Diagnostyka nicieni - Instytut Ochrony Roślin - Poznań

10 Diagnostyka nicieni – pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi
3.2. Oznaczanie w oparciu o metody biologii molekularnej
Identyfikację gatunków przeprowadza się według następującego porządku:
3.2.1. Izolacja DNA
Tkanki larw lub osobników dorosłych należy rozgnieść tak, aby przynajmniej czę-
ściowo je zmacerować. Następnie stosuje się jedną z poniższych procedur:
przy pomocy gotowych zestawów
Najlepiej przeprowadzić izolację przy pomocy gotowych zestawów do izolacji DNA
z tkanek zwierzęcych, dostępnych komercyjnie (np. DNeasy Isolation Kit, Qiagen).
W pierwszym etapie rozgniecione tkanki zalewa się niewielką ilością buforu lizującego
(dokładna objętość, wg. instrukcji producenta) zawierającym proteinazę K. Etap ten
należy wydłużyć do ok. 4 godzin, w celu dokładnej lizy tkanek. Później przemywa się
materiał genetyczny związany na błonie kolumienek z zestawu, a procedurę kończy
się wymyciem oczyszczonego DNA z błony i zawieszeniem w wodzie lub 10 mM roztworze
TrisCl (pH 7.5).
izolacja metodą ekstrakcji fenolowej
Rozgniecione tkanki należy zmieszać z ok. 100 μl buforu do izolacji DNA (50 mM
TrisCl pH 7,5; 50 mM NaCl; 5 mM EDTA; 0,5% SDS) z dodatkiem proteinazy K, o stężeniu
50 μg/ml i trawić przez noc w 37°C lub 56°C. Następnie dodać do próby równą
objętość mieszaniny fenol/chloroform (1:1) i przeprowadzić kilkukrotnie ekstrakcję
fenolową, aż do zaniku interfazy, po czym wykonać ekstrakcję chloroformem (1 raz).
DNA z fazy wodnej wytrącać etanolem (2,5 objętości) w obecności octanu amonu (1/3
objętości, 7,5 M) w –80°C przez 20 min. Osad zbierać przez wirowanie przy 14 000
rpm, 20 min. w 4°C, a następnie przemyć 70% etanolem, suszyć i rozpuścić w wodzie
lub buforze 1xTE (10 mM TrisCl pH 7,5; 1 mM EDTA).
UWAGA:
– Jakość wyizolowanego DNA sprawdzić w świetle UV po rozdziale elektroforetycznym
w 0,8% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (stęż. 0,5 μg/ml). Stężenie
uzyskanego DNA można ocenić spektrofotometrycznie przy długości fali λ =
260 nm, natomiast czystość preparatu można ocenić na podstawie wartości A / 260
A (wartość pomiędzy 1,7–1,9 świadczy o jego czystości).
280
– Wyizolowany DNA należy przechowywać w –20°C.
3.2.2. Identyfikacja gatunków metodą PCR
Do celów wykrywania, a także różnicowania nicieni tego rodzaju, zwłaszcza gatunków
kwarantannowych zostało opracowanych wiele metod opartych głównie na standardowej
reakcji PCR, a także real-time PCR, w tym także protokoły rekomendowane
przez EPPO. Należą do nich:
– metoda standardowej reakcji PCR opisana przez Petersena i Vraina (1996) do wykrywania
gatunków: M. hapla, M. chitwoodi i M. fallax oparta na amplifikacji se-