Tööstuslik biotehnoloogia ja rekombinantsed valgud
Tööstuslik biotehnoloogia ja rekombinantsed valgud
Tööstuslik biotehnoloogia ja rekombinantsed valgud
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
<strong>Tööstuslik</strong> <strong>biotehnoloogia</strong> <strong>ja</strong> <strong>rekombinantsed</strong> <strong>valgud</strong><br />
MIKROOBNE FERMENTATSIOON<br />
<strong>Tööstuslik</strong>u mikroobse fermentatsiooni võib<br />
<strong>ja</strong>gada järgmiselt:<br />
1. Mikroobirakkude (biomassi) tootmine<br />
2. Mikroobsete metaboliitide tootmine<br />
3. Mikroobsete ensüümide tootmine<br />
4. Mikroobne transformatsioon<br />
5. Rekombinantsete produktide tootmine<br />
1. Mikroobne biomass<br />
<strong>Tööstuslik</strong>ult toodetakse bioproteiine e. single<br />
cell proteins (SCP) nii inimtoiduks kui loomasöödaks.<br />
SCP toomine toimub nii pärmide,<br />
bakterite, hallitusseente <strong>ja</strong> fototroofsete mikroorganismide<br />
baasil.<br />
Eeldused:<br />
1. mikroorganismid võivad toota väga suuri<br />
valgukoguseid.<br />
2. mikroorganismide kiire paljunemine,<br />
mille tõttu on biomassi juurdekasv mitu<br />
korda suurem kui näit. kõrgematel<br />
taimedel <strong>ja</strong> loomadel.<br />
Imeta<strong>ja</strong>d (ka inimene) ei suuda ise sünteesida<br />
kaheksat aminohapet, mille tõttu on va<strong>ja</strong>lik<br />
nende nn. asendamatute aminohapete saamine<br />
toiduga. Mikroobivalk ei jää oma asendamatute<br />
AH-de sisalduse poolest alla näit. kala-<br />
<strong>ja</strong>hule kui nn. optimaalsele valgusöödale <strong>ja</strong><br />
isegi ületab so<strong>ja</strong> baasil toodetud sööta. Vt.<br />
TABEL<br />
Mikroobirakud loomasööda või toiduna<br />
Mikroobirakkude kvaliteedi üle loomasööda<br />
või inimtoiduna ei saa otsustada ainult<br />
valgusisalduse või aminohappelise koostise<br />
järgi Tähtis on ka seeditavus <strong>ja</strong> sööda taluvus<br />
loomade puhul.<br />
Seeditavuse määrab muuhulgas rakukesta<br />
paksus <strong>ja</strong> koostis, taluvuse eelkõige ainevahetust<br />
koormavate või ainevahetusele<br />
toksiliste ainete sisaldus.<br />
Esmajoones kitsendab mikroobivalkude<br />
kasutamist söödana nende kõrge nukleiinhapete<br />
sisaldus. Mikroorganismidel, kui väga<br />
kiirelt kasvavatel organismidel on tunduvalt<br />
suurem DNA <strong>ja</strong> RNA sisaldus kui toiduks<br />
kasutatavatel taime <strong>ja</strong> loomarakkudel. Näit.<br />
eukarüootsetel pärmirakkudel on see 3-6<br />
(9)% kuivmassist. Prokarüootsetel bakteritel<br />
ulatub see 15-20% <strong>ja</strong> muudab nad kasutatavaks<br />
ainult piiratud koguses, kui ei õnnestu<br />
nende NH sisaldust vähendada.<br />
Mikroobi<strong>valgud</strong> inimtoiduna?<br />
Ühest arvamust ei ole. Inimtoiduks ettenähtud<br />
SCP produkte on vähe. Nii pagari- kui<br />
õllepärmi on juba ammu rakendatud toiduainetetööstuses<br />
<strong>ja</strong> sõdade järel on toodetud ka<br />
nn. "toidupärmi" (melassi baasil).<br />
Pärmiekstrakt. Tegelikult pole see mitte<br />
valguline toiduaine, vaid eelkõige väikestes<br />
kogustes kasutatav maitse- <strong>ja</strong> vitamiinilisand.<br />
SCP-id otse inimtoiduna??<br />
Nõuded mikroobivalgu kasutamisel<br />
inimtoiduks.<br />
1. Väga hoolikalt puhastada st. eraldada<br />
rakukestad <strong>ja</strong> nukleiinhapped.<br />
2. Eemaldada ained (näit. teatud lipiidid),<br />
mis pole inimorganismi poolt metaboliseeritavad.<br />
3. Kõrvaldada raskemetallide jäljed.<br />
Selline töötlemine muudab produktid kalliks.<br />
Praegu on peaaegu ainus ametlikult lubatud<br />
mikroobse päritoluga valguline toiduprodukt<br />
mükoproteiin, mille tootmine töötati väl<strong>ja</strong><br />
Inglismaal firmas "Rank Hovis McDougall".<br />
Mükoproteiin: koosneb peamiselt seenemütseelist.<br />
Tootmisel kasutatakse mullast<br />
eraldatud hallitusseene Fusarium venenatum-i,<br />
spetsiaalset tüve. Nii protsess kui produkt on<br />
hoolikate uuringute <strong>ja</strong> katsetuste tulemus.<br />
Toodetakse pidevprotsessis, substraadiks<br />
glükoos <strong>ja</strong> teised taolised toitained,<br />
lämmastikuallikaks on ammoniaak <strong>ja</strong><br />
ammooniumisoolad. Peale fermentatsiooni<br />
töödeldakse kultuuri termiliselt, et vähendada<br />
RNA hulka <strong>ja</strong> seejärel eraldatakse mütseel<br />
vaakumfiltreerimisel. 1986. a. peale hoolikaid<br />
katsetusi ohutuse seisukohalt lubati selle<br />
kasutamine inimtoiduna,. Esialgu kaubastati<br />
töödeldud kujul toidulisandina. Alates 1993.<br />
aastast on saadav ka toormater<strong>ja</strong>lina<br />
kaubamärgi “Quorn R ” all UK-s <strong>ja</strong> alates<br />
2002.a. USA-s. VT. ka: www.quorn.com<br />
Kõrvutades mükoproteiini tootmist valkude<br />
sünteesiga loomadel selgub terve rida eeliseid.<br />
1. Kasvukiirus: substraadi üleviimine valguks<br />
on võrratult efektiivsem kui toidu omastamine<br />
koduloomade poolt. Vt. TABEL<br />
2. Täiskasvanud kultuuri kiuline struktuur,<br />
mille tõttu võib imiteerida liha "struktuuri"<br />
<strong>ja</strong> lisandite arvel ka selle maitset <strong>ja</strong> värvust<br />
2. Mikroobsed metaboliidid<br />
Kuigi tänapäeval on molekulaarne <strong>biotehnoloogia</strong><br />
suunatud põhiliselt kõikvõimalike<br />
valkude (nii rekombinantsete kui tavaliste)<br />
tootmisele, kasutatakse rekombinantsete DNAde<br />
tehnoloogiat siiski ka terve rea madalmolekulaarsete<br />
ühendite tootmisel nagu<br />
vitamiinid, aminohapped <strong>ja</strong> antibiooti-kumid.<br />
Näide: mikroobse indigo tootmine<br />
JOONIS<br />
Arvukad bakterid, eelkõige Pseudomonas-e<br />
tüved on võimelised kasutama ainsa<br />
süsinikuallikana tervet rida aromaatset tuuma<br />
1 http://www.biotech.ebc.ee/
sisaldavaid orgaanilisi ühendeid: naftaliin,<br />
tolueen, ksüleen <strong>ja</strong> fenool. Enamasti asuvad<br />
nende degradatsiooni eest vastutavad geenid<br />
suurtes plasmiidides (50-200kb). Sageli<br />
tehakse ootamatuid avastusi, mis võivad<br />
osutuda väga kasulikuks.<br />
Pseudomonas’e plasmiid NAH7, millel on<br />
kaks eraldi operoni <strong>ja</strong> mis võimaldab seda<br />
plasmiidi sisaldaval peremeesrakul kasvada<br />
naftaliinil.<br />
1. Trüptofaani konversioon kasvusöötmes<br />
indooliks ensüüm trüptofanaasi poolt, mida<br />
sünteesitakse E. coli peremeesraku poolt.<br />
2. Indooli oksüdatsioon cis-indool-2,3dihüdrodiooliks<br />
naftaliini dioksügenaasi<br />
poolt, mida kodeerib NAH7 plasmiidist<br />
pärinev DNA insert<br />
3. Spontaanne vee eraldumine <strong>ja</strong> oksüdatsioon<br />
õhu käes, mille tulemusel moodustub<br />
indigo<br />
Seega andis kahe erineva organismi <strong>ja</strong> erineva<br />
ensümaatilise ra<strong>ja</strong> ensüümide kombinatsioon<br />
täiesti ootamatu tulemuse. Lisades veel juurde<br />
geeni, mis kodeerib ensüüm ksüleeni oksüdaasi<br />
(originaalis on see TOL plasmiidis), siis saab<br />
produkti veel kiiremini, sest reaktsioonil tekkiv<br />
indoksüül oksüdeerub spontaanselt indigoks.<br />
Indigo on tööstuslikult väga tähtis sinine<br />
värvipigment, mida kasutatakse nii puuvillase<br />
kui ka villase riide värvimiseks. Algselt<br />
eraldati seda taimedest, kuid nüüd<br />
sünteesitakse keemiliselt. Aasta toodetakse ca<br />
13x10 6 kg indigot väärtusega ca 200 milj.<br />
dollarit. Mikroobne tootmine avab uued<br />
võimalused, kuna ei kasutata ohtlikke<br />
kemikaale nagu aniliin, formaldehüüd <strong>ja</strong><br />
tsüaniid, mida rakendatakse keemilisel<br />
sünteesil.<br />
Mikroobne aminohapete tootmine <strong>ja</strong><br />
kasutamine<br />
AH-d toodetakse üle kogu maailma ca 800.000<br />
tonni aastas väärtusega üle 5 mil<strong>ja</strong>rdi $.<br />
Rohkem kui poole sellest kogusest moodustab<br />
glutamiinhape.<br />
Antibiootikumide tootmine<br />
Alates antibiootikumide avastamisest 1930<br />
aastatel on eraldatud üle 12.000 erineva<br />
antibiootikumi erinevatest mikroorganismidest.<br />
Eelkõige Streptomyces perekond<br />
3. Mikroobsed ensüümid<br />
(VT. Ensüümide loeng)<br />
Mikroobsed ensüümid leiavad põhiliselt<br />
kasutamist nii toiduainete- <strong>ja</strong> kääritustööstuses,<br />
samuti ka kliinilistel <strong>ja</strong> analüütilistel<br />
eesmärkidel <strong>ja</strong> pesupulbrites.<br />
4. Mikroobsed transformatsioonid<br />
Näiteks äädika tootmine (etanooli konversioon<br />
äädikhappeks). Kuna mikroorganismid on<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
kõrge regiooni- <strong>ja</strong> stereospetsiifilisusega<br />
hiraalsed katalüüsiühikud, siis on mikroobsed<br />
protsessid tunduvalt spetsiifilisemad kui<br />
keemilised <strong>ja</strong> võimaldavad seetõttu teatud<br />
funktsionaalsete rühmade lisamist, eemaldamist<br />
või modifitseerimist komplekssete<br />
molekulide spetsiifilistes kohtades. Aminohapete<br />
tootmine<br />
5. Rekombinantsed produktid<br />
Rekombinantse DNA tehnoloogia põhiline<br />
kasutamine tänapäeval on mitmesuguste<br />
valkude tootmine. Enamus rekombinantseid<br />
valke toodetakse mikroobide abil, kuigi ka<br />
rekombinantsete imeta<strong>ja</strong>rakkude tähtsus selles<br />
osas suureneb pidevalt.<br />
Näiteks raviotstarbelised <strong>valgud</strong>. Tänapäevaks<br />
on kloonitud üle 300 erineva terapeutilise<br />
valgu geenid (enamasti cDNA kujul).<br />
Terapeutiliste rekombinantsete valkude<br />
kasutamine TABEL<br />
Etapid:<br />
1. cDNA-de eraldamine Erinevad<br />
võimalused.<br />
2. Kloonimine Kui kloon on käes, siis<br />
subkloonitakse see E. coli ekspressioonivektorisse<br />
<strong>ja</strong> ekspresseeritakse mikroorganismis.<br />
3. Geeni ekspressiooni optimeerimine<br />
GEENI EKSPRESSIOONI REGULAT-<br />
SIOON JA SELLE OPTIMEERIMINE<br />
PROKARÜOOTIDEL<br />
Kloonides mingi geeni vektorisse, ei tähenda<br />
see veel, et geen ka edukalt ekspresseerub.<br />
<strong>Tööstuslik</strong>eks va<strong>ja</strong>dusteks on tihtipeale va<strong>ja</strong><br />
saada kloonitud geenilt suuri valgukoguseid.<br />
Geeni ekspressiooni moduleerimiseks on<br />
mitmeid võimalusi:<br />
1. Sobiva promootor <strong>ja</strong> terminaator järjestuse<br />
kasutamine<br />
2. Ribosoomi seondumissaidi (RBS) tugevus<br />
3. Kloonitud geeni koopiate arv <strong>ja</strong> sõltuvus<br />
kloonitud geeni asukohast (plasmiidis või<br />
integratsioon peremeesraku genoomi).<br />
4. Sünteesitud võõrvalgu rakusisene<br />
lokalisatsioon<br />
5. Peremeesraku translatsiooni efektiivsus<br />
6. Kloonitud geeni produkti stabiilsus<br />
peremeesrakus.<br />
Universaalset strateegiat maksimaalse<br />
ekspressiooni saavutamiseks ei ole.<br />
Kõige rohkem uuritud peremeesorganism on E.<br />
coli Seetõttu toodetakse ka enamus tööstuslikult<br />
huvipakkuvaid rekombinantse DNA<br />
produkte E. coli baasil. Kuid kasutatakse ka<br />
teisi peremeessüsteeme.<br />
2 http://www.biotech.ebc.ee/
Geeni ekspressiooni regulatsioon<br />
tugevatelt <strong>ja</strong> reguleeritavatelt promootoritelt.<br />
Tugev promootor on selline, mille afiinsus<br />
RNA polümeraasi suhtes on kõrge. Selle<br />
tulemusel transkribeeritakse järgnev regioon<br />
kõrge sagedusega. Promootori regulatsioon<br />
võimaldab rakul (<strong>ja</strong> ka uuri<strong>ja</strong>l) kontrollida<br />
transkriptsiooni ulatust.<br />
Kuidas leitakse potentsiaalseid promootorjärjestusi?<br />
JOONIS<br />
Konstitutiivsed <strong>ja</strong> reguleeritavad promootorid<br />
Miks ei ole alati hea kloonida geeni tugeva<br />
konstitutiivse promootori kontrolli alla?<br />
Võib hakata kahjustama raku enda elu, kuna on<br />
teatud mõttes energia väl<strong>ja</strong>vool. Rakk võib<br />
plasmiidi <strong>ja</strong>gunemise käigus väl<strong>ja</strong> visata, kuna<br />
ilma plasmiidita rakud kasvavad kiiremini <strong>ja</strong><br />
võtavad kultuuri üle. Plasmiidi stabiilsus on<br />
probleemiks eelkõige siis kui on va<strong>ja</strong> saada<br />
plasmiidse geeni produkti suures koguses.<br />
Seetõttu oleks otstarbekam kui kloonitud geeni<br />
ekspressioon toimuks vaid peremeesraku<br />
kasvutsükli kindlas etapis, kasutades tugevaid<br />
reguleeritavaid promootoreid.<br />
Reguleeritavad promootorid<br />
Kõige sagedamini kasutatavad tugevad<br />
reguleeritavad promootorid on:<br />
1. E.coli lac <strong>ja</strong> trp (trüptofaani) operonidelt;<br />
2. tac promootor, mis on in vitro konstrukt,<br />
mis sisaldab lac promootori –10 regiooni <strong>ja</strong> trp<br />
promootori –35 regiooni; ca 5 x tugevam kui<br />
trp <strong>ja</strong> 10 x tugevam kui lac. Represseeritakse<br />
samuti lac repressori poolt <strong>ja</strong> indutseeritakse<br />
IPTG-ga.<br />
3. vasak või p L promootor bakteriofaagilt λ <strong>ja</strong><br />
4. bakteriofaagi T7 geen 10 promootor.<br />
Kõik need promootorid interakteeruvad<br />
repressoritega, mis võimaldab kontrollida<br />
nende sisse- <strong>ja</strong> väl<strong>ja</strong> lülitamist. Kõiki neid<br />
promootoreid tunneb ära E. coli RNA<br />
polümeraasi holoensüüm, mis kasutab sigma<br />
faktorit. See on valk, mis kombinatsioonis<br />
RNA polümeraasi holoensüümi moodustavate<br />
core valkudega juhib holoensüümi seostumist<br />
DNA promootorregioonile, mis on olemas<br />
tunduvalt suuremas koguses kui teised<br />
minoorsed sigma faktorid. Selle tulemusel ei<br />
ole transkriptsioon limiteeritud sigma faktorite<br />
puuduse tõttu.<br />
lac promootor<br />
Kui kasvusöötmes ei ole laktoosi, siis on E.<br />
coli lac promootor represseritud lac repressor<br />
valgu poolt, mis takistab lac operoni<br />
transkriptsiooni. Indutseerimiseks ehk lac<br />
promootori sisse lülitamiseks on va<strong>ja</strong> kas<br />
laktoosi või isopropüül-ß-D-thiogalaktopüranosiidi<br />
(IPTG) manulust. Mõlemad ühendid on<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
võimelised takistama lac repressori seondumist<br />
lac operaatorile <strong>ja</strong> võimaldavad seega<br />
transkriptsiooni.<br />
Transkriptsiooni lac promootorilt reguleeritakse<br />
ka kataboliit aktivaator valgu (CAP)<br />
seostumisega promootor järjestusele. Kui CAP<br />
seondub promootorile, siis suurendab see<br />
promootori afiinsust RNA polümeraasi suhtes,<br />
võimendades seeläbi tagapool asuvate geenide<br />
transkriptsiooni. CAP-i afiinsust promootori<br />
suhtes tõstab cAMP, mille tase on kõige<br />
kõrgem siis kui glükoosi tase on madalaim.<br />
Kui induktor on olemas <strong>ja</strong> ei ole operaatorile<br />
seondunud repressorit, siis võib kõrge<br />
rakusisene cAMP kontsentratsioon samuti viia<br />
tugevale transkriptsioonile.<br />
trp promootor on negatiivselt reguleeritud<br />
trüptofaan-trp repressor valgu kompleksi poolt,<br />
mis seostub trp operaatorile <strong>ja</strong> takistab<br />
transkriptsiooni trp operonilt. Derepressioon e.<br />
sisse lülitamine toimub kui kõrvaldada<br />
keskkonnast trüptofaan või lisada 3-indoolakrüül<br />
hapet.<br />
p L promootorit kontrollitakse bakteriofaag λ<br />
cI repressorvalgu poolt. Praktikas kasutatakse<br />
sageli cI repressori temperatuuri tundlikku<br />
mutanti cI857. Rakke milles on temperatuuri<br />
tundlik cI repressor kasvatatakse alguses 28°–<br />
30°C juures. Sellel temperatuuril takistab cI<br />
repressor transkriptsiooni p L promootorilt. Kui<br />
rakukultuur saavutab va<strong>ja</strong>liku kasvustaadiumi<br />
(tavaliselt log faasi keskosa) siis tõstetakse<br />
temperatuur 42°C juurde, mille juures<br />
termosensitiivne cI repressor inaktiveerub <strong>ja</strong><br />
transkriptsioon käivitub.<br />
Bakteriofaag T7 promootor va<strong>ja</strong>b<br />
transkriptsiooniks T7 RNA polümeraasi. Selle<br />
promootori kasutamiseks inserteeritakse T7<br />
RNA polümeraasi geen E. coli kromosoomi<br />
bakteriofaag λ lüsogeen E. coli lac promootori<br />
kontrolli alla. Kui rakud on transformeeritud<br />
plasmiidiga, milles sihtmärk geen on T7<br />
promootori kontrolli all, siis lisatakse<br />
söötmesse IPTG. Sellistel tingimustel indutseeritakse<br />
T7 RNA polümeraasi geen,<br />
hakatakse tootma T7 RNA polümeraasi <strong>ja</strong><br />
kloonitud geen transkribeeritakse <strong>ja</strong><br />
transleeritakse. Tavaliselt on lag periood<br />
umbes 1 tund või rohkem alates a<strong>ja</strong>st kui<br />
indutseeriti T7 RNA polümeraasi geen kuni<br />
transkribeeritakse target geeni.<br />
Repressori taseme kontroll<br />
Kui repressorit on liialt palju, siis on raske<br />
indutseerida transkriptsiooni. Kui aga<br />
repressorit on liialt vähe, siis toimub<br />
transkriptsioon ka ilma indutseerimata.<br />
Promootor “lekib”.<br />
Et seda kontrollida pannakse näiteks repressor<br />
<strong>ja</strong> promootor erinevatesse plasmiididesse,<br />
mille koopia arv raku kohta on erinev.<br />
3 http://www.biotech.ebc.ee/
Tavaliselt pannakse repressor madala koopia<br />
arvuga plasmiidi (1-8 koopiat raku kohta) <strong>ja</strong><br />
promootor kõrge koopia arvuga plasmiidi (30-<br />
100 koopiat raku kohta). Repressori võib<br />
panna ka üksiku geenina bakteri kromosoomi.<br />
Valgu produktsiooni suurendamine<br />
Vektori pCP3 konstrueerimise näide. JOONIS<br />
Plasmiid pCP3 sisaldab pPLc2833 plasmiididst<br />
pärinevat p L promootorit <strong>ja</strong> ß-laktamaasi geeni<br />
(amp R resistentsuse geen) <strong>ja</strong> replikatsiooni<br />
origini plasmiidist pKN402<br />
pCP3 plasmiidi sisaldavaid bakterirakke<br />
kasvatatakse alguses 28°C juures <strong>ja</strong> seejärel<br />
tõstetakse temperatuur 42°C-ni. Madalamal<br />
temperatuuri on E. coli peremeesraku kromosomaalsesse<br />
DNA-sse integreeritud cI<br />
repressor, funktsionaalne, mille tagajärjel on p L<br />
promootor väl<strong>ja</strong> lülitatud <strong>ja</strong> plasmiidi<br />
koopiaarv normaalne. Kui tõsta temperatuur<br />
üles 42°C-ni siis temperatuuritundlik cI<br />
repressor inaktiveerub, mille tagajärjel lülitub<br />
sisse p L promootor <strong>ja</strong> tõuseb plasmiidi koopia<br />
arv. Seetõttu on pCP3 hea ekspressioonivektor.<br />
Large-Scale süsteemid<br />
Väikesemahuliste kultuuride puhul, (1–5 liitrit)<br />
on indutseerimine suhteliselt lihtne: näit. tõstes<br />
temperatuuri või lisades keemilist induktorit.<br />
<strong>Tööstuslik</strong>u toomise puhul on aga tegemist<br />
suurte mahtudega (20 – 200 liitrit pilootreaktorid)<br />
või (>200 liitrit tööstuslikud<br />
reaktorid) <strong>ja</strong> nende puhul ei tule selline<br />
temperatuuri tõstmine kõne alla, kuna see<br />
nõuaks liialt palju energiat <strong>ja</strong> võtaks palju<br />
aega. Samuti on keemilise induktori (IPTG)<br />
lisamine nii suures mahus ebama<strong>ja</strong>nduslik.<br />
Seetõttu kasutatakse kahe plasmiidi süsteemi,<br />
mille puhul cI repressor on pandud trp<br />
promootori kontrolli alla <strong>ja</strong> viidud madala<br />
koopia arvuga plasmiidi. Madala koopia<br />
arvuga plasmiid kindlustab, et cI repressori<br />
molekule ei saaks liialt palju. Meid huvitav<br />
geen on kloonitud teise plasmiidi p L<br />
promootori kontrolli alla.<br />
Kui söötmes ei ole trüptofaani siis on trp<br />
promootor sisse lülitatud <strong>ja</strong> toimub cI<br />
repressori süntees, mille tagajärjel on p L<br />
promootor väl<strong>ja</strong> lülitatud. Kui kasvusöötmes<br />
on aga trüptofaani, siis on olukord vastupidine.<br />
Trüptoon (söötme komponent) sisaldab<br />
efektiivse transkriptsiooni indutseerimiseks<br />
küllaldaselt trüptofaani. Seega saab suhteliselt<br />
odavalt manipuleerida geeni ekspressiooni ka<br />
suuremahulises kultuuris.<br />
Ekspressioon teistes mikroorganismides<br />
Ei ole universaalset vektorit ega ka promootorrepressor<br />
süsteemi, mis võimaldaks optimaal-<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
selt hästi ekspresseerida geene igasugustes<br />
erinevates peremeesorganismides.<br />
Teisalt on mitmesugused E. coli puhul<br />
kasutatud lähenemised <strong>ja</strong> strateegiad kasulikud<br />
ka teiste mikroorganismide juures.<br />
Kontrolliti ß-galaktosidaasi ekspressiooni<br />
erinevate promootorite alt erinevates gram<br />
negatiivsetes bakterites.<br />
Tulemused näitasid, et<br />
1. Kõik promootorid omasid teatud aktiivsust<br />
kõigis testitud bakterites<br />
2. E. coli-is oli kõige aktiivsem tac<br />
promootor. Samuti oli see kõige väiksema<br />
aktiivsusega promootor teistes mikroorganismides<br />
3. Nm promootor (neomütsiini resistentsuse<br />
geenilt) oli tugevuselt järgmine promootor<br />
E. coli-s <strong>ja</strong> kõige aktiivsem teistes testitud<br />
mikroorganismides.<br />
Seega kuigi E. coli promootorid ei ole teistes<br />
kõige tugevamad mikroorganismides, saab<br />
neid sõltuvalt rakendusest siiski kasutada.<br />
On proovitud ka konstrueerida universaalset<br />
promootorit transposoon 5 (Tn5) baasil.<br />
Fusion <strong>valgud</strong> (Liit<strong>valgud</strong>)<br />
Sageli on peremeesorganismis toodetavaid<br />
võõrvalke väga väikeses koguses. Paljudel<br />
juhtudel on põhjuseks võõrvalgu degradatsioon.<br />
Sellest ülesaamiseks liidetakse<br />
kloonitud geeni produkt stabiilse peremehe<br />
valguga. Taolist kombinatsiooni nimetatakse<br />
fusion valguks e. liitvalguks.<br />
Liitvalke konstrueeritakse DNA tasemel<br />
ligeerides kokku kahe geeni kodeerivad piirkonnad.<br />
Kõige lihtsamate fusionvektorite<br />
puhul inserteeritakse sihtmärk geen kloonitud<br />
peremehe geeni kodeeriva piirkonna sisse.<br />
Põhiline on kloonida geen õiges lugemisraamis<br />
<strong>ja</strong> seetõttu tuleb täpselt teada mõlema<br />
geeni nukleotiidseid järjestusi.<br />
Liitvalkude lahtilõikamine<br />
Sageli on liitvalgu peremeesraku poolse osa<br />
esinemine lõppproduktis ebasoovitav. Näiteks<br />
kui on va<strong>ja</strong> seda valku kasutada kliinilisel<br />
otstarbel. Samuti võib see mõjutada meid<br />
huvitava valgu bioloogilist aktiivsust.<br />
Üks võimalus liitvalgu ebasoovitava osa<br />
eemaldamiseks on lisada valgule väike<br />
aminohapete lõik, mida tuntakse ära<br />
spetsiifilise mittebakteriaalse proteaasi poolt.<br />
Selline liitmine tehakse samuti DNA tasemel.<br />
Liidetakse oligonukleotiid linker, mis kodeerib<br />
proteaasi äratundmissaiti. Näiteks liidetakse<br />
kloonitud geenile oligonukleotiid linker, mis<br />
kodeerib aminohappe järjestust Ile-Glu-Gly-<br />
Arg. Peale fusion valgu sünteesi <strong>ja</strong><br />
puhastamist kasutatakse verehüübimisfaktorit<br />
Xa ,et lõigata kloonitud produkt lahti peremees<br />
valgu järjestusest. Faktor Xa spetsiifiline<br />
4 http://www.biotech.ebc.ee/
proteaas, mis lõikab unikaalselt peptiidsidet<br />
Ile-Glu-Gly-Arg järjestuse C-terminaalses<br />
otsas. Kuna sellist peptiidjärjestust natiivsetes<br />
valkudes eriti sageli ei esine, siis saab seda<br />
mehhanismi kasutada ka üldisemalt.<br />
Liitvalkude kasutamine<br />
Teatud rakenduste <strong>ja</strong>oks võib liitvalk olla ka<br />
lõpp-produktiks.<br />
Liitvalke kasutatakse näit. rekombinantsete<br />
valkude puhastamise lihtsustamiseks. TAG<br />
konstruktid.<br />
Pärmi (S. cerevisiae) plasmiid, mis sisaldab<br />
inimese interleukiin-2 geeni, on liidetud<br />
markerpeptiid järjestusega (Asp-Tyr-Lys-Asp-<br />
Asp-Asp-Asp-Lys). Sellel on topeltfunktsioon<br />
vähendades ekspresseeritud interleukiin-2<br />
geeni produkti degradatsiooni <strong>ja</strong> võimaldades<br />
produkti puhastada.<br />
Seda 8 aminohappelist markerpeptiidi<br />
nimetatakse Flag-peptiidiks. Peale konstrukti<br />
ekspresseerimist pärmis puhastatakse<br />
sekreteeritud fusionvalk immuunoafiinsus<br />
kromatograafial, kus antikehad markerpeptiidi<br />
vastu on immobiliseeritud kand<strong>ja</strong>le. Peale<br />
puhastamist eraldatakse markerpeptiid veise<br />
intestinal enterokinaasiga.<br />
Inklusioonkehad<br />
Paljud E. coli <strong>valgud</strong> akumuleeruvad<br />
lahustumatute, intratsellulaarsete, bioloogiliselt<br />
inaktiivsete inklusioonkehadena. Väikeses<br />
koguses bioloogiliselt aktiivset valku saab<br />
neist küll kätte, kuid ekstraheerimine nõuab<br />
kallist <strong>ja</strong> aeganõudvat valkude lahustamist <strong>ja</strong><br />
ümbervoltimist. Kuna in vivo on sageli valkude<br />
lahustamatuse põhjuseks nende mittekorrektne<br />
voltimine, siis on mitmeid strateegiaid kuidas<br />
seda lahendada.<br />
Tioredoksiini kasutamine. 11.7 kDa valk mis<br />
jääb fusion valgu osana lahustuvaks isegi siis<br />
kui kuni 40% raku valgust sisaldab<br />
fusionvalku. Target geen kloonitakse E. coli<br />
plasmiidvektori MCS-i kohe tioredoksiini järgi<br />
p L promootori kontrolli alla. E. coli peremeesrakkudes<br />
on ka cI repressor (trp promootori<br />
kontrolli all) integreerituna kromosomaalsesse<br />
DNA-sse. Trüptofaani lisamisel hakatakse<br />
plasmiidi transleerima <strong>ja</strong> fusion valk koguneb<br />
eelistatult osmootselt aktiivsetesse saitidesse,<br />
mida nimetatakse adhesiooni tsoonideks E. coli<br />
peremeesraku tsütoplasma membraani sisepinnal.<br />
Lahustuv valk saadakse kätte osmootse<br />
šokiga. Puhta valgu saab kätte lõigates<br />
enterokinaasiga lahti.<br />
Tandeemsed geeniarrayd<br />
JOONIS<br />
Tavaliselt on geeniekspressiooni tase proportsionaalne<br />
transkribeeritud geenikoopiate<br />
arvuga peremeesrakus. Kui tõsta meid<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
huvitavat geeni sisaldavat plasmiidide arvu,<br />
siis saab loomulikult ka meid huvitavat valku<br />
rohkem. Plasmiidi koopiaarvu tõstmine on aga<br />
probleemne, sest lisaks meid huvitavale geeni<br />
järjestusele sisaldavad plasmiidid ka muid<br />
järjestusi. Seetõttu pole see parim lahendus.<br />
Seega tuleb tõsta geenikoopiate arvu madala<br />
koopiaarvuga plasmiidis.<br />
Kloneerimine AvaI saitide abil<br />
Kloneerimine sünteetiliste suunatud adapterite<br />
abil.<br />
Ekspressioonvektorite transleerimine<br />
Kuigi promootor võib olla hea, siis sellest tihti<br />
ei piisa kloonitud produkti maksimaalse<br />
saagise saamiseks. Väga oluline on samuti<br />
translatsiooni efektiivsus <strong>ja</strong> uue produkti<br />
stabiilsus.<br />
Prokarüoodi rakkudes ei ole erinevate mRNAde<br />
translatsioon sageli sama efektiivsusega.<br />
Seega mõnda valku võib saada sadu või<br />
tuhendeid koopiaid mõnda valku aga vaid<br />
üksikud koopiad.<br />
Selle olukorra põhjuseks võib osaliselt olla<br />
ribosoomi seostumissait (RBS). RBS on<br />
mRNA-s 6-8 nukleotiidiline sait, mis paardub<br />
komplementaarse järjestusega ribosoomi<br />
väikese subühiku RNA komponendis.<br />
JOONIS<br />
Üldiselt: mida tugevam on seostumine mRNA<br />
<strong>ja</strong> ribosomaalse RNA vahel seda efektiivsem<br />
on translatsiooni initsiatsioon. Sellepärast on<br />
paljud E. coli ekspressiooni vektorid on<br />
disainitud nii, et kloonitud geeni mRNA<br />
sisaldaks tugevat ribosoomi seostumissaiti.<br />
Tingimused<br />
1. Ribosoomi seostumissait peab olema<br />
täpsel kaugusel kloonitud geeni<br />
startkoodonist AUG.<br />
2. DNA järjestus, mis sisaldab ribosoomi<br />
seostumissaiti <strong>ja</strong> meid huvitava geeni<br />
esimesi koodoneid ei tohi sisaldada<br />
järjestusi, mis peale transkriptsiooni<br />
võivad moodustada sekundaarstruktuure e.<br />
luupe. Need takistavad mRNA interaktsiooni<br />
ribosoomiga. Seega iga<br />
kloonitud geeni puhul peaks olema selge,<br />
et RBS on õigel kohal <strong>ja</strong> mRNA<br />
sekundaarstruktuurid ei sega seondumist.<br />
On väl<strong>ja</strong> arendatud terve rida ekspressioon<br />
vektoreid, milles on nii transkriptsiooni kui ka<br />
translatsiooni signaalid kloonitud eukarüootsete<br />
geenide ekspresseerimiseks E. coli-s.<br />
Näit. pKK233-2 sisaldab Amp R geeni, tac<br />
promootorit, lacZ RBS-I, ATG startkoodonit,<br />
mis asub 8 nukleotiidi allpool RBS-ist <strong>ja</strong><br />
bakteriofaag λ transkriptsiooni terminaatoreid<br />
T1 <strong>ja</strong> T2<br />
Potentsiaalne probleem on nn. rakuline<br />
sobimatus. Tekib siis kui kloonitud geen<br />
5 http://www.biotech.ebc.ee/
kasutab koodoneid, mis on harvalt kasutusel<br />
peremees raku poolt. Sellisel juhul ei ole<br />
peremees rakul küllaldaselt tRNA-sid, nende<br />
harvade koodonite <strong>ja</strong>oks <strong>ja</strong> kloonitud geeni<br />
pealt saadav valgukogus jääb madalamaks kui<br />
loodetud. Võib kasutada kunstlikult<br />
sünteesitud geeni kui geeni produkt on väga<br />
tähtis <strong>ja</strong> sünteesida see niimoodi, et geen<br />
sisaldaks peremeesraku <strong>ja</strong>oks sobivamaid<br />
koodoneid. Seda nim. koodonite optimiseerimiseks.<br />
Valkude stabiilsuse tõstmine<br />
Normaalselt kasvavates rakkudes on erinevate<br />
valkude pool eluiga erinev ulatudes minutitest<br />
tundideni. Erineva stabiilsuse põhjus on<br />
disulfiidsildade moodustumine <strong>ja</strong> teatud<br />
aminohapete esinemine (või mitteesinemine)<br />
valgu N terminaalses otsas. Kui lisada sinna<br />
juba DNA kloonimise tasemel erinevaid<br />
aminohappeid varieerub valgu in vitro eluaeg<br />
suuresti. Valkudes on ka regioone, mis<br />
muudavad nad vastuvõtlikumaks proteolüütilisele<br />
degradatsioonile. Nim. PEST regioonid,<br />
seal on palju proliini (P) glutamiinhappe (E),<br />
seriini (S) <strong>ja</strong> treoniini (T) jääke. Mõnikord neid<br />
regioone kõrvaldatakse geneetiliste manipulatsioonide<br />
käigus, kuigi valgu enda funktsioon ei<br />
tohi sellest muutuda.<br />
Hapniku limitatsioonist ülesaamine<br />
E. coli <strong>ja</strong> ka teised mikroorganismid, mida<br />
kasutatakse võõrvalkude saamiseks va<strong>ja</strong>vad<br />
kasvuks hapnikku. Hapniku lahustuvus aga on<br />
vees (st. söötmes) piiratud. Kui rakkude<br />
tihedus kultuuris kasvab, siis saab lahustunud<br />
hapnik kiiresti otsa, rakkude eksponentsiaalne<br />
kasv aeglustub <strong>ja</strong> rakud lähevad statsionaarsese<br />
faasi. Selle käigus aga muutub rakkude<br />
metabolism <strong>ja</strong> mille tulemusel võivad<br />
rakusisesed proteaasid hakata toodetavat valku<br />
degradeerima.<br />
Proteaasi defektsete peremeesrakkude<br />
kasutamine<br />
Spetsiaalsete E. coli tüvede konstrueerimine,<br />
mis ei tooda proteolüütilisi ensüüme. Lihtne<br />
see pole sest E. coli-il on vähemalt 25 erinevat<br />
proteaasi <strong>ja</strong> ainult väheseid neist on uuritud<br />
geenide tasemel. Samuti on nende proteaaside<br />
funktsiooniks ebanormaalsete valkude degradeerimine<br />
<strong>ja</strong> seega on see funktsioon tähtis<br />
rakkude enda elutegevusele. On siiski<br />
konstrueeritud rakuliine, milles on defektsed<br />
üks või rohkem proteaasi.<br />
DNA integreerimine peremeesraku<br />
genoomi<br />
Iga plasmiid kujutab endast peremeesrakule<br />
metaboolset koormust, kuna rakk kasutab<br />
energiat nii plasmiidi replikatsiooniks kui ka<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
plasmiidi poolt kodeeritud valkude transkriptsiooniks<br />
<strong>ja</strong> translatsiooniks.<br />
Mida suurem on plasmiidi koopia arv, seda<br />
suurem on metaboolne koormus. Selle<br />
tulemusel kaotab sageli osa rakke <strong>ja</strong>gunemise<br />
<strong>ja</strong> kasvu vältel plasmiidi. Kuna need rakud<br />
tavaliselt kasvavad kiiremini, siis varsti nad<br />
domineerivad kultuuris <strong>ja</strong> kuna plasmiidi<br />
sisaldavate rakkude osa jääb järjest<br />
väiksemaks, siis langeb ka produkti saagis.<br />
Strateegiad kuidas seda olukorda vältida.<br />
Laborimastaabis saab teha antibiootikumide<br />
selektsiooni, mille puhul kultuuris kasvavad<br />
ainult need rakud, mis sisaldavad plasmiidi (<strong>ja</strong><br />
plasmiidis teatud antibiootikumi resistentsusgeeni).<br />
Seda on aga raske kasutada nii piloot<br />
katsetes rääkimata tööstuslikest protsessidest,<br />
kuna see on liialt kallis.<br />
Samuti on keskkonda vabastatavate<br />
geneetiliselt modifitseeritud mikroorganismide<br />
puhul oluline, et nad oleksid ühelt poolt<br />
efektiivsed kuid teiselt poolt ohutud. Seega ei<br />
tohi kloonitud DNA kaduma minna ega teistele<br />
mikroorganismidele üle kanduda.<br />
DNA sisestamine bakteri kromosoomi. Kui<br />
kloonitud geeni sisaldav DNA on<br />
bakterikromosoomi osa, siis on ta suhteliselt<br />
stabiilne <strong>ja</strong> säilib paljude generatsioonide<br />
vältel ilma selektiivse pressita.<br />
1. Kloonitav geen ei tohi sattuda (st.<br />
integratsioonisait ei tohi olla) peremehele<br />
olulise geeni sees.<br />
2. Sisestatav geen peaks olema reguleeritava<br />
promootori all.<br />
DNA sisestamiseks bakteri kromosoomi<br />
kasutatakse homoloogilist rekombinatsiooni.<br />
Võib kasutada ka kaheetapilist protsessi.<br />
Valgusekretsiooni tõstmine<br />
Kloonitud geenilt toodetud valgu stabiilsus<br />
sõltub sageli tema asukohast rakus. Näiteks on<br />
rekombinantne proinsuliin ca 10 x stabiilsem,<br />
kui ta on sekreteeritud (eksporditud) periplasmasse<br />
(ruum tsütoplasma <strong>ja</strong> välismembraani<br />
vahel) võrreldes tsütoplasmaga.<br />
Samuti on periplasmasse või söötmesse<br />
sekreteeritud valke kergem puhastada.<br />
Tavaliselt hoolitseb valgu ekspordi eest läbi<br />
membraanide spetsiaalne aminohappeline<br />
järjestus, mida nimetatakse signaalpeptiidiks.<br />
Mõnikord on võimalik lisada kloonitud geenile<br />
signaalpeptiidi kodeeriv järjestus, kuid see ei<br />
ole veel garantiiks et sekretsioon toimuks<br />
efektiivselt. Lisaks E. coli <strong>ja</strong> teised gramnegatiivsed<br />
mikroorganismid üldiselt ei<br />
sekreteeri valke keskkonda kuna neil on<br />
välismembraan.<br />
Kaks võimalust:<br />
6 http://www.biotech.ebc.ee/
1. Kasutada gram-positiivseid prokarüoote<br />
või siis eukarüoodi rakke, milledel<br />
mõlemal puudub välismembraan <strong>ja</strong> mis<br />
seetõttu saavad sekreteerida valke<br />
keskkonda.<br />
2. Kasutada gram-negatiivsete bakterite<br />
puhul insenergeneetikat<br />
Metaboolne koormus<br />
Kui sisestada peremeesorganismi võõrgeen siis<br />
sageli muudab see peremeesraku metabolismi<br />
nii et see mõjutab rakkude normaalset elu.<br />
Metaboolse koormuse põhjuseks võivad olla<br />
1. Plasmiidide koopia arvu suurenemise, mis<br />
nõuab täiendavaid raku energeetilisi<br />
ressursse plasmiidi replitseerimiseks,<br />
transkribeerimiseks <strong>ja</strong> translatsiooniks.<br />
2. Vähene hapniku kogus kasvusöötmes ei<br />
ole sageli küllaldane peremeesraku<br />
metabolismiks <strong>ja</strong> plasmiidide säilitamiseks<br />
<strong>ja</strong> ekspressiooniks.<br />
3. Valkude üleproduktsioon <strong>ja</strong> selle mõju<br />
teatud aminoatsüül-tRNA-dele<br />
4. Kui rakus tehakse võõrvalku <strong>ja</strong><br />
eksporditakse tsütoplasmast kas<br />
rakumembraanile või periplasmasse, siis<br />
võib see “ummistada” raku normaalsed<br />
eksporditeed <strong>ja</strong> takistada rakule oluliste<br />
valkude õiget lokalisatsiooni.<br />
5. Peremees rakud millesse on sisestatud<br />
sellele rakule mitte omased metaboolsed<br />
omadused, võib raku segi lüüa<br />
6. Võõrvalk võib peremeesrakus ise segada<br />
raku funktsioneerimist.<br />
REKOMBINANTSETE VALKUDE<br />
SAAMINE EUKARÜOOTIDES<br />
Mõningatel juhtudel on bakteriaalses süsteemis<br />
toodetud eukrüootsed <strong>valgud</strong> ebastabiilsed või<br />
ei oma bioloogilist aktiivsust. Samuti<br />
(vaatamata hoolsale puhastamisele) võivad<br />
bakteriaalsed ühendid osutuda toksilisteks.<br />
Põhimõtteliselt peavad kõik inimesel<br />
meditsiinilisel eesmärgil rakendatavad <strong>valgud</strong><br />
olema identsed naturaalsete valkudega nii<br />
nende biokeemilistelt, biofüüsikalistelt <strong>ja</strong> ka<br />
funktsionaalsetelt omadustelt. Prokarüootsed<br />
süsteemid ei ole kahjuks võimelised kõiki neid<br />
nõudmisi täitma, mille põhjuseks on enamasti<br />
posttranslatsiooniliste modifikatsioonide<br />
puudumine.<br />
1. Korrektne disulfiidsildade moodustumine.<br />
Seda reaktsiooni vahendab ensüüm<br />
disulfiidi isomeraas. Mittetäielikult<br />
volditud valk on ebastabiilne <strong>ja</strong> inaktiivne.<br />
2. Valgu prekursorite proteolüütiline<br />
lõikamine. Selleks et saada funktsionaalset<br />
valku kõrvaldatakse eellasvalgust teatud<br />
aminohappe järjestused.<br />
3. Glükosüülimine. See on põhiline<br />
modifikatsioon, mis annab valkudele<br />
© 2005 Biotehnoloogia õppetool – Dots. Ants Kurg<br />
stabiilsuse <strong>ja</strong> mõnedel juhtudel ka kindlad<br />
omadused. Enamus valkude glükosüülimisi<br />
toimub spetsiifiliste suhkrujääkide<br />
lisamisel seriinile või treoniinile<br />
(näit. O-liiteline glükosüülimine) või<br />
asparagiinile(näit. N-liiteline glükosüülimine).<br />
4. Valkudest olevatele aminohapetele teatud<br />
rühmade lisamine. Fosforüülimine,<br />
atsetüülimine, sulfateerimine, atsüülimine,<br />
γ-karboksüülimine, müristüliseerimine <strong>ja</strong><br />
palmitüleerimine.<br />
Kõigist neist eelpooltoodu modifikatsioonidest<br />
on prokarüootsed süsteemid kõige vähem<br />
võimelised läbi viima korrektset<br />
glükosüleerimist <strong>ja</strong> teatud rühmade lisamist<br />
aminohapetele valkudes.<br />
7 http://www.biotech.ebc.ee/
Change language