Μικροβιακή Î£Ï Î½Î´Ï Î±ÏƒÏ„Î¹ÎºÎ® Βιοσύνθεση: Σχεδιασμός νέων ...

Μικροβιακή Συνδυαστική Βιοσύνθεση:
Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων
Αλέξανδρος Σίσκος
Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας,
Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας
alesiskos@bio.uth.gr
Μεταπτυχιακό δίπλωμα ειδίκευσης: “Μικροβιακή Βιοτεχνολογία”
Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
20 Ιανουαρίου 2010

• Μικροβιακή Συνδυαστική Βιοσύνθεση:
Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων
Polyketide drug design with combinatorial biosynthesis/
bioengineering
• Σχεδιασμός νέων φαρμάκων και βιοενεργών ουσιών με τη βοήθεια
γονιδιακών αλλαγών
• Μικροοργανισμοί ως κυτταρικά εργοστάσια μακρομορίων
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 2

ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ
•Μεγάλη ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών με
εξαιρετικά μεγάλη ποικιλία στις δομές. Παράγονται από
μύκητες, βακτήρια, φυτά, θαλάσσιους οργανισμούς.
•Ο παραδοσιακός ορισμός τους θεωρεί ότι παράγονται
από τη συμπύκνωση (πολυμερισμό, συνένωση)
μονάδων οξικού κατά τρόπο ‘κεφαλή-ουρά’. (Λιπαρά
οξέα, τερπένια)
•Ενώσεις εξαιρετικά μεγάλης βιολογικής σημασίας και
χρήσεων (αντιβιοτικά, αντικαρκινικά)
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 3

O
O
O
O
O
O
OH
Tartolon B
ΜΑΚΡΟΛΙΔΙΑ (macrolides)
Na
B
OH
O
O
O
O
O
O
Me
HO
Me
Me
O
O
OH
Me
O
Me
O
Me
Me
O
OH
OH
Me O
O
OMe
Me
erythromycin A
αντιβιοτικό
Me
OH
NMe 2
OCH 3
O
OCH 3
O
O
OH
soraphen A
αντιμυκητιακό
OCH 3
OH
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 4

ΠΟΛΥΕΘΕΡΕΣ ΚΑΙ ΠΟΛΥΕΝΙΑ
OMe
HO
O
HO
MeO
O
H
O
H
O
O
H
O
H
MeO
O
O
OH
O
HO 2 C
Monensin A
αντιβιοτικό
OH
N
O
O MeO
OH H
O
rapamycin
ανοσοκαταστολέας
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 5

ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ
MeO
O
O
OH
O
OH
Me
OH OH O
rubrofusarin
OMe
O
OH
O
O
MeO
O
O
Aflatoxin B1
καρκινογόνος μυκητοξίνη
O
O
O
OH NH 2
daunomycin
αντικαρκινικό
CO 2 H
OH
6-methylsalicylic acid
αρωματικό αντιβιοτικό
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 6

ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ
• Κοινό χαρακτηριστικό όλων των πολυκετιδίων είναι ο
τρόπος με τον οποίο κατά τη διάρκεια της
βιοσύνθεσής τους σχηματίζονται νέοι δεσμοί C-C:
αποκαρβοξυλιοτική συνένωση μαλονικού και ενός
άκυλο θειοεστέρα με αποτέλεσμα την παραγωγή
ενός β-κετο-θειοεστέρα.
• Ο βιοσυνθετικός μηχανισμός προσομοιάζει εξαιρετικά
με τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων και μάλιστα η
βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων μπορεί να θεωρηθεί
απλά σαν μια ειδική περίπτωση βιοσύνθεσης
πολυκετιδίων.
• Πως τόσο διαφορετικά δομικές ενώσεις προέρχονται από την
ίδια βιοσυνθετική οδό (pathway)?????
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 7

H 3 C
(5)
O
SCoA
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ
acetyl-CoA
carboxylase CO 2
O
O
SACP
OH
O
SACP
O
SCoA
OH
O
malonyl-SCoA
ACP
CoASH
O
SACP
OH
O
malonyl-SACP
O
SACP
O
fatty acid
malonyl-SCoA
SACP
O
SACP
CO 2
HSCoA
O
OH
O
O
O
SACP
SACP
SACP
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 8

ΠΡΟΤΕΙΝΗ ΦΟΡΕΑΣ ΑΚΥΛΙΟΥ
(acyl carrier protein ACP)
SH
N
H
O
N
H
O
O
O-
P O
O
NH
O
4'-phosphopantetheine moiety
peptide chain
Ο ‘βραχίονας’ φωσφοπαντοθενικού της ACP
(θειοεστέρας) πηγαινοφέρνει τα υποστρώματα
μεταξύ των ενζυμικών ενεργοτήτων

R
O
O
AT
KS
ACP
KR
DH
ER
O
R
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΩΝ
SCoA
CO 2
O
SCoA
AT
acyl transferase
keto synthase
acyl carrier protein
keto reductase
dehydratase
enoyl reductase
Ομάδα εκκίνησης
(starter unit)
R
S
KS
O
R
O
S
*
ACP
Ομάδα επέκτασης
(extender unit)
O
O
CO 2
SH
KS
R
R
S
ACP
R
R
R
R *
*
R
R *
O
O
S
S
S
ACP
ER
ACP
DH
ACP
Σχηματισμός δεσμού C-C στη βιοσύνθεση πολυκετιδίων προς παραγωγή δι-, τρι-, πολυκετιδίων
*
KR
O
O
OH
O

ΔΟΜΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΠΟΛΥΚEΤΙΔΙΩΝ
(σύγκριση με FA)
• Οφείλεται στην επιλογή της ομάδας εκκίνησης (οξικό,
προπιονικό, βουτυρικό, φαινολικό)
• Στην ικανότητα ενσωμάτωσης όχι μόνο ομάδων οξικού, αλλά και
ομάδων προπιονικού (C 3 ) και βουτιρικού (C 4 ) και στον αριθμό
αυτών των ομάδων
• Στο διαφορετικό βαθμό αναγωγής της κέτο ομάδας του β-κετοθειοέστερα
• Συνεπώς προκύπτουν μέχρι και δυο οπτικώς ενεργά κέντρα για
κάθε βιοσυνθετικό κύκλο
• Διαφορετικές αντιδράσεις κυκλοποίησης
• ‘Μέτα πολυκετιδικές’ τροποποίησεις όπως οξειδώσεις,
αναγωγές, μεθυλιώσεις, ακυλιώσεις, γλυκοσυλιώσεις
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 11

ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΩΝ
O
Πλήρης αναγωγή
SEnz
fatty acids
pathway A
R
O
SEnz
+ n
R
O
SEnz
CO 2 H
pathway B
OH OH O O
SEnz
pathway C
complex polyketides
type I
O O O O O O
Καμία αναγωγή
SEnz
aromatic polyketides
type II
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 12

ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ
(Polyketide synthases PKS)
•Οι διαφορές στις δομές των πολυκετιδίων προκύπτουν
από διαφορές στην ενζυμική αρχιτεκτονική, οργάνωση
και λειτουργία.
•Υπάρχουν δυο ακραίες μορφές ενζυμικής οργάνωσης
(όπως και στα FA).
•PKS τύπος I
•PKS τύπος II
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 13

ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ
(Polyketide synthases PKS)
• TYPE I (modular) PKS: πολύπλοκα ενζυμικά συστήματα. Κάθε
αντίδραση της βιοσύνθεσης πραγματοποιείται από μια ξεχωριστή
ενζυμική δραστικότητα (περιοχή-domain) και ηοποία
χρησιμοποιείται κατά κανόνα μια και μόνο φορά. Οι περιοχές
(domain) υπεύθυνες για μια δομική μονάδα ακυλίου είναι
οργανωμένες σε στοιχεία δραστικοτήτων (module) και τα οποία
είναι οργανωμένα σε μια η περισσότερες πολυδραστικές πρωτεΐνες
(πολύ μεγάλου μεγέθους).
• Παράγουν πολύπλοκα μη-αρωματικά πολυκετίδια όπως τα
μακρολίδια, οι πολυεθέρες, τα πολυένια. Απαντώνται συνήθως σε
βακτήρια και θαλάσσιους οργανισμούς. Διαφορετικός βαθμός
αναγωγής σε κάθε βιοσυνθετικό κύκλο. Χρήση προπιονικού,
βουτυρικού.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 14

ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ ΤΗΣ
ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ TYPE I (modular) PKS
eryAI
eryAII
eryAIII
gene level
3 πλαίσια αναγνωσης
load
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3
module 2
module 4
module 6
module 1
module 3
module 5
end
protein level
ER
DH KR
KR
KR
KR
KR
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE
S
O
S
O
S
O
S
O
S
O
S
O
S
O
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
6-Deoxyerythronolide B
Γονιδιακό συγκρότημα ερυθρομυκίνης Α στο Saccharopolyspora erythraea. Η θειοεστεράση
(thiosterare TE) κυκλοποίει (λακτόνη) και απελευθερώνει το πολυκετίδιο από το ένζυμο.

ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ
(Polyketide synthases PKS)
• TYPE II (aromatic) PKS: πιο πρωτόγονη συλλογή ξεχωριστών
ενζύμων. Κάθε ενζυμική δραστικότητα αποτελεί και μια
ξεχωριστή πρωτεΐνη.
• Κάθε μια από τις ενζυμικές αυτές δραστικότητες μπορεί να
χρησιμοποιείται επαναληπτικά σε κάθε βιοσυνθετικό κύκλο (όπως
και οι βακτηριακές FAS).
• Απουσία αναγωγικών δραστικοτήτων (ΣΕ ΠΛΗΡΗ ΑΝΤΙΘΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ
FAS) και συνεπώς τρεις και μόνο ενζυμικές δραστικότητες-πρωτείνες
μπορούν να αποτελούν την ελάχιστη PKS.
• Απαντώνται σε μύκητες και φυτά.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 16

TYPE II (aromatic) PKS:
ARO
Βιοσύνθεση της Doxorubicin από βακτηριακή
τύπου ΙΙ PKS
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 17

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΩΝ
R
O
O
AT
KS
ACP
KR
DH
ER
O
R
SCoA
CO 2
O
SCoA
AT
acyl transferase
keto synthase
acyl carrier protein
keto reductase
dehydratase
enoyl reductase
O
R
O
O
R
R *
R *
O
O
O
S
S CO 2 SH S
KS ACP
KS ACP
type II PKS
FAS type I
KR
R
R
R
R *
* OH
R
R *
O
O
O
S
S
S
ACP
ER
ACP
DH
ACP
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 18

• Η εμφάνιση PKS τύπου Ι ή ΙΙ έχει σχέση με τη δομή του
πολυκετιδίου και όχι τον οργανισμό προέλευσης (σε αντίθεση με
τα FA).
• Η δομική οργάνωση των FAS εξαρτάται από τον οργανισμό που
απαντώνται
– FAS I: Θηλαστικών. Όλες οι ενζυμικές δραστικότητες είναι
συνδεδεμένες (ομοιοπολικά) μεταξύ για να σχηματίσουν μια μεγάλη
πολυδραστική πρωτείνη (συνήθως επτά ενζυμικές δραστικότητες).
– FASII: Βακτηριακή. Αποτελείται από σετ διακριτών πρωτεϊνών οι
οποίες μπορούν να απομονωθούν η κάθε μια ξεχωριστά.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 19

ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ
ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗΣ
• Τα μοντέλα των PKS τύπου Ι και ΙΙ δεν είναι
οι μοναδικές περιπτώσεις που απαντώνται
στη φύση. Ποικιλία παραδειγμάτων όπου η
ενζυμική οργάνωση είναι ενδιάμεση των
ακραίων δομών τύπου I και II.
– Επαναληπτικά PKS Ι (iteratively)
– Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases
CHS). PKS τύπος ΙΙΙ (φυτά)
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 20

Επαναληπτικά (iterative) PKS Ι
• Επαναληπτικά PKS Ι: Ενζυμική αρχιτεκτονική τύπου
Ι, αλλά μερικές ενζυμικές δραστικότητες
χρησιμοποιούνται επαναληπτικά (iteratively). Δηλαδή
οι ενζυμικές δραστικότητες είναι οργανωμένες σε
μεγάλες πολυδραστικές πρωτείνες, αλλά σε αντίθεση
με τις κλασικού τύπου Ι, μερικές από τις
δραστικότητες χρησιμοποιούνται επαναληπτικά.
• Παραδείγματα η βιοσύνθεση από μύκητες των 6-
MSA και lovastatin.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 21

Βιοσύνθεση Lovastatin από επαναληπτική
μυκητιακή PKS τύπου Ι
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 22

Συνθάσες της χαλκόνης
(chalcone synthases CHS)
• Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases CHS): Ενζυμική
αρχιτεκτονική τύπου ΙΙ (ξεχωριστά ένζυμα). Όμως τα ένζυμα
αυτά μπορούν να χρησιμοποιήσουν τις ομάδες ακυλίου με τη
μορφή του συνενζύμου Α (CoA), χωρίς να μεταφερθούν στην
ACP. Επίσης πολλές ενζυμικές αντιδράσεις (αποκαρβοξυλίωση,
κυκλοποίηση, δημιουργία δεσμού C-C, αρωματοποίηση)
• Πολυκετίδια φυτών, φαινυλοπροπανοείδη (χρωστικές, αντι-UV,
χημειοπροστατευτικές κλπ.).
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 23

Naringenin (ναρινγκίνη). Συνθάση της χαλκόνη
(chalcone synthase). Φυτά τυπος ΙΙΙ PKS
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 24

ΜΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ
(non ribosomal peptide synthases NRPS)
• Τα μη ριβοσωμικά πεπτίδια είναι γραμμικά, κυκλικά ή
διακλαδιζώμενα πεπτίδια με συνήθως λιγότερο από 20 μονάδες
• Πολλά μη ριβοσωμικά πεπτίδια είναι πολύ σημαντικά φάρμακα
όπως η κυκλοσπορίνη Α, πενικιλίνη, βανκομυσίνη
• Παράγονται από τις μη ριβοσωμικές πεπτιδικές συνθάσες οι
οποίες εκτός από τα πρωτεϊνογενή αμινοξέα (20) μπορούν και
χρησιμοποίουν γύρω στα 300 !!!! άλλα αμινοξέα
• Οι NRPS έχουν δομή και ενζυμική αρχιτεκτονική παρόμοια με
τον τυπο Ι PKS (modular)
• Για κάθε δομική μονάδα-αμινοξύ, υπάρχει ένα διαφορετικό
στοιχείο ενζυμικών δραστικοτήτων (module) και όλες μαζί είναι
οργανωμένες σε μια η περισσότερες πολυδραστικές πρωτεΐνες
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 25

ΜΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ
(non ribosomal peptide synthases NRPS)
module'
module''
module'
module''
C A PCP
C A PCP
C A PCP C A PCP
R '
S
O
NHR
R''
S
NH 2
O
A: adenylation
PCP: peptyl carrier protein
γνωστό και ως T: thiolation
C: condenastion
πεπτιδικός
δεσμός
SH
E: epimerasation
MT: methylation
Cy: cyclisation
R: reduction
Ox: oxidation
R''
O
RHN
S
O
NH
R '
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 26

• Πολλά παραδείγματα συστημάτων που
είναι μίγματα δυο από των παραπάνω
για παράδειγμα
– εναλλαγή PKS τύπου Ι και ΙΙ,
– μεικτά PKS/NRPS (epothiolone,
myxothiazol, rapamycin)
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 27

MEIKTA PKS/NRPS
(ή μήπωςφυσικήβιοσυνθετικήμηχανική)
O
S
N
O
OH
HS
H 2 N
O
OH
PKS/NRPS systems
O
OH
O
Epothilone
cysteine
S
N
S
N
OMe
MeO
CONH 2
Myxothiazol
Χρησιμοποίηση αμινοξέων σαν δομικές μονάδες σε φυσικά συστήματα PKS/NRPS.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 28

Βιοσύνθεση ραπαμυκίνης
OMe
HO
O
MeO
O
O
OH
O
N
O
MeO
O
OH
O
H
rapamycin
ανοσοκαταστολέας
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 29

Ταξινόμηση διαφόρων PKS σε σχέση με
τους οργανισμούς
Τύπος PKS
Οργανισμοί
Modular PKS τύπος Ι
Βακτήρια (πρώτιστα)
Επαναληπτική PKS τύπος Ι
Μύκητες (μερικά βακτήρια)
Επαναληπτική PKS τύπος ΙΙ
Μόνο βακτήρια
Επαναληπτική PKS τύπος ΙΙΙ
PKS/NRPS υβριδικά
Κυρίως φυτά, (μερικά
βακτήρια και μύκητες)
Βακτήρια - μύκητες
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 30

ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ
(combinatorial biosynthesis)
•Το μοντέλο ενζυμικής αρχιτεκτονικής PKS τύπου Ι προβλέπει ότι
κάθε ενζυμική περιοχή (domain) είναι υπεύθυνη για μια και μόνο
αντίδραση της βιοσύνθεσης και κάθε στοιχείο δραστικοτήτων για
κάθε δομική μονάδα.
•Υπόθεση: Πιθανές αλλαγές στο γονίδιο θα πρέπει να
προκαλέσουν τις αντίστοιχες αλλαγές στη δομή του μορίου.
•Αξιοποίηση της τεράστιας βιοσυνθετικής ποικιλίας (δομικές
μονάδες, στερεοχημεία, οξειδωτική κατάσταση) των πολυκετιδίων
για την επίτευξη των τεραστίου εύρους δομικών αλλαγών.
•Παραγωγή υβριδικών αντιβιοτικών ή μη-φυσικών φυσικών
προϊόντων με τη χρήση της λεγόμενης βιοσυνθετικής μηχανικής.
•Mutasynthesis: Η παραγωγή αναλόγων φαρμακευτικών
προϊόντων, όχι με χημική σύνθεση, αλλά με τη χρήση της μοριακής
βιολογίας (σχεδιασμένες αλλαγές στο επίπεδο των γονιδίων)

Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 32

ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ
(combinatorial biosynthesis)
• Η συνδυαστική βιοσύνθεση κατέστη δυνατή με τη κατανόηση
της βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων και ανάπτυξη της γενετικής,
κλωνοποίησης, μικροβιολογίας, ετερόλογης έκφρασης
πρωτεϊνών.
• Επίσης η αλληλουχία πολλών βιοσυνθετικών γονιδιωμάτων έχει
αποσαφηνισθεί, προσφέροντας τη δυνατότητα αναγνώρισης
των αλληλουχίας υπεύθυνων για συγκεκριμένες αντιδράσεις.
• Εφαρμογή σε Βακτήρια. Actinomycetes (βακτήρια εδάφους) και
ειδικά στα Streptomyces.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 33

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ
eryAI
eryAII
eryAIII
load
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3
module 2
module 4
module 6
module 1
module 3
module 5
end
ER
DH KR
KR
KR
KR
KR
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE
S
O
S
O
S
O
S
O
S
O
S
O
S
O
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
6-Deoxyerythronolide B

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ
O
O
OH
HO
O
O
OH
O
O
OH
NMe 2
O
Me
OH
OMe
erythromycin A
O
O
OH
OH
OH
O
6-Deoxyerythronolide
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
Me
OH
OH
hydroxylase
glycosyltransferase
glycosyltransferase
O
O
OH
O
O
OH
O
O
OH
NMe 2
O
Me
OH
OH
OH
O
O
OH
HO
O
O
OH
O
O
OH
NMe 2
O
Me
OH
OH
hydroxylase
(O)-methyltransferase

ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΟΙ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ - ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ
HO
O
MeO
MeO
OH
O
O
O
O
Rapamycin
OMe
HO
O
OMe
O
O
O
N
O
O MeO
OH H
O
H
O
OH
NMe
HO
2
HO
O
O O
+ O
O
O
H
O
OH
O OMe
O
OH
Erythromycin A
HO
O
OH
O
O
OMe
OH
O
OH
O
H
“Erymectamycin”
Avermectin B1b
O
H
OH
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 36

ΔΙΑΓΡΑΦΗ ΤΗΣ KR ΣΤΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ 5 ΤΗΣ
ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ
KS
module 5
KR
AT ACP
DEBS 3
module 6
KR
KS AT ACP
S
O
S
5 O
end
TE
O
OH
κυκλοποίηση
O
O
O
OH
5 O
OH
O
μετα PKS
γλυκοσυλίωση
O
O
O
OH
O
5 O
O
OH
OH
O
OH
5
O
O
HO
O
O
OH
OH
O
O
O
OH
NMe 2
OH
OH
OH
O
OMe
Me
OH
erythromycin A
Donadio et al. 1991: Το πρωτοποριακό πείραμα που αποκάλυψε την ενζυμική
αρχιτεκτονική των PKS τύπου Ι και άνοιξε το δρόμο της συνδυαστικής βιοσύνθεσης. Η
διαγραφή της KR προκαλεί την ακριβώς προβλεπόμενη δομική αλλαγή.

ΔΙΑΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ER ΣΤΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ 4 ΤΗΣ
ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ
DEBS 2 DEBS 3
module 4
module 6
module 3
module 5
end
O
DH
ER
KR
KR
KR
OH
KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE
O
OH
S
O
S
O
S
O
S
O
O
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
O
O
NMe 2
OH
O
O
OH
Donadio et al. 1993
Me
O
OH
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 38
OH

ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ
Biosynthetic engineering
• Τα παραπάνω πειράματα διαγραφής μίας ενζυμικής περιοχής σκοπό
είχαν την μελέτη των ενζύμων PKS τύπου Ι, αλλά αποκάλυψαν τις
τεράστιες δυνατότητες τις οποίες έχει οι γενετική μηχανική τέτοιων
συστημάτων.
• Από τότε η έρευνα της γενετικής τροποποίησης των PKS έχει
προσελκύσει τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον.
• Μεθοδολογίες που έχουν χρησιμοποιηθεί περιλαμβάνουν τη διαγραφή
περιοχών, μεταφορά περιοχών ή στοιχείων, ανάμειξη περιοχών ή
στοιχείων δυο διαφορετικών PKS γονιδιακών συστημάτων, εμφύτευση
νέων στοιχείων δραστικοτήτων, αλλαγή ενζυμικής εκλεκτικότητας ή
ειδικότητας. Παράγωγή πληθώρα αναλόγων πολυκετιδίων.
• Απομώνωση των αντιστοίχων πρωτείνων DEBS1, 2 και 3 και in vitro
μελέτη.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 39

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΘΕΙΟΕΣΤΕΡΑΣΗΣ
DEBS-1-TE
AT
ACP
KS
AT
KR
ACP
KS
AT
KR
ACP
TE
OH
S
O
S
O
S
OH
O
OH
OH
cyclise
O
triketide
lactone
O
Cortes et al., 1995: Μεταφορά της θειοεστεράσης στο τέλος της DEBS1 και παραγωγή
του τρικετιδίου αντί του επτακετιδίου. Εξαιρετικό μοντέλο μελέτης των PKS (δουλεύει
και in vitro), παραγωγή αναλόγων στατίτης κτλ. Από τότε η ΤΕ έχουν επιτυχώς
τοποθετηθεί στο τέλος του στοιχείου 3 και 5 δινοντας τα αντίστοιχα τετρα-, εξα-κετίδια
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 40

ΥΒΡΙΔΙΚΗ PKS-ΑΛΛΑΓΗ ΔΟΜΙΚΗΣ ΜΟΝΑΔΑΣ
Hybrid PKS
απουσία μεθυλίου
AT
ACP
KS
AT r
KR
ACP
KS
AT
KR
ACP
TE
OH
S S S
O
O
O
cyclise
O
O
OH
OH
AT r from RAPS 1
OH
hybrid product
Oliynyk et al., 1996: Αλλαγή δομικής μονάδας στη παραγωγή τρικετίδιου. Πληθώρα
παραδειγμάτων αξιοποίησης διαφορετικών εκλεκτικοτήτων των ΑΤ.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 41

AΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΩΝ ΣΤΗ DEBS1-TE
Hybrid PKS
avermectin
loading
module
ery extension modules
end
OH
KR
KR
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP
S
R
O
S
R
O
OH
S
R
TE
O
OH
OH
cyclise
R
O
O
R: Me, Et, i-Pr, sec-Bu
R: Ph
Jacobsen et al., 1997: Εμφύτευση του στοιχείου φόρτωσης δομικής μονάδας από το γονίδιο της
avermectin. Παραγωγή αναλόγων του τρικετίδιου.
Wilkinson et al., 2001: Εμφύτευση του στοιχείου φόρτωσης δομικής μονάδας (Ph) από το
γονίδιο του soraphen A
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 42

ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ
rap module 2
load
module 1
module 2
module 3
module 4
module 5
module 6
end
ER
DH KR
KR
KR
KR
KR
KR
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE
O
HO
OH
O
Et OH
O
O
OH
Et
novel octaketides
OH
O
O
OH
OH
OH
•Rowe et al. 2001: Εμφύτευση ολοκλήρου στοιχέιου απο το γονίδιο
της ραπαμυκίνης και παραγωγή νέων οκτακετιδίων μακρολιδίων
από καλιεργειες Saccharopolyspora erythraea.
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 43

ΥΒΡΙΔΙΚΕΣ PKS
Avermectin-erythromycin υβριδικά αντιβιοτικά
O
OH
Ανάλογα της ερυθρομυκίνης
R 2
O
OH
HO
O
O
NMe 2
Α, Β, D, με τουλάχιστον την
ίδια δραστικότητα
O
O
OR 1
OH
O
R 1 = H or CH 3 ,
R 2 = H or OH
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 44

Mutasynthesis
(a)
(b)
(c)
(d)
Wild type
Μεταλλαγμα στο οποίο η βιοσύνθεση έχει ανασταλεί σε κάποιο κρίσιμο στάδιο
Precursor-directed biosynthesis: στη καλλιέργεια προσθέτουμε ανάλογα
(mutasynthon) των πρόδρομων ενώσεων – ανταγωνισμός με τις φυσικές πρόδρομες
ενώσεις
Mutasynthesis: Μόνο τα ανάλογα παράγονται

Rapamycin → Rapalogues
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 46

Βελτιώνοντας το Borrelidin
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 47

ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ
(combinatorial biosynthesis)
• Συστήματα ετερόλογης έκφρασης
– Streptomyces coelicolor CH999 (actinorodin defecient, τύπος ΙΙ),
– Streptomyces lividans K4-114 (actinorodin defecient, τύπος ΙΙ),
– Saccharopolyspora erythraea JC2 (ερυθρομυκίνη deficient, τυπος Ι)
– E.coli με συν-έκφραση Ppant – ενζύμων
– Myxococcus xanthus
– Pseudomonas putida
• Στα συστήματα ετερόλογης έκφρασης θα πρέπει να λαμβάνεται
υπόψη εάν υπάρχουν?
– Post-PKS ενζυμα
– Φωσφωπαντοθεϊνικός βραχίονας
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 48

Παράδειγμα μεθοδολογίας ετερόλογης
έκφρασης σε Pseudomonas putida
• Μεθοδολογία ετερόλογης έκφρασης βιοσυνθετικών
γονιδίωναπόμηδιαθέσιμεςπήγεςήδύσκολες
πηγές.
– Δημιουργία βιβλιοθηκών βιοσυνθετικών γονιδιωμάτων
– Αναγνώριση και ανάλυση του γονιδιακού συγκροτήματος
– Κλωνοποίηση σε κατάλληλη κατασκευή με υποκινητή κλπ
– Μετασχηματισμός σε pseudomonad
– Παραγωγή της ουσίας στον ετερόλογο ξενιστή
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 49

Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 50

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
•Η συνδυαστική βιοσύνθεση δίνει τη δυνατότητα παραγωγής
βιβλιοθήκης αναλόγων φυσικών προϊόντων με σχεδιασμένες
αλλαγές στο επίπεδο των γονιδίων. Τεραστία δυναμική στην
ανακάλυψη νέων φαρμάκων
•Παντρεύει τη μοριακή βιολογία με τη συνθετική χημεία
•Επιθυμητή η δημιουργία βιοσυνθετικών βιβλιοθηκών δομικών
μονάδων
•Σχεδιασμός φαρμάκων: Στο μέλλον o σχεδιασμός φαρμάκων θα
γίνεται με το ανακάτεμα και ταίριασμα γονιδίων κατά παραγγελία
για τη δημιουργία νέων επιθυμητών ενώσεων. Αξιοποίηση του
ενζυμικού συστήματος σαν μια μοριακή γραμμή παραγωγής
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 51

ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
Ανασκόπησης (Για τις εξετάσεις να διαβάσετε τα δυο πρώτα)
1. Amoutzias GD, Van de Peer Y, Mossialos D. Evolution and taxonomic
distribution of nonribosomal peptide and polyketide synthases. Future
Microbiol. 2008;3:361-70.
2. Weissman KJ. Mutasynthesis - uniting chemistry and genetics for drug
discovery. Trends Biotechnol. 2007 ;25(4):139-42.
3. Bode HB, Müller R. Analysis of myxobacterial secondary metabolism
goes molecular. J Ind Microbiol Biotechnol. 2006;33(7):577-88.
4. Weissman KJ, Müller R. A brief tour of myxobacterial secondary
metabolism. Bioorg Med Chem. 2009 ;17(6):2121-36.
5. Hertweck C. The biosynthetic logic of polyketide diversity. Angew
Chem Int Ed Engl. 2009;48(26):4688-716.
6. Staunton, J. and Weissman, K.J., 2001. Natural Products Reports, 18,
380-416. (PKS)
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 52

ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
Ερευνητικά
1. Donadio, S.; Staver, M. J.; McAlpine, J. B.; Swanson, S. J.; Katz, L. Science 1991, 252, 675-
679.
2. Donadio, S.; McAlpine, J. B.; Sheldon, P. L.; Jackson, M.; Katz, L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
1993, 90, 7119.
3. Cortes, J.; Wiesmann, K. E. H.; Roberts, G. A.; Brown, M. J. B.; Staunton, J.; Leadlay, P. F.
Science 1995, 268.
4. Oliynyk, M.; Brown, M. J. B.; Cortes, J.; Staunton, J.; Leadlay, P. F. Chem. Biol. 1996, 3, 833-
839.
5. Jacobsen, J. R.; Hutcinson, C. R.; Cane, D. E.; Khosla, C. Science 1997, 277, 367-369.
6. Wilkinson, C. J.; Frost, E. J.; Staunton, J.; Leadlay, P. F. Chem. Biol. 2001, 151, 1-12.
7. Hill, A., M., Harris, J. P., Siskos, A., P., 1998. Chem. Commun., 2361-2362.
8. Rowe, C. J., Bohm, I. U., Thomas, I. P., Wilkinson, B., Rudd, B. A.M., Foster, G., Blackaby, A.
P.,Sidebottom, P. J., Roddis, Y., Buss, A. D., Staunton, J., Leadlay, P. F., Chemistry and
Biology 2001, 8, 475-485.
9. Siskos AP, Baerga-Ortiz A, Bali S, Stein V, Mamdani H, Spiteller D, Popovic B, Spencer JB,
Staunton J, Weissman K, Leadlay PF (2005) Molecular Basis of Celmer’s Rules:
Stereochemistry of Catalysis by Isolated Ketoreductase Domains from Modular Polyketide
Synthases. Chem Biol, 12(10): 1145-1153
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 53