2010年第04期 - 中国科学院生物物理研究所

前 沿望图 2 蛋 白 质 3D 结 构 产 生 途 径 的步 骤 及 其 每 一 步 骤 附 随 的 蛋 白 质 损耗 量 的 模 式 图 。 模 式 图 显 示 , 靶 蛋 白的 每 一 步 操 作 都 会 导 致 下 一 个 步 骤靶 蛋 白 数 量 的 减 少 。蛋 白 质 结 晶 的 最 基 本 前 提 条 件是 获 得 一 个 稳 定 的 同 类 蛋 白 质 制 品 。所 以 , 一 旦 蛋 白 质 的 稳 定 性 和 同 质 性达 到 足 够 程 度 , 研 究 组 便 开 始 结 晶 。结 晶 机 器 人 能 够 有 效 地 操 作 结 晶 盘 ,并 进 行 孵 化 和 远 程 检 查 。 经 常 可 以 观察 到 晶 体 形 成 , 但 所 形 成 的 晶 体 并 不一 定 都 是 能 够 用 于 结 构 测 定 的 高 质量 晶 体 。 为 了 改 进 这 些 晶 体 的 质 量 ,必 须 对 去 污 剂 、 沉 淀 剂 、pH 值 、 脂 肪含 量 、 添 加 剂 、 盐 、 温 度 等 多 个 因 素 进行 优 化 。 去 污 剂 或 去 污 剂 混 合 物 的 选择 以 及 保 留 适 度 的 脂 肪 是 非 常 重 要的 , 需 要 认 真 考 虑 。研 究 没 有 功 能 特 性 描 述 的 靶 蛋白 时 , 必 须 先 鉴 定 它 们 的 功 能 。 为 了这 个 目 的 , 可 事 先 通 过 大 肠 杆 菌 功 能替 补 试 验 分 析 被 选 中 的 转 运 蛋 白 , 或运 用 以 电 生 理 学 为 基 础 的 固 相 支 撑膜 进 行 转 运 评 价 。2) 代 表 性 论 文(1)Hunte, C., E. Screpanti, M.Venturi, A. Rimon, E. Padan and H.Michel: Structure of a Na+/H+ antiporterandinsights into mechanism ofaction and regulation by pH. Nature435,1197-1202(2005).(2) Surade, S., M. Klein, P.C.Stolt-Bergner,C.Mü nke,A.RoyandH.Michel:Comparative analysis and "expressionspace" coverage of the productionof prokaryotic membrane proteinsfor structural genomics. ProteinSci. 15,2178-2189(2006).(3)Screpanti, E., E. Padan, A.Rimon, H. Michel and C. Hunte: Crucialstepsinthestructure determinationof the Na+/H+ antiporter NhaA in itsnative conformation. J.Mol.Biol. 362,192-202(2006).(4)Olkhova, E., C. Hunte, E.Screpanti, E. Padan and H. Michel:Multiconformation continuum electrostaticsanalysis of the NhaA Na+/H+antiporter of Escherichia coli withfunctional implications. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 103, 2629-2634(2006).(5)Olkhova,E., E. Padan and H.Michel: The influence of protonationstatesonthe dynamicsofthe NhaA antiporterfrom Escherichia coli. Bio 原phys. J. 92,3784-3791(2007).3) 资 助马 普 学 会 (Max-Planck-Society)德 意 志 联 合 研 究 会 (DeutscheForschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereiche472and628) )德 国 研 究 和 技 术 部 GermanMinistryof Research and Technology(“ProAMP”-project)欧 盟 [EuropeanUnion(“E-MeP”)]4 结 构 膜 蛋 白 组 学 研 究 组(Structural Membrane Proteomics)这 个 研 究 组 的 目 标 是 从 极 端 嗜热 古 细 菌 Aquifex aeolicus 的 细 胞 膜中 分 离 、 鉴 定 和 结 晶 多 种 蛋 白 质 和 膜蛋 白 复 合 体 , 并 对 分 离 后 的 膜 蛋 白 和膜 蛋 白 复 合 体 进 行 功 能 描 述 。1) 研 究 背 景一 般 认 为 , 极 端 嗜 热 古 生 菌 生 物体 的 蛋 白 质 比 它 们 的 同 伴 嗜 温 细 菌的 蛋 白 质 更 稳 定 、 更 刚 性 。 因 此 , 利 用极 端 嗜 热 古 生 菌 生 物 体 的 复 合 物 比利 用 嗜 温 菌 的 复 合 物 更 易 获 得 稳 定 、同 质 、 易 结 晶 的 膜 蛋 白 复 合 物 ( 图 1)。因 此 , 研 究 组 挑 选 极 端 嗜 热 古 生 菌 真细 菌 (hyperthermophilic eubacterium)Aquifex aeolicus 作 为 研 究 靶 生 物 。Aquifex aeolicus 的 基 因 组 相 对 较 小( 比 大 肠 杆 菌 基 因 组 小 1/3), 相 对 的蛋 白 质 复 合 体 的 数 目 也 较 低 , 所 以 纯化 独 立 的 膜 蛋 白 也 比 较 容 易 。 已 在 多个 独 立 操 纵 子 中 发 现 了 Aquifex 基 因组 的 大 多 数 基 因 , 但 是 , 属 于 同 一 个通 路 或 同 一 个 蛋 白 质 复 合 体 的 基 因却 常 常 分 散 地 分 布 在 整 个 基 因 组 。 而且 , 同 一 个 基 因 经 常 存 在 几 个 同 源体 , 所 以 , 必 须 先 鉴 定 不 同 复 合 体 上存 在 的 是 某 个 蛋 白 质 亚 单 位 的 哪 一个 同 源 体 。30PDF 文 件 使 用 "pdfFactory Pro" 试 用 版 本 创 建 www.fineprint.cn