Molekularno-bioloÅ¡ke metode u mikrobioloÅ¡koj kontroli mesa i ...

tehnologija mesa UDK: 637.5.055:579.8 

Osniva~ i izdava~: Institut za higijenu i tehnologiju mesa, Beograd BIBLID: 0494-9846 

Molekularno-biolo{ke metode u mikrobiolo{koj 

kontroli mesa i proizvoda od mesa* 

Aleksandra Stjepanovi}, Brankica Markovi}, Slavica Veskovi}-Mora~anin 

S a d r ` a j: Patogeni hrane, uzro~nici razli~itih bolesti kod ljudi i ìvotinja, kao i bakterije kvara predstavljaju ozbiljan 

problem u celom svetu. Posledi~no, primena mikrobiolo{ke kontrole kvaliteta u industriji hrane, pa i industriji mesa, 

predstavlja meru koja ima za cilj minimiziranje rizika od infekcije patogenima iz hrane. Klasi~ne mikrobiolo{ke metode u 

identifikaciji patogena i bakterija kvara u mesu i proizvodima od mesa koriste adekvatne medijume neophodne za predoboga}enje 

i oboga}enje, izolaciju patogena na selektivnim podlogama, kao i njihovu konfirmaciju utvr|ivanjem njihovih morfolo{kih 

karakteristika i upotrebom biohemijskih i/ili serolo{kih testova. Ove, konvencionalne metode, zahtevaju intenzivan 

rad, dug vremenski period, a ipak, dobijeni rezultati ne moraju biti uvek pouzdani (kao {to je npr. slu~aj kod pokretljivih 

mikroorganizama koji ne podleù kultivaciji). U cilju prevazilaènja ovih nedostataka razvijene su brze i senzitivne metode za 

detekciju, identifikaciju i kvantifikaciju patogena poreklom iz hrane, uklju~uju}i i meso i proizvode od mesa. Te metode mogu 

se podeliti na imunolo{ke, bioluminiscentne i molekularno-biolo{ke metode. Molekularno-biolo{ke metode, iako se do sada 

jo{ uvek ne primenjuju u rutinskoj praksi, predstavljaju obe}avaju}u alternativu i mogu zameniti ili upotpuniti sada{nje referentne 

metode u ovoj oblasti. 

Klju~ne re~i: patogeni hrane, molekularno-biolo{ke metode, brzi testovi, biosenzori 

MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES IN MICROBIOLOGICAL CONTROL OF 

MEAT AND MEAT PRODUCTS 

A b s t r a c t: Foodborne pathogens that cause numerous illnesses and diseases in humans and animals, as well as 

spoilage bacteria, represent the serious problem worldwide. Consequently, microbiological quality control in the food industry, 

as well as in meat industry, is the measure that aims towards minimizing the risk of infection caused by food pathogens. 

Conventional microbiological techniques for detection of pathogenes and spoilage bacteria in meat and meat products, use 

suitable media necessary for the pre enrichment and enrichment, pathogen isolation on selective media, as well as their confirmation 

by determination of their morphological features and by employment of biochemical and/or serological tests. These, 

conventional methods, require intensive work, long time and, however, obtained results may be false (as for instance in viable 

microorganisms that cannot be cultivated). In order to overcome these problems, fast and sensitive detection methods have 

been developed. These methods can be divided into immunological, bioluminescent and molecular methods. Molecular biology 

methods, even though they are still rarely applied in the routine practice, are the promising alternative that can replace 

or be auditioned to current reference methods in this area. 

Key words: foodborne pathogens, molecular biology methods, rapid tests, biosensors. 

UVOD 

Bolesti uzrokovane trovanjem hranom ugroàvaju 

javno zdravlje {irom sveta i jedan su od najve- 

}ih uzroka obolevanja (Wallace i sar., 2000). Uporedo 

sa sve ve}om globalizacijom trì{ta, pove}anjem 

broja ljudi i intenziteta transporta, kao i zna- 

~ajnih promena u navikama konzumiranja hrane 

u~estalost pojavljivanja ovako izazvanih bolesti je 

zna~ajno pove}ana (Käferstein i sar., 1997). Danas 

je poznato preko 200 razli~itih bolesti koje su posledica 

konzumiranja mikrobiolo{ki neispravnih prehrambenih 

proizvoda, a njihovi simptomi variraju 

od blagog gastroenteritisa do sindroma koji predstavljaju 

pretnju po ìvot sa mogu}no{}u hroni~nih 

komplikacija (Mead i sar., 1999). 

Detekcija patogena i bakterija kvara u hrani 

predstavlja izazov usled ~injenice da su ti mikroorganizmi 

u hrani prisutni u malom broju, maskirani 

su njenim matriksom, a po brojnosti ih prevazilazi 

veliki broj autohtonih bakterija. Konvencionalne/ 

klasi~ne mikrobiolo{ke metode podrazumevaju 

upotrebu neselektivnih medijuma za predoboga}enje, 

selektivnih medijuma za oboga}enje i naknadnu 

potvrdu morfolo{kim, biohemijskim i/ili serolo{kim 

testovima. One, usled toga, zahtevaju dosta rada, 

dugo traju i nisu uvek pouzdane (npr. kod detekcije 

pokretljivih, nekulturelnih- VBNC formi bakterija). 

* Uvodno predavanje na Me|unarodnom 54. savetovanju industrije mesa, odrànom 18-20. juna 2007. godine u Vrnja~koj Banji 

AUTORI: Dr Aleksandra Stjepanovi}, Brankica Markovi}, dipl. biohem., dr Slavica Veskovi}-Mora~anin, Institut za higijenu i tehnologiju mesa, 

Beograd 

tehnologija mesa 48 (2007) 1-2, 123-130 

123


U cilju prevazilaènja ovih nedostataka razvijen je 

odre|en broj alternativnih, brzih metoda za detekciju, 

identifikaciju i kvantifikaciju patogena u hrani, 

{to je od posebnog zna~aja za industriju hrane. Naime, 

prehrambena indutsrija zahteva brè metode u 

cilju dobijanja adekvatne informacije o mogu}em 

prisustvu patogena u sirovinama i krajnjim proizvodima 

zbog kontrole procesa proizvodnje i pra}enja 

higijenske prakse u objektima za proizvodnju. Ove 

brze metode obezbe|uju ranu detekciju i enumeraciju 

mikroorganizama i mogu se podeliti na: modifikovane 

i automatizovane konvencionalne metode, 

bioluminiscentne, imunolo{ke i molekularne (Fung, 

2002; Scheu i sar., 1998). 

ISPITIVANJA KOJA SE BAZIRAJU NA 

DETEKCIJI NUKLEINSKIH KISELINA 

Metode koje se trenutno primenjuju za detekciju 

patogenih i mikroorganizama kvara u mesu i 

proizvodima od mesa naj~e{}e se baziraju na hibridizaciji 

nukleinskih kiselina ili reakciji lan~anog 

umnoàvanja (Polimerase Chain Reaction-PCR). 

Njima se mogu detektovati specifi~ni delovi DNK ili 

RNK molekula. Tehnike detekcije DNK su jednostavnije 

u pore|enju sa onima za detekciju RNK, 

me|utim postoji mogu}nost da ovi, DNK-bazirani 

metodi detekcije, daju pozitivne rezultate i kod detekcije 

DNK iz neìvih i/ili inaktivisanih bakterija. 

Zbog toga, detekcija neìvih i/ili inaktivisanih patogena 

predstavlja glavni problem kod direktne primene 

PCR tehnike, naro~ito kod onih ispitivanja koja 

ne uklju~uju prethodno oboga}enje uzorka. S 

druge strane, mRNK je manje stabilna u pore|enju sa 

DNK i zbog toga ima ve}i potencijal za vi{e specifi- 

~nu detekciju ìvih }elija populacija patogena u hrani. 

U zavisnosti od èljene specifi~nosti detekcije 

(specifi~nost na nivou roda, vrste, soja), mogu se 

kao ciljne sekvence koristiti razli~iti delovi genoma 

(Scheu i sar., 1998). 

HIBRIDIZACIJA NUKLEINSKIH 

KISELINA 

Hibridizacija nukleinskih kiselina predstvlja 

relativno brzu skrining tehniku za identifikaciju 

patogena u hrani. Ovaj metod moè se iskoristiti i za 

detekciju ciljnih patogena u medijumu za oboga- 

}enje. Princip ove reakcije je hibridizacija izme|u 

DNK ili RNK molekula prisutnih u ciljnom organizmu 

i DNK probe koja ima sekvencu kompelementarnu 

ciljnoj sekvenci (slika 1). DNK probe obi~no 

sadrè 15-30 nukleotida (Enne de Boer i Beumer, 

1999). Specifi~nost hibridizacione analize je u potpunosti 

kontrolisana nukleotidnom sekvencom probe. 

Prvi korak obuhvata lizu }elije i pre~i{}avanje 

da bi se dobila slobodna nukleinska kiselina koja 

moè hibridizovati sa DNK probom. Kada je hibrid 

formiran, mogu se koristiti razli~ite tehnike za njegovu 

detekciju. Direktna hibridizacija koristi radioaktivne 

i fluorescentne probe za hibridizaciju nukleinske 

kiseline u uzorku. Indirektna detekcija se odvija 

sa enzimskim reporterima na ~vrstim podlogama- 

membranama (nitrocelulozne ili najlonske) i 

polimerskim partikulama. U ovu svrhu naj~e{}e kori{}eni 

formati su Southern blot i dot blot formati 

kod kojih se ciljna nukleinska kiselina imobili{e na 

membrani, nakon separacije na elektroforetskom 

gelu (Southern blot) ili iz rastvora (dot blot) (Barbour 

i Tice, 1997). 

Danas na trì{tu postoji nekoliko komercijalnih 

sistema za detekciju patogena iz hrane kakav je 

Slika 1. Proces stvaranja hibridnog lanca 

DNK/RNK (www.accessexcellence.org) (a-b) 

denaturacija na oko 120 o C; (c-d) 

Proces renaturacije-hibridizacije 

Figure 1. Process of creating a hybrid strand of 

DNA/RNA (a-b) denaturation at about 120°C; 

(c- d) renaturation-hybridization process molecule 

i Gene-Trak koji koristi patogen-specifi~ne probe za 

vezivanje sa bakterijskim rRNK i kolorimetrijski 

sistem za detekciju specifi~nih proba – rRNK hibrida 

(Enne de Boer i Beumer, 1999). Molekuli rRNK 

se vrlo ~esto koriste kao meta u metodi hibridizacije 

zbog toga {to nude visok nivo osetljivosti, jer postoji 

veliki broj ciljnih kopija (>1000) u jednoj bakterijskoj 

}eliji. Nedostatak ovog, rRNK baziranog, 

metoda leì u njegovoj ograni~enoj specifi~nosti. 

Naime, vrste u bliskom srodstvu (npr. Listeria mo- 

124 tehnologija mesa 48 (2007) 1-2, 123-130

Molekularno-biolo{ke metode u mikrobiolo{koj kontroli ... Molecular Biology Techniques in Microbiological Control ... 

nocytogenes i Listeria innocua) dele visoko sli~ne 

rRNK sekvence i zbog toga nije mogu}a njihova 

diferencijacija. 

METODI AMPLIFIKACIJE 

Slika 2. Ciklus PCR reakcije 

(Tabitha Powledge, 2004) 

Figure 2. The cycle of the PCR reaction 

Zbog svoje ve}e senzitivnosti, molekularno- 

-biolo{ke metode koje uklju~uju korak amplifikacije 

postaju sve vi{e popularne. Najvi{e primenjivan 

metod amplifikacije je reakcija lan~anog umnoàvanja 

ili PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR je 

osamdesetih i devedesetih godina pro{log veka 

postao {iroko kori{}ena metoda za brzu i specifi~nu 

detekciju patogena prisutnih u hrani (Chen, 2003). 

U po~etku su se PCR analize koristile samo u istra- 

ìva~kim laboratorijama ali su poslednjih godina 

mnoge kompanije uvele komercijalno dostupne 

PCR sisteme za detekciju patogena hrane kakvi su 

Listeria monocytogenes, E.coli O157: H7 i Salmonella 

sp. (Scheu i sar., 1998). Ovi metodi su vi{e 

specifi~ni u pore|enju sa konvencionalnim, biohemijskim 

metodima za identifikaciju. 

U praksi se ~esto sre}emo sa ~injenicom da razli~ite 

komponente hrane, podloge za rast mikroorganizama 

i reagensi za izolaciju nukleinskih kiselina 

mogu redukovati ili ~ak blokirati reakciju amplifikacije. 

Ove komponente su uop{teno poznate kao 

inhibitori amplifikacije (Rossen i sar., 1992). Poznati 

inhibitori uklju~uju konstituente hrane (organske i 

fenolne komponente, glikogen, masti i jone kalcijuma), 

komponente iz okruènja (npr. fenolne komponente, 

te{ki metali), konstitutente bakterijskih }elija, 

neciljane nukleinske kiseline kao i laboratorijske 

kontaminente. Zato je neophodno izvr{iti pripremu 

uzorka- preamplifikaciju, tj. izvr{iti karakterizaciju i 

uklanjanje inhibitornih supstanci. Ovi postupci 

predstavljaju vaàn korak u pripremi uzorka za amplifikaciju 

u cilju obezbe|enja preciznosti reakcije 

(Wilson, 1997). Svrha koraka preamplifikacije je da 

se pove}a koncentracija ciljnog organizma do nivoa 

koji je neophodan za datu metodu i da se redukuju 

ili isklju~e supstance koje inhibiraju proces amplifikacije. 

Procedure preamplifikacije mogu biti biohemijske, 

imunolo{ke, fizi~ke ili fiziolo{ke (Rådström 

i sar., 2003). U praksi se najvi{e koriste PCR, 

RTi-PCR, MPCR i NASBA metodi amplifikacije. 

PCR je jednostavna, prilagodljiva, osetljiva, 

specifi~na i reproducibilna analiza. Svaki PCR ciklus 

sastoji se od tri faze (denaturacija, elongacija i 

terminacija), a u toku jedne PCR reakcije u proseku 

se odigra oko 40-tak ovakvih ciklusa (slika 2). U 

ovoj analizi koristi se DNK polimeraza, enzim koji 

umnoàva specifi~ne fragmente DNK molekula, 

upotrebom kratkih, sekvenca specifi~nih, oligonukleotida 

koji se dodaju reakciji (Tabitha Powledge, 

2004). Ovi oligonukleotidi se nazivaju prajmeri i 

imaju sekvence komplementarne ciljnim sekvencama 

u DNK molekulu mikroorganizma (tabela 1). 

Prvi i naj~e{}e kori{}en od ovih enzima je Taq DNK 

polimeraza (iz bakterije Thermus aquaitcus), ali se 

{iroko koristi i Pfu DNK polimeraza (iz Pyrococcus 

furiosus), usled njene visoke pouzdanosti tokom 

kopiranja DNK sekvence. Iako su ova dva enzima 

razli~ita, oni imaju neke zajedni~ke osobine koje ih 

~ine primenjivim u PCR reakciji: oni mogu stvarati 

nove lance DNK, koriste}i informaciju u uzora~koj 

DNK i prajmere, a tako|e su, {to je jako bitno, termostabilni 

(Valasek i Repa, 2005). 

Tabela 1. DNK prajmeri koji se koriste za detekciju patogena u hrani u PCR reakciji 

Table 1. DNA primers used for the detection of food pathogens i PCR reaction 

Organizam Ciljna sekvenca PCR proizvod Referenca 

Listeria monocytogenes listeriolizin O 520 bp Mengaud i sar., 1990 

Salmonella.spp. 1.8 kb HIND III 1179 bp Tsen i sar., 1994 

Campzlobacter jejuni flagelinski A gen 450 bp Oyfo i sar., 1992 

E.coli O157:H7 

H7, O157, eaeA, etilA, 

vt1, vt2 geni 

multipleks Paton i Paton, 1998 


125


Termostabilnost je neophodna jer se na po~etku 

svakog PCR ciklusa dvostruki lanac DNK denaturi{e 

do jednolan~ane forme ("topi se") primenom 

visoke temperature u reakcionoj tubi (93-96 o C). 

Temperatura na kojoj polovina DNK molekula postane 

jednolan~ana naziva se temperatura topljenja 

(Tm). Nakon hla|enja, nastupa druga faza PCR ciklusa 

koja se sastoji u vezivanju prajmera za specifi~ne 

komplementarne sekvence, sada jednolan~anog, 

ciljnog DNK molekula. Prajmeri spre~avaju 

te`nju razdvojenih lanaca DNK za ponovnim vezivanjem 

jonskim vezama i omogu}avaju DNK polimerazi 

da zapo~ne sintezu novog lanca. Ovo je 

faza vezivanja prajmera i odvija se na temperaturi 

od 65-75 o C. Tre}a faza PCR ciklusa je faza produènja 

lanca ili elongacija (na oko 72 o C) kod koje 

dolazi do vezivanja baza iz reakcione sme{e, komplementarnih 

ciljnoj sekvenci. Nakon ove faze, dolazi 

do odvajanja prajmera i obustavljanja produ- 

ètka lanca, a kao rezultat dobijaju se dve kopije 

èljenog segmenta DNK. 

PCR metodom se mogu amplifikovati geni 

specifi~ni za odre|enu taksonomsku grupu bakterija 

kao i geni odgovorni za virulentnost patogenih 

mikroorganizama (Bej i sar, 1994). Za brzu identifikaciju 

bakterijskih sojeva PCR metodom, nije 

neophodno dobijanje ~istih kultura kao {to je slu~aj 

sa konvencionalnim mikrobiolo{kim metodama 

(Rasmussen i sar., 1994). 

Nedostaci PCR metode odnose se na nemogu}nost 

razlikovanja DNK molekula koji poti~u od 

ìvih i mrtvih }elija, nemogu}nost dobijanja kvantitativne 

informacije (Rodríguez-Lázaro i Hernández, 

2006), kao i na vreme koje je potrebno za pravljenje 

gelova da bi se utvrdilo prisustvo/odustvo patogena 

prisutnih u hrani (Fung, 2002). Nadalje, sve komercijalno 

dostupne PCR analize jo{ uvek zahtevaju 

korak predoboga}enja uzorka jer se tako smanjuje 

rizik od dobijanja la`no pozitivnih rezultata – 

detekcija mrtvih mikroorganizama. Druga zna~ajna 

komponenta ovih komercijalnih analiza je uvo|enje 

internih pozitivnih kontrola koje ukazuju na PCR 

nedostatke. 

Multipleks PCR (MPCR) je metoda koja se 

upotrebljava za istovremenu identifikaciju nekoliko 

genskih sekvenci koje pripradaju istom patogenu ili 

poti~u iz me{avine razli~itih mikroorganizama 

(Chamberlain i sar., 1988). Glavna prednost multipleks 

PCR-a u odnosu na konvencionalni PCR je 

njegova nià cena. To se prvenstveno odnosi na 

smanjenje utro{ka odgovaraju}ih reaganasa kakav 

je i Taq DNK polimeraza. Prednost kori{}enja multipleks 

PCR-a u rutinskog dijagnostici, u odnosu na 

sisteme gde se nekoliko patogena analizira individualno, 

je i u kra}em vremenu koje je neophodno za 

pripremu uzorka kao i kra}em vremenu koje je potrebno 

za dobijanje rezultata. Reakciona sme{a koja 

se koristi u ovim sistemima naj~e{}e sadrì vi{e od 

~etiri para prajmera. 

Da bi se obezbedila specifi~nost sistema neophodno 

je dizajnirati prajmere duè od onih koji se 

koriste u konvencionalnoj PCR metodi i koji se karakteri{u 

ve}om temperaturom topljenja (Tm). Koncentracija 

magnezijuma, pored toga {to uti~e na 

specifi~nost reakcije, jedan je od najzna~ajnijih faktora 

kod PCR reakcije koji odre|uje njenu efikasnost 

(McPherson i Møller, 2000). Uop{teno, kod 

MPCR-a koncentarcija MgCl 2 

je ve}a od one koja 

se primenjuje u konvencionalnoj PCR reakciji. MPCR 

obi~no detektuje 16S rRNK gene (Rosselló-Mora i 

Amann, 2001). Ovaj gen je nekada nedovoljan za 

razlikovanje blisko srodnih vrsta (Normand i sar., 

1996; Torriani i sar., 2001), pa se onda detektuju i 

drugi geni da bi se osigurala visoka specifi~nost 

MPCR-a. 

Real-time PCR je jo{ jedna tehnika koja se 

bazira na PCR reakciji. Su{tinska prednost Real- 

-time PCR-a (RTi-PCR) je u tome {to precizno razlikuje 

i meri specifi~ne sekvence DNK u uzorku 

iako su one kvantitativno jako male. On istovremeno 

prati sintezu novih molekula tokom PCR 

reakcije u stvarnom vremenu (real time), upotrebom 

fluorescentne tehnologije (Heid i sar., 1996). Podaci 

se, zna~i, prikupljaju tokom PCR reakcije, a ne 

samo na kraju procesa, kao {to je to slu~aj kod konvencionalne 

PCR metode. Da bi se postiglo 

pra}enje DNK amplifikacije u stvarnom vremenu 

pribeglo se upotrebi fluorescentnih proba tokom PCR 

procesa (slika 3). Na trì{tu postoji nekoliko tipova 

ovih proba, a neke od njih su DNK vezuju}e boje 

(EtBr ili SYBR green I), sekvenca-specifi~ne fluorescentne 

oligonukleotidne probe (TaqMan probe), 

probe hibridizacije itd. (Valasek i Repa, 2005). 

Slika 3. RTi- PCR probe (Valasek i Repa, 2005) 

Figure 3. RTi- PCR probes 

Svaki tip ovih proba ima svoje jedinstvene 

karakteristike, ali je na~in delovanja prili~no jednostavan. 

U principu, one menjaju intenzitet fluo- 



rescencije tokom procesa amplifikacije DNK. 

SYBR Green I emituje hiljadu puta ve}u fluorescenciju 

kada je vezana za dvolan~anu DNK u odnosu 

na to kada se nalazi slobodna u rastvoru. Zato }e fluorescentni 

signal od SYBR Green I biti ve}i ukoliko 

se u uzorku nalazi ve}a koli~ina ciljnog DNK molekula. 

Glavne prednosti RTi-PCR-a su te {to je to 

format u zatvorenoj tubi (~ime se izbegava rizik od 

kroskontaminacije), analiza je brza i jednostavna, 

ekstremno je {irok dijapazon kvantifikacije i zna- 

~ajno je ve}a pouzdanost rezultata u pore|enju sa 

konvencionalnom PCR reakcijom. 

Najzna~ajniji zahtev RTi-PCR tehnologije je 

sposobnost detekcije fluorescentnog signala i snimanje 

nepredovanja PCR reakcije. Neophodna je 

energija za ekscitaciju i detekciju emisione talasne 

duìne. Energija ekscitacije se postiè posebnim 

lampama, svetlosnim diodama ili laserom, a detekcija 

se vr{i raznim tipovima fotodetektora. Nadalje, 

da bi se odigrala PCR reakcija potreban je i termocajkler 

koji postiè èljenu temperaturu zahvaljuju}i 

strujanju vazduha. Ovo je jo{ jedna osobina koja 

RTi-PCR razlikuje od konvencionalnog PCR-a kod 

koga se temperatura postiè zagrevanjem blokova, 

pa sam proces zagrevanja i hla|enja traje duè. Tako 

je za zavr{etak 40 PCR ciklusa tokom RTi-PCR-a 

potrebno 30 minuta za razliku od konvencionalne 

PCR reakcije tokom koje je za isti broj ciklusa potrebno 

1h i 45 minuta (Edwards i sar., 2004). Naravno, 

Real-time instrumentalizacija ne bi bila potpuna 

bez odgovaraju}eg kompjuterskog hardvera 

kao i softvera za prikupljanje i analizu dobijenih 

podataka. 

Rezultati RTi-PCR-a sastoje se od amplifikacionih 

krivih, koje se mogu koristiti za kvantifikaciju 

inicijalne koli~ine uzora~kih DNK molekula 

visoke preciznosti u {irokom dijapazonu koncentracija 

(Schmittgen i sar., 2000). Amplifikaciona kriva 

tipi~no predstavlja tri razli~ite faze (slika 4). Prva, 

ili faza inicijacije, odigrava se tokom prvog PCR 

ciklusa, gde se emitovana energija ne moè razlikovati 

od osnovne linije, potom sledi eksponencijalna, 

ili log faza, koja prati rast fluorescencije sve do 

poslednje, stacionarne faze kada dolazi do iscrpljenja 

reagenasa i nema detekcije fluorescencije (Rodríguez-Lázaro 

i Hernández, 2006). 

Slika 4. Amplifikaciona kriva za RTi-PCR 

Figure 4. Amplification curve for RTi-PCR 

Amplifikacija sekvenci nukleinskih kiselina – 

NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) 

je tehnika koja je prvi put opisana 1991. godine 

(Compton, 1991). Koristi se za kontinuiranu amplifikaciju 

nukleinskih kiselina pri izotermalnim 

uslovima. NASBA je osetljiv sistem baziran na transkirpcionoj 

amplifikaciji prilago|en detekciji delova 

RNK molekula (Deiman i sar., 2002). U ovoj 

reakciji se koriste tri razli~ita enzima (T7 RNK 

polimeraza, RNK-aza i reverzna transkriptaza pti- 

~ijeg mijeloblastoznog virusa – AMV) za amplifikaciju 

sekvenci jednolan~anog RNK molekula 


(Rodríguez-Lázaro i Hernández, 2006). Reakcija 

tako|e uklju~uje dva oligonukleotidna prajmera koji 

su komplementarni ciljnom regionu RNK molekula, 

dezorksiribonukleotidne trifosfate za aktivnost 

AMV reverzne transkriptaze i ribonukleozidne trifosfate 

za aktivnost T7 RNK polimeraze. Reakcija 

se odvija na temperaturi od 41oC u trajanju od 1-2h. 

Na ovoj temperaturi genomska DNK ostaje dvolan- 

~ana i tako ne moè postati substrat za amplifikaciju. 

Tokom NASBA reakcije generi{e se 10-100 kopija 

ciljne sekvence RNK molekula u svakom ciklusu, 

tako da se nakon 4-5 ciklusa dobije oko milion 

127


kopija ciljne sekvence (Compton, 1991). Broj ciklusa 

u NASBA reakciji je znatno manji u pore|enju 

sa konvencionalnom PCR metodom kod koje je potrebno 

oko 20-tak ciklusa da se dobije 1x109 

molekula tokom reakcije (Chan i Fox, 1999). 

Obzirom da je NASBA, kao i ostale molekularno-biolo{ke 

tehnike, instrumentalna tehnika, ona 

moè dati la`no pozitivne rezultate (Knowk i Higuchi, 

1989). Naj~e{}i uzrok dobijanja la`no pozitivnih 

rezultata je slu~ajna kontaminacija uzoraka ili 

reagenasa (kros-kontaminacija) u laboratoriji. Ovaj 

problem se moè prevazi}i uvo|enjem internih kontrola 

amplifikacije – IAC (Internal Amplification 

Controls) (Hoorfar i sar., 2004). IAC su neciljane 

sekvence nukleinskih kiselina koje se simultano amplifikuju 

sa ciljnom sekvencom (Cone i sar., 1992). 

Kada se reakciji doda IAC uvek }e se dobiti kontrolni 

signal iako u uzorku nije prisutna ciljna sekvenca 

(Rodriguez- Lazzaro i Hernandez, 2005). Ukoliko 

se ovaj signal ne pojavi zna~i da reakcija nije 

uspela. 

NASBA tehnika je obe}avaju}e dijagnosti~ko 

sredstvo za detekciju pokretljivih mikroorganizama 

jer se bazira na detekciji i umnoàvanju RNK molekula. 

Obzirom da NASBA ima podjednaku brzinu 

i ta~nost kao i PCR, a pored toga ima i prednost u 

smislu da detektuje samo ìve patogene, ona predstavlja 

obe}avaju}i laboratorijski metod u mikrobiologiji 

hrane. 

METODE SUBTIPIZACIJE MOLEKULA 

Metodi subtipizacije koji se koriste za diferencijaciju 

sojeva (ili subtipova) bakterija kvara ili 

patogena u mesu i proizvodima od mesa nalaze sve 

ve}u primenu u laboratorijskoj praksi budu}i da su 

brzi, precizni i efikasni, te pomaù u procesu pra- 

}enja prenosa bolesti prenosivih hranom. Uop{teno, 

metodi subtipizacije bakterija mogu se podeliti na 

one bazirane na fenotipu i molekularno-geneti~ke, 

odnosno DNK bazirane metode (Wiedmann, 2002). 

Naj~e{}e kori{}eni DNK-bazirani metodi subtipizacije 

za bakterijske patogene uklju~uju profilisanje 

plazmida, elektroforezu u pulsiraju}em elektri~nom 

polju (PFGE), ribotipizaciju, amplifikaciju 

polimorfizma duìne fragmenta (AFLP), nasumi~nu 

amplifikaciju polimorfne DNK (RAPD), kao i 

druge metode kakve su npr. tipizacija multilokusnih 

sekvenci (MLST). Ovi metodi obezbe|uju osetljivu 

diskriminaciju sojeva i ve}i nivo standardizacije i 

reproducibilnosti u odnosu na fenotip-bazirane 

metode (serotipizacija, biotipizacija, multilokusna 

elektroforeza enzima) (de Boer i Beumer, 1999; van 

Belkum i sar., 2001). 

Elektroforeza u pulsiraju}em elektri~nom 

polju PFGE (Pulsed Gel Field Eelectrophoresis) 

karakteri{e bakterije u subtipove daju}i odgovaraju}e 

DNK sekvence nakon digestije bakterijske genomske 

DNK restrikcionim enzimima. Tokom ovog 

postupka, bakterijska DNK se izdvaja i kasnije iseca 

enzimima do DNK fragmenata. Ovi enzimi vr{e isecanje 

DNK na mestima gde je prisutna kratka, specifi~na 

sekvenca. Restrikcioni enzimi daju od 8-25 

bendova - traka DNK molekula koji sadrè od 40 do 

600 kilobaznih parova - kb. (Weidmann, 2002). Obzirom 

na to da se fragmenti DNK molekula ove veli~ine 

ne mogu razdvajati standardnim elektroforetskim 

tehnikama, koristi se posebna tehnika elektroforeze. 

Tokom elektroforeze, menja se smer elektri~nog 

polja, pa se tako postiè razdvajanje DNK 

fragmenata koji se kasnije vizueliziraju bojenjem 

etidijum bromidom. Ovako dobijeni fragmenti upore|uju 

se sa ve} postoje}om bazom podataka i na taj 

na~in se utvr|uje stepen srodnosti prou~avanog bakterijskog 

soja. Naime, tokom kontinualne elektroforeze, 

DNK fragmenti veli~ine preko 30-50 kb 

migriraju istom brzinom bez obzira na veli~inu, {to 

se na gelu uo~ava kao jedna difuzna traka. Me|utim, 

ukoliko su fragmenti DNK primorani da menjaju 

smer kretanja tokom elektroforeze, fragmenti 

razli~itih veli~ina bi}e me|usobno razdvojeni. Sa 

svakom novom preorjentacijom elektri~nog polja, 

manji DNK fragmenti }e po~eti da se kre}u u novom 

smeru brè nego oni ve}e molekularne mase. 

Usled toga, ve}i DNK fragmenti zaostaju iza, obezbe|uju}i 

separaciju od manjih DNK fragmenata. 

PFGE subtipizacija pokazuje visok nivo diskriminacije 

u detekciji bakterijskih patogena hrane 

i usled toga predstavlja zlatni standard u laboratorisjkog 

dijagnostici (Swaminathan i Feng, 1994). 

Ribotipizacija je jo{ jedna od DNK baziranih 

metoda subtipizacije tokom koje se prvo bakterijska 

DNK iseca na fragmente restrikcionim enzimima. 

Za razliku od restrikcionih enzima koji se koriste 

tokom PFGE reakcije i seku DNK u ve}e fragmente, 

tokom ribotipizacije genomska DNK se iseca u 

mnogo manjih fragmenata (vi{e od 300-500) veli- 

~ine od 1-30 kb. Tako dobijeni fragmenti se razdvajaju 

po veli~ini elektroforezom na agaroznom gelu. 

U kasnijem, Southern blot koraku, DNK probe se 

specifi~no vezuju za DNK fragmente koji sadrè gene 

koji kodiraju sintezu ribozomalne RNK (rRNK). 

Usled toga, ciljni fragmenti su samo oni DNK fragmenti 

koji sadrè rRNK gene (Bruce, 1996). 

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphysm) 

je nedavno razvijena tehnika genotipizacije 

koja se zasniva na selektivnoj amplifikaciji 

restrikcionih fragmenata DNK molekula (Vos i sar., 

1995). Tehnika uklju~uje tri koraka: isecanje DNK i 



vezivanje oligonukleotidnih adaptera, selektivnu 

amplifikaciju setova restrikcionih fragmenata i elektroforezu 

amplifikovanih fragmenata. Metoda omogu}ava 

da se 50-100 restrikcionih fragmentata analizira 

simultano na denaturi{u}em poliakrilamidnom 

gelu. 

BIOSENZORI 

Biosenzori su ure|aji koji detektuju biolo{ke 

ili hemijske komplekse i deluju po principu antigenantitelo, 

enzim-substrat ili receptor-ligand. Ve}ina 

biosenzora dizajniranih za detekciju patogena u hrani 

testirana je samo na ~istim bakterijskim kulturama. 

Za ovakve aplikacije patogeni su prvo izolovani 

iz hrane a potom podvrgnuti analizi biosenzorom. 

Bilo je svega nekoliko poku{aja da se detektuju patogeni 

direktno iz hrane, ovom metodologijom i to 

predstavlja izuzetan izazov. Nadalje, populacije ciljnih 

mikroorganizama su izuzetno male u pore|enju 

sa onima koji se prirodno nalaze u hrani i koji ne 

predstavljaju pretnju za zdravlje potro{a~a. Usled 

toga, primenjuju se razli~ite strategije za detekciju 

tako malog broja patogenih mikroorganizama direktno 

iz hrane. 

Povr{inski plasmon rezonantni senzor je 

opti~ki sensor koji ima sposobnost da detektuje momenat 

vezivanja biomolekula u stvarnom vremenu 

(nekoliko sekundi ili minuta) bez obeleàvanja molekula 

tako {to detektuje razlike u intenzitetu svetlosti 

koja se reflektuje sa osvetljene povr{ine. Kada 

do|e do vezivanja, to uslovljava menjanje ugla refleksije 

svetlosti sa medijuma {to rezultira stvaranjem 

signala. Iako se ova metoda najvi{e koristi za 

detekciju ìvih }elija E. coli O157:H7, Salmonella i 

Listeria, on je na{ao i svoju primenu za detekciju 

malih molekula toksina kakvi su stafilokokni i botulinum 

toksin. 

DNK biosenzori na{li su svoju primenu usled 

prou~avanja interesantnog svojstva DNK molekula 

u pogledu njegovih hemijskih i fizi~kih osobina. 

DNK biosenzor je dijagnosti~ki ure|aj koji imobili{e 

jednolan~ani DNK molekul na odgovaraju- 

}em matriksu u cilju detektovanja hibridizacionog 

signala nakon izlaganja komplementarnom DNK 

molekulu (Lu i sar., 2000; Mandrell i Wachtel, 

1999). Ciljni mikroorganizam moè biti detektovan 

hibridizacijom specifi~ne sekvence na povr{ini 

transducera (Davis i sar., 2005). Iako su postojale 

dileme oko porekla sposobnosti provodljivosti 

DNK molekula, zaklju~eno je da DNK moè posluìti 

kao elegantan model za jednodimenzionalni 

transport elektrona (Kavita Arora i sar., 2006). Veliki 

je broj materijala od kojih se izra|uju matriksi 

koji sluè za vezivanje DNK molekula kakvi su 

grafit, zlato, platina, ugljena elektroda itd. (Cha i 

sar., 2003; Wang i Zhou, 2002). Ovaj vid detekcije 

ima nekoliko prednosti kakve su: laka imobilizacija 

DNK (fizi~ka ili elektrohemijska), smanjeno vreme 

odgovora, ve}a stabilnost i osetljivost, ure|aj se 

lako transportuje itd. 

UMESTO ZAKLJU^KA 

Unapre|enja na polju imunologije, molekularne 

biologije, automatizacije i kompjuterske tehnologije 

i dalje }e imati pozitivne efekte na razvoj 

brzih, osetljivih i pouzdanih metoda za detekciju 

patogenih i bakterija kvara u hrani. Molekularnobiolo{ki, 

DNK-bazirani metodi detekcije patogena 

hrane, naro~ito PCR, mogu postepeno zameniti konvencionalne 

metode za detekciju. Naravno, postoji 

jo{ uvek mnogo problema koji se moraju re{iti, 

kakvi su npr. priprema uzorka, eliminacija efekata 

prouzrokovanih nespecifi~nim vezivanjem i kros 

hibridizacijom kao i jo{ ve}a osetljivost celokupnog 

sistema. Me|utim, potencijal molekularno-biolo- 

{kih metoda je skoro revolucionaran. 

Nadalje, biosenzori predstavljaju novu eru u 

detekciji patogenih i bakterija kvara u hrani. Veruje 

se da }e, sa budu}im razvojem biosenzora i napretkom 

u modernoj biotehnologiji, mikrobijalni 

biosenzori imati obe}avaju}u i svetlu budu}nost. 

LITERATURA 

Barbour, W.M., Tice, G., 1997. Genetic and immunologic 

techniques for detecting foodborne pathogens and toxins. 

In: Doyle, M.P., Beuchat, L.R., Montville, T.J. 

(Eds.), Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers, 

ASM Press, Washington DC, 710-727; 

Bej, A.K., Mahbubani, M.H., Boyce, M.J., Atlas, R.M., 1994. 

Detection of Salmonella spp. In oysters by PCR. Appl. 

Environ. Microbiol. 60, 368-373; 

Bruce, J., 1996. Automated system rapidly identifies and characterizes 

microorganisms in food. Food technology, 50, 

77-81; 


Cha, J., Han, J.I., Choi, Y., Yoon, D.S., Who, K., Lim, G., 

2003. DNA hybridization electrochemical sensor using 

conducting polymer, Biosensors and Bioelectronics, 18, 

1241-1247, 2003; 

Chan, A.B., Fox, J.D., 1999. NASBA and other transcriptionbased 

amplification methods for research and diagnostic 

microbiology. Rev. in Med. Microbiol., 10, 185-196; 

Chen, J., 2003. Contemporary monitoring methods. In R.H. 

Schmidt and G.E. Rodrick (Eds.), Food safety handbook 

(chapter 11). Hoboken, NJ: John Wiley &Sons, 

Inc.; 

129


Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., Nguyen, P.N., 

Caskey, C.T., 1988. Deletion screening of the Duchenne 

muscular dystrophy locus via multiplex DNA 

amplification. Nucleic Acids Res. 16, 11141-11156; 

Compton, J., 1991. Nucleic acid sequence-based amplification. 

Nature 350, 91-92; 

Cone, R.W., Hobson, A.C., Huang, M.L., 1992. Coamplified 

positive control detects inhibition of polymerase chain 

reactions. J. Clin. Microbiol. 30, 3185-3189; 

Davis, F., Nabok, A.V., Higson, S.P.J., 2005. Species differentiation 

by DNA - modified carbon electrodes using an 

ac impedimetric approach, Biosensors and Bioelectronics, 

Vol 20,1531-1538; 

de Boer Enne, Beumer, R.R., 1999. Methodology for detection 

and typing of foodborne microorganisms. International 

Journal of Food Microbiology 50, 119-130; 

Deiman, B., van Aarle, P., Sillekens, P., 2002. Characteristics 

and applications of nucleic acid sequence-based amplification 

(NASBA). Mol. Biotechnol. 20, 163-179; 

Edwards, K., Logan, J., Saunders, N., 2004. Real-time PCR: 

an Essential Guide. Norfolk, UK: Horizon Bioscience; 

Fung, D.Y.C., 2002. Predictions for rapid methods and automation 

in food microbiology. J. AOAC Int. 85,1000-1002; 

Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., Williams, P.M., 1996. 

Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994; 

Hoorfar, J., Malorny, B., Abdulmawjood, A., Cook, N., 

Wagner, M., Fach, P., 2004. Practical considerations in 

design of internal amplification control for diagnostic 

PCR assays. J. Clin. Microbiol.42,1863-1868; 

Kavita Arora, Subhash, C., Malhotra, B.D., 2006. Recent developments 

in bio-molecular electronics techniques for 

food pathogens. Analytica Chimica Acta 568, 259-274; 

Käferstein, F.K., Motarjemi, Y., Bettcher, D.W., 1997. 

Foodborne disease control: a transnational challenge. 

Emerging Infect. Dis. 3, pp. 503-510; 

Knowk, S., Higuchi, R., 1989. Avoiding false positivies with 

PCR. Nature 339, 237-238; 

Lu, H., Zhao, Y., Ma, J., Li, W., Lu, Z., 2000. Coll. Surf. A: 

Physicochem. Eng. Aspects 175,147; 

Mandrell, R., Wachtel, M.R., 1999. Novel detection techniques 

for human pathogens that contaminate poultry. 

Current Opinion Biotech. 10(3), 273-278; 

McPherson, M.J., Møller, S.G., 2000. Reagents and instrumentation. 

PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, 

23-60; 

Mengaud, J., Vicente, M.F., Chenevert, J., Pereira, J.M., 

Geoffroy, C., Gicquel-Sanzey, B., Baquero, F., Perez- 

Diaz, J.C., Cossart, P., 1988. Expression in Echerichia 

coli and seqeunce analysis of listeriolysin O determinant 

of Listeria monocytogenes. Infection and Immunity, 

56,4,766- 772; 

Mead, P.S., Slutsker, L., Griffin, P.M., Tauxe, R.V., 1999. 

Food-related illness and death in the United States. 

Emerging Infect. Dis. 5, 607-625; 

Normand, P., Ponsonnet, C., Nesme, X., Neyra, M., Simonet, 

P., 1996. ITS analysis of prokaryotes. Molecular Microbial 

Ecology Manual. Kluwer Academic Publishers, 

Dordrecht, 1-12; 

Oyofo, B.A., Thornton, S.A., Burr, D.H., Trust, T.J., Pavlovskis, 

O.R., Guerry, P., 1992. Specific detection of 

Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by using 

polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 

30, 2613-2619; 

Paton, A.W., Paton, J.C., 1998. Detection and characterization 

of shiga toxigenic Echerichia coli by using multiplex 

PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterochemorrhagic 

E.coli hlyA, rfbO11 and rfbO157. Journal of Clinical 

Microbiology, 36, 598-602; 

Powledge Tabitha, M., 2004. The polymerase chain reaction. 

Advan Physiol Educ 28, 44-50; 

Rasmussen, H.N., Rasmussen, O.F., Andersen, J.K., Olsen, 

J.E., 1994. Specific detection of Yersinia enterolytica 

by two step PCR using hot-start and DMSO. Molleculer 

and cellular probes, 8, 99-108; 

Rodríguez-Lázaro, D., Hernández, M., 2006. Molecular methodology 

in food microbiology diagnostics: trends and 

current challenges, IUFoST 2006 DOI: 10.1051/ 

IUFoST:20060643, Article available at http://iufost. 

edpsciences.org or http://dx.doi.org/10.1051/IUFoST: 

20060643; 

Rosselló-Mora, R., Amann, R., 2001. The species concept for 

prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 25, 39-67; 

Rådström, P., Knutsson, R., Wolfs, P., Dahlenborg, Löfström, 

Ch., 2003. Pre-PCR processing of sampling. In: 

Sachse, K. and Frey, J. (Eds.) Methods in Molecular 

Biology: PCR detection of microbial pathogens. Humana 

Press, Totowa, USA, 31-50; 

Rossen, L., Norskov, P., Holmstorm, K., Rasmussen, O.F., 

1992. Inhibition of PCR by components of food samples, 

microbial diagnostic assays and DNA-extraction 

solutions. Int. J. Food Microbiol. 17, 37-45; 

Scheu, P.M., Berghof, K., Stahl, U., 1998. Detection of pathogenic 

and spoilage microorganisms in food with the 

polymerase chain reaction. Food Microbiol. 15,13-31; 

Schmittgen, T.D., Zakrajsek, B.A., Mills, A.G., Gorn, V., 

Singer, M.J., Reed, M.W., 2000. Quantitative reverse 

transcription-polymerase chain reaction to study 

mRNA decay: comparison of endpoint and real-time 

methods. Anal. Biochem. 285, 194-204; 

Swaminathan, B., Feng, P., 1994. Rapid detection of foodborne 

pathogenic bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 48, 

401-426; 

Torriani, S., Felis, G.E., Dellaglio, F., 2001. Differentiation of 

Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum 

by recA gene sequence analysis and multiplex 

PCR assay with recA gene-derived primers. Appl. Environ. 

Microbiol. 67, 3450-3454; 

Tsen, H.Y., Liou, W., Lin, C.K., 1994. Possible use of polymeraze 

chain reaction method for the specific Salmonella 

in beef. Journal of fermentation and Bioengineering, 

77, 137-143; 

Valasek, M.A., Repa, J., 2005. The power of real-time PCR. 

Advan Physiol Educ 29, 151-159; 

van Belkum, A., Struelens, M., de Visser, A., Verbrugh, H., 

Tibayrenc, M., 2001. Role of Genomic Typing in Taxonomy, 

Evolutionary Genetics, and Microbial Epidemiology. 

Clinical Microbiology Reviews Vol. 14, No. 

3, 547-560; 

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Rijans, M., van de Lee, T., 

Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, 

M., Zabeau, M., 1995. AFLP: a new technique for 

DNA fingerprinting. Nucleic Acid Res. 23, 4407-4414; 

Wang, J., Zhou, F., 2002. Scanning Electrochemical Microscopic 

Imaging of Surface-Confined DNA Probes and 

Their Hybridization via Guanine Oxidation, J. Electroanal. 

Chem., 537, 95-102; 

Wallace, D.J., Van Gilder, T., Shallow, S., Fiorentino, T., 

Segler, S.D., Smith, K.E., Shiferaw, B., Etzel, R., 

Garthright, W.E., Angulo, F.J., FoodNet Working 

Group., 2000. Incidence of Foodborne Illnesses Reported 

by the Foodborne Diseases Active Surveillance 

Network (FoodNet)-1997. J. Food Prot. 63, 807-809; 

Wilson, I.G., 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid 

amplification. Appl. Environ. Microbiol., 63, 3741-3751; 

Wiedmann, M., 2002. Molecular subtyping methods for 

Listeria monocytogenes. J. AOAC Int. 85, 524-531. 

Rad primljen: 17.04.2007.

Molekularno-bioloÅ¡ke metode u mikrobioloÅ¡koj kontroli mesa i ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?