Diagnostyka nicieni - Instytut Ochrony Roślin - Poznań

I N S T Y T U T O C H R O N Y R O Ś L I N 

PA Ń S T W O W Y I N S T Y T U T B A D AW C Z Y 

Dyrektor – doc. dr hab. Marek MRÓWCZYŃSKI 

Z A K Ł A D U P O W S Z E C H N I A N I A , W Y D AW N I C T W 

I W S P Ó Ł P R A C Y Z Z A G R A N I C Ą 

Kierownik – dr Stefan WOLNY 

ul. Władysława Węgorka 20, 60-318 Poznań 

tel: 061 864 90 27, fax: 061 867 63 01 

e-mail: upowszechnianie@ior.poznan.pl 

Redaktor wydawnictw 

upowszechnieniowych i wdrożeniowych: 

Dr Stefan Wolny 

Recenzent: 

Prof. dr hab. Marek Tomalak 

Autorzy opracowania: 

Dr Renata Dobosz 

Dr Aleksandra Obrępalska-Stęplowska 

Mgr Katarzyna Nowaczyk 

Prof. dr hab. Stefan Kornobis 

Autorzy fotografii: 

Dr Renata Dobosz 

Mgr Magdalena Gawlak 

Mgr Witold Karnkowski 

Program Wieloletni 2006–2010 

1.3. Określanie zakresu zmienności morfologicznej i molekularnej nicienipasożytów 

roślin w celu identyfikacji gatunków objętych regulacjami prawnymi 

ISBN 978-83-89867-36-0 

© Copyright by Instytyt Ochrony Roślin – Państwowy Instytut Badawczy 

Nakład: 150 egz. 

Opracowanie graficzne oraz projekt okładki: mgr inż. Dominik Krawczyk 

Druk: TOTEM, Świętokrzyska 53, 88-100 Inowrocław, tel. (052) 354 00 40, 

http://www.totem.com.pl

SPIS TREŚCI 

1. WYKRYWANIE ...................................................................................3 

2. IZOLACJA MATERIAŁU ......................................................................4 

3. IDENTYFIKACJA GATUNKU ...............................................................4 

CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW ...........................................................7 

4. LITERATURA ..................................................................................13 

1. WYKRYWANIE 

Gatunki z rodzaju Meloidogyne posiadające status organizmów kwarantannowych 

umieszczone na liście A2 EPPO: 

– (guzak amerykański) M. chitwoodi Golden et al. 1980 

– (guzak holenderski) M. fallax Karssen 1996 

1.1. Rośliny żywicielskie 

Ze względu na zakres roślin żywicielskich gatunki rodzaju Meloidogyne dzieli się 

na trzy grupy: 

I) gatunki pasożytujące na roślinach dwuliściennych, 

II) gatunki mające żywicieli wśród roślin jednoliściennych 

III) oraz gatunki, których żywicielami są zarówno rośliny jedno- jak i dwuliścienne 

(Karssen, 1999 ). 

Ponieważ M. chitwoodi podobnie jak M. fallax reprezentują trzecią grupę troficzną 

mogą one, poza takimi roślinami jak np. ziemniak lub marchew, wystąpić również 

w uprawie zbóż czy kukurydzy. Pospolicie występujący w otwartym gruncie M. hapla 

(guzak północny) związany jest z roślinami dwuliściennymi, choć znane są sporadyczne 

przypadki jego wystąpienia na roślinach jednoliściennych z rodzajów: Allium 

sp. (Oostenbrink, 1960) i Hosta sp. (Brinkman i Goossens, 1994). 

1.2. Objawy 

Guzaki nie powodują specyficznych objawów na nadziemnych częściach roślin. 

Obserwowane więdnięcie czy żółknięcie liści może być też wywołane przez inne szkodniki, 

patogeny chorobotwórcze albo czynniki abiotyczne. Objawy typowe dla Meloidogyne 

zaobserwować można na podziemnych częściach roślin.

4 Diagnostyka nicieni – pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi 

Są to charakterystyczne wyrośla na korzeniach, zwane również guzami, powstające 

w wyniku interakcji pasożyt-żywiciel. Wyrośla związane z pasożytowaniem M. chitwoodi. 

(fot. 1a) czy M. fallax (fot. 1b) są nieco mniejsze niż obserwowane na korzeniach roślin 

porażonych przez M. hapla, a wyrastające z nich korzenie boczne nie są tak liczne jak 

wyrastające z guzów powstałych na skutek porażenia przez guzaka północnego (fot. 1c). 

Zewnętrznym objawem porażenia bulw ziemniaka przez M. chitwoodi (fot. 2a) czy 

M. fallax (fot. 2b) jest szorstka skórka z charakterystycznymi naroślami, które u pew- 

nych odmian ziemniaka nie występują mimo stwierdzonego silnego porażenia. Pod 

skórką można obserwować nekrotyczne fragmenty tkanki koloru brązowego oraz charakterystyczne 

małe, ciemne plamki (wyraźnie widoczne na tle mleczno-żółtej tkanki 

bulwy). (M. chitwoodi fot. 3a; M. fallax 3b). 

UWAGA: 

W niewybarwionych korzeniach, poza złożami jajowymi, stadia rozwojowe guzaków 

znajdujące się wewnątrz tkanek nie zawsze są dokładnie widoczne. Dlatego podczas 

obserwacji systemów korzeniowych zaleca się zwrócenie szczególnej uwagi nawet na 

niewielkie zgrubienia tkanek. 

2. IZOLACJA MATERIAŁU 

Materiał biologiczny pozyskuje się z tkanek roślin (korzeni i bulw) oraz z gleby. 

Z wyroślami związane są wszystkie stadia rozwojowe. Wewnątrz tkanek znajdują się 

nieruchome stadia rozwojowe guzaków (samice) i larwy. Natomiast na zewnątrz można 

łatwo zaobserwować, zamknięte w galaretowatej osłonce, złoża jajowe (już przy 

powiększeniu 20x uzyskiwanym przy pracy z optycznym mikroskopem stereoskopowym). 

Izolując materiał biologiczny z tkanek uzyskuje się również larwy inwazyjne (J ), 2 

które opuściły złoże jajowe a jeszcze nie wniknęły do korzeni oraz robakowate, ruchliwe 

samce. Z gleby izoluje się wyłącznie stadia ruchliwe: larwy inwazyjne (J ) i samce. 

2 

3. IDENTYFIKACJA GATUNKU 

Identyfikacji gatunku guzaka dokonuje się na podstawie cech morfologicznych 

i morfometrycznych oraz w oparciu o badanie genetyczne. 

3.1. Oznaczanie na podstawie cech morfologicznych i morfometrycznych 

Cechy diagnostyczne służące oznaczeniu gatunku to: 

– „wzór” na płytce perinealnej1 samicy, 

– długość i kształt guzów sztyletu samicy i samca oraz 

– długość ciała larw inwazyjnych (J ), 2 

– długość ich ogona 

– długość części przezroczystej (hyalinowej). 

Zestawienie zakresów zmienności cech diagnostycznych guzaków zamieszczono w tabeli 1. 

1 płytka perinealna – konfiguracja powierzchni oskórka w postaci charakterystycznego dla poszczególnych 

gatunków Meloidogyne układu linii perinealnych okalających wulwy i odbyt

Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Meloidogyne 5 

Fot. 1. Wyrośla powstałe na korzeniach w wyniku pasożytowania M. chitwoodi (a), M. fallax (b) oraz 

M. hapla (c) 

Fot. 2. Objawy porażenia widoczne na powierzchni bulwy ziemniaka wywołane przez M. chitwoodi (a) 

i M. fallax (b) 

Fot. 3. Objawy porażenia wewnętrznych tkanek bulwy ziemniaka wywołane przez M. chitwoodi (a) 

i M. fallax (b)


Tabela 1. Cechy diagnostyczne oraz zakresy zmienności cech wykorzystywanych w diagnostyce gatunków 

z rodzaju Meloidogyne 

Stadium/Cecha* 

Meloidogyne 

hapla chitwoodi fallax 

Samica – Długość sztyletu (µm) 14–17 11–13 14–15 

Samiec – Długość sztyletu (µm) 17–23 16–18 18–21 

Larwy inwazyjne (J 2 ) 

Długość ciała (µm) 


Długość ogona (µm) 


Długość części przezroczystej 

(hyalinowej) (µm) 

305–517 336–417 381–435 

30–69 39–47 46–56 

6–20 9–14 12–16 

Kształt guzów sztyletu okrągłe nieregularne okrągłe 

*W tabeli podano zakresy zmienności cech (w nawiasach umieszczono wartości minimalne i maksymalne). 

Dane morfometryczne przygotowano w oparciu o dane literaturowe oraz badania własne.

CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW 

Ciało samic, mniej lub bardziej za- 

okrąglone w kształcie gruszki. W przed- 

niej części występuje szyjka i część gło- 

wowa. Sztylet jest lekko wygięty z wy- 

raźnymi, delikatnymi, zaokrąglonymi 

guzami. Fałdy oskórka delikatne. Na 

tylnej cześci ciała widoczna okrągła 

płytka perinealna. Niekiedy fałdy oskórka 

formują po bokach tzw. skrzydełka. 

W okolicy ogona widoczne punktowanie 

oskórka (fot. 4a). 

Samce: Głowa wysoka, oddzielona 

od reszty ciała, sztylet delikatny, guzy 

zaokrąglone wyraźnie widoczne. Pola 

boczne z 4 liniami. 

Guzak północny 

Meloidogyne hapla (Chitwood 1949) 

Larwy inwazyjne (J ) smukłe, z delikatniejszym, w porównaniu do larw mątwików, 

2 

szkieletem głowy (fot. 4b) oraz delikatnym sztyletem długości 10–12 µm. Guzy sztyletu 

okrągłe, oddzielone od jego podstawy. Hemizonid1 występuje przed otworkiem wydalniczym. 

Ogon stożkowaty, na zakończeniu zaokrąglony. Przezroczysta część ogona 

przyjmuje często nieregularny kształt (fot. 4c). 

Fot. 4. M. hapla: wzór płytki perinealnej (a); głowa larwy inwazyjnej (b), zakończenie ogona (c) 

1 hemizonid – część systemu nerwowego, widoczna jako soczewkowaty twór położony pod oskórkiem na 

brzusznej stronie ciała nicienia w pobliżu otworu wydalniczego

Guzak amerykański 

Meloidogyne chitwoodi (Golden et al. 1980) 

Samice mają ciało okrągłe lub lekko 

gruszkowate z krótką szyjką zakończoną 

częścią głowową. Sztylet delikatny, guzy 

sztyletu są wyraźnie oddzielone od jego 

podstawy, owalne lub nieregularne, lekko 

spłaszczone i delikatnie pochylone. 

Dolna część sztyletu lekko zakrzywiona 

po stronie grzbietowej. Wulwa umieszczona 

na niewielkim wzniesieniu. Płytka 

perinealna stosunkowo mała, okrągła lub 

owalna. Łuk grzbietowy przechodzący od 

niskiego i zaokrąglonego do stosunkowo 

wysokiego. (fot. 5a). Linie boczne słabowidoczne. 

Głowa samca nieoddzielona od reszty ciała, brak poprzecznej szczeliny, sztylet 

delikatny, guzy wyraźnie oddzielone od podstawy sztyletu, owalne lub nieregularne, 

lekko spłaszczone i delikatnie pochylone. Na polach bocznych 4 linie. 

Larwy inwazyjne (J ). Ciało smukłe, sztylet delikatny 9,5–10 µm długi, guzy u sa- 

2 

micy i samca podobne (fot. 5b). Hemizonid jest położony przed lub w bliskim sąsiedztwie 

otworu wydalniczego. Ogon stożkowaty, na końcu zaokrąglony (fot. 5c). 

Fot. 5. M. chitwoodi: wzór płytki perinealnej (a);głowa larwy inwazyjnej (b), zakończenie ogona (c)

Ciało samicy okrągłe lub w kształ- 

cie gruszki z krótką szyjką. Sztylet de- 

likatny, jego dolna część jest lekko za- 

krzywiona po stronie grzbietowej. Guzy 

sztyletu są wyraźne, okrągłe. Wulwa 

umieszczona na niewielkim wzniesieniu. 

Płytka perinealna owalna z grubymi 

liniami (fot. 6a). 

Głowa samca lekko oddzielona od 

reszty ciała. Sztylet delikatny, lekko 

wygięty w kierunku grzbietowym. Guzy 

sztyletu są wyraźne, okrągłe. Na polach 

bocznych widoczne 4 linie. 

Guzak holenderski 

Meloidogyne fallax (Karssen 1996) 

Larwy inwazyjne (J ) są smukłe z delikatnym sztyletem i wyraźnie widocznymi 

2 

okrągłymi guzami (fot. 6b). Hemizonid występuje przed lub w pobliżu otworu wydalniczego. 

Ogon stożkowaty na końcu okrągły (fot. 6c). 

Fot. 6. M. fallax: wzór płytki perinealnej (a);głowa larwy inwazyjnej (b), zakończenie ogona (c)


3.2. Oznaczanie w oparciu o metody biologii molekularnej 

Identyfikację gatunków przeprowadza się według następującego porządku: 

3.2.1. Izolacja DNA 

Tkanki larw lub osobników dorosłych należy rozgnieść tak, aby przynajmniej czę- 

ściowo je zmacerować. Następnie stosuje się jedną z poniższych procedur: 

przy pomocy gotowych zestawów 

Najlepiej przeprowadzić izolację przy pomocy gotowych zestawów do izolacji DNA 

z tkanek zwierzęcych, dostępnych komercyjnie (np. DNeasy Isolation Kit, Qiagen). 

W pierwszym etapie rozgniecione tkanki zalewa się niewielką ilością buforu lizującego 

(dokładna objętość, wg. instrukcji producenta) zawierającym proteinazę K. Etap ten 

należy wydłużyć do ok. 4 godzin, w celu dokładnej lizy tkanek. Później przemywa się 

materiał genetyczny związany na błonie kolumienek z zestawu, a procedurę kończy 

się wymyciem oczyszczonego DNA z błony i zawieszeniem w wodzie lub 10 mM roztworze 

TrisCl (pH 7.5). 

izolacja metodą ekstrakcji fenolowej 

Rozgniecione tkanki należy zmieszać z ok. 100 μl buforu do izolacji DNA (50 mM 

TrisCl pH 7,5; 50 mM NaCl; 5 mM EDTA; 0,5% SDS) z dodatkiem proteinazy K, o stężeniu 

50 μg/ml i trawić przez noc w 37°C lub 56°C. Następnie dodać do próby równą 

objętość mieszaniny fenol/chloroform (1:1) i przeprowadzić kilkukrotnie ekstrakcję 

fenolową, aż do zaniku interfazy, po czym wykonać ekstrakcję chloroformem (1 raz). 

DNA z fazy wodnej wytrącać etanolem (2,5 objętości) w obecności octanu amonu (1/3 

objętości, 7,5 M) w –80°C przez 20 min. Osad zbierać przez wirowanie przy 14 000 

rpm, 20 min. w 4°C, a następnie przemyć 70% etanolem, suszyć i rozpuścić w wodzie 

lub buforze 1xTE (10 mM TrisCl pH 7,5; 1 mM EDTA). 

UWAGA: 

– Jakość wyizolowanego DNA sprawdzić w świetle UV po rozdziale elektroforetycznym 

w 0,8% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (stęż. 0,5 μg/ml). Stężenie 

uzyskanego DNA można ocenić spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 

260 nm, natomiast czystość preparatu można ocenić na podstawie wartości A / 260 

A (wartość pomiędzy 1,7–1,9 świadczy o jego czystości). 

280 

– Wyizolowany DNA należy przechowywać w –20°C. 

3.2.2. Identyfikacja gatunków metodą PCR 

Do celów wykrywania, a także różnicowania nicieni tego rodzaju, zwłaszcza gatunków 

kwarantannowych zostało opracowanych wiele metod opartych głównie na standardowej 

reakcji PCR, a także real-time PCR, w tym także protokoły rekomendowane 

przez EPPO. Należą do nich: 

– metoda standardowej reakcji PCR opisana przez Petersena i Vraina (1996) do wykrywania 

gatunków: M. hapla, M. chitwoodi i M. fallax oparta na amplifikacji se-


kwencji IGS (ang. intergenic spacer) w sekwencji rDNA, bez konieczności trawienia 

restrykcyjnego produktu, 

– oraz metoda opisana przez Wisharta i wsp. (2002) również oparta na amplifikacji 

przy pomocy gatunkowo-specyficznych starterów przyłączających się w obrębie re- 

gionu ITS. 

Przynależność gatunkową badanych nicieni z rodzaju Meloidogyne określić można 

na podstawie różnic w długości produktów reakcji. 

Innym sposobem detekcji i różnicowania jest metoda opisana przez Zijlstra i wsp. 

(1997), która polega na amplifikacji sekwencji ITS metodą PCR, a następnie trawieniu 

enzymami restrykcyjnymi powstałych produktów reakcji. Przynależność gatunkową 

określa się na podstawie różnic w długości fragmentów restrykcyjnych. 

Ze względu na istniejące różnice w sekwencjach nukleotydowych we fragmentach 

ITS oraz IGS (wynikających ze zróżnicowania genetycznego populacji, w tym również 

tych, które nie zostały do tej pory opisane), do których przyłączają się startery oraz 

różnic w miejscach cięcia enzymami restrykcyjnymi, może niekiedy dojść do reakcji 

krzyżowych czy powstawania niespecyficznych produktów. Czasami uzyskane wyniki 

są trudne do interpretacji. 

Najbezpieczniejszą więc metodą, chociaż bardziej pracochłonną, jest sekwencjonowanie 

uzyskanych produktów reakcji. Autorzy proponują więc, aby oczyszczony 

produkt reakcji PCR poddać sekwencjonowaniu (w jednym z serwisów oferujących 

tego typu usługi) celem potwierdzenia otrzymanego wyniku. 

Metodą umożliwiającą uzyskanie produktów w standardowej reakcji PCR dla każdego 

z gatunków Meloidogyne (nie tylko trzech wyżej wymienionych) jest reakcja opisana 

ostatnio przez zespół Berry i wsp (2008), z zastosowanie startera uniwersalnych 

dla wielu rodzjów nicieni – 18S, oraz startera Melo-R-long umożliwiającego amplifikację 

nicieni z rodzaju Meloidogyne. 

Detekcja PCR z zastosowaniem metody Berry i wsp. 

Reakcję przeprowadza się wykorzystując 25 μl mieszaniny reakcyjnej, która zawierać 

powinna: 

– 5 U polimerazy Taq , 

– 1x stężony bufor załączony do polimerazy zawierający zwykle: 10 mM 

• Tris-HCl pH 8,8, 1,5 mM MgCl , 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 

2 

– 2 μM każdego ze starterów: 18S (5’TTGATTACGTCCCTGCCCTTT3’) 

• i Melo-R-long (5’GGCCTCACTTAAGAGGCTCA 3’), 

– 200 μM dNTP, 

– 1 μL wyizolowanego DNA. 

Reakcję należy przeprowadzić stosując poniżej podany profil termiczny reakcji: 

– wstępna denaturacja w 94°C przez 3 minuty, 

– 30 cykli składających się z: 

• denaturacji w 94°C przez 1 min.,


• przyłączania starterów w 57°C przez 1 min, 

• elongacji w 72°C przez 1 min. 

– końcowej elongacji w 72°C przez 10 min. 

Długość produktu dla wszystkich nicieni z rodzaju Meloidogyne powinna wynieść 

ok. 380 nt. 

UWAGA: 

w każdej analizie powinny być nastawione trzy reakcje kontrolne 

– pozytywna (zawierająca pewny materiał genetyczny pochodzący z gatunku, któ- 

rego obecność próbujemy stwierdzić, np. DNA z M. hapla przy identyfikacji M. 

hapla) 

– negatywna (zawierająca DNA izolowany z innego gatunku) 

– kontrola odczynnikowa (czyli próba zawierająca wszystkie odczynniki użyte do 

w/w analiz, bez DNA). 

Próby b i c powinny dać wynik negatywny. 

3.2.3. Analiza wyników 

Rozdział elektroforetyczny. Wyniki reakcji PCR sprawdza się poprzez rozdzie- 

lenie produktów amplifikacji w 2% żelu agarozowym. Przykładowy wynik uzyskany 

w amplifikacji nicieni M. hapla, M . chitwoodi, M. fallax przedstawia ryc. 1. 

Ryc. 1. Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji PCR nicieni metodą opisaną przez Berry i wsp. 

(2008): 1) M. hapla, 2) M. chitwoodi, 3) M. fallax, K– – próba odczynnikowa, M – marker masy 

cząsteczkowej.


Sekwencjonowanie. Do sekwencjonowania, oprócz produktu, należy przesłać je- 

den ze starterów, dzięki któremu produkt ten otrzymano. Wyniki sekwencjonowania 

należy porównać z danymi zdeponowanymi w Banku Genów (www.ncbi.nlm.nih.gov/ 

Genbank/index.html). 

4. LITERATURA 

Berry SD, Fargette M, Spaull VW, Morand S, Cadet P (2008) Detection and quantification of root-knot 

nematode (Meloidogyne javanica), lesion nematode (Pratylenchus zeae) and dagger nematode (Xiphinema 

elongatum) parasites of sugarcane using real-time PCR. Mel and cell probes 22: 168–176. 

Brinkman H., Goossens J., 1994) Het noordelijk worteklnobbelaaltje Meloidogyne hapla bij Hosta – sorten. 

Gewasbescherming 25: 79–82. 

Karssen G., Brzeski W. M. 1998. Meloidogyne Göldi, 1892. ss: 242–263. W: Nematodes of Tylenchina in 

Poland and temperate Europe. (M. W. Brzeski, eds). Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Warszawa. 

Karssen G. 1999. The plant-parasitic nematode genus Meloidogyne Göldi, 1892 (Tylenchida) in Europe. 

Ph. D. Thesis, University of Gent, 161 ss. 

Kornobis S. 2003. Diversity of Meloidogyne hapla Chitwood, 1949 population in Poland. Russian Journal 

of Nematology 12(1): 31–38 

Oostenbrink M. 1960) Enige bijzondere aaltjesaantastingen in 1959. T. Pl. Zietken 67: 126–127. 

Petersen DJ, Vrain TC (1996) Rapid identification of Meloidogyne chitwoodi, M. hapla and M. fallax using 

PCR primers to amplify their ribosomal intergenic spacer. Fundamental and Applied Nematology 19 

(6): 601–605. 

Wishart J, Phillips MS & Blok VC (2002) Ribosomal intergenic spacer: a polymerase chain reaction diagnostic 

for Meloidogyne chitwoodi, M. fallax, and M. hapla. Phytopathology 92, 884–892. 

Zijlstra C (1997) A reliable, precise method to differentiate species of root-knot nematodes in mixtures 

on the basis of ITS-RFLPs. Fundamental and Applied Nematology 20: 59–63.

Diagnostyka nicieni - Instytut Ochrony Roślin - Poznań

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?