Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v ...
Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v ...
Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Základy</strong> <strong>imunologických</strong> <strong>metod</strong>:<br />
<strong>interakce</strong> <strong>antigen</strong>-<strong>protilátka</strong><br />
<strong>využití</strong> v laboratorních <strong>metod</strong>ách
Imunoglobuliny –<br />
membránově vázané a solubilní<br />
receptory
Epitopy<br />
• Antigen = částice rozpoznávaná protilátkou<br />
• Epitop (<strong>antigen</strong>ní determinanta) = část <strong>antigen</strong>u, na<br />
který se váže <strong>protilátka</strong>.<br />
• Většina <strong>antigen</strong>ů má více epitopů (multivalentní)<br />
• Většinou cukr nebo peptid.<br />
Fig. 2.9
Epitopy rozpozávané <strong>protilátka</strong>mi<br />
jsou obvykle lokalizovány na<br />
povrchu <strong>antigen</strong>u<br />
Fig. 2.8
Konformační vs. lineární<br />
epitopy<br />
Fig. 2.11
Epitopy<br />
heat, acid<br />
Konformační epitopy – zničení při denaturaci<br />
Lineární epitopy – neovlivněné denaturací
2 lehké řetězce<br />
-lambda (λ)<br />
-kappa (κ)<br />
2těžké řetězce<br />
Základní struktura<br />
imunoglobulinů<br />
Fig. 2.2
Základní struktura<br />
imunoglobulinů<br />
Fig. 2.2<br />
Fig. 2.2
Štěpení protilátek<br />
Antigen-binding Fragment<br />
(Fragment vážící protilátku)<br />
Crystallizable Fragment<br />
(krystalizovatelný fragmen
Třída imunoglobulinů (izotypy)<br />
H: γ µ δ α ε<br />
(IgG1 –4) (IgA1 –2)<br />
L-chain: κ or λ
Rozdíly mezi imunoglobuliny
Fyzikální vlastnosti<br />
imunoglobulinů
IgM<br />
• Membránově vázaný monomer and<br />
sekretovaný pentamer.<br />
•Prvnítřída protilátek syntetizovaná<br />
během ontogeneze a při imunitní<br />
odpovědi<br />
• Aktivace komplementu; aglutinace.<br />
•Může být transportována na slizniční<br />
povrch
IgG<br />
• Nejvyšší koncentrace v séru<br />
• 4 podtřídy: IgG1 - 4<br />
• Aktivace komplementu<br />
• Binds to Fcγ -receptors on neutrophils,<br />
macrophages and NK cells
• Obvykle dimer<br />
IgA<br />
•Sekreční IgA je dimer se sekreční<br />
komponentou<br />
• 2 podtřídy: IgA1 and IgA2<br />
•Nejčastější imunoglobulin ve slizničních<br />
sekretech<br />
• Neutralizace; Zabraňuje vazbě<br />
mikroorganismů na receptory<br />
• Není efektivní v aktivaci komplementu
IgE<br />
• Velmi nízká sérová koncentrace u<br />
zdravých lidí.<br />
• Koncentrace je vyšší u pacientů s<br />
parazitárními infekcemi a u pacientů s<br />
alergiemi<br />
• Váže se na receptory na žírných<br />
buňkách a bazofilech. Následuje<br />
degranulace a uvolňování zánětlivých<br />
mediátorů
IgD<br />
• Velmi nízká koncentrace v séru<br />
• Primárně nalézána spolu s IgM na<br />
naivních B buňkách<br />
• Neznámá funkce
Funkce imunoglobulinů
Funkce imunuglobulinů
Polyklonální vs. monoklonální<br />
protilátky<br />
• Polyklonální protilátky<br />
– Purifikace ze séra imunizovaných zvířat<br />
(koza, králík)<br />
– Proti mnoha epitopům, různe affinitní<br />
– Rozdíly mezi šaržemi<br />
• Monoklonální protilátky<br />
– Produkce imortalizovanými plazmatickými<br />
buňkami, většinou myší původ<br />
– Jedna specificita, definovaná afinita
Monoklonální protilátky<br />
• Imortalizace jednoho klonu B buněk produkujících určitou protilátku<br />
• Fúze B buněk s buňkami myelomu
Interakce <strong>antigen</strong> - <strong>protilátka</strong><br />
• Nekovalentní vazba:<br />
– Elektrostatická<br />
– Vodíkové můstky<br />
– Van der Waalsovy síly<br />
– Hydrofobní síly<br />
• Afinita: Síla <strong>interakce</strong> mei epitopem a<br />
jedním vazebným místem protilátky<br />
• Avidita: Suma všech interkací meyi<br />
protilátkou a <strong>antigen</strong>em
Crosreaktivita<br />
A B<br />
Antiserum vyrobené proti <strong>antigen</strong>u A reaguje také s <strong>antigen</strong>em B<br />
• Antigen A a B mají stejný epitop<br />
• Antigen A a B mají podobný (ale ne stejný) epitop
Metody, kde se využívájí protilátky<br />
Neznačený <strong>antigen</strong>/<strong>protilátka</strong><br />
• Precipitace<br />
• Aglutinace<br />
Značený <strong>antigen</strong>/<strong>protilátka</strong><br />
• Enzyme-linked immunosorbent assay<br />
(ELISA)<br />
• Radioimmunoassay (RIA)<br />
• Western blotting<br />
• Immunofluorescence<br />
• Průtoková cytometrie
Sensitivita <strong>metod</strong><br />
precipitace - 30 µg/ml<br />
aglutinace - 1 µg/ml<br />
radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml
Agregáty vzniklé interakcí multivalentních protilátek a multivalentních<br />
makromolekulárních <strong>antigen</strong>ů Precipitation reaction<br />
Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace<br />
nejkratší nebo precipitace nejvýrazněj ší, se nazývá<br />
optimální poměr a j e obvyke tvořen ekvivalentními<br />
množstvími <strong>antigen</strong>u a protilátky.
Precipitační reakce<br />
Ab + solubilní Ag Síť <strong>antigen</strong>ů a protilátek<br />
Precipitace<br />
Stanovení imunoprecipitace:<br />
vizuálně<br />
<strong>metod</strong>ami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení)<br />
Metody<br />
Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavce<br />
Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu<br />
•Radiální imunodifúze<br />
•Dvojitá difúze<br />
•Imunoelektroforéza
Radiální imunodifúze<br />
Protilátka je rozpuštěná v gelu;<br />
Ag je přidán do jamek<br />
Měření koncentrace různých sérových<br />
proteinů, např. hladiny imunoglobulinů
Ab a Ag difundují proti sobě<br />
Dvojitá difúze<br />
• Stanovení homogenity systému <strong>antigen</strong>-<strong>protilátka</strong><br />
• Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění<br />
• Používáno následně po purifikaci směsi <strong>antigen</strong>ů<br />
• Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými <strong>antigen</strong>y<br />
Identické<br />
Neidentické<br />
Částečně identické
Dvojitá difúze
Dvojitá difúze
Dvojitá difúze
Imunoelektoforéza<br />
Kombinace separace <strong>antigen</strong>ů elektroforézou s identifikací<br />
pomocí dvojité difúze<br />
detekce presence nebo absence proteinu v seru
Aglutinační reakce<br />
Ab + částicový Ag Aglutinace (shlukování)<br />
•Přímá aglutinace<br />
• Pasivní aglutinace<br />
• Aglutinační inhibice
Přímá aglutinace<br />
• Ag je přirozenou složkou částice<br />
• Např. testování pacientova séra na přítomnost<br />
protilátek proti určité bakterii:<br />
– Pacientovo serum je seriově ředěno do zkumavek<br />
s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou<br />
aglutinací určuje titr protilátky v séru
Přímá aglutinace<br />
• Stanovení protilátek proti erytrocytům<br />
• Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může<br />
být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG<br />
protilátky)<br />
• Řešení: Coombsův test - použití anti<br />
imunoglobulinového séra<br />
Eg. Detection of anti-Rh antibodies in the blood of an Rh- woman
Coombsův Test<br />
• Přímý: přidá se <strong>protilátka</strong> proti lidskému<br />
imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným<br />
krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou<br />
erytrocyty pokryty <strong>protilátka</strong>mi<br />
• Nepřímý: inkubuje se testované sérum s<br />
erytrocyty zdravého dárce. Incubate test serum<br />
with red blood cells. Promytí. přidá se Coombsovo<br />
činidlo.<br />
• stanovení Rh protilátek<br />
• diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz<br />
volných antierytrocytárních protilátek v plazmě<br />
(séru)
Přímý a nepřímý Coombsův test<br />
Měření<br />
vázané<br />
protilátky<br />
Měření sérové<br />
protilátky
Pasivní aglutinace<br />
• Aglutinace mezi protilátkou a solubilním<br />
<strong>antigen</strong>em vázaným na nesolubilní částici<br />
(latexová částice)<br />
• Mnohonásobně zvýšení citlivosti oproti<br />
precipitační reakce<br />
• Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních<br />
onemocnění<br />
– Diagnostika autoimunitní thyroitidy:<br />
Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit<br />
k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta<br />
- Diagnostika revmatoidní artritidy
Inhibice aglutinace<br />
• velmi citlivá <strong>metod</strong>a, umožňující detekci malých<br />
množství <strong>antigen</strong>u. Ag je navázán např. na latexové<br />
partikule a v testu je přítomná <strong>protilátka</strong> proti tomuto Ag,<br />
která aglutinuje.<br />
• Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje<br />
aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab.<br />
• Průkaz užívání drog (kokain, heroin).<br />
• Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice<br />
hemaglutinace sérovými <strong>protilátka</strong>mi může být využita k<br />
diagnostice (zarděnky, chřipka).
Hemaglutinace
• radioaktivní<br />
• fluorescenční<br />
• enzymatické<br />
Metody se značeným<br />
<strong>antigen</strong>em/protilátkou<br />
• Enzyme-linked immunosorbent assay<br />
(ELISA)<br />
• Radioimmunoassay (RIA)<br />
• Western blotting<br />
• Imunofluorescence<br />
• Průtoková cytometrie
Enzyme-linked<br />
immunosorbent<br />
Principle of<br />
assay<br />
ELISA/RIA<br />
(ELISA)<br />
1 2<br />
3 4<br />
1. Potažení jamek<br />
<strong>antigen</strong>em<br />
2. Přidání vzorku séra<br />
3. Přídání enzymem<br />
značené protilátky<br />
(anti-human IgG)<br />
4. Přidání substrátu<br />
5. Odečtení barevné<br />
reakce
Western blotting<br />
Western blot
Imunofluorescence<br />
Přímá–vazba značené protilátky<br />
Nepřímá<br />
• vazba primární protilátky a značené sekundární protilátky<br />
• k detekci autoprotilátek. Sérum pacienta se nechá reagovat se substrátem.<br />
(normální tkáň jiného pacienta nebo tkáň zvířecí nebo buňky standardních<br />
buněčných kult). Detekce navázaných protilátek pomocí značených<br />
sekundárních protilátek, specifických vůči jednotlivým třídám lidských<br />
protilátek.
Průtoková<br />
cytometrie
Průtoková cytometrie: stanovení<br />
CD4 T buněk
Monitoring CD4 T buněk u<br />
HIV pacienta
Change language