Predavanje 7 - PBF - Sveučilište u Zagrebu
Predavanje 7 - PBF - Sveučilište u Zagrebu
Predavanje 7 - PBF - Sveučilište u Zagrebu
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
15.4.2013.<br />
BIOTRANSFORMACIJE<br />
dr.sc. Ivana Radojčić Redovniković<br />
iradojci@pbf.hr<br />
7. predavanje<br />
Laboratorij za tehnologiju i primjenu stanica i biotransformacije<br />
Kačićeva 30<br />
Zavod za biokemijsko inženjerstvo<br />
Prehrambeno-biotehnološki biotehnološki fakultet<br />
<strong>Sveučilište</strong> u <strong>Zagrebu</strong><br />
Pekarski kvasac Saccharomyces<br />
cerevisiae kao reagens<br />
u organskoj kemiji<br />
• multienzimski sustav<br />
sposoban za<br />
provoñenje raznovrsnih<br />
reakcija → najčešće<br />
korišteni<br />
mikroorganizam<br />
1
15.4.2013.<br />
Industrijski mikroorganizam...<br />
• ne smije biti patogen<br />
• mora proizvoditi željeni<br />
produkt u visokom iskorištenju<br />
• mora brzo rasti na jeftinim<br />
hranjivim podlogama<br />
• poželjna mogućnost genetskih<br />
modifikacija<br />
IZVOR DUŠIKA<br />
IZVOR<br />
UGLJIKA<br />
PRODUKT<br />
IZMJENA<br />
TVARI<br />
NADH<br />
ATP<br />
DNA<br />
SUPSTRAT<br />
E<br />
PRODUKT<br />
DNA<br />
2
15.4.2013.<br />
• 1894. godine → Dumas prvi opisao reducirajuća svojstva<br />
kvasca na sintetskom supstratu → redukcija sumporova praha<br />
u H 2 S<br />
• 1921. godine izvedena jedna od prvih opisanih<br />
biotransformacija → aciloinska kondenzacija benzaldehida i<br />
acetaldehida<br />
O<br />
C<br />
benzaldehid<br />
H<br />
+<br />
H 3 C<br />
O<br />
H<br />
acetaldehid<br />
H<br />
C<br />
OH<br />
Saccharomyces<br />
COCH<br />
*<br />
3<br />
cerevisiae<br />
(R)-3-fenil-3-<br />
hidroksipropan-2-onon<br />
• do 1950-te<br />
godine objavljeno više od 160 znanstvenih radova<br />
o uporabi pekarskog kvasca kao reagensa u sintezi organskih<br />
spojeva<br />
• 1970-te<br />
godine opisana je sinteza enantiomerno čistih spojeva<br />
pomoću pekarskog kvasca<br />
• PREDNOSTI uporabe Saccharomyces cerevisiae<br />
enzimi kvasca i njihove aktivnosti vrlo su dobro istraženi<br />
jeftin<br />
lagan za rukovanje (može se uzgajat u nesterilnim uvjetima<br />
→ moguć uzgoj u standardnoj laboratorijskoj opremi)<br />
nije toksičan<br />
visok redukcijski potencijal → ne zahtijeva dodatak<br />
koenzima<br />
u odnosu na katalizatore koji se rabe u klasičnim organskim<br />
sintezama → manje zagañuje okolinu (biorazgradiv →<br />
reakcije koje katalizira izvode se u vodenim otopinama)<br />
3
15.4.2013.<br />
• NEDOSTACI uporabe Saccharomyces cerevisiae<br />
produktivnost mikrobnih konverzija obično je niska (većina<br />
neprirodnih supstrata su toksični za žive organizme → max.<br />
konc. 0,1 - 0,3 %)<br />
otežano izdvajanje željenog produkta → vodeni medij<br />
često sadržava stanične sastojke, nutrijente, metabolite i<br />
supstrat, koji se transformiraju u više od jednog produkta<br />
osobiti problem → skladištenje produkta unutar stanice<br />
umjesto da se izlučuje u medij<br />
selektivnost → supstrat se pod utjecajem enzima može<br />
podvrći privremenim transformacijama<br />
Danas se razmatraju problemi mehanizma i selektivnosti →<br />
postavljena općenita pitanja vezana uz biotransformacije<br />
pomoću stanica kvasca<br />
? reproducibilnost biotransformacije<br />
? uvjeti rada<br />
? enzimska aktivnost<br />
? selektivnost<br />
? prihvaćanje (ne)prirodnih supstrata<br />
? genetski izmjenjeni kvasci<br />
? izdvajanje proizvoda<br />
4
15.4.2013.<br />
1) Reproducibilnost biotransformacije<br />
• ne može se mjeriti s reproducibilnošću klasične organske sinteze<br />
• zahtjeva se<br />
uporaba istog soja kvasca<br />
uzgoj u istim uvjetima<br />
ista koncentracija biomase i supstrata<br />
• kod procesa biotransformacija redukcijom supstrata → brzina i<br />
stereokemija reakcija neznatno se razlikuju od soja da soja<br />
razlika proizlazi iz sposobnosti kvasca da proizvede dovoljnu<br />
količinu koenzima → ne zbog eventualnog nedostatka enzima<br />
koji odreñuje brzinu reakcije<br />
2) Uvjeti rada<br />
• faza mikrobnog rasta i biotransformacija su<br />
odvojene i svaka od njih se može zasebno<br />
optimirati<br />
a) izvor energije → ugljikohidrati (donori vodika za<br />
regeneraciju NAD(P)H), etanol (zamjena za ugljikohidrate<br />
→ ne dolazi do nakupljanja meñuprodukata)<br />
b) uporaba liofilizirane ili prešane kulture → bolji prinosi kod<br />
redukcije jednostavnih ketona<br />
c) imobilizacija kvasca → jednostavna regeneracija<br />
d) uporaba organskih otapala → mogu povećati prinos<br />
kada je supstrat/produkt slabo topljiv u vodi te smanjiti<br />
inhibiciju produktom → nema nepoželjnih hidroliza<br />
5
15.4.2013.<br />
Prikaz reakcijskog mehanizma regeneracije koenzima uz<br />
uporabu 1) ugljikohidrata i 2) etanola kao izvora energije<br />
1)<br />
ugljikohidrat<br />
etanol, CO 2 ,<br />
metaboliti<br />
NAD(P) +<br />
NAD(P)H<br />
R 1 OH<br />
C<br />
R 2 H<br />
R 1<br />
C O<br />
R 2<br />
2)<br />
etanol<br />
CO 2<br />
O 2<br />
NAD(P) +<br />
NAD(P)H<br />
R 1 OH<br />
C<br />
R 2 H<br />
R 1<br />
C O<br />
R 2<br />
Imobilizacija stanica kvasca<br />
• prednosti → višestruka uporaba biokatalizatora →<br />
jednostavnija izolacija produkta<br />
• nedostak → smanjenje katalitičke aktivnosti<br />
kvasca (niže iskorištenje transformacije) zbog<br />
1) otežane difuzije supstrata, kisika i izvora energije do<br />
stanice<br />
2) oštećenja stanice tijekom izvoñenja imobilizacije<br />
• imobilizacijom dolazi do promjena u<br />
stereoselektivnosti kvasca → tijekom provoñenja<br />
imobilizacije dolazi do promjene fizioloških,<br />
morfoloških i metaboličkih svojstava kvasca<br />
6
15.4.2013.<br />
3) Enzimska aktivnost stanica<br />
kvasca<br />
• od 1000 enzima nabrojanih u Handbook of<br />
Enzymes nekoliko stotina izolirano ih je iz<br />
pekarskog kvasca (prisutno još i više)<br />
• važno → identificirati pojedinačne enzime koji<br />
djeluju na supstrat<br />
na taj način dolazi do postavljanja eksperimentalnih<br />
uvjeta koji pogoduju djelovanju odreñenog enzima →<br />
povećanje aktivnosti<br />
4) Selektivnost<br />
• u biotransformacijama pomoću kvasca selektivnost<br />
je često niža od željene → najučinkovitije<br />
poboljšanje selektivnosti je modifikacija supstrata<br />
• slaba enantioselektivnost često je posljedica<br />
djelovanja više od jednog enzima na isti supstrat<br />
(isti afinitet ali različita stereoselektivnost)<br />
rješenje → selektivna inhibicja enzima (težak<br />
zadatak u ovako kompleksnom<br />
sustavu)<br />
7
15.4.2013.<br />
5) Prihvaćanje (ne)prirodnih supstrata<br />
Otapanje supstrata u<br />
netoksičnim otapalima<br />
koji se miješaju s vodom<br />
prije dodavanja u<br />
reakcijski medij (etanol,<br />
aceton, DMSO i dr.)<br />
Kristalični supstrat se usitni u<br />
čestice mikronske veličine<br />
Kemijski i fizički postupci sa<br />
stanicama → liofilizacija, dodatak<br />
detergenata, obrada lizozimom,<br />
osmotski šok, sonifikacija i dr.<br />
Dodatak<br />
površinski<br />
aktivnih tvari<br />
reakcijskom<br />
mediju<br />
Izvoñenje<br />
transformacije u<br />
dvofaznom<br />
sustavu vodaorgansko<br />
otapalo<br />
Transformacija uz nisku<br />
koncentraciju supstrata<br />
Netopljiv u<br />
reakcijskom<br />
mediju<br />
Utječe na<br />
vijabilnost i<br />
reprodukciju<br />
kvasca<br />
Postepeno dodavanje supstrata →<br />
kontinuirani ili polukontinuirani proces<br />
SUPSTRAT<br />
Promjena<br />
soja kvasca<br />
Ne može proći<br />
kroz staničnu<br />
membranu<br />
Kemijska<br />
modifikacija<br />
supstrata<br />
Pokazuje slabo<br />
iskorištenje, regio- i<br />
stereoselektivnost<br />
Provoñenje<br />
reakcije s<br />
izoliranim enzimom<br />
Genetske<br />
modifikacije<br />
kvasca<br />
Dodatak<br />
inhibitora ili<br />
induktora<br />
Promjena reakcijskih parametara<br />
• pH<br />
• temperatura<br />
• promjena sastava medija<br />
• promjena gustoće stanica<br />
6) Genetski modificirani kvasci<br />
• podrazumijeva<br />
► uvoñenje i ekspresiju stranih gena u stanici kvasca<br />
► selektivno uklanjanje odreñenih gena<br />
• teško je predvidjeti ponašanje modificiranih<br />
kvasaca u praktičnoj industrijskoj proizvodnji<br />
• primjer<br />
Baeyer-Villigerova oksidacija supstituiranih<br />
ciklopentanona/cikloheksanona<br />
8
15.4.2013.<br />
7) Izdvajanje produkta<br />
• u laboratorijskim uvjetima<br />
► kontinuirana ekstrakcija → moguće jedino kada se<br />
emulzija može razdvojiti sedimentacijom ili<br />
centrifugiranjem<br />
• u industrijskim mjerilima<br />
► izolacija male količine produkta iz velikog volumena<br />
vodenog medija vrlo je nepovoljna → može se jedino<br />
nadoknaditi visokom cijenom proizvoda<br />
REDUCIRAJUĆI ENZIMI<br />
PEKARSKOG KVASCA<br />
• stanice kvasca obiluju ovim enzimskim aktivnostima<br />
(oko 40 oksido-reduktaza)<br />
dehidrogenaze → stanica kvasca sadrži višestruke<br />
dehidrogenaze koje su sposobne prihvatiti neprirodne<br />
supstrate → vode do stvaranja kiralnog centra → najvažniji<br />
enzim je alkohol-dehidrogenaza<br />
(YADH)<br />
• prednost → ne zahtijeva dodatak koenzima<br />
1)koenzimi su skupi → moraju se dodati u stehiometrijskim<br />
količinama<br />
2)potrebna regeneracija koenzima konvencionalnim<br />
metodama ili drugim enzimskim reakcijama<br />
9
15.4.2013.<br />
ENZIM<br />
YADH (ADH I, ADH II, ADH III)<br />
Izocitrat-dehidrogenaza<br />
Enoat-reduktaza<br />
Glukoza-dehidrogenaza<br />
6-P-glukonat-dehidrogenaza<br />
Glukoza-6-P-dehidrogenaza<br />
Laktat-dehidrogenaza<br />
Acetoin-reduktaza<br />
Sukcinat-dehidrogenaza<br />
Glicerol-3-P-dehidrogenaza<br />
Malat-dehidrogenaza<br />
REAKCIJA KOJU KATALIZIRA<br />
Oksidacija alkohola u aldehide/ketone<br />
Oksidativna dekarboksilacija izocitrata u α-<br />
ketogluterat<br />
Redukcija C=C veze<br />
Oksidacija β-D-glukoze u glukono-δ-lakton<br />
Oksidacija 6-fosfoglukonata u ribulozu-5-P<br />
Oksidacija glukoze-6-P u 6-fosfoglukono-δ-lakton<br />
Redukcija piruvata u laktat<br />
Oksidacija acetoina u diacetil<br />
Dehidrogenacija sukcinata u fumarat<br />
Oksidativna dekarboksilacija α-ketogluterata u<br />
sukcinil-CoA<br />
Oksidacija glicerol-3-P u dihidroksiaceton-fosfat<br />
Redukcija karbonilne skupine u steroidima<br />
Oksidacija malata u oksalacetat<br />
Redukcija aldehida i ketona stanicama kvasca<br />
• enzimska reakcija pomoću kvasca koja se najviše<br />
primjenjuje → asimetrična redukcija prokiralne karbonilne<br />
skupine<br />
• jednostavni alifatski i aromatski ketoni reduciraju se prema<br />
Prelogovom pravilu i daju (S)-alkohole visoke optičke<br />
čistoće<br />
O<br />
R 1 R 2<br />
H -<br />
re-strana<br />
NADH<br />
α-ketogluteratdehidrogenaza<br />
Hidroksisteroiddehidrogenaza<br />
alkohol-<br />
dehidrogenaza<br />
H<br />
OH<br />
R 1 S * R 2<br />
Prelogov<br />
produkt<br />
enantiomerni višak je to veći što se bočni lanci više<br />
razlikuju (do 96%) !!!<br />
10
15.4.2013.<br />
• niska stereoselektivnost pojavljuje se zbog nekoliko razloga<br />
supstrat se može reducirati jedinstvenom oksidoreduktazom<br />
preko prijelaznog stanja za dva enantiomera<br />
ako se dva enzima, oba s velikom ali obrnutom<br />
stereokemijskom prednošću takmiče za isti supstrat → optička<br />
je čistoća produkta odreñena ena relativnim brzinama<br />
pojedinačnihnih reakcija, koje opet ovise o koncentraciji<br />
supstrata<br />
Rješenje → 1) modifikacija supstrata<br />
2) selektivna inhibicija jedne od konkurentnih<br />
dehidrogenaza ili uklanjanje gena koji<br />
kodiraju za te enzime<br />
Redukcija β-oksoestera (β-ketoestera) s<br />
pekarskim kvascem → u vodenim medijima<br />
• 1975. godine → prvi rad u kojem su opisane redukcije<br />
β-oksoestera<br />
u optički aktivne sekundarne alkohole<br />
O<br />
β<br />
α<br />
O<br />
etil-3-oksobutanoat<br />
Saccharomyces<br />
cerevisiae<br />
OC 2 H 5<br />
OH<br />
*<br />
O<br />
OC 2 H 5<br />
uočeno → pekarski kvasac<br />
reducira etil-3-<br />
oksobutanoat u S-izomer, , a<br />
etil-3-oksopentanoat<br />
u R-<br />
izomer<br />
produljenjem<br />
ugljikovodičnog lanca β-<br />
oksoestera mijenja se<br />
stereokemijski put →<br />
pekarski kvasac sadrži<br />
barem dvije<br />
oksidoreduktaze uključene<br />
u redukciju<br />
(S)-etil-3-<br />
hidroksibutanoat<br />
PRELOGOVO PRAVILO se ne može<br />
primjeniti na redukciju tih β-ketoestera !!!<br />
11
15.4.2013.<br />
• apsolutna konfiguracija kiralnog centra β-hidroksiestera može se<br />
usmjeriti modifikacijom supstrata s odgovarajućim esterima s kratkim ili<br />
dugačkim alkilnim lancima<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
* *<br />
O<br />
R 1 OR 2 R 1 OR R 2<br />
1 OR 2<br />
H<br />
R<br />
S<br />
β-ketoester<br />
H -<br />
β-hidroksiester<br />
O O β-hidroksiester<br />
O O<br />
R 1 OR 2<br />
R 1 OR 2<br />
H<br />
OH<br />
O<br />
H -<br />
• uporaba acikličkih β-hidroksiestera<br />
→ grañevni blokovi u<br />
organskoj kemiji (β-laktam, feromoni insekata, karotenoidi,<br />
kolesterol-antagonisti, antidepresivi, antitumorski spojevi i dr.)<br />
• mogući problem pri izvoñenju redukcije β-<br />
oksoestera u vodi<br />
hidroliza estera u etanol i odgovarajuće 3-okso li 3-<br />
hidroksikarboksilne kiseline → mogu se dalje metabolizirati u<br />
produkte → octena kiselina, aceton i CO 2<br />
potrebno reducirati hidrolitičke procese što je više<br />
moguće → pomoću inhibitora hidrolitičkih enzima ili<br />
genetskim modifikacijama (uklanjanje gena odgovornih<br />
za sintezu enzima s hidrolitičkom aktivnosti)<br />
ili<br />
provoditi redukciju u bezvodnom mediju<br />
12
15.4.2013.<br />
Redukcija β-oksoestera s pekarskim kvascem<br />
→ u organskim otapalima<br />
• prednosti uporabe organskih otapala (npr. benzen, dietil-eter,<br />
toluen)<br />
poboljšana je kontrola stereokemije produkta<br />
postignuta je mogućnost ostvarenja reakcija sa supstratima koji<br />
nisu topljivi u vodi<br />
olakšana je izolacija produkta<br />
nema nepoželjnih nusreakcija (hidroliza, racemizacija i dr.)<br />
• u ovim uvjetima potrebno je dodati vodu kako bi se zadržala<br />
katalitička aktivnost enzima<br />
enzim je potpuno hidratiziran kad je okružen s nekoliko slojeva<br />
molekula vode → djeluje kao mikroreaktor za enzim i zaštita od<br />
štetnih djelovanja organskih otapala<br />
• što je s regeneracijom koenzima?<br />
<br />
u organskim otapalime nema regeneracije koenzima →<br />
redukcija ovisi o količini raspoloživog NAD(P)H u kvascu<br />
<br />
povećanje količine kvasca → povećanje količine<br />
NAD(P)H → povećanje opsega redukcije<br />
• nedostaci uporabe organskih otapala<br />
<br />
<br />
toksičnost organskih otapala<br />
problem odlaganja nakon upotrebe<br />
13
15.4.2013.<br />
Redukcija nekih β-oksoestera u organskim otapalima i vodi<br />
SUPSTRAT<br />
HEKSAN<br />
pretvorba<br />
%<br />
e.e.<br />
%<br />
TOLUEN<br />
pretvorba<br />
%<br />
e.e.<br />
%<br />
VODA<br />
pretvorba<br />
%<br />
e.e.<br />
%<br />
Etil-piruvat<br />
100 100 (S) 80 100 (S) 100 93 (S)<br />
Etil-3-oksobutanoat<br />
100 93 (S) 100 100 (S) 100 96 (S)<br />
Etil-3-oksopentanoat<br />
100 77 (S) 66 76 (R) 100 2 (R)<br />
Etil-3-oksohaksanoat<br />
66 28 (R) 16 27 (R) 100 86 (S)<br />
Redukcija C=C veza s pekarskim kvascem<br />
• enantioselektivne redukcije prokiralnih C=C<br />
dvostrukih veza s enzimima mogu se postići s<br />
visokom specifičnošću i primjenjive su na velik niz<br />
supstrata<br />
• enzimi koji su odgovorni za te reakcije su NADH-<br />
ovisne enoat-reduktaze<br />
izolirane i karakterizirane → većina transformacija u<br />
preparativne svrhe izvodi se s cijelim mikrobnim<br />
stanicama zbog problema recikliranja koenzima i<br />
osjetljivosti enoat-reduktaze na tragove kisika<br />
14
15.4.2013.<br />
• stereokemijski tijek redukcije enoata pomoću pekarskog<br />
kvasca → trans-adicija vodika na C=C vezu<br />
• da bi enoat-reduktaza mogla dobro reducirati dvostruku vezu<br />
mora biti aktivirana elektron-donorskim supstituentima<br />
R<br />
E<br />
Cl<br />
COOMe<br />
α,β-nezasićeni ester<br />
pekarski<br />
kvasac<br />
(hidrolaza)<br />
R<br />
Cl<br />
COOH<br />
pekarski<br />
kvasac<br />
(enoat-<br />
reduktaza)<br />
R<br />
Cl<br />
*<br />
R<br />
COOH<br />
R<br />
Z<br />
Cl<br />
COOMe<br />
α,β-nezasićeni ester<br />
pekarski<br />
kvasac<br />
(hidrolaza)<br />
R<br />
Cl<br />
COOH<br />
pekarski<br />
kvasac<br />
(enoat-<br />
R<br />
reduktaza)<br />
R= C 2 H 5 , (CH 3 ) 2 CH, CHCl 2<br />
Cl<br />
*<br />
S<br />
COOH<br />
Pravila za asimetričnu hidrogenaciju C=C veze<br />
pomoću pekarskog kvasca<br />
<br />
<br />
<br />
reducirati se mogu samo C=C veze koje su aktivirane<br />
elektron-donorskim supstituentima<br />
α,β-nezasićene karboksilne kiseline i esteri lako se<br />
transformiraju u zasićene analoge<br />
α,β-nezasićeni aldehidi/ketoni općenito se transformiraju u<br />
dva stupnja<br />
1) redukcija C=C veze → nastaje zasićeni aldehid/keton<br />
2) redukcija karbonilne skupine zasićeniog<br />
aldehida/ketona u odgovarajući kiralni alkohol<br />
15
15.4.2013.<br />
Stvaranje C-C veze sa<br />
stanicama kvasca<br />
• u kvascu se eksprimiraju različiti enzimi koji kataliziraju<br />
stvaranje C-C veze (aldolaze, transketolaze, acetil-<br />
CoA-sintetaza i dr.)<br />
• biotransformacija neprirodnih supstrata nije moguća<br />
• piruvat dekarboksilaza<br />
katalizira prijenos C 2<br />
jedinice piruvata na<br />
acetaldehid →<br />
nastaje aciloin →<br />
ACILOINSKKA<br />
KONDENZACIJA<br />
Aciloinska kondenzacija<br />
piruvat-dekarboksilaza dobro prihvaćaja<br />
aromatske aldehide (benzaldehid,<br />
o-klorbenzaldehid) → ne prihvaća<br />
p-klor- i p-nitrobenzaldehid<br />
dobiveni aciloin može se<br />
reducirati u sljedećem<br />
stupnju enzimom<br />
dehidrogenazom u<br />
erythro-diol<br />
R 1<br />
O<br />
H<br />
R 2<br />
piruvatdekarboksilaza<br />
O<br />
COOH<br />
CO 2<br />
R 1<br />
R<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
dehidrogenaza<br />
R 2<br />
R 1<br />
(R)-α-hidroksiketon<br />
(aciloin)<br />
OH<br />
R 2<br />
piruvat-dekarboksilaza<br />
prihvaća α-okso-kiseline (C 2 -<br />
do C 4 -ekvivalenti mogu se<br />
prenijeti na različite aldehide)<br />
acilni anion prenosi se na si-stranu<br />
aldehidnog supstrata→ nastaje<br />
(R)-α-hidroksiketon (aciloin)→<br />
stereokemija prema Prelogovom<br />
pravilu<br />
16
15.4.2013.<br />
• ovisno o strukturi supstrata, glavne konkurentne reakcije su<br />
redukcija aldehida u odgovarajuće primarne alkohole<br />
(dehidrogenaze)<br />
• industrijska primjena aciloinske kondenzacije → prevoñenje<br />
aciloina u (-)-efedrin<br />
reduktivnom aminacijom<br />
+<br />
O<br />
O<br />
H<br />
pekarski<br />
kvasac<br />
benzaldehid<br />
CO 2<br />
OH<br />
O<br />
Me-NH<br />
2<br />
H 2 /Pt<br />
1-hidroksi-1-fenilpropan-2-on<br />
OH<br />
HN<br />
(-)-efedrin<br />
CH 3<br />
zasićenje α,β-nezasićenih dvostrukih veza (enoatreduktaze)<br />
2-metilamino-1-<br />
fenilpropan-1-ol<br />
H 3 C<br />
COOH<br />
2-oksopropanska kiselina<br />
Oksidacije sa stanicama kvasca<br />
• ograničena primjena<br />
oksidacijski potencijal pekarskog kvasca je<br />
ograničen<br />
biooksidacija alkohola u aldehide/ketone nije od<br />
velikog značaja (osim selektivne oksidacije<br />
poliola)<br />
oksidacija sulfida u sulfokside uspješno se<br />
proizvodi pomoću plijesni Aspergillus sp., Rhizopus<br />
sp. i Penicillium sp.<br />
17
15.4.2013.<br />
• rekombinantni pekarski kvasac (15 C) rabi se u<br />
Baeyer-Villigerovoj oksidaciji 2-, 3- ili 4-<br />
supstituiranih ciklopentanona i cikloheksanona u<br />
cikličke estere (laktone) → uvoñenje kiralnog<br />
centra u molekulu<br />
kvasac transformiran plazmidom u koji je kloniran gen<br />
koji kodira za enzim cikloheksanon-monooksigenazu,<br />
CHMO (iz Acinetobacter sp.)<br />
O<br />
O<br />
15 C<br />
O<br />
(CHMO)<br />
*<br />
R<br />
R<br />
4-alkilcikloheksanon<br />
Adicija vode na dvostruku vezu<br />
• u novije vrijeme objavljena je reakcija katalizirana<br />
pekarskim kvascem koja ima veliki sintetski značaj<br />
O<br />
O<br />
C<br />
pekarski<br />
kvasac<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
X<br />
X<br />
e.e. 90 – 95 %<br />
dehidrataza<br />
H 2 O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
C<br />
H<br />
dehidrgenaza<br />
NAD(P)H<br />
X = H 2 , O<br />
X<br />
18
15.4.2013.<br />
Hidroliza estera sa stanicama kvasca<br />
• u kvascu su prisutna tri enzima koja provode hidrollizu<br />
1) hidrolaza steroidnih estera<br />
2) hidrolaza triacilglicerola (lipaza)<br />
3) hidrolaza karbocikličkih estera (esteraza)<br />
• lipaze i esteraze komercijano su dostupne, jeftine i pokazuju<br />
visoku učinkovitost → uporaba pekarskog kvasca u hidrolizi<br />
estera nije našla primjenu<br />
• Iznimka je uporaba kvasca u rezoluciji različitih α-aminokiselina<br />
→ hidroliza N-acil-derivata etilnih estera<br />
NHAc<br />
H NHAc<br />
+<br />
R COOEt R COOEt<br />
R *<br />
40 %, 99 % ee<br />
N-acilni derivat<br />
N-acilni derivat<br />
etilnog estera<br />
etilnog estera<br />
AcHN<br />
R *<br />
S<br />
H<br />
COOH<br />
N-acilni derivat<br />
karboksilne kiseline<br />
Aktivacija<br />
liofilizirane ili<br />
prešane kulture<br />
dodavanje<br />
reaktanta<br />
(1 g / 5 L medij )<br />
inkubacija<br />
(miješanje ili<br />
potresivanje,<br />
trajanje 2-10<br />
dana)<br />
izdvajanje,<br />
pročišćavanje i<br />
identifikacija<br />
produkta<br />
(kemijske tehnike)<br />
izolacija<br />
produkta<br />
(ekstrakcija org.<br />
otapalom)<br />
uklanjanje<br />
biokatalizatora<br />
iz reakcijske<br />
smjese<br />
(filtracija)<br />
19
Change language