Bakteriocini BMK kao prirodni protektori hrane - inmesbgd.com

Tehnologija mesa 51 (2010) 1, 83–94je na konvencionalnom postupku koji obuhvata serijuuzastopnih precipitacija amonijum-sulfatom,postupke izmene jona u hidrofobnim interakcijama,gel-filtraciju i tečnu hromatografiju (povratno-faznu,pod visokim pritiskom). Drugi vid prečišćavanjapredstavlja jednostavan analitički princip koji sesastoji iz tri koraka: precipitacije amonijum-sulfatom,ekstrakcije ili precipitacije hloroformom ilimetanolom i povratno-fazne tečne hromatografijepod visokim pritiskom. Treći oblik izolacije bakteriocinase obavlja preko adsorpcije pomoću hidrofobnoggela, nakon čega sledi određivanje najvećegmogućeg titra bioraspoloživih bakteriocina. U optimalizacijiovoga postupka stoji podešavanje pHvrednosti medijuma u uslovima u kojima se odvijafermentacija.Slavica Vesković-Moračanin (2005, 2008a) izolovalaje bakteriocin iz Lb. sakei (sakacin) kao i izLn. mesenteroides (mesenterocin), metodom zasićeneprecipitacije amonijum-sulfatom. Navedeni protokolu radu bio je baziran na osnovama metode dobijanjabakteriocina iz BMK koje su postavili Schillingeri Lücke (1989), ali koji je prilagođen laboratorijskimuslovima rada autora. Postupak izolovanjabakteriocina u poluprečišćenom obliku obuhvatao jevišednevne aktivnosti s ciljem umnožavanja željenekulture Lb. sakei i Ln. mesenteroides do potrebnekoncentracije biomase, koja je davala maksimalnuprodukciju bakteriocina, i samog postupka izolacijebakteriocina.Ista autorka (2005, 2007) je, ispitujući svojstvabakteriocina BMK izolovanih iz Ln. mesenteroidesE 131 i iz različitih sojeva Lb. sakei, potvrdila njihovuproteinsku prirodu, čime je otvorila vrata njihovimdaljim istraživanja, kao potencijalnih bioprotektora,u proizvodnji fermentisanih kobasica. Autorkaje ispitivala uticaj proteolitičkih enzima (Pepsin– TS, jačine 1:10000, Papain ≥ 30000 i ProteinazeK, 600 m Ansou U/mL) na aktivnost izolovanihbakteriocina. Rezultati su pokazali da bakteriocini,posle tretiranja navedenim proteolitičkim enzimima,gube svoju aktivnost, čime izostaje i antilisterijskiefekat. Autorka je enzimske preparate dodavala,pojedinačno, u koncentraciji od 1 mg/mL. Nakoninkubacije, jedan čas pri temperaturi od 37°C, kojaje obavljena radi ispoljavanja potencijalne aktivnostiproteolitičkih enzima, izostala je antilisterijskaaktivnost kod oba izolovana bakteriocina. Na ovajindirektan način potvrđena je njihova proteinskapriroda.Proteinska priroda predstavlja veoma značajnuosobinu bakteriocina, koja određuje njihovu sudbinuu organizmu ljudi, kao krajnjih korisnika proizvodau čijoj se izradi koriste dodati bakteriocini, ili pakBMK kao sigurni producenti bakteriocina. Bilo kakvadruga mogućnost, vezana za metaboličku sudbinubakteriocina u organizmu čoveka (akumulacija,delimična razgradnja, resorpcija i druge), ne bi bilapoželjna. Ovo svojstvo uliva optimizam za nastavakdaljih istraživanja i navodi na mogućnost njihovečešće primene, u okviru kompleksnog sistema zaštitehrane od dejstva nepoželjnih mikroorganizama.Još jedan od značajnih činilaca koji određujemogućnost primene bakteriocina BMK u tehnološkimprocesima industrije mesa, je, svakako, njihovatermorezistentnost. Sposobnost bakteriocina da preživeprocese termičke obrade, predstavlja jedan odnajznačajnijih kriterijuma za njihovu primenu.Slavica Vesković-Moračanin (2008, 2008a) jeispitivala uticaj povišenih do visokih temperaturana ispoljavanje antilisterijske aktivnosti sakacina imesenterocina. Izbor temperatura je bio adekvatanonima koje se, inače, primenjuju u industriji mesa,kao obavezni deo tehnološkog procesa proizvodnjeodređenih proizvoda. Po 1 mL izolovanog poluprečišćenogbakteriocina, autorka je izložila dejstvusledećih temperatura: 65°C, 80°C, 90°C i 100°C, kaoi dejstvu visokih temperatura (121°C) i povišenogpritiska (1,2 Ba), u procesu autoklaviranja. Kivetesa bakteriocinima su izlagane dejstvu temperatura utoku 10 i 30 minuta. Uticaj temperature od 100°C jeodređivan posle ekspozicije od 10, 30 i 60 minuta, aefekat visoke temperature (121°C) i povišenog pritiska(1,2 Ba) posle 15 minuta. Rezultati ovih istraživanjasu pokazali izuzetnu termostabilnost ispitivanihbakteriocina. Naime, njihovo antilisterijsko svojstvose zadržalo čak i posle procesa autoklaviranja,što u uslovima industrijske proizvodnje odgovaraefektima sterilizacije.Jačina izolovanih bakteriocina koji potiču izBMK određuje se principom kritičnog dilucionog razblaženja(Barefoot i Klaenhammer, 1983). Suštinareakcije zasniva se na pronalaženju najvećeg, maksimalnograzblaženja bakteriocina koje, u podlozisa izabranim test-mikroorganizmom, daje antimikrobniefekat. Naime, izolovani bakteriocin, u količiniod 50 μL, tzv. bakteriocinska porcija, razblažuje seodređenim dilutentom (destilovana voda, fiziološkirastvor, Ringerov rastvor) do onog stepena kojiobezbeđuje inhibiciju rasta test-mikroorganizma(L. monocytogenes) veću od 2 milimetra. Jačinabakteriocinske aktivnosti se iskazuje arbitarnimjedinicama i izražava se kao AU/mL. Ispitivanavrednost se dobija korišćenjem formule: AU/mL =2 n × (1000 μL/50 μL), gde n predstavlja navedenistepen razblaženja.Slavica Vesković-Moračanin (2005, 2007a) je,ispitujući osobine sakacina, bakteriocina izolovanogiz Lb. sakei I151, koji potiče iz tradicionalne fermentisanekobasice, utvrdila da njegova jačina91