Η ανάγκη χρήσης πρότυπων μικροβιακών συστημάτων στη μελέτη ...

m.biotech.biol.uoa.gr

Η ανάγκη χρήσης πρότυπων μικροβιακών συστημάτων στη μελέτη ...

ΘΕΜΕΛΙΩΣΗ ΤΗΣ «ΚΛΑΣΣΙΚΗΣ» ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ, ΤΟΥΣ ΦΑΓΟΥΣ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣ

1941-45, G. Beadle/E. Tatum – Βιοχημική Γενετική - Τροφικές μεταλλάξεις στην N.

crassa: γονίδια και μεταβολικές αντιδράσεις: ΕΝΑ ΓΟΝΙΔΙΟ ΕΝΑ

ΕΝΖΥΜΟ. Ένωση γενετικής, βιοχημείας, μικροβιολογίας. Μεταλλάξεις στα

βακτήρια, γραμμική διάταξη βακτηριακών γονιδίων (χρωμόσωμα;). S. Luria,

M. Delbrück.

1944, O. Avery, C. McLeod, M. McCarty – Μετασχηματισμός DNA: Φορέας

γενετικής πληροφορίας και όχι το «ηλίθιο» μόριο (Dulbruck). Το DNA πια

εκπροσωπεί τη γενετική οντότητα που είχε ανακαλύψει ο Mendel.

Σεξουαλικότητα βακτηρίων (Streptococcus).

1950, Ε. Chargaff – Ποικιλότητα του DNA λόγω διαφορετικής σύστασης πουρινών,

Α=Τ, G=C.

1952, A. Hershey, M. Chase – Ο ρόλος του DNA στη μόλυνση βακτηρίων από

φάγους (Τ2). Ανακάλυψη σύζευξης, μεταγωγής (J. Lederberg, E. Tatum, N.

Zinder).

E. Wollman – Διακοπτόμενη σύζευξη, χαρτογράφηση του βακτηριακού

χρωμοσώματος.

J. Watson, F. Crick, M. Wilkins – Μοριακή δομή του DNA. Ηδιπλήέλικακαιη

σημασία της συμπληρωματικότητας. Αντιγραφή, μεταλλάξεις, μεταγραφή,

ανασυνδυασμός, μεντελική οντότητα γονίδιο DNA διάταξη πουρινών,

χημικός κώδικας με την μορφή αλφαβήτου. Γονίδιο = Φράση. O ιδιαίτερος

ρόλος της R. Franklin


1951 – 1958. Ανακάλυψη του RNA και προσδιορισμός μοριακής δομής πρωτεΐνης

(ινσουλίνη) – F. Sanger. Gamow-υπόθεση γεν. κώδικα. M. Meselson & F.

Stahl-αντιγραφή DNA

Ένα γονίδιο Μια πρωτεΐνη.

Σχέση ανάμεσα σε δύο γραμμικά πολυμερή. Αλφάβητο 4 γραμμάτων αλφάβητο

20 γραμμάτων τελική δομή («ιδεογράμματα»). Ρόλος ριβοσωμάτων (F.

Crick)

1961 – Ηχρυσήχρονιά.... και η Γαλλική Σχολή

Αγγελιοφόρο RNA, ο «ασύλληπτος» συνδετικός κρίκος – F. Jacob, S. Brenner, M.

Meselson, F. Gros, S. Spegelman: ετερόδιπλο mRNA : DNA μόριο.

Κεντρικό Δόγμα Μοριακής Βιολογίας mRNAπρωτεΐνη – F. Crick

Ο Γενετικός κώδικας. M. Nirenberg, J. Matthei, S. Brenner, S. Benzer, F. Crick,

C. Barnett, R. Watts-Tobin. PolyU = F - F – F…

Γονιδιακή ρύθμιση. A. Lwoff, F. Jacob, J. Monod


Η ΔΕΥΤΕΡΗ ΕΠΑΝΑΣΤΑΣΗ (70’s-80’s)

Ανακάλυψη ενζύμων τροποποίησης του DNA: περιοριστικά ένζυμα, λιγάσες,

πολυμεράσες, μεθυλάσες, φωσφατάσες, κινάσες, κλπ.

Χρήση πλασμιδίων ή φάγων ως φορέων γονιδίων.

Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων.

Μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχιών DNA.

Αντισώματα.

Η ΤΡΙΤΗ ΕΠΑΝΑΣΤΑΣΗ (80’s-00’s)

Τaq Πολυμεράση και PCR

Αυτοματοποιημένες τεχνικές

Γονιδιωματική-Πρωτεωμική–Βιοπληροφορική

ΝΕΕΣ ΑΝΑΚΑΛΥΨΕΙΣ

Μωσαϊκή δομή ευκαρυωτικών γονιδίων, κυτταρικός κύκλος, ενδοκυτταρική μεταφορά, ομοιότητα

μηχανισμών, γονιδιακή ρύθμιση από απόσταση, η θεωρεία του μοριακού μαστορέματος,

διπλασιασμός γονιδίων, πρωτεΐνες μωσαϊκού τύπου, μεταθετά και ρετρομεταθετά στοιχεία,

ογκογονίδια, ρετροιοί, λεπτομερής δομή πρωτεϊνών μέσω αναλύσεων κρυσταλλογραφίας και

NMR, νουκλεοπρωτεΐνες, η σημασία της χρωματίνης, πολυπλοκότητα ρυθμιστικών κυκλωμάτων,

τελομερή, ο αναδυόμενος ρόλος των μικρών RNA στο γονιδίωμα των θηλαστικών,

κρυσταλλογραφία διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, RNAi, κλπ, κλπ.


ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ

Μ Η Χ Α Ν Ι Σ Μ Ο Ι

1. Μεταγραφική ρύθμιση Ι - έλεγχος δράσης του υποκινητή – ταχύτητα παραγωγής

mRNA.

2. Μεταγραφική ρύθμιση ΙΙ - Μηχανισμός «εξασθένησης» παραγωγής mRNA.

3. Μεταγραφική ρύθμιση ΙΙΙ - Εναλλακτικοί παράγοντες σ – έλεγχος δράσης της

πολυμεράσης.

4. Μεταγραφική ρύθμιση ΙV -Μεταγραφική ρύθμιση μέσω μεταθετών στοιχείων.

5. Μετα-μεταγραφική ρύθμιση – Ελεγχος σταθερότητας mRNA – Αποικοδόμηση

mRNA-Δευτεροταγείς δομές mRNA .

6. Μεταφραστική ρύθμιση (tRNA, frameshifting, εξασθένηση).

7. Μετα-μεταφραστική ρύθμιση –(Φωσφορυλίωση).

8. Επιγενετικά φαινόμενα - Μεθυλίωση του DNA


ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ...

μια ανασκόπηση

Μια μεταγραφική οντότητα (γονίδιο) αποτελείται από το DNA μεταξύ του

«υποκινητή», όπου αρχίζει η μεταγραφή, και της «απόληξης» (terminator), όπου

τερματίζεται η μεταγραφή.

Το DNA χρησιμεύει σαν εκμαγείο για την σύνθεση του RNA.

Το υβρίδιο DNA-RNA είναι μικρό (2-3 ζβ) και παροδικό.

Το ολοένζυμο RNA polymerase, α 2

ββ΄, είναι υπεύθυνο για την σύνθεση

(επιμήκυνση) του RNA. Ο παράγοντας «σ» είναι απαραίτητος για το στάδιο της

«έναρξης» μέσω της «αναγνώρισης» του υποκινητή. Ο πυρήνας του ενζύμου α 2

ββ΄

έχει γενική συνάφεια για το DNA αλλά ο «σ» μειώνει την μη-εξειδικευμένη δέσμευση

σε «τυχαίο» DNA, αλλά αυξάνει την συνάφεια της πολυμεράσης για υποκινητές.

Οι βακτηριακοί υποκινητές χαρακτηρίζονται από δύο συντηρημένες αλληλουχίες στις

θέσεις –35 (TTGACA) και –10 (TATAAT) σχετικά με το σημείο έναρξης της

μεταγραφής. Ηπολυμεράση«προσγειώνεται» στην –35 και «απλώνεται» πέρα από

την –10. Καλύπτει 77 ζβ. Το αρχικό «κλειστό» δυαδικό σύμπλοκο γίνεται «ανοικτό»

τήκοντας μια περιοχή 12 ζβ από το –10 ώς το +2. Πολλαπλοί κύκλοι «ανεπιτυχούς»

έναρξης που ελευθερώνουν μεταγραφήματα 2-9 ζβ προηγούνται της κανονικής

έναρξης. Ο παράγοντας «σ» απελευθερώνει και το ένζυμο «συστέλλεται» σε 50 ζβ,

κινείται κατά μήκος του DNA και συνθέτει RNA. Το ένζυμο συστέλλεται σε 30-40 ζβ

όταν η νέα αλυσίδα RNA είναι 15-20 β.


Το ένζυμο προχωρά μ’ έναν μηχανισμό συστολής – διαστολής όπου το πίσω μέρος του

προχωρά 1 ζβ ενώ το πρόσθιο μέρος του παραμένει σταθερό για 7-8 ζβ που θα έχει

κινηθεί το πίσω μέρος.

Εάνσυμβείκάτιτο«ασυνήθιστο», η πολυμεράση καταστρέφει το RNA και

ξαναρχίζει.

Η μεταγραφή τερματίζεται στην «απόληξη» και το DNA επανακτά την δομή της

διπλής έλικας.

Η «δύναμη» του υποκινητή περιγράφει την συχνότητα με την οποία η RNA

πολυμεράση αρχίζει την μεταγραφή. Εξαρτάται από τις αλληλουχίες στις θέσεις –

35 ή –10 –εάν είναι ιδανικές- και από αλληλουχίες καθοδικά του σημείου έναρξης.

Ο βαθμός υπερελίκωσης του DNA, διαφορετικοί παράγοντες «σ», και ρυθμιστικές

πρωτεΐνες επηρεάζουν την δράση της πολυμεράσης.

Ο τερματισμός της μεταγραφής γίνεται σε δύο ειδών θέσεις. Στην «ενδογενή

απόληξη» περιοχές GC σχηματίζουν δομή φουρκέτας που ακολουθείται από μία

σειρά U(T). Στην «ρ-εξαρτώμενη απόληξη» ο παράγων «ρ» αναγνωρίζει μία

περιοχή 50-90 ζβ, πριν το σημείο τερματισμού, πλούσια σε C και φτωχή σε G. H

αντίδραση του τερματισμού απαιτεί υδρόλυση ΑΤΡ. Οι παράγοντες Nus αυξάνουν

την δράση του παράγοντα «ρ» και αποτελούν στόχους «αντι-αποληκτικών»

παραγόντων. Οι παράγοντες «σ» και Nus είναι ανταγωνιστικοί και δεν

συνυπάρχουν ποτέ στην RNA πολυμεράση.


Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ

H ΕΚΦΡΑΣΗ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΣΥΝΕΧΗΣ («ΣΥΣΤΑΤΙΚΗ»)

Τα γονίδια «ανάβουν» και «σβήνουν» σε απόκριση σε φυσιολογικά και αναπτυξιακά

σήματα. Οι μηχανισμοί ρύθμισης ενσωματώνονται σε αλληλοεξαρτώμενα

«κυκλώματα» τα οποία εξασφαλίζουν ότι ομάδες γονιδίων θα τεθούν σε λειτουργία

ή σε αδράνεια με την σειρά που πρέπει. Η σημασία του χρόνου στην γονιδιακή

έκφραση της ανάπτυξης.

ΟΠΕΡΟΝΙΑ

Τα βακτηριακά γονίδια κοινών μεταβολικών οδών συχνά σχηματίζουν οπερόνια

(συνεργιώματα) που εμπεριέχουν όλα τα γονίδια που κωδικεύουν μεταφορείς και

ένζυμα για τον καταβολισμό ή αναβολισμό μιας ουσίας. Αποτέλεσμα της έκφρασης

ενός οπερονίου είναι ένα «πολυσιστρονικό» mRNA που «ωριμάζει» σε αυτόνομα

RNA για κάθε γονιδιακό προϊόν. Ηοπερονικήοργάνωσηεξυπηρετείτην

συνδυασμένη ρύθμιση γονιδίων που εμπλέκονται σε μια κυτταρική λειτουργία.


ΚΥΡΙΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ:

ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ –ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ-XEΙΡΙΣΤΕΣ

Η μεταγραφή ρυθμίζεται από την αλληλεπίδραση «ρυθμιστικών πρωτεϊνών» (transπαράγοντες)

και «χειριστών»(θέσεις cis). Μια ρυθμιστική πρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζει

πολλά γονίδια και με διαφορετικό αποτέλεσμα. Οι χειριστές επηρεάζουν μόνο τα

γονίδια που βρίσκονται δομικά συνδεδεμένα με αυτούς.

ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΔΟΜΙΚΏΝ (S) ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ (R) ΓΟΝΙΔΙΩΝ

R

Επαγωγέαςαναστολέας

O

S

(-/+)

Τέσσερα βασικά συστήματα

ρύθμισης

PCI, NCI, PCR, NCR


ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ

Οι ρυθμιστικοί αναστολείς

παρεμποδίζουν την RNA πολυμεράση

είτε στην δέσμευση στον υποκινητή

είτε στην έναρξη της μεταγραφής είτε

στις επαφές της με τους επαγωγείς

Οι επαγωγείς είτε

ενεργοποιούν την RNA

πολυμεράση, είτε την

βοηθούν να δεσμευθεί σε μηιδανικούς

στόχους DNA στον

υποκινητή είτε

παρεμποδίζουν τις επαφές της

με τους αναστολείς


ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΕΣ ΩΣ

ΣΥΝΕΠΑΓΩΓΕΙΣ, ΣΥΝΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ, ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ Η ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ….

Μικρά οργανικά μόρια (μεταβολίτες), που συνήθως είναι ουσίες σχετικές με το

μεταβολικό μονοπάτι το οποίο κωδικεύει ένα συγκεκριμένο οπερόνιο, ρυθμίζουν

θετικά ή αρνητικά τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες μέσω αλλοστερικών αντιδράσεων που

προκαλούν στις ρυθμιστικές πρωτεΐνες όταν αυτές είναι «ελεύθερες» ήήδη

δεσμευμένες στους υποκινητές. Ονομάζονται συνεπαγωγείς, συναναστολείς αλλά

και επαγωγείς ή αναστολείς

Οόροςgratuitous inducer. Η ικανότητα ενός μορίου να λειτουργεί ως

συνεπαγωγέας/συναναστολέας των ρυθμιστικών πρωτεϊνών δεν συνεπάγεται ότι το

μόριο αυτό μπορεί πάντα να καταβολισθεί από τα ένζυμα που κωδικεύονται από το

οπερόνιο που ενεργοποιείται (J. Monod)


Αρνητική ρύθμιση

Θετική ρύθμιση

R

o

S

NCI

PCI

π.χ. lac operon

ΕΠΑΓΩΓΗ

(-)

Επαγωγέας

Ανενεργός

Αναστολέας

R o

(+)

Επαγωγέας

S

Eνεργός

Eπαγωγέας

π.χ. καταβολισμός

N, C

ΑΝΑΣΤΟΛΗ

R

o

(-)

Συναναστολέας

S

Eνεργός

Αναστολέας

NCR

Επαγωγέας

R

o

(+)

Συναναστολέας

PCR

S

π.χ. try operons

γεν-καταβολισμός C

π.χ. γενικός έλεγχος

καταβολισμού Ν


ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

1. Δέσμευση στον «χειριστή» -αναγνώριση στόχου στο DNA

2. Δέσμευση – αλληλεπίδραση με το μικρό μόριο

συνεπαγωγέας – συναναστολέας

3. Ενεργοποίηση του βασικού μεταγραφικού μηχανισμού – Πολυμεράση

4. Ικανότητα των ρυθμιστικών πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν (συνεργατικά

ή ανταγωνιστικά) με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες


ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΩΝ ΟΠΕΡΟΝΙΩΝ

Μεταλλαγές στην ρυθμιστική πρωτεΐνη ή στον χειριστή.

Στα δομικά γονίδια οι μεταλλαγές επηρεάζουν μόνο την πρωτεΐνη που κωδικεύεται.

Στον χειριστή οι μεταλλαγές

επηρεάζουν όλα τα γονίδια –

πρωτεΐνες του οπερονίου που

βρίσκονται σε θέση –cis (cisdominant,

trans-recessive)


ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΩΝ ΟΠΕΡΟΝΙΩΝ

Στο ρυθμιστικό γονίδιο οι μεταλλαγές

επηρεάζουν όλα τα γονίδια, όλων των

οπερονίων (-cis και –trans) που

βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο της

αντίστοιχης ρυθμιστικής πρωτεΐνης.

Πλειοτροπικές μεταλλαγές.


ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ

1. Στο μοτίβο-περιοχή αναγκαίο για την δέσμευση στο DNA.

2. Στο μοτίβο που αναγνωρίζει το μικρό μόριο επαγωγής ή αναστολής.

3. Στο μοτίβο που χρειάζεται για την ενεργοποίηση της πολυμεράσης.

4. Σε περιοχές που αλληλεπιδρούν (συνεργατικά ή ανταγωνιστικά) με άλλες

ρυθμιστικές πρωτεΐνες

5. Σε άλλες περιοχές που έμμεσα επηρεάζουν τα παραπάνω μοτίβα, συνήθως

μέσω του αποτελέσματος που έχουν στην γενική δομή του μορίου.


ΕΙΔΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ

ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΟΠΕΡΟΝΙΟΥ

Θ

Ε

Τ

Ι

Κ

Ε

Σ

Μερική απώλεια λειτουργικότητας (partial loss of function)

Μεταλλαγές που είτε μειώνουν την απόδοση της πρωτεΐνης, είτε επηρεάζουν ένα

από τα μοτίβα λειτουργίας της (δέσμευση στο DNA, δέσμευση ρυθμιστικού

μορίου, κλπ).

Αλλαγή της λειτουργίας (gain-of-function)

Απόκτηση νέας λειτουργίας. π.χ. δέσμευση σε νέους στόχους αναγνώριση άλλων

μορίων.

Ολική απώλεια λειτουργικότητας (loss-of-function)

Σημειακές, εξαλείψεις, παρεμβολές, κλπ. Σ’ ένα αρνητικό κύκλωμα τέτοιες

μεταλλαγές στο R γονίδιο οδηγούν σε συνεχή («συστατική») έκφραση του

οπερονίου, ενώ σ’ ένα θετικό κύκλωμα οδηγούν στην μη-έκφραση του

οπερονίου («μη-επαγωγή»).


Μεταλλαγή PCI PCR NCI NCR

Απώλειας

λειτουργίας

ΜΗ –

ΕΠΑΓΩΓΗ

-

ΜΟΝΙΜΗ

ΑΝΑΣΤΟΛΗ

-

ΣΥΝΕΧΗΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ

+

ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ

(ΣΥΝΕΧΗΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ)

+

Απώλεια

ικανότητας

δέσμευσης στο

DNA

ΜΗ –

ΕΠΑΓΩΓΗ

-

ΜΟΝΙΜΗ

ΑΝΑΣΤΟΛΗ

-

ΣΥΝΕΧΗΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ

+

ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ

(ΣΥΝΕΧΗΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ)

+

Απώλεια

ικανότητας

δέσμευσης με

επαγωγέααναστολέα

ΜΗ –

ΕΠΑΓΩΓΗ

-

ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ

+

ΜΟΝΙΜΗ

ΑΝΑΣΤΟΛΗ

-

ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ

+

Μόνιμη

δέσμευση στο

DNA

ΣΥΝΕΧΗΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ

+

ΣΥΝΕΧΗΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ

+

ΜΟΝΙΜΗ

ΑΝΑΣΤΟΛΗ

-

ΜΟΝΙΜΗ

ΑΝΑΣΤΟΛΗ

-


ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

1) Οφαινότυποςπου προκαλεί μια μεταλλαγή είναι αποκαλυπτικός όσον

αφορά: (i) στο είδος του γονιδίου (ρυθμιστικό, δομικό, χειριστής)

(ii) στο είδος του κυκλώματος

2) Η συχνότητα του φαινότυπου αυτού είναι επίσης ενδεικτική του είδους

του μεταλλαγμένου γονιδίου

Άλλα κριτήρια που μας αποκαλύπτουν το είδος του κυκλώματος είναι:

3) Γενετική «κυριαρχία» (dominance) των μεταλλαγών, π.χ. σε «αρνητικά»

συστήματα, «αρνητικές» μεταλλαγές είναι «υπολειπόμενες», ενώ οι

«θετικές» μεταλλαγές είναι «κυρίαρχες». Το αντίθετο σε «θετικά»

συστήματα. Πρόβλημα όταν η «κυριαρχία» είναι ποσοτικά εξαρτώμενη

4) Φαινότυποι μεταλλαγών «αναστροφής» (reversion). Σε «θετικό»

κύκλωμα, «αρνητικές» μεταλλαγές αναστρέφονται σε φυσιολογικούς

φαινότυπους. Σε αρνητικό κύκλωμα «αρνητικές» μεταλλαγές

αναστρέφονται σε μεταλλαγές συνεχούς έκφρασης


ΠΡΟΤΥΠΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ

ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ


Πλεονεκτήματα

Ταχεία αύξηση με μορφή αποικιών (2-3h χρόνος διπλασιασμού)

Μαζική παραγωγή. Απλά θρεπτικά Οικονομικά

συστήματα

Moνοκύτταροι

οργανισμοί (ζύμες)-μονοπυρηνικάμονοπυρηνικά σπόρια (νηματοειδείς)

Κατάλληλοι για γενετική ανάλυση, καθώς είναι απλοειδείς οργανισμοί

αλλά μπορούν να υπάρξουν και σε διπλοειδή κατάσταση – Γενετικοί χάρτες

Μικρό γονιδίωμα

(1/100-1/200

1/200 ανθρώπινου)

S. cerevisiae 1.4 x 10 7 bp

A.nidulans

2.7 x 10 7 bp

Ικανότητα μετασχηματισμού – «αντιστροφή» γενετική

Ποικιλία εξωγονιδιωματικών φορέων, συστημάτων στοχευμένης

ενσωμάτωσης – αντικατάστασης γονιδίων, knock-outs

outs, κλπ.

Κυτταρικοί ή μοριακοί μηχανισμοί όμοιοι με αυτούς των αντίστοιχων

ανώτερων ευκαρυωτικών (>30% γονιδίων ομόλογα με ανθρώπινα γονίδια)

Συστήματα έκφρασης γονιδίων από ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς


ΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ…..

Ζύμες

Saccharomyces cerevisiae

Schizosacharomyces pombe

Νηματοειδείς

μύκητες

Aspergillus nidulans

Neurospora crassa


ΛΙΓΑ ΙΣΤΟΡΙΚΑ…..

Μερικά από τα καλύτερα στιγμιότυπα

Πρώτο μισό του αιώνα, S. cerevisiae, A. nidulans & N. crassa, θεμελιώνονται ως

εξαιρετικά συστήματα γενετικής ανάλυσης – Φυλετικός κύκλος, διασταυρώσεις,

ανάλυση ασκών, γενετικοί χάρτες, κλπ

1941, Beadle & Tatum, μεταλλαγές αυξοτροφίας στη N. crassa, θεμελίωση του

δόγματος ένα γονίδιο-ένα

ένζυμο (πρωτεΐνη).

Η αρχή της σύγκλισης γενετικής-

βιοχημείας.

1949, Lindegren, Συζευκτικοί τύποι στο S. cerevisiae

1952, Ανακάλυψη του παραφυλετικού κύκλου στον A. nidulans από Pontecorvo &

Roper

1960-1970

1970’s s EδραίωσηE

του γενετικού κώδικα και αναλόγων ρυθμιστικών

κυκλωμάτων (Scazzocchio, Arst, Hershkowitz, Guarente) αλλά και της έλλειψης

οπερονίων στα ευκαρυωτικά


1970-1980

1980’s,

Επίτευξη γενετικού μετασχηματισμού στη ζύμη (1978) και σε νηματοειδείς

(1984), Απαρχή της Μοριακής Γενετικής σε ευκαρυωτικά. Μεταλλαγές ρύθμισης του

κυτταρικού κύκλου cdc σε S. cerevisiae & S. pombe (Nurse, Nasmyth , Hartwell)

Μεταλλαγές ελαττωματικής έκκρισης sec (Sheckman(

Sheckman),

Μεταλλαγές μεταφραστικής &

μεταγραφικής ρύθμισης (Hinnebush, Struhl, Fink, Cooper) στον S. cerevisiae .

Μεταλλαγές κιρκαδικής ρύθμισης και επιγενετικών φαινομενένων RIP, MIP, quelling,

(Selker, Faugeron, Rosignol),

μεταλλαγές ρύθμισης κυτταροσκελετού (Morris,

Osmani)

σε Neurospora, Aspergillus, Podospora, Ascobolus

1990’s Γονιδίωμα Saccharomyces cerevisiae (Goffeau(

Goffeau, , 1996). Two-hybrisd

system

(Fields & Song 1990). Μεταλλαγές ρύθμισης της μεταγραφής μέσω τροποποίησης της

χρωματίνης στον S. cerevisiae

2000’s Πρώτη πλήρης συλλογή απενεργοποιημένων γονιδίων (knock-outs) στον S.

cerevisiae. Γονιδιώματα Aspergillus nidulans, Schizosaccharomnyces pombe,

Neurospora crassa. Γονιδιώματα συγγενών παθογόνων μυκήτων.


ΤΟ ΠΡΩΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΒΗΜΑ ΣΤΗΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ– Η

ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ

ΤΟΥ S. cerevisiae

~ 6000 γονίδια

(~2κβ

Μ.Ο.) .)

120 rRNAs

40 sRNA

274 tRNA

51 ρετρομεταθετά

στοιχεία Τy

Ιντρόνια μόνο σε rRNA

1 cM~ 3kb

28% γνωστές λειτουργίες

26% ορφανά γονίδια

σε Β.Δ.

11% μόνο στον Saccharomyces

15% ομόλογα με γνωστές

πρωτεΐνες

14% ομόλογα μοτίβα

6% Α.Π.Μ. . ??

>30% γονίδια ομόλογα

ανθρώπινων γονιδίων

περιλαμβανομένων και

γονιδίων «ασθενειών»

Organism

Zea mays

(corn)

H. sapiens

(human)

C. elegans

D. melanogaster

(fruit fly)

A. nidulans

S. cerevisiae

(yeast)

E. coli

10

23

1.05 x 10 8

14000 γονίδια

2.7x x 107 bp

14000 γονίδια

1.4x 10 7 bp

4x 10 6 bp

Chromosomes

Per haploid

cell

4

8

16

106 107 108 109 1010

DNA content per cell (bp)

1


Οικογένειες πρωτεϊνών

Cytoplasmic structure

Organelle biogenesis

Nuclear structure

Cell envelope

Signal transduction

Cell rescue

Not clear-cut

cut

Amino acids

Nitrogen/Sulfur

Nucleotides

Phosphate

Intracellular trafficking

Transport facilitators

Protein shaping

Translation

Transcription, transcription

control

Carbohydrates

Lipids

Cofactors

Energy metabolism

Cell growth, cell division,

DNA synthesis

14 Κατηγορίες Πρωτεϊνών του Σακχαρομύκητα

1/3 ΓΟΝΙΔΙΩΝ

ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΓΙΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗ


ΦΥΛΕΤΙΚΟΣ & ΑΦΥΛΕΤΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΣΤΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣ ΜΟΝΤΕΛΑ


Απομόνωση μεταλλαγών, ταξινόμηση σε επικρατούσες-υπολειπόμενες

υπολειπόμενες,

θετικές-αρνητικές

Η «φύση» μιας μεταλλαγής

μπορεί να μελετηθεί με 4 γενετικά Τεστ

•Γενετικού

Διαχωρισμού. Ένα γονίδιο;

Διασταύρωση με φυσιολογικό τύπο (wt)

&

αναζήτηση του 1:1

•Επικράτειας. Φαινότυπος σε διπλοειδή.

•Γενετικής

Συμπλήρωσης. Τεστ

λειτουργίας σε διπλοειδή. Είναι δυο

μεταλλαγές λειτουργικά

συμπληρωματικές;

•Γενετικής

Σύνδεσης. Τεστ τοπολογίας.

Είναι δυο μεταλλαγές γενετικά

συνδεδεμένες (στο

ίδιο γονίδιο);

Ανάλυση απογόνων


Υπάρχουν εξαιρέσεις όπου τα

τεστ δίνουν «περίεργα»

αποτελέσματα;

•Ενδογονιδιακή

συμπληρωματικότητα

•Μη-συνδεδεμένη

μη-

συμπληρωματικότητα


ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae

Μεθοδολογία όμοια του χημικού μετασχηματισμού βακτηρίων

Μεθοδολογία επιλογής μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση

μεταλλαγής

Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ - (προτιμότερα

με

Μεταλλαγή ολικής έλλειψης) και πλασμίδιο με φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ +

Κύτταρα στη λογαριθμική φάση αύξησης (OD=0.5)

Επώαση σε οξικό Li (ανάλογο

του Ca ++ , Rb ++ στα βακτήρια)-ρευστοποίηση

ρευστοποίηση μεμβράνης

Πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG)+DΝΑ

(πλασμίδιο)

Θερμικό σοκ 42 ο C

Eπώαση

σε επιλεκτικό θρεπτικό (συνήθως

θρεπτικό χωρίς

Απόδοση: διαφέρει ανάλογα το πλασμίδιο (αυτόνομο

ή ενσωμάτωσης),

μέγιστη 10 5- 6 τ/μg


ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae

Πλασμίδια που αντιγράφονται σε βακτήρια

(Ε.coli) και στον S. cerevisiae

Περιέχουν γονίδια επιλογής σε E. coli

(συνήθως

Α r ) και σε S. cerevisiae (LEU2,

TRD1,

HIS3,

URA3,

κλπ).

Πλασμίδια ενσωμάτωσης στο

γονιδίωμα

ARS


CEN

Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής που

περιέχουν αλληλουχίες

λουχίες αυτόνομης

αντιγραφής ARS από το γονιδίωμα του S.

cerevisiae ή το φυσικό πλασμίδιο 2μ

Τα πλασμίδια 2μ υπάρχουν >12

αντίγραφα/κύτταρο

και είναι σταθερά.

Τα πλασμίδια ARS υπάρχουν επίσης σε

πολλαπλά αντίγραφα αλλά

είναι ασταθή εκτός εάν περιέχουν και

αλληλουχίες CEN από το κεντρομερές του

S. cerevisiae. Τα πλασμίδια ARS-CEN

CEN: : 1-21

αντίγραφα/κύτταρα

κύτταρα.


-

ΓΟΝΙΔΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae

Απαραίτητοι για την αναγνώριση των γενετικά τροποποιημένων

κυττάρων – κλώνων.

Κυρίως γονίδια ενζύμων του μεταβολισμού αμινοξέων και

βάσεων που αρχικά κλωνοποιήθηκαν σε βακτήρια.

Leu2 +

Mετασχηματισμός

στελέχους

Leu2 -

Ανάλογο σύστημα με αυτό των

βακτηρίων όπου κυρίως

χρησιμοποιούνται γονίδια

ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά.

Leu2 +


Κυριότερα Γονίδια Επιλογής στον S. cerevisiae

γονίδια βιοσύνθεσης αμινοξέων-πυριμιδινών

YEAST

SELECTABLE

ΜARKERS

G ENE

E NZYME

S ELECTION

HIS3

LEU2

LYS2

Imidazole glycerolphosphate dehydratase

β-Isopropylmalare

dehydrogenase

a-Α minoadipate reductase

histidine

leucine

lysine

TRP1

N-(5

΄-phosphoribosyl)

-anthranilate isomerase

tryptophan

URA 3

Orotidine -5΄-phosphate decarboxylase

uracil


Ο ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΝΗΜΑΤΟΕΙΔΩΝ (Α. nidulans)

Μεθοδολογία όμοια αλλά και με σημαντικές διαφορές του μετασχηματισμού ζυμών

Επιλογή μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση μεταλλαγής.

Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ - και πλασμίδιο με

φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ + . Σπανιότερα χρησιμοποιούνται και γονίδια

ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά όπως η ολιγομυκίνη, φλυομυκίνη, υγρομυκίνη.

Διάκριση υπολειπόμενων και κυρίαρχων γενετικών στοιχείων επιλογής

μετασχηματισμένων στελεχών

Mετασχηματισμός

πρωτoπλαστ

πλαστών)σεσε ισοοσμωτικό περιβάλλον. Το κυτταρικό

τοίχωμα καταστρέφεται με ενζυμική πέψη (μέσω

λυτικών ενζύμων).

Οι πρωτόπλαστες, που μπορεί να προέρχονται από μυκήλιο (πολυπύρηνοι) ή

κονιδιοσπόρια (1-2 πυρήνες),

απομονώνονται από το μείγμα, προστίθεται DNA

(πλασμίδιο) και PEG. Η σύντηξη πρωτόπλαστων οδηγεί σε «είσοδο» του DNA.

Αναγέννηση πρωτόπλαστων – μετασχηματισμένων πυρήνων

Χαμηλής – Μέσης απόδοσης : 10-10

4 t/μg g DNA. Εξαρτημένη από το πλασμίδιο.

Πλασμίδια ενσωμάτωσης: : 10-1000

1000 τ/μg

Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής: : 100.000 τ/μg

Αλλες μέθοδοι: Ηλεκτροδιάτριση, Βιολιστικός βομβαρδισμός. Οχι ιδιαίτερα

αποδοτικότεροι των κλασσικών μεθόδων.


ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ A. nidulans

Πλασμίδια που περιέχουν αλληλουχίες

αντιγραφής (OriC) και επιλογής (Α r ) σε E.

coli και γονίδιο επιλογής στον A. nidulans

(ανθεκτικότητα

σε αντιβιοτικά ή

συμπλήρωση μεταβολικής ανεπαρκείς π.χ.

argB, amdS, pyrG)

Τα πλασμίδια αυτά ενσωματώνονται στο

γονιδίωμα σε ομόλογες ή μη ομόλογες

περιοχές. Η ενσωμάτωση τους μπορεί να

οδηγήσει σε απλή ή πολλαπλή

ενσωμάτωση του πλασμιδίου ή

αντικατάσταση ολοκλήρου ή μέρους του

γονιδίου από το γονιδίωμα

Πλασμίδια τύπου ARS χρησιμοποιούνται αλλά είναι ιδιαίτερα ασταθή και δεν

χρησιμοποιούνται

ευρέως


Η ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΤΟΥΝ

A. nidulans

Στον S. cerevisiae, πλασμίδια που δεν φέρουν αλληλουχίες 2μ ή ARS ενσωματώνονται

κυρίως με ομόλογο ανασυνδυασμό. Ο ετερόλογος (τυχαίος;)

ανασυνδυασμός είναι

πολύ σπάνιος

Στον A. nidulans, τα πλασμίδια ενσωματώνονται με

ομόλογο και/ή ετερόλογο ανασυνδυασμό

Η ενσωμάτωση μπορεί να είναι απλή ή πολλαπλή

γονιδιωματικό

αντίγραφο argB

(μάρτυρας)

Μ

τ1 τ2 τ3

Απλή ετερόλογη

ενσωμάτωση

Απλή ομόλογη ενσωμάτωση

Τριπλή ομόλογη ενσωμάτωση

Σε όλους τους μύκητες, γραμμικό πλασμιδιακό DNA ενσωματώνεται με διπλό ομόλογο

ανασυνδυασμό που συνήθως οδηγεί σε γονιδιακή αντικατάσταση στο γονιδίωμα.


ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ

ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ ΜΥΚΗΤΩΝ

Ομόλογος Ανασυνδυασμός

Α

Χ

Α΄

απλό

cross-over

over

Ετερόλογος Ανασυνδυασμός

Χ

απλό

cross-over

over

Διπλασιασμός γονιδίου Α

Εάν η θέση ενσωμάτωσης

αντιστοιχεί σε γονίδιο =

απενεργοποίηση

Γονιδιακή αντικατάσταση

Χ

Α

Α΄

Χ

Α΄


ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ

ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ και ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ

Σπουδαίο «εργαλείο» για την λειτουργική ανάλυση γονιδίων

α) Αντικατάσταση – με γραμμικό

ομόλογο DNA, το οποίο «διορθώνει» το

μεταλλαγμένο γονίδιο και επιτρέπει την

άμεση επιλογή μετασχηματισμένων

στελεχών.

Χ

Α -

Α +

μεταλλαγή

Χ

Α +

β) Στοχευμένη ενσωμάτωση μέσω συγκεκριμένων αλληλουχιών π.χ. ένα πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο

επιβολής Α και το γονίδιο υπό μελέτη Β προτιμούμε να ενσωματωθεί μέσω αλληλουχιών Α, ώστε το

υπό μελέτη γονίδιο Β να παραμείνει όπως έχει χωρίς να ανασυνδυαστεί – Το γονίδιο Β του πλασμιδίου

είναι ελλειπές ή φέρει μεταλλαγή, άλλη από αυτή του γονιδίου Β του γονιδιώματος.

Επιλέγοντας στελέχη Β + , επιλέγουμε τους παραπάνω ανασυνδυασμούς...

Α

Χ

Β -

Β -

Α

Χ

Β Δ

Β -

Β -- Α

Β -Δ

Α

Β +


γ) Στοχευμένη απενεργοποίηση γονιδίου∗

∗ Σε περίπτωση θνησιγόνων απενεργοποιήσεων ο μετασχηματισμός γίνεται σε διπλοειδή κύτταρα...

Α +

1) Χρησιμοποιόντας γραμμικό DNA που

φέρει γονίδιο επιλογής το οποίο

«διακόπτει» το Α.Π.Μ. του γονιδίου που θα

αντικατασταθεί

Χ Β +

Α - , Β +

Χ

x

Α +

Α -

x

2) Χρησιμοποιώντας πλασμίδιο που φέρει μέρος

του γονιδίου για απενεργοποίηση.

A +

ΧhoI

3) Ενσωμάτωση μέσω δράσης περιοριστικού ενζύμου

(REMI).

Τα άκρα XhoI του πλασμιδίου, παρουσία του

ενζύμου XhoI, ανασυνδυάζονται σε θέσεις XhoI στο

γονιδίωμα. Αν το γονίδιο μας έχει θέση XhoI οι πιθανότητες

απενεργοποίησης του μέσω ενσωμάτωσης του πλασμιδίου

είναι μεγάλες.

Χ

B +

B +


«ΔΙΑΣΩΣΗ» ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ A. nidulans ή S. cerevisiae

x

A r

Προϋπόθεση της μελέτης γονιδίων που

μετασχηματίζουν στελέχη μυκητών και τους

προσδίδουν ενδιαφέροντες φαινοτύπους είναι η

απομόνωση των πλασμιδίων που εμπεριέχουν τα

γονίδια αυτά. Η «διάσωσή» τους γίνεται σε

βακτήρια E. coli.

απομόνωσηDNA

A r

μετασχ.

βακτηρίων

Στον S. cerevisiae όπου χρησιμοποιούνται κυρίως

αυτόνομα αντιγραφικά πλασμίδια αυτό είναι απλό.

Τα κύτταρα λύονται και μετασχηματίζουμε

βακτήρια επιλέγοντας Α r καθώς όλα τα πλασμίδια

του S. cerevisiae φέρουν το γονίδιο Α r .

EcoRI

A r

+ T4 λιγάση

EcoRI

EcoRI

A r

Στον A. nidulans όπου τα πλασμίδια ενσωματώνονται

στο γονιδίωμα, η «διάσωσή» τους είναι

δυσκολότερη αλλά εφικτή λόγου μιτωτικής ή

μειωτικής «εξωσωμάτωσης» (excision) των

πλασμιδίων – κυρίως όταν αυτά δημιουργούν

διπλασιασμούς γονιδίων. Εναλλακτικά μπορούμε

να «αποκόψουμε» την περιοχή ενσωμάτωσης και

να την απομονώσουμε


ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ

Πλεονεκτήματα

Ύπαρξη εκατοντάδων

μεταλλαγμένων στελεχών

στους μύκητες...

Η ευκολία απομόνωσης νέων

μεταλλαγμένων στελεχών.

Η ευκολία παραγωγής πλήρων

γενωμικών βιβλιοθηκών λόγω

του μικρού γονιδιώματος

και της απουσίας ιντρονίων (ή

παρουσίας μικρών ιντρονίων).

Η δυνατότητα κλωνοποίησης

γονιδίων μικρής ομοιότητας ή

μη-ομολόγων

γονιδίων

από άλλους οργανισμούς.


ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΝΤΑΣ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ


ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ

Ένα μοναδικό εργαλείο για την in vivo μελέτη ενδογονιδιακών ή διαγονιδιακών

αλληλεπιδράσεων

Κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουν το

αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή

Μια κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να είναι:

1.Ενδογονιδιακή

2.Διαγονιδιακή

• Οι Ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:

1.Αν

Ανaστροφή

της αρχικής μεταλλαγής

2.Μεταλλαγή

«Δεύτερης

θέσης»

Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι:

1. Εξειδικευμένες ως προς την αρχική

μεταλλαγή (allele-specific)-

Υποδηλώνουν «επαφές».

2. Μη-εξειδικευμένες

ως προς την αρχική

μεταλλαγή (allele non-specific

specific)

Υποδηλώνουν εναλλακτικούς

μηχανισμούς (by-pass)


Οι Διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:

1. Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής

λειτουργίας (by-pass)

2. Σε γονίδιο που κωδικεύει πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την

αρχικά μεταλλαγμένη πρωτεΐνη

Μεταφραστική καταστολή


ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ

ΜΕΣΩ ΑΠΛΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΉΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

…..και

με με τη βοήθεια του PCR για τις ενδογονιδιακές μεταλλαγές

More magazines by this user
Similar magazines