Филогенетическая систематика прокариот - ГБОУ ВПО ...

ГОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА
ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ»
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМАТИКА ПРОКАРИОТ
Методические рекомендации для студентов,
обучающихся по специальности 020209.65 - Микробиология
Уфа 2011

УДК 579.23.252.8.06 (07)
ББК 52.649я7
Ф54
Филогенетическая систематика прокариот: Методические
рекомендации для студентов, обучающихся по специальности 020209 –
Микробиология / Составители: Ан.Х.Баймиев, Ал.Х.Баймиев,
А.Р.Мавзютов – Уфа, 2011. – 19с.
Настоящие методические рекомендации предназначены для
студентов, обучающихся по специальности 020209 – Микробиология.
Создано с целью обеспечения адекватной оценки современного
состояния систематики бактерий.
Рекомендовано в печать Координационным научно-методическим
советом и утверждено решением Редакционно-издательского совета (РИС)
ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет Росздрава».
Рецензенты:
А.В.Чемерис, д.б.н., профессор, заместитель директора Учреждения
Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского
научного центра РАН;
Ю.В.Вахитова, д.б.н., ведущий научный сотрудник Учреждения
Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского
научного центра РАН.
© ГОУ ВПО Башкирский государственный
медицинский университет Росздрава, 2011
2

Введение
Систематика (таксономия) — наука о многообразии и
взаимосвязях между организмами. Одна из задач систематики —
распределение (классификация) множества организмов по группам
(таксонам). Таксон по определению - группа организмов, обладающих
заданной степенью однородности. Но прежде чем осуществлять такое
распределение, необходимо достаточно полно охарактеризовать объекты и
на основании отобранной информации идентифицировать их. Последнее
может привести к выявлению организмов с неизвестными или известными
признаками и соответственно помещению их в новый таксон на
определенном уровне или же отнесению к известным таксонам.
Для характеристики организмов используют разнообразные
признаки: морфологические, цитологические, культуральные,
физиологические, биохимические, иммунологические и др. Если объем
информации для характеристики объектов по существу беспределен, как
бесконечен сам процесс познания природы, то для целей идентификации
может быть использован ограниченный объем информации, достаточный
для распределения организмов по таксономическим группам.
Специальный раздел таксономии — номенклатура — имеет дело с
правилами присвоения наименований описанным объектам. В систематике
бактерий для наименования объекта используют биномиальную
номенклатуру К. Линнея (К. Linne, 1707—1778), согласно которой
биологическому виду присваивают название, состоящее из двух слов:
первое определяет принадлежность организма к определенному роду,
второе — виду. Названия бактериям присваивают в соответствии с
правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий.
Основной таксономической категорией является вид. По
современным представлениям, вид — это группа близких между собой
организмов, имеющих общий корень происхождения и на данном этапе
эволюции характеризующихся определенными морфологическими,
биохимическими и физиологическими признаками, обособленных отбором
от других видов и приспособленных к определенной среде обитания.
Важным признаком, определяющим принадлежность организмов к
одному виду, является их способность скрещиваться и давать
жизнеспособное потомство. Однако у прокариот размножение половым
путем отсутствует, поэтому данный признак для определения видовой
принадлежности к ним неприменим. Отнесение прокариотных организмов
к одному или разным видам осуществляется в большой степени
эмпирическим путем на основе анализа многих признаков, при этом
генетическая информация, содержащаяся в нехромосомных генетических
элементах, для определения видовой принадлежности не используется.
Виды объединяют в таксоны более высокого порядка - роды, роды -
в семейства, далее следуют порядки, классы, отделы, царства. Для высших
таксономических категорий пока нет удовлетворительного определения.
3

В микробиологии употребляются такие термины, как "штамм" и
"клон". Под штаммом понимают бактериальные культуры одного вида,
выделенные, например, из разных мест обитания. Различия между
штаммами не выходят за пределы вида. Клон - еще более узкое понятие,
это культура, выделенная из одной клетки.
Существуют 2 типа систематики биологических объектов:
филогенетическая, или естественная, в основе которой лежит
установление родственных (генетических, эволюционных) связей между
организмами, и практическая, или искусственная, цель которой -
выявление степени сходства между организмами для быстрой их
идентификации и установления принадлежности к определенным
таксонам. Если существующая систематика высших организмов отражает
в определенной мере эволюционные связи между ними, т. е. признаки,
используемые для выявления степени сходства, отражают и степень
родства между этими организмами, то попытка создания на этой же основе
систематики прокариот не была успешной.
Практическая или искусственная систематика прокариот
Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариотных
организмов решается с помощью Определителя бактерий Берги,
выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с
привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных
групп бактерий. Первое издание определителя было выпущено в 1923 г.
группой американских бактериологов под руководством Д. X. Берги (D. H.
Bergey, 1860 — 1937); девятое издание в 4 томах вышло в 1984 — 1989 гг.
В девятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные
организмы, отнесенные в царство Prokaryotae, разделены на 33 группы.
Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, как правило,
относятся к категории легко определяемых и вынесены в названия групп,
например: грамотрицательные аэробные палочки и кокки (группа 4),
анаэробные грамотрицательные кокки (группа 8), грамположительные
палочки и кокки, образующие эндоспоры (группа 13), скользящие
бактерии, образующие плодовые тела (группа 24). Основная идея
классификации "по Берги" — легкость идентификации бактерий. Для
осуществления этого используют совокупность признаков:
морфологических (форма тела; наличие или отсутствие жгутиков;
капсулы; способность к спорообразованию; особенности
внутриклеточного строения; окрашивание по Граму), культуральных
(признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой
культуры), физиолого-биохимических (способы получения энергии;
потребности в питательных веществах; отношение к факторам внешней
среды; нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в
молекуле ДНК; наличие и характер минорных оснований в ДНК;
нуклеотидный состав рибосомальной РНК; последовательность
аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).
4

Для девятого издания Определителя бактерий Берги характерен
отказ от построения классической иерархической системы классификации.
Она заменена списком упомянутых выше групп и сохранилась только
фрагментами. Краткая характеристика этих групп дана в следующем
разделе. Ценность определителя в том, что он представляет собой
наиболее полную сводку известных бактериальных форм и самое
современное пособие для идентификации бактерий.
В этом же руководстве предложена схема деления царства
Prokaryotae на высшие таксоны (отделы, классы). В основу деления на
отделы положено строение клеточной стенки. Название и краткая
характеристика отделов и классов представлены в таб.1.
Таблица 1
Деление царства Ргоkагуоtае на высшие таксоны (Murray, 1984)
Отдел I.
Gracilicutes
Включает
организмы с разной
морфологией,
имеющие грамотрицательную
клееточную
стенку.
Размножение в
основном бинарным
делением, в
некоторых группах
– почкованием, в
одной – множественным
делением.
Спор не
образуют. Многие
подвижны: с
помощью жгутиков
или скольжения.
Аэробные, аназробные
или факультативно
аназробные
формы. Отдел
подразделяется на 3
класса, объединяющие
нефотосинтезирующие
(Scotobacteria) и
фотосинтезирующи
е
(Anoxyphotobacteria
, Oxyphotobacteria)
организмы
Отдел II.
Firmicutes
Входят организмы
с грамположительной
клеточной
стенкой. Размножаются
в основном
бинарным делением.
Некоторые
образуют зндоспоры.
У других
споры на гифах или
в спорангиях.
Перемещаются с
помощью жгутиков.
Большинство
неподвижны. В
состав отдела
входят азробные,
анаэробные,
факультативно
анаэробные формы.
В зависимости от
морфологии
предложено
деление на 2 класса:
Firmibacteria (кокки,
палочки,
неветвящиеся нити)
и
(ветвящиеся
формы)
Thallobacteria
Отдел III.
Tenericutes
Относятся
прокариоты, у
которых
отсутствует
клеточная стенка
и
не
синтезируются
предшественники
пептидогликана.
Клетки окружены
ЦПМ,
чрезвычайно
плеоморфны.
Размножение
бинарным
делением,
почкованием,
фрагментацией.
Окрашивание по
Граму
отрицательное.
Характерно
образование
мелких,
врастающих в
агар колоний.
Могут быть
сапрофитами,
паразитами или
патогенами.
Представлены
одним классом
Mollicutes
Отдел IV.
Mendosicutes
Объединены прокариоты,
по имеющимся
данным, претендующие
на более
раннее происхождение,
чем формы, включенные
в 1 и 11 отделы.
Клетки раз-ной формы:
кокки, палочки, нити.
Многие плеоморфны.
Большинство имеют
клеточную стенку, но
она не содержит
типичного пептидогликана.
Клеточная
стенка может быть
построена только из
белковых макромолекул
или гетерополисахаридов.
Окрашивание
по Граму отрицательное
или положительное.
Большинство
– строгие аназробы.
Многие имеют
жгутики. Характеризуются
экологическим и
метаболическим
разнообразием, способностью
жить в
экстремальных условиях.
Объединены в
класс Archaeobacteria
5

Представленная в Определителе бактерий Берги система
классификации является строго идентификационной и не решает задачи
выявления эволюционных связей между прокариотами. В то же время
конечной целью является построение такой системы, в основе которой
лежали бы родственные связи между прокариотными организмами.
Филогенетическая или естественная систематика прокариот
Важный шаг на пути создания естественной систематики прокариот
связан с успехами молекулярной биологии. В 60-х гг. было установлено,
что все свойства организма определяются уникальными химическими
молекулами — ДНК, поэтому бактерии могут быть классифицированы
путем сравнения их геномов. По такому признаку, как генетический
материал, оказалось возможным на основании выявления степени сходства
делать вывод о степени родства между организмами. Первоначально для
таксономических целей сравнивали молярное содержание суммы гуанина
и цитозина (ГЦ) в процентах от общего количества оснований ДНК у
разных объектов. Этот показатель у прокариот колеблется от 25 до 75%.
Однако ГЦ-показатель дает возможность только для грубого сравнения
геномов. Если организмы имеют одинаковый нуклеотидный состав ДНК,
возможно и сходство и различие между ними, поскольку генетическое
кодирование основано не только на определенном содержании оснований
в единице кодирования (триплете), но и на их взаимном расположении.
Колебания нуклеотидного состава ДНК у эукариотных
микроорганизмов (молярная доля, %): грибы — 26 — 70, водоросли — 37
— 68, простейшие — 22 — 68; у высших растений и животных — 35 — 45.
Колебания в составе оснований ДНК вирусов приблизительно такие же,
как у прокариот.
Более тонкий метод оценки генетического сходства организмов —
сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК из разных источников
методом ДНК-ДНК-гибридизации. Метод наиболее полезен для
классификации на уровне вида, т. е. в случае высокой степени гомологии,
и мало информативен для классификации объектов на уровне высоких
таксонов. В то же время часто несовпадение выводов, сделанных на
основании фенотипических признаков и ДНК-гибридизации. В целом
значение данных о строении ДНК для систематики прокариот огромно, так
как позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о
степени родства между организмами.
Помимо анализа молекул ДНК для установления степени родства
между прокариотными организмами разработаны методические подходы,
позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в
клетке одинаковые функции. Это могут быть белки (ферредоксины,
цитохромы и др.) или рРНК. С использованием последних в качестве
филогенетических маркеров связано крупное открытие, позволяющее поновому
взглянуть на систему живого мира.
6

Выбор рРНК для решения проблем эволюционной систематики
прокариот оказался удачным по ряду причин: эти молекулы обнаружены у
всех клеточных форм жизни, что указывает на их древнейшее
происхождение; их функции всегда одинаковы; первичная структура в
целом характеризуется высокой консервативностью. Особенностью рРНК
является нахождение вне сферы действия отбора, поэтому данные
молекулы эволюционируют в результате спонтанных мутаций,
происходящих с постоянной скоростью, и накопление таких мутаций
зависит только от времени. Таким образом, мерой эволюционного
расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в
молекулах сравниваемых рРНК.
Известно, что в рибосомах прокариот и эукариот присутствуют 3
типа рРНК, различающихся молекулярной массой и коэффициентом
седиментации. Информационная емкость крупных молекул больше, но их
труднее анализировать. Поэтому наиболее удобным оказался анализ
молекул рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот),
состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. К настоящему
времени последовательности 16S и 18S рРНК изучены более чем у 400
организмов, принадлежащих к разным царствам живой природы.
Для выявления генетических расстояний между бактериями,
позволяющими делать определенные выводы о принадлежности штаммов
к тем или иным видам, необходима разработка специальных подходов к
изучению и паспортизации таких близкородственных штаммов бактерий.
Решением проблемы может служить применение для этих целей ряда
методов молекулярной биологии, способных с довольно высокой
чувствительностью на генетическом уровне выявлять различия
исследуемых микроорганизмов.
Для филогенетического анализа микроорганизмов удобным является
схема (рис.1.), ранее разработанная в лаборатории молекулярной биологии
и биотехнологии УфНЦ РАН для анализа клубеньковых бактерий. Данная
схема состоит из следующих этапов:
1. Выделение чистых культур микроорганизмов;
2. Выделение тотальной ДНК микроорганизмов;
3. RAPD анализ;
4. ERIC-, BOX-, REP-PCR, ПДРФ анализ гена 16S и/или 23S
генов рРНК;
5. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S
рРНК;
6. Сравнительный анализ полученных нуклеотидных
последовательностей с аналогичными нуклеотидными
последовательностями из международного банка данных нуклеотидных
последовательностей GenBank.
7

Рис. 1. Схема филогенетического анализа клубеньковых бактерий.
Метод RAPD используется для анализа генетического полиморфизма
геномов бактерий.
Метод RAPD представляет собой понижение сложности
амплификации ДНК с помощью ПЦР. Для генома, состоящего из
повторяющихся и уникальных последовательностей, сложность генома
(используют для описания всевозможных присутствующих в нем
последовательностей ДНК) определяется в виде нормированной суммы
всех последовательностей.
Сложность генома определяет скорость гибридизации уникальных
последовательностей с препаратами ДНК. В этой связи специфическое
селективное понижение сложности препарата ДНК могло бы ускорить и
облегчить проведение его анализа с помощью гибридизации. Решение этой
проблемы затрудняется тем, что исследователь редко располагает
достаточным количеством информации о последовательностях ДНК
анализируемого генома с неизвестной первичной структурой для
осуществления выбора его представительной части с целью дальнейшего
использования при амплификации с помощью ПЦР.
Несмотря на нетривиальный характер задачи, в настоящее время
имеется методический подход, позволяющий с помощью ПЦР понижать
сложность образца ДНК без каких либо предварительных знаний о его
первичной структуре. Метод получил название случайной амплификацией
полиморфных последовательностей ДНК (Random Amplified Polymorphic
DNA - RAPD). Метод основан на использовании в ПЦР коротких
праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов. При этом в
8

конкретной ПЦР чаще всего используется только один праймер. В этом
случае продукт ПЦР будет образовываться, если инвертированные
повторяющиеся последовательности, которые содержат в себе сайт
посадки такого праймера, будут располагаться в анализируемом геноме
достаточно близко друг от друга, на расстоянии, допускающем
эффективное прохождение ПЦР. Приняв такое расстояние равным 2 т.п.о.,
исходя из статистических расчетов вероятности встречаемости в геноме
размером 3*10 п.о. двух одинаковых случайных последовательностей
конкретной длины, можно теоретически определить число
соответствующих ампликонов в таком геноме. Этот метод успешно
используется для поиска информативных полиморфных маркеров,
пригодных для физического картирования геномов животных и растений, а
также идентификации организмов.
В геноме прокариот встречаются некоторые повторяющиеся
генетические элементы, количество и расстояние между которыми у
разных видов микроорганизмов имеет свое определенное значение.
Подобрав к таким генетическим элементам праймер можно получить
продукты амплификации с индивидуальным для каждого микроорганизма
спектром полос. Одними из таких методов являются BOX-PCR (Box
elements), ERIC-PCR (Enterobacterial repetitive intergenic consensus) и REP-
PCR (Repetitive intergenic palindrome).
ПДРФ-анализ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
(Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis).
Наличие сайтов рестрикции в геномной ДНК и их взаимное
расположение однозначно определяются последовательностью
нуклеотидов исследуемой ДНК, поскольку сам сайт рестрикции - не что
иное, как строго определенная последовательность нуклеотидов ДНК,
узнаваемая и расщепляемая рестриктазами. Полное расщепление
анализируемой геномной ДНК отдельными рестриктазами приводит к
образованию определенного набора фрагментов ДНК, число и размеры
которых соответствуют расположению сайтов рестрикции. Анализ
полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый
ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis)
включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию
специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение
образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК,
содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по
Саузерну.
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если
возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего
полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса
возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного
фрагмента. При отсутсвии сайта узнавания в исследуемой области ДНК
размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его
обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном
9

соответствии полиморфной области сайгу pecтрикции образуются два
фрагмента меньшей длины.
Метод ПДРФ широко используется в генетических исследованиях
популяций, поскольку наличие в геноме исследуемого организма
рестрикционного фрагмента ДНК определенной длины является
прекрасным генетическим маркером и одновременно фенотипическим
признаком, тесно связанным с генотипом организма. Это позволяет
следить за распространением такого маркера в популяциях. ПДРФмаркеры
благодаря их четкой принадлежности определенным
генетическим локусам не уступают по информативности
распространенным биохимическим маркерам и во многих случаях
оказываются удобнее сложных фенотипических признаков.
Наибольший прогресс в реконструкции филогении микроорганизмов
был достигнут благодаря секвенированию генов рибосомных РНК. В
частности, секвенирование рРНК малой субъединицы позволило
пересмотреть взаимоотношения между разными бактериями. На основе
анализа этих последовательностей было показано, что семейство
Rhizobiaceae входит в состав α-протеобактерий или пурпурных бактерий.
Для филогенетического анализа также используются ген рРНК
большой субъединицы и межгенный транскрибируемый спейсер. Но в
виду того, что ген 16S рРНК более удобен для исследования благодаря
наличию консервативных участков фланкирующих данный ген и
оптимальному размеру (размер составляет примерно 1600 п.н.)
большинство исследователей предпочитают использовать для
филогенетических исследований именно ген 16S рРНК. Это привело к
тому, что GenBank на сегодняшний день содержит намного больше
последовательностей именно данного гена. А это в свою очередь дает
возможной сравнивать вновь исследуемый микроорганизм фенотипически
с большим количеством других микроорганизмов именно по этому гену,
гену 16S рРНК.
Выделение ДНК
На сегодняшний день существует множество способов выделения
ДНК. Основными критериями, предъявляемыми при выборе метода
являются его быстрота, качество и стоимость. Рассмотрим 2 широко
применяемых метода при работе с микроорганизмами. Первый из методов
предложенный Бумом (Boom) основан на сорбции ДНК на частичках
силикогеля (SiO 2 ) в присутствии 4-6 М гуанидинтиоционата. Лизирующим
агентом в данном случае служит Triton X100, содержащийся в
лизирующем буфере в концентрации 0,5-1%. В свою очередь
гуанидинтиоционат 4-6 М концентрации за счет своих хаотропных свойств
также способствует лизированию клеток. В дальнейшем при добавлении
суспензии силикогеля на их частицах происходит сорбция нуклеиновых
кислот (НК). При центрифугировании комплекс SiO 2 + НК уходит в
осадок, а надосадочную жидкость, содержащую все остальные
10

компоненты клеток становится возможным удалить. Для избавления от
остатка гуанидинтиоционата осадок промывают в 70% этиловым спиртом
в присутствии которого комплекс SiO 2 + НК не разрушается и при
центрифугировании также уходит в осадок. Надосадочная жидкость также
удаляется. При добавлении к комплексу воды, НК переходят в
растворимую форму, тем самым освобождаясь от частичек силикогеля.
Для лучшего перехода НК в раствор суспензию комплекса в воде можно
нагреть до 65С.
Процедура выделения ДНК этим методом такова:
1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок. Добавить в
пробирки по 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидинтиоционат,
1% Triton X100);
2. Промаркировать пробирки. В пробирки с лизирующим раствором
внести необходимое количество клеток исследуемых
микроорганизмов. Пробы тщательно перемешать на вортексе и
прогреть 5 мин при температуре 65 °С. Процентрифугировать 5 с при
5 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не
полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5
мин при 12 тыс. об/мин и использовать для выделения ДНК
надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку;
3. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл
ресуспендированного сорбента (силикагель, диатомовая земля,
стеклянные бусинки и т.д.). Перемешать на вортексе, поставить в
штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин;
4. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс. об/мин
в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы;
5. Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки (5М
гуанидинтиоционат), перемешать на вортексе до полного
ресуспендирования сорбента;
6. Осадить сорбент центрифугированием при 5 тыс. об/мин на
микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость,
используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для
каждой пробы;
7. Добавить в пробы по 950 мкл раствора для отмывки (70% этиловый
спирт), перемешать на вортексе до полного ресуспендирования
сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на
микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы;
8. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин
для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны
быть открыты. В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции
ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при
температуре 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе;
11

9. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин
на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержащая очищенную
ДНК готова к постановке ПЦР.
Второй метод очень простой. ДНК из бактерий выделяют
лизированием клеток в 1% Triton X100. Для этого в пробирки на 1,5 мл со
100мкл 1% Triton X100 помещают небольшое количество бактериальных
клеток. После суспендирования клеток пробирки инкубируют при
температуре 95˚С 10 мин. Клеточный дебрис осаждают
центрифугированием при 12000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочную
жидкость берут в качестве матрицы для ПЦР.
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации ДНК in
vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и
размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз.
Возможность получения огромного количества копий одного строго
определённого участка генома значительно упрощает исследование
имеющегося образца ДНК. В основе метода ПЦР лежит природный
процесс – комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое
с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название
репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя
несколько стадий:
1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение
нитей ДНК);
2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок,
необходимых для инициации синтеза ДНК);
3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих
нитей).
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из
термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы которой
находится в области 70-72 градусов, позволило сделать процесс
репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro.
Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по
заданной программе осуществляют циклическую смену температур,
создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику
лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении
циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий
специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества
анализируемого материала, который может содержать единичные клетки
микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для
идентификации их методом электрофореза.
Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке
последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках –
коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к
специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой
12

цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания
стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две
олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые
праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на
левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы
таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между
ними. Для получения достаточного количества копий искомого
характеристического фрагмента ДНК амплификация включает несколько
(20-40) циклов. Таким образом, ПЦР представляет собой многократное
увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК
катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.
Для проведения амплификации необходимы следующие
компоненты:
ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый
специфический фрагмент);
Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных
пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах
определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического
фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности
проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения
анализа;
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех
дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных
цепей ДНК);
Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза,
катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного
присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой
ДНК);
Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+,
необходимые для поддержания активности фермента).
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в
различных температурных режимах:
1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает
при 93-95 градусах в течение 30-40 сек;
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение
праймеров происходит комплементарно к соответствующим
последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах
13

специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя
температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65
градусов. Время отжига -20-60 сек;
3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание
цепей ДНК происходит от 5-конца к 3 -концу цепи в противоположных
направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом
для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор
дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза
катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taqполимеразой)
и проходит при температуре 70-72 градусов. Время
протекания синтеза – 20-40 сек.
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК
служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором
происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК
(ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат
матрицей для синтеза новых цепей.
Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по
формуле 2n, где n-число циклов амплификации. Поэтому, даже если в
исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная
молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108
молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной
визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном
геле.
ПЦР обычно проводят на амплификаторах – программируемых
твердотельных термостатах. Разновидностей моделей этих приборов очень
много. Одним из них является МС2 «Терцик» компании “ДНКтехнология”
(Россия).
14

RAPD-анализ
Для RAPD-анализ штаммов микроорганизмов используют
«произвольные» короткие (5-10н) праймеры, например, такие как 5’-
GGGCGCTG-3’, 5’-CAGGCCCTTC-3’
Схема амплификации следующая:
начальная денатурация (95С, 2 мин);
25-30 циклов амплификации:
1) денатурация - 95С, 20 сек;
2) отжиг – 32-33С, 20 сек;
3) элонгация - 72С, 1 мин с удлинением времени на 2 сек на
каждый цикл;
достраивание цепей ДНК - 72С в течение 4 мин.
Реакцию проводят в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 67
мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2-2,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20,
0,1 мкг геномной ДНК, 30-50 пМ произвольного праймера, по 250 мкМ
дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 5-10 е.а. Taq-полимеразы.
Для предотвращения испарения в ходе реакции, поверх реакционной
смеси наслаивают минеральное масло. При использовании приборов с
нагреваемой крышкой, таких как амплификатор «T1 Thermocycler» можно
обойтись без данной процедуры. В некоторых случаях, для того, чтобы
повысить воспроизводимость результатов и получить меньшее количество
четких полос в электрофоретических треках амплифицированной ДНК,
RAPD проводят с использованием более длинных праймеров и при более
высоких температурах их отжига. Например, с использованием праймеров
5’-TTACTGCGAACC-3’ и 5’-GAGGGTGGCGGTTCT–3’ (праймер,
гомологичный кóровой последовательности гипервариабельных повторов
фага М13). Состав реакционной смеси не отличался от
вышеописанного. Режим амплификации следующий: начальная
денатурация (94С, 4 мин); 30 циклов амплификации: 1) денатурация -
94С, 30 сек; 2) отжиг – 40-42С, 1 мин; 3) элонгация - 72С, 1 мин;
достраивание цепей ДНК - 72С в течение 5 мин.
15

Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле
Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК
осуществляют в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и
требуемого разрешения, используя 0,4 - 2,0%-ные агарозные гели или же 4
- 12%-ные полиакриламидные гели. Источниками питания служат
например приборы такие как модели 250/2.5 фирмы Bio-Rad (США) или
Эльф-4 ДНК-технология (Россия).
Для проведения агарозного гель-электрофореза существуют
различные модели приборов, одним из которых является прибор модели
Sub-Cell GT WIDI MINI (Bio-Rad, США). В качестве буферной системы
можно использовать трис-ацетатный буфер ТАЕ (40 мМ трис-ацетата (рН
7,6) и 2мМ ЭДТА) или трис-боратный буфер TBE (89 мМ трис-борат
(рН8,3) и 2мМ ЭДТА). При разделении фрагментов ДНК электрофорез
проводят в 1 -2%-ных гелях агарозы, при напряжении 8 – 10 V на см длины
геля.
В качестве маркеров можно использовать фрагменты ДНК фага
лямбда после расщепления рестрикционными эндонуклеазами Eco91I (или
ее изошизомером рестриктазой BstEII), HindIII и PstI.
После окончания электрофореза гели окрашивают бромистым
этидием (5 мкг/мл) в течение 10 мин. Флуоресценцию нуклеиновых кислот
наблюдают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 302 нм. Гели
фотографируют с помощью фотодокументационной системы например Gel
Camera System (UVP, Inc. США).
ПДРФ-анализ
ПДРФ анализ гена 16S рРНК проводят с использованием
мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции таких как AluI, MspI или Tru9I.
Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК используют праймеры,
фланкирующие фрагмент гена размером примерно 1400 п.н. следующего
состава:
5-tggctcagaacgaacgctggcggc-3 - PdrfF
5-taccttgttacgacttcaccccagtc-3 – PdrfR
Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
Расщепление ДНК проводят в буферах, рекомендованных фирмамипоставщиками.
Время рестрикции может варьировать от 1 час до 1 суток в
зависимости от цели эксперимента, а также от количества расщепляемого
препарата ДНК и единиц активности взятого в реакцию фермента.
Для каждого конкретного фермента применяется наиболее
оптимальная для него температура инкубации (30 0 С, 37 0 С и 65 0 С). Для
предотвращения испарения инкубационного раствора расщепление ДНК
при 65 о С проводят под слоем минерального масла. При комбинированном
расщеплении препаратов ДНК двумя или более рестрикционными
эндонуклеазами либо выбирают буферные растворы, наиболее оптимально
соответствующие особенностям действия всех используемых ферментов,
16

либо проводят последовательную инкубацию расщепляемой ДНК с
разными ферментами, начиная с требующего более низкую ионную силу.
По завершению рестрикции к препаратам расщепленной ДНК
добавляют специальный буфер для нанесения, содержащий 6-ти кратный
ТАЕ-буфер (для агарозных гелей) или ТВЕ-буфер (для полиакриламидных
гелей), 50%-ный глицерин и маркерные красители ксиленцианол FF и
бромфеноловый синий, и фракционируют их с помощью электрофореза.
Секвенирование ДНК на автоматическом секвенаторе
Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование)
амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК бактерий проводят на
автоматических секвенаторах. В случае применения прибора ABI PRISM
310 фирмы “Applied Biosystems” (США) используют наборы для
секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1».
Секвенирующую реакцию проводят при следующем режиме: 96 о C –
10 сек., 53 о C – 10 сек., 60 о C – 4 мин. Количество циклов 25-30. Состав
реакционной смеси включает 4 мкл «Terminator Ready Reaction Mix», 10-15
нг амплифицированной ДНК-матрицы, 3.2 пкм праймера. Смесь до
конечного объема 10 мкл доводят деионизованной водой.
Очистку от избытка невключившихся меченых
дидезокситерминаторов проводят с помощью набора «Centri-Step»
“Applied Biosystems” (США).
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
Для выяснения филогенетических взаимоотношений между
различными видами микроорганизмов и уточнения времени их
дивергенции используются методы определения эволюционных
дистанций, основанные на сравнении нуклеотидных последовательностей
гомологичных генов. В определенной мере по степени сходства
нуклеотидных последовательностей гомологичных генов можно судить о
степени филогенетического родства бактерий.
Визуализация филогенетических отношений осуществляется с
помощью дендрограммы – чертежа, отражающего родственные связи
между генетическими макромолекулами. По структуре дендрограмма
напоминает разветвлённое дерево.
Для построения дендрограмм могут быть использованы пакеты
молекулярно-биологических программ, таких как “Lasergene” фирмы
“DNASTAR, Inc.”, MEGA 3 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis),
DNASIS (Hitachi) и другие.
Частями дендрограммы являются 1) корень, 2) ветви и 3)
последовательности. Взаимное расположение ветвей называется
топологией. Длина ветви – расстояние от корня или от последнего
разветвления до её конца. Под дендрограммой обычно указывается её
масштаб – отрезок, равный определенному эволюционному расстоянию.
17

Рис. 2. Дендрограмма в традиционной форме, построенная на
основании эволюционных дистанций, вычисленных методом p-distance.
Таким образом, дендрограмма дает визуальное представление о
филогенетических взаимоотношениях между различными видами
микроорганизмов по гену, взятому в анализ.
Наиболее распространенным является анализ, основанный на
вариабельных фрагментах консервативных элементов генов рРНК. Выбор
именно этих генов обусловлен, прежде всего, доступностью огромных
массивов данных о структуре генов рРНК у самых разнообразных
микроорганизмов. Гены рРНК соответствуют ряду требований, которым
должны удовлетворять молекулярные филогенетические маркеры:
1) присутствуют у всех представителей исследуемой группы
родственных организмов;
2) происходят от общего предка и функционально постоянны;
3) генетически стабильны, т.е. относятся к так называемым генам
«домашнего хозяйства» (housekeeping genes), обеспечивающим основу
жизнедеятельности клетки. В генах рРНК чередуются константные
(консервативные), а также высоко вариабельные области. Поэтому ген 16S
рРНК является удобным и информативным маркером для изучения
филогенетического родства между микроорганизмами, поскольку он имеет
высококонсервативные и вариабельные участки.
Еще одним мощным инструментом филогенетического анализа
является поиск сходных последовательностей в базе данных генов с
помощью программы «Megablast», доступной на вебсайте NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov.). С помощью данной программы производится
поиск гомологичных последовательностей по всей базе данных
нуклеотидных последовательностей «GenBank». Это дает возможность
оценить гомологию анализируемого гена исследуемого микроорганизма с
аналогичными генами других микроорганизмов, и тем самым получить
первичные данные о филогенетическом положении исследуемого
микроорганизма.
18

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМАТИКА ПРОКАРИОТ
Методические рекомендации для студентов,
обучающихся по специальности 020209 - Микробиология
Авторы:
Баймиев Андрей Ханифович
Баймиев Алексей Ханифович
Мавзютов Айрат Радикович
Редактор Н.А. Брагина
Лицензия № 0177 от 10.06.96
Сдано в набор
Подписано в печать
Отпечатано на ризографе
Формат 60х90 1/16. Усл.-печ.л. 1,19
Тираж 100 экз.
450000, Уфа, Ленина, 3,
Башкирский государственный медицинский университет
19