha oksüdatsioonile<br />
resistentsemaid ensüüme asendades oksüdatsioonitundlikud<br />
aminohapped resistentsetega.<br />
2. Disulfiidsillad<br />
Subtilisiini molekuli sisestati kaks täiendavat<br />
disulfiid silda, et tõsta termostabiilsust.<br />
3. Ensüümi spetsiifilisuse muutmine<br />
Subtilisiinil on suur hüdrofoobne sidumis sait,<br />
milles paikneb külgahelana 166. pos. AH jääk.<br />
W-t ensüümil on seal glütsiin. Asendades selle<br />
kõigi 19 võimaliku aminohappega uuriti nende<br />
substraadi-spetsiifikat ja saadi väga erinev<br />
spekter. Näiteks Lys 166 asenduse puhul oli<br />
kcat/Km 800 x suurem kui wild-type ensüümi<br />
puhul.<br />
4. Elektrostaatilised efektid<br />
On olulised ensümaatilise katalüüsi juures<br />
osaledes transitsiooni saidi (laetud) stabiliseerimisel.<br />
Seriin proteaaside keemiline<br />
modifitseerimine on näidanud, et katalüüsi pH<br />
sõltuvus muutub ensüümi üldise pinnalaengu<br />
muutudes. Sellest tuleneb üldine meetod<br />
ensüümide pH sõltuvuse modifitseerimiseks,<br />
muutes ensüümi aktiivtsentri elektrostaatilist<br />
ümbrust ensüümi GI-ga.<br />
Subtilisiini puhul on näidatud, et ühe<br />
pinnalaengu muutus omab olulist efekti<br />
ensüümi pH sõltuvusele. Asendades Asp 99,<br />
mis paikneb 14-15Å kaugusel aktiivtsentrist<br />
laenguta Ser jäägiga mõjutab taoline muutus<br />
nii aktiivtsentri ionisatsiooni konstanti ja<br />
ensüümi ülekande oleku laengut<br />
EKSTREMOFIILIDE KASUTAMINE<br />
<strong>BIOTEHNOLOOGIA</strong>S<br />
NB! Hea ülevaade “The production of<br />
biocatalysts and biomolecules from extremophiles”<br />
(2002) Schiraldi and DeRosa Trends in<br />
Biotech pp.515-521.<br />
Termofiilid, psührofiilid, atsidofiilid, alkalofiilid,<br />
halofiilid, osmofiilid, barofiilid, radiatsiooni<br />
resistentsed ja raskemetallide tolerantsed<br />
mikroorganismid. Kõigil neil on suur<br />
biotehnoloogiline ja kommertsiaalne tähtsus.<br />
Termofiilid:<br />
psührofiilid –5 - +20°C<br />
mesofiilid +15 - +40°C<br />
termofiilid +45 - +100°C<br />
hüpertermofiilid üle +100°C<br />
4 http://www.biotech.ebc.ee/
Süstemaatika: arhebakterid, prokarüoodid ja<br />
eukarüoodid<br />
Kuidas nad seda saavutavad?<br />
Enamus termosüüme on sarnased mesofiilsetele<br />
ensüümidele k.a. fülogeneetilised<br />
variatsioonid.<br />
1. Nende aminohappeline järjestus on<br />
tüüpiliselt 40-85% sarnane nende<br />
mesofiilsetele analoogidele.<br />
2. Nende 3D struktuurid on ülekantav ka<br />
nende mesofiilsetele analoogidele<br />
3. Neil on sama katalüütiline mehhanism.<br />
Välja arvatud vähesed erandid saab kloonitud<br />
termosüüme edukalt ekspresseerida mesofiilsetes<br />
organismides. Neil on kõik natiivsele<br />
ensüümile omased omadused.<br />
Kuigi on olemas teatud täiendavad faktorid<br />
nagu: soolad, polüamiinid või glükosüleerimine,<br />
mis aitavad stabiliseerida teatud<br />
termosüüme on enamus neist “sisemiselt”<br />
termostabiilsed. Seega on see erineva<br />
aminohappelise järjestuse tulemus.<br />
Iga termosüüm on stabiliseeritud erinevate<br />
mehhanismide unikaalse kombinatsiooni<br />
poolt. Kõik eeldatavad aminohapete asendamise<br />
reeglid mesosüümide ja termosüümide<br />
vahel (määratud statistilise analüüsi põhjal) on<br />
vastuolus vähemalt ühe termosüümi järjestusega.<br />
Seega pole olemas universaalset valgu<br />
stabiliseerimise mehhanismi.<br />
Enamus valkude stabilisatsioonil osalevaid<br />
molekulaarseid mehhanisme on väljaselgitatud<br />
uurides mesofiilseid ensüüme. Nüüd on juba<br />
ka olemas kristalliseeritud termosüüme ja<br />
seetõttu võimalik võrrelda nii mesosüüme kui<br />
termosüüme. Vt. Hea ülevaade (1996) Trends<br />
in Biotech June p.185.<br />
1. Termosüümid on “rigiidsemad”<br />
Ensüümid peavad hoidma oma katalüütiliselt<br />
aktiivset struktuuri lahtivoltimise eest denatureerivates<br />
reaktsioonitingimustes Erinevad<br />
mehhanismid: α-heeliksi stabiliseerimine,<br />
elektrostaatiliste interaktsioonide optimeerimine<br />
ja konformatsioonilised muutused.<br />
2. Hüdrofoobsed interaktsioonid<br />
Arvatakse et hüdrofoobsed interaktsioonid<br />
annavad vajaliku energia valkude vesilahuses<br />
kokku pakkimiseks. Näit. T. thermophilus’e 3isopropüülmalaadi<br />
dehüdrogenaasil on kaks<br />
hüdrofoobset jääki (Leu246 ja Val249)<br />
ensüümi dimeeri piirpinnal, mis on E. coli-s<br />
asendatud vähemhüdrofoobsete jääkidega (Glu<br />
ja Met). Tehes E. coli’s samad asendused saab<br />
ka seda stabiliseerida dissotsatsiooni ja<br />
denaturatsiooni vastu..<br />
3. “Pakkimise” efektiivsus<br />
Ensüümi valguline “tuum” on tüüpiliselt<br />
hüdrofoobne, suurenenud pakkimise efektiivsus<br />
on sageli korrelatsioonis suurenenud<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
hüdrofoobsusega. Kristallograafilistel uuringutel<br />
põhinev suunatud mutagenees on<br />
näidanud, et kui täita volditud struktuuris<br />
hüdrofoobsed “õõned” ja suurendada sellega<br />
pakkimise hüdrofoobsust tõuseb ka valgu<br />
termostabiilsus.<br />
4. Soola sillad<br />
Immobiliseerunud ioonid on väga aktiivsed,<br />
viidates sellele, et intramolekulaarsed valgupinna<br />
soolasillad on väga stabiilsed, isegi kui<br />
valk on väga polaarses keskkonnas. Soola<br />
sillad stabiliseerivad ka sekundaarstruktuuri,<br />
suurendades selle rigiidsust. T. thermophilus’e<br />
RNase H täiendavad soolasillad toetavad pH<br />
efekti. Soolasildade võrgustik, mis E. coli’l<br />
puudub stabiliseerib ß-heeliksit.<br />
B stearothermophilus’e fosfoglütseraat kinaas<br />
sisaldab 15 täiendavat soolasilda võrreldes<br />
pärmi ensüümiga.<br />
5. Konformatsiooniliste pingete vähendamine<br />
6. Lahtipakkimise entroopia vähendamine<br />
Lahtipakitud valkudes on Gly (millel puudub<br />
ß-süsinik) aminohappejäägiks millel on<br />
kõrgeim konformatsiooniline entroopia.<br />
Pakkimisel kulub kõige rohkem energiat Gly<br />
paikapanekuks. Teisalt: Pro jäägid oma<br />
pürrolidooniringiga võivad omada vähe<br />
konfiguratsioone, mis on samuti määratud<br />
eelneva jäägi konfiguratsiooni poolt. Gly<br />
asendamine mingi teise AH-jäägiga.<br />
7. α-heeliksi stabiliseerimine<br />
Termosüümide heeliksites on valdavalt Ala<br />
jäägid.<br />
8. Vesiniksidemed<br />
Positiivne korrelatsioon termostabiilsuse ja<br />
subühiku siseste laetud-neutraalsete<br />
vesiniksidemete vahel.<br />
9. Loop’ide stabiliseerimine<br />
Luubid on valkudes nn. nõrgad lülid. Need on<br />
regioonid, kus lahtipakkimine (termiline<br />
denaturatsioon) toimub kõigepealt. Termosüümide<br />
luubid on lühemad kui nende mesosüümidest<br />
analoogidel, või puuduvad mõned<br />
neist üldse. See tõstab valgu kompaktsust.<br />
10 Resistentsus kovalentsele destruktsioonile<br />
Cys destruktsioon, Asn ja Glu deamiinimine,<br />
Cys oksüdatsioon ja peptiidsidemete hüdrolüüs.<br />
Termosüümidel on vähem tundlikke AHjääke.<br />
Termosüümide inaktivatsioon toimub<br />
eelkõige kovalentsel modifikatsioonil ja vähem<br />
lahtipakkimise tõttu on see mehhanism üks<br />
tähtsamaid termostabiilsete ensüümide<br />
saamisel insener-geneetika abil.<br />
5 http://www.biotech.ebc.ee/
Change language