Anaerobe bakterier, isolation og identifiaktion

Anaerob dyrkning og identifikation. Tage Justesen 

ANAEROBE 

BAKTERIER 

ISOLATION OG IDENTIFIKATION 

I DET KLINISK MIKROBIOLOGISKE LABORATORIUM 

Tage Justesen, nov. 2002 

19-06-03 T. Justesen 1


Indledning 

Identifikationsskemaerne omfatter anaerobe bakteriearter af human oprindelse eller af betydning 

for sygdom hos mennesker. Bakterier af animalsk og anden oprindelse er kun sporadisk nævnt. 

De fleste arter, som isoleres i det klinisk mikrobiologiske laboratorium, stammer oprindeligt fra 

et eller flere af menneskets normalfloraområder: Mundhule, Tarmkanal, Vagina og Hud, og det 

overvejende antal er apatogene eller lavpatogene opportunister. 

Det er vigtigt, at et bakteriefund ses i sammenhæng med den kliniske tilstand, når fundets 

betydning skal vurderes. I det følgende er nævnt faktorer af betydning for valg af 

identifikationsniveau i det daglige arbejde. 

Fund af anaerobe bakterier i præsterile områder som blod, spinalvæske, ledvæske, pleuraexsudat 

etc.er altid betydningsfulde. Renkulturer fra infektiøse processer er næsten altid betydningsfulde 

og dominerende arter i blandingsflora ligeledes. 

Prøver med blandingsflora fra steder med kommunikation til normalfloraområderne må 

imidlertid altid vurderes kritisk. 

De hyppigst isolerede arter i relevant prøvemateriale er Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, 

Peptostreptococcus og Clostridium arter. 

Nogle anaerobe bakterier giver anledning til særlige sygdomsbilleder. 

Visse Actinomycesarter samt Propionibacterium propionicum (tidl. Arachnia) kan forårsage 

actinomycose. Blandt Clostridierne giver nogle af de toxinogene arter, hyppigst C. perfringens, 

anledning til nekrotiserende infektioner (gasgangræn o.l.) og toxindannende C. difficile stammer 

kan undertiden medføre pseudomembranøs enterocolitis. Disse og andre clostridier isoleres dog 

oftest fra andre prøvetyper,hyppigt i blandinger, hvor de ikke kan tillægges nogen specifik 

betydning. C. tetani og C.botulinum er årsager til karakteristiske kliniske sygdomsbilleder, men 

isoleres næsten aldrig fra klinisk prøvemateriale. 

F. necrophorum forårsager nekrobacillose eller postanginøs sepsis og findes her i 

bloddyrkninger. Propionibacterium acnes er et eksempel på en hyppigt forekommende 

forurening fra huden i bloddyrkninger og bør derfor kunne genkendes med sikkerhed. 

Definitiv identifikation af anaerobe isolater er langt fra altid mulig, dels fordi fænotypiske træk 

ikke er tilstrækkelig diskriminerende og dels fordi endnu ikke beskrevne arter kan dukke op. 

Nogle af de lige nævnte arter er forholdsvis let genkendelige og Bacteroides, Prevotella, 

Fusobacterium og de mikroaerofile anaerobe gram negative stave bør kunne adskilles på 

slægtsniveau og i visse tilfælde artsbestemmes. Hos visse arter er det mikroskopiske billede 

næsten diagnostisk f.eks. F. nucleatum, Leptotrichia buccalis, C. perfringens og C. 

clostridioforme. 

Nærværende manual består af et afsnit om metoder, medier og procedurer samt en samling 

identifikationsskemaer bestående parvis af en dikrotom nøgle og et “endeligt” 

identifikationsskema. 



Langt den overvejende del af betydningsfulde anaerobe isolater til hører gruppen af moderat 

anaerobe eller aerotolerant anaerobe bakterier (se næste side). 



Mikroorganismers forhold til ILT. 

1) Vækstbetingelser til rådighed i laboratoriet (det fysiske 

miljø): 

Anaerobt : iltfrit 

Aerobt : Ilt i atmosfærisk koncentration 

Mikroaerobt ell. mikroaerofilt : Ilt i subatmosfærisk koncentration (~ 5%) 

CO2 atmosfære : Ca. 10% CO2 i atmosfærisk luft. 

2) Mikroorganismernes stofskifte (det genotypiske): 

Anaerob organisme: Kan ikke udnytte ilt til vækst og formering, men får energi ved 

fermentering. Væksten er maximal under iltfri forhold. 

Fakultativ anaerob organisme: Kræver ikke ilt til vækst og formering, men kan udnytte ilt selv 

i atmosfæriske koncentrationer - har både fermentativt og oxydativt potentiale. 

Aerob organisme : Kræver ilt til vækst og formering - rent oxydativt stofskifte. 

Mikroaerofil organisme : Kræver ilt til vækst og formering, men tåler ikke ilt i atmosfæriske 

koncentrationer (optimum 2 - 10% ilt). Fakultativt mikroaerofile organismer kan også vokse 

under iltfri forhold. 

3)Mikroorganismens præsentation (det fænotypiske): 

Obligat anaerobe: Organismer som kun gror under anaerobe forhold (< 5% ilt), ikke 

mikroaerofilt, i CO2-atmosfære eller aerobt. Kan underinddeles i: 

Strikt anaerobe : Organismer som kun gror i < 0,5% ilt. 

Moderat anaerobe : Organismer som kan gro i op til ca. 5% ilt. 

Aerotolerant eller ilttolerant anaerob: Organisme som har anaerobt stofskifte, men som kan 

vokse i atmosfæriske iltkoncentrationer (+CO2) (ex. Streptokokker, Lactobaciller, C. tertium) 

Mikroaerotolerant: Organisme som vokser bedst anaerobt men kan tolerere en vis mængde ilt 

(ca. 5 - 15%) (+CO2). 

Fakultativ: Organisme som ikke kræver ilt, men kan udnytte ilt (vokser lige godt med eller uden 

ilt). 

Obligat aerob: Organisme som kræver > 15% ilt for maximal vækst. 

Capnofile: Organismer som kræver eller stimuleres i væksten af kuldioxyd. 

Hydrogenofile: Organismer som kræver eller stimuleres af hydrogen. 



Opsamling og transport af klinisk materiale 

Klinikerne må altid opfordres til at tage rigeligt materiale fra til bakteriologisk undersøgelse. Jo 

mere materiale desto bedre beskyttelse af alle slags bakterier. 

De fleste klinisk betydningsfulde anaerobe bakterier (og andre bakterier for den sags skyld) vil 

overleve i mange timer i nogle få ml pus i et almindeligt tilproppet sterilt prøverør, som 

transporteres ved omgivelsestemperatur. 

Anvend ikke podepinde hvis pus, væske eller væv kan opsamles da disse materialer kan 

anvendes til direkte mikroskopi og give umiddelbart brugbare oplysninger om en infektion. 

Afkøling øger alt andet lige iltmængden i prøvematerialet, men for praktiske formål vil en 

midlertidig opbevaring i køleskab være acceptabel. 

Hvis anvendelse af podepind ikke kan undgås skal den transporteres i Stuart’s transportagar, 

som kan opbevares køligt inden selve transporten. 

Prøvebehandling i laboratoriet bør foregå uden unødig forsinkelse med anvendelsen af egnede 

medier og udsåede plader skal bringes under anaerobe forhold umiddelbart efter tilsåningen. 

Anaerobe betingelser kan opnås på forskellige måder. Anaerobkammeret er efterhånden 

foretrukket her i landet da den nødvendige gasforsyning kan etabeltres.Lufttætte krukker kan 

evakueres med en pumpe og efterfyldes med en gasblanding, som regel 80% N2 + 10% H2 + 

10% CO2. En katalysator i krukken er nødvendig for at fjerne de sidste rester af ilt. 

Forskellige typer af forseglede breve indeholdende kemikalier, som udvikler H2 og CO2 eller er 

iltabsorberende efter tilsætning af vand, findes, men er betydelig dyrere i længden end de to 

førstnævnte metoder. Hertil kommer at anaerobe forhold opnås næsten med det samme med 

kammer og pumpemetoden medens betydelig længere tid kan forløbe inden de kemiske metoder 

er effektive. “Anaerogen” fra Oxoid er fundet bedst i en sammenlignende undersøgelse med 

adskillige andre fabrikater og har den fordel at den ikke kræver vedligeholdelse af en katalysator 

(J Clin Microbiol 1996;34:1646). 

Agarmedier til anaerob dyrkning. 

En chokoladeplade (“laked blood agar”) suppleret med K-vitamin og cystein (SSI’s anaerob 

plade) anbefales som standardmedium. En almindelig chokoladeplade kan også bruges i langt de 

fleste tilfælde. 

På anaerobpladen vil de fleste klinisk relevante anaerobe bakterier vokse frem efter 1 - 2 dages 

inkubering. Chokoladepladetypen understøtter (i modsætning til en blodpladen) udviklingen af 

pigment, fluorescens og katalaseproduktion. Pladen kan anvendes både som primærplade, 

rendyrkningsplade og resistensplade. 

De hyppigst forekommende Bacteroides og Clostridiumarter vil vokse lige så godt på almindelig 

5% blodagar, der dog ikke kan anbefales som standdardmedium, men som supplement. 10% 

blodagarplade er ikke dokumenteret bedre end 5%. 

(En diplomopgave som sammenlignede medier fandt 10% blod underlegent i forhold til øvrige 

afprøvede medier.) 

Anaerobe gram positive ikke sporedannende stave stave f.eks. Actinomyces, som ikke har 

særlige vækstkrav vokser lige så godt på en 5% blodplade som på en anaerob chokoladeplade. 

Undertiden kan kolonierne også være lettere at kende på en blodplade. 



Primær udsåning af prøvemateriale. 

Følgende fremgangsmåde kan anbefales, idet den giver mulighed for hurtigt at se om der er 

“ægte” anaerobe bakterier tilstede (hæmningszone omkring metronidazoldisken) samtidig med, 

at der kommer god separation af kolonier. Omkring kanamycindisken vil mange fakultative 

bakterier (enterobakterier, stafylokokker) hæmmes medens hyppigt forekommende anaerobe 

bakterier er kanamycinresistente og derfor vil blive selekteret i zonen (se envidere under 

aflæsning af zonerne). 

1) Materialet (en dråbe pus eller podepind) udstryges 

i zig-zak på et ca. 2 - 3 cm bredt område 

i pladens ene side. Det er en almindelig 

fejl, at første strøg tilsås for tæt. 

) Med en øsken spredes videre 

vinkelret på første strøg til 

pladens midtlinje. 

3) Øskenen vendes, og resten 

af pladen tilsås nu vinkelret på 

2.strøg så hele pladen udnyttes. 

4) En metronidazoldisk på 5 µg 

og en kanamycindisk på 1000 µg 

(1 mg) anbringes som vist på figuren. 

Metronidazol 

Inkuber ved 35 -37° under anaerobe forhold, sædvanligvis i 2 døgn. 

Kanamycin 

Figur 1. 

Udsåning af prøvemateriale på agarmedie 

Primærplader anbefales reinkuberet sammen med rendyrkninger og omsåninger, som bør 

anbringes anaerobt umiddelbart. 

Ved mistanke om anaerob vækst i bloddyrkninger eller f.eks. hvis der kun er vækst i anaerob 

kolberne eller hvis særlige morfologiske træk umiddelbart kan ses ved mikroskopi 

(kasseformede gram positive stave, sporedannelse, pleomorfe- eller fusiforme gramnegative 

stave), bør den anaerobe primærudsåning udvides med: 

5% blodplade, EYA-plade, og en ekstra anaerobplade med en galde-, vancomycin- og 

colistindisk (se under trin 2 identifikation). 



Foreløbig identifikation - se algoritme side 6a 

Aflæsning på primærpladen, enkelte direkte tests samt mikroskopi er ofte tilstrækkelige til at 

stille en klinisk meningsfuld diagnose. 

Metronidazolaflæsningen 

1) Selektivitet: 

Metronidazolfølsomhed = “ægte” anaerob bakteriestamme. 

2) Identifikation: 

Metronidazolresistens ses hos medlemmer af bakterieslægter, som ikke sædvanligvis regnes for 

anaerobe, men som evt. især ved primærisolation kun eller overvejende vokser under anaerobe 

forhold, som Streptococcus og Lactobacillus. Actinomyces og Propionibacterium er også 

resistente og vil sv. hertil vokse i alm. CO2 skab efter nogle dages inkubation. 

Ægte mikroaerofile bakterier varierer i metronidazolfølsomhed. 

3) Resistensbestemmelse: Metronidazolfølsomhed (zone ≥ 10 mm sv.t. MIC ≤ 8mg/l) på 

primærpladen indikerer at dette stof kan overvejes til behandling. 

Kanamycinaflæsningen 

Stafylokokker og Enterobacteriaceae hæmmes af kanamycin, så zonen kommer til at virke som 

selekterende område for de hyppigst forekommende anaerobe gram negative stave: Bacteroides, 

Prevotella, Porphyromonas. 

Denne Kanamycinresistens er af central betydning for den foreløbige identifikation af 

Gram negative stave. 

Andre gram negatie stave er meget Kanamycinfølsomme. 

Clostridiumarter er også følsomme men ofte med en lidt mindre zone. 

De ovennævnte følsomheder for metronidazol og kanamycin må ikke mistolkes som 

resistens, hvis der i tilfælde med meget stort inoculum forekommer genvækst i zonen 

efterhånden som antibiotikakoncentrationen falder centralt pg.a. fortsat diffusion. 

Koloni 

Beskrives med den sædvanlige terminologi. 

Størrelsen af kolonien bør angives evt. som meget lille, små eller store f.eks. e. 2 døgn. 

Spredning omkring kolonien og/eller sværm noteres. 

Farve kan angives (grålig, gullig, grønlig, brunlig, sort, rødlig ect.). 

Sort pigmentering er et vigtigt karakteristikum hos medlemmer af Pophyromonas- og nogle 

medlemmer af Prevotellaslægten og fremkommer hurtigst og tydeligst på chokoladaagar. 

En del andre anaerobe bakterier vil efter mere end to dages inkubation på anaerob pladen 

efterhånden også kunne antage mørke brunlige toner, Actinomyceter er et eksempel herpå. 

Nogle anaerobe bakterier giver anledning til dannelsen af en tydelig rødfarvning af 

chokoladeagaren omkring kolonierne især efter at pladerne lige er fjernet fra de anaerobe 

dyrkningsbetingelser. Dette skyldes formentlig dannelsen af hæmokromogen ved en 

reduktionsproces forårsaget af bakterievæksten. Farven fader som regel efter udsættelse for ilt. 

Ingen diagnostisk betydning. 



Små huller i agaren ses hos visse stammer af “B.ureolyticus” og Campylobacter spp., såkaldt 

"pitting" (pit = grube). Disse arter kan også undertiden lave en lille fin sværm lige omkring 

selve kolonien - et slør eller "haze". En positiv oxydasereaktion kan bestyrke mistanken. 

Fluorescens 

Undersøges bedst i helt mørkelagt rum med en UV-lampe med en bølgelængde på 366 nm. 

Prevotella spp. som ikke er pigmenterede fluorescerer ofte rubinrødt. Hvis pigmentering 

indtræder ophører fluorescensen i takt hermed ! 

Bacteroides fragilis gruppen har normalt ikke fluorescens, men lejlighedsvis kan koralrød og 

svag grønligt fluorescens forekomme. 

Fusobacterium spp. fluorescerer kraftigt gul-grønt, "chartreuse", ligesom visse 

Clostridium spp. bl.a. C. difficile og C. innocuum. 

Katalase 

Udføres efter de samme retningslinjer som for aerobt voksende bakterier. 

Anaerobpladen fremmer dannelsen af katalaseenzymet (porfyrinrinholdigt) hos de katalase 

positive arter (visse "B. fragilis", Propionibakterier, A. viscosus). Undertiden er det nødvendigt 

at eksponere kulturen for ilt i ca. en time før reaktionen fremkommer eller tilsætte brintoverilte 

direkte til en flydende kultur. 

Anaerobpladen kan undertiden være svagt katalase positiv (batchafhængigt, hvis ikke al 

enzymaktivitet er varmedestrueret), så undgå at få agar med. 

Alle Clostridier er katalase negative i modsætning til Bacillusarter ! 

Lugt. 

Anvend helst en frisk udtaget pladekultur da de flygtige fede syrer efterhånden fordamper. 

Lugten af smørsyre er ikke til at tage fejl af og f.eks. Cl. perfringens og Fusobacterium sp. skal 

lugte kraftigt af smørsyre. 

B. fragilis gruppens medlemmer lugter ikke af smørsyre, men af en blanding af propionsyre, 

isosmørsyre og isovalerianesyre, som lugter ubehageligt sødlig-surt. 

Behagelig aromatisk lugt som af syrnede mælkeprodukter eller karamel findes især hos 

Bifidobacterium spp. 

Lugten af "hestestald" (?) skyldes dannelse af paracresol, og bruges ofte til at karakterisere C. 

difficile, men dannes også af andre Clostridium spp. samt bl.a. “B. ureolyticus”. 

Stikkende syrlig lugt af eddikesyre eller propionsyre kan også undertiden tydelig fornemmes hos 

Propionibacterium sp. 

Mikroskopi af Grampræparat. 

Ikke-sporedannende gram positive stave er oftest tydeligt gram positive. 

Visse gram-negative kokker (Veillonella spp.) kan være gramvariable især i unge kulturer. 

Nogle clostridier med subterminale sporer danner mange frie sporer, der ses som blåligrøde 

ringe med farveløst indhold. 

Hovedproblemet ved gramfarvning af anaerobe bakterier er at visse Clostridium spp. er 

ensartet gram-negative og uden synlige sporer. Mobiluncus er også oftest gram negativ 

Vancomycinfølsomhed og Colistinresistens viser her den gram positive natur af disse 

stammer ! (se næste afsnit) 



Regelmæssige stave har ensartet tykkelse eller form (f. eks. Clostridium, Lactobacillus, 

Bacteroides, Fusobacterium ect.) og kan være mere eller mindre krumme eller tilspidsede og 

lejret i par- og kædedannelse. Længden er varierende. Helhedsbilledet er ofte ensartethed. 

Uregelmæssige stave har varierende tykkelse og ofte forgreninger, kølleformer, y-former etc. 

(Actinomyces, Bifidobacterium, Propionibacterium). Helhedsbilledet er oftest pleomorfi. 

Mikroskopi af fugtigt præparat: 

Bevægelighed 

Bevægelighed ophører ofte indenfor minutter efter udsættelse for ilt og afkøling til 

stuetemperatur. Bevægelighed bevares længst under midten af dækglasset, hvor iltningen er 

mindst ! (Pasteur: "La vie sans air"). 

Lav evt. flere præparater for bevægelighed fra forskellige kulturer inkl. positive forgæringsglas. 

Sporer 

Anaerobt voksende sporedannere er identiske men Clostridium sp. 

Sporer ses som stærkt lysbrydende legemer med kun en i hver celle, og bør kunne skelnes fra 

inklusionslegemer (ofte flere i hver celle) og "pseudosporer" som ses når bakterierne ligger på 

tværs af hinanden eller "vender enden" til beskueren. Sporeformen er ikke diagnostisk men 

lejringen er vigtig. 

Terminale sporer ses i præparatet kun i den terminale position hos sporebærende bakterier. 

Bakterier med terminale sporer er slanke stave og sporen opsvulmer bakterielegemet. 

Subterminale sporer kan ses i alle positioner i bakterielegemet. Bakterier med denne type sporer 

er tykke stave og sporener på tykkelse med bakterielegemet. 

Proteolyse 

Kan ses på EYA- og anaerobpladen (chokoladeplade) og består i en zone af opklaring i agaren 

omkring kolonien set i modlys. 

Denne reaktion er normalt ensbetydende med at stammen også er gelatinesmelter. 

OBS ! Erytrocytter i chokoladeplader er langtfra altid totalthæmolyserede og derfor kan en 

eventuel "resthæmolyse" forveksles med proteolyse. 

Slutbemærkninger. 

Algoritmens kriterier skal være opfyldt for at anvende de foreløbige eller tentative 

diagnoser anført i kursiv. 



Identifikation - trin 2 og rendyrkning 

A) Generelle tests og procedurer 

Fra renkulturer og isolerede enkeltkolonier på primærpladen 

Gentag undersøgelser som ikke er faldet klart ud ved primæraflæsningen - rendyrk ! 

1) Identifikationsdisks med Vancomycin, Colistin og galde. 

Bør udføres rutinemæssigt 

Formål: 

1. Foretage primær differentiering indenfor gruppen af Gram negative stave (sammen med 

kanamycin- og galderesultatet) 

2. Endegyldig placering af bakteriestammen som gram negativ eller positiv. 

Hyppigste fejltagelse i identifikationsprocessen er rubriceringen af affarvede gram positive 

bakterier som gram negativ. 

Udførelse: 

Tilsåning af en agarplade som til resistensbestemmelse - pas på for stort inoculum. 

Anbring en disk med VANCOMYCIN 5µg, COLISTIN 10µg og ROSCO-tablet "Oxgall" på 

pladen og inkuber anaerobt. 

Aflæsning: 

Vancomycin Zone ≥10 mm = FØLSOM, zone < 10mm = R. 

Colistin Zone ≥10 mm = FØLSOM, zone < 10mm = R, partiel hæmning = S 

Galde Vækst helt ind til tabletten = R, hvilken som helst zone = S 

Aflæsningen omkring galdetabletten kræver evt. anvendelse af lup for at se om der er vækst 

eller ej helt ind til tabletten, idet den koncentriske galdesyreudfældning omkring tabletten 

fejlagtigt kan tolkes som zonedannelse og dermed følsomhed. 

Tolkning: 

Tolkning: se også oversigten side 15. 

1) Bacteroidesarterne og de fleste Prevotellaarter er colistin R 

og de er altid vancomycin R (og kanamycin R) 

2) Ellers gælder om hovedregel at ægte gram negative bakterier er Vancomycin R og 

Colistin S og ægte gram positive bakterier er Vancomycin S og Colistin R. 

Visse Clostridium sp. og Mobiluncus er uniformt gram negative efter almindelig gramfarvning . 

C. innocuum og visse Lactobacillus sp. kan være vancomycin R, men er næsten altid tydeligt 

gram positive. 

3) B. fragilis gruppen er galderesistente. Visse sjældnere gram negative stave kan også være det, 

men de er kanamycinfølsomme. Galderesistens er et udtryk for naturlig forekomst i tarmen. 

Fejlkilder: Diskenes antibiotikaindhold er kritisk - resistensdisks dur ikke ! 

Tilså thioglucollat, halvflydende- samt serumbouillon. 

Det anbefales at der på et tidligt tidspunkt i identifikationsforløbet fremstilles et stik i en 

halvflydende agar fra en renkultur af stammen. 

Inkuberes under aerobe forhold i 1 - 2 døgn og anbringes herefter ved stuetp. 

19-06-03 T. Justesen 10


Glasset tjener dels til vurdering af vækst i forhold til ilt, evt. luftdannelse og som opbevaring for 

stammen. 

Visse Prevotella spp. og Porphyromonas spp. vokser ikke i SSI´s thioglucollatglas. 

Væksten af f.eks. Actinomyces spp. er ofte god og karakteristisk i serumbouillon med dannelse af 

små klumper eller fnug af bakteriehobe langs med glassets indside. 

Luftdannelse 

Aflæses sædvanligvis i glucoseglassets Durhamrør. Erfaringen viser at SSI’s Halvflydende agar 

også retinerer luft i form af små luftbobler (f.eks. hos nogle non-sakkarolytiske stammer) i 

modsætning til thioglucollat, hvor luftbobler hurtigt forsvinder. 

5% blodplade 

5% blodplade tilsås. Vigtig ved hurtig konfirmation af diagnosen Fusobacterium necrophorum 

som har β-hæmolyse efter et døgns anaerob inkubation. 

Grampositive ikke sporedannende metronidazolresistente stave som kan være Actinomyces, 

Propionibacterium, Lactobacillus bør udsås på blodplade da kolonien her ofte er karakteristisk. 

Indolproduktion - tryptophanasetesten. 

Tryptophanbuffer (SSI). Opslemning til synlig uklarhed. 

Inkubation i alm. termostat i op til 24 timer. 

Udrystning med Xylol eller "Micro-Clear" (ca. ½ ml) før tilsætning af indolreagens. 

Positiv = rød. 

Ureasetest. 

Ureabuffer (SSI). Opslemning til synlig uklarhed. 

Aflæsning i op til maximalt 24 timer efter inkubation i alm. termostat. 

Positiv = rød. 

ONPG. 

En β-galactosidase test med ONPG-substrat (SSI). Opslemning til synlig uklarhed. 

Aflæsning i op til maximalt 24 timer efter inkubation i alm. termostat. 

Anaerob inkubation tilrådes ved tvivl om resultatet. 

Positiv = gul. 

19-06-03 T. Justesen 11


Identifikation - trin 3 - Specielle tests 

EYA (Egg Yolk Agar)-plade til påvisning af Lecitinase- og lipasedannelse 

(Clostridium, Fusobacterium, evt. Prevotella) 

Tilså kun den ene pladehalvdel med et stort inoculum og lav et par punktinokulationer på den 

anden halvdel. Inkuberes i 1døgn for lecitinase evt. 3-5 døgn for lipase. 

Aflæsning: 

Lecitinaseaktivitet viser sig ved at agaren bliver hvid også udenfor koloniens rand medens selve 

kolonien ikke ændres. Den diffusible lecitinase spalter lecitin så der sker en udfældning af 

uopløselige diglycerider i agaren. 

Lipaseaktivitet er resultatet af en nedbrydning af triglycerider til glycerol og frie fedtsyrer. 

Fedtsyrer med smeltepunkt over 37° kan ikke diffundere og udfældning af disse sker derfor i 

overfladen af agaren sv.t. selve kolonien og meget tæt på denne. Kolonien bliver hvid med et 

iridicerende skær. Evt. opklaring i selve agaren omkring kolonierne skyldes proteolyse. Ved 

tvivl geninkuberes pladen så det karakteristiske perlemorsagtige skær kan udvikles og iagttages 

efter 3 - 5 døgn. 

Fejlkilder: 

Hvis pladen tilsås med alm. spredning vil en kraftig lecitinasedanner kunne gøre hele pladen 

ensartet positiv, så aflæsningen tolkes som negativ. 

Undersøgelse for sporer . 

Mange clostridiumarter danner først synlige sporer efter nogle dages forløb. 

Sporedannelsen hos Clostridium spp. kan fremmes ved at inkubere kulturen i ca. 3 - 5 døgn 

under anaerobe forhold gerne på flere forskellige medier herunder EYA-plade. 

Clostridiumarter, især de slanke og Gramvariable, danner ofte så få sporer, at de overses ved 

mikroskopi. 

Det er en almindelig misforståelse, at udsættelse af anaerobe bakterier for ilt fremmer 

sporedannelsen. Ilt slår anaerobe bakterier ihjel, og så danner de ikke noget som helst !! 

Ved ingen synlige sporer og mistanke om Clostridium laves: 

Sporeprøven udføres ved at der fremstilles en suspension med synlig uklarhed i ca. 1/2 ml dest. 

vand eller saltvand. Det er vigtigt ikke at berøre glassets sider med øjenålen. Tilsæt 1/2 ml ren 

etanol - den fra gramfarvningen) og lad denne "half and half" blanding stå ved stuetemperatur i 1 

time. Herefter udsås en dråbe til spredning på en anaerob plade til anaerob inkubering v. 35°. 

Vækst på pladen = sporedannelse. 

Ilttolerance og CO2 krav 

Inkuber ensartet tilsåede plader samtidig ved de fire dyrkningsbetingelser som er tilstede: 

Almindelig aerobt, CO2 termostat, mikoaerofilt (ca. 5% ilt) og anaerobt 

1. Aerobt + CO2 

Actinomyces spp., Propionibacterium spp., visse ægte streptokokker og lactobaciller er 

alle metronidazolresistente og vokser langsomt frem efter nogle dage. 

C. tertium (og C. carnis) kan vokse i CO2 inkubator men danner ikke spore 

Sporedannelse og metronidazolfølsomhed under anaerobe forhold. 

19-06-03 T. Justesen 12


2. Mikroaerofilt (5% ilt + CO2 ) 

Campylobacter spp, Helicobacter spp. og ” B. ureolyticus”. 

og evt. andre mikroaerofile gram negative stave 

Actinomyces spp. har CO2 krav, hvis de skal kunne vokse ved ilttilstedeværelse. 

Sammenlign defor også vækst aerobt med og uden CO2 

Desulfoviridintest. 

(Desulfovibrio og Desulfomonas spp. samt ofte Bilophila) 

Påvisning af sulfitreductase. Kraftig ubehagelig svovlagtig lugt fra kulturen. 

En enkelt dråbe 2 N NaOH afsættes direkte på en anaerob plade med tæt vækst og betragtes 

straks i UV-lys (365 nm). 

Positiv: Rød fluorescens sv.t. dråben. Negativ: Ingen fluorescens. 

Svovlbrintedannelse. 

Svovlbrinte eller H2S dannelse påvises ved at tilså et TSI-skråagar (Tri-Sugar-Iron) med 

sædvanlig teknik. 

Inkubation skal ske under anaerobe forhold for at reaktionen fremkommer ! 

Ved fjernelse af glasset fra kammeret kan sortfarvningen forsvinde helt efter nogle få timer, så 

aflæsningen skal foretages med det samme ! 

Svovlbrintedannelse er nyttig i Campylobacter/B. ureolyticus diagnostikken. 

Øvrige direkte enzymtests for præformerede enzymer. 

Testene anvendes i forskellige sammnehænge. Se de enkelte skemaers anvisninger. 

Direkte enzymtests: α-glucosidase, β-glucosidase, α-galactosidase α-fucosidase, β-N-acetylglucosaminidase, 

alkalisk fosfatase m.fl. 

Anvend Rosco`s tabletter efter forskriften (opslemning til synlig uklarhed i 1/4 ml saltvand. 

Tilsætning af tablet. Aflæsning efter højst 1 døgn v. 35°under alm. aerobe forhold. 

Ved 

Positiv = gul (N-acety-glucosaminidase: Kun stærk gul er positiv) Negativ = farveløs - svag gul. 

Specielt for Anaerobe gram positive kokker 

En ROSCO tablet m. SPS anbringes på en tilsået plade. Aflæsning: S ≥ 12 mm = 

Peptostreptococcus anaerobius er som den eneste ægte anaerobe gram positive kok der er 

følsom. SPS er en forkortelse af Sodium Polyanethol Sulfonat (også kendt som LIQUOID der er 

tilsat bloddyrkningskolber som antikoagulans). 

Nitrattest. se under Co-kulturbeskrivelsen 

Gelatine smeltning se under Co-kulturbeskrivelsen 

Esculinhydrolyse se under Co-kulturbeskrivelsen 

Sukkerforgæringer se under Co-kulturbeskrivelsen 

FORGÆRINGERNE I DET FØLGENDE KAN UDFØRES MED CO- 

KULTURPRINCIPPET 

Reaktioner, som kræver vækst af bakterierne sammen med substratet (sukkerforgæringer, 

gelatinesmeltning, nitratreduktionsprøven etc.), kan med fordel udføres som "Co-kultur", d.v.s. 

at den anaerobe bakteriestamme udsås sammen med en i de nævnte henseender inaktiv stamme 

af typen Acinetobacter eller "B. anitratum". Ved vækst af denne bakterie fjernes ilt i tilstrækkelig 

19-06-03 T. Justesen 13


grad fra substratet til, at de fleste anaerobe stammer kan vokse, selv om det pågældende substrat 

inkuberes i en almindelig aerob termostat. 

De pågældende glas kan også anbringes i anaerobkammer men tilstedeværelse af CO2 her 

vanskeliggør indikatoraflæsningerne. 

Metoden er ikke egenet til aerotolerante gram positive ikke sporedannende stave f. eks. 

Actinomyces. Tilsæt i stedet en dråbe hestecitratplasma til forgæringsglassene. 

Co-kulturprincippet. 

En bakteriestamme af typen Acinetobacter ("B. anitratum") som ikke kan forgære sukkerarter 

eller smelte gelatine anvendes og så den om rutinemæssigt ca. en gang om ugen, og lad den stå 

ved stuetp. f. eks. på blå plade så den altid er klar. (vi kalder vores stamme BANCO: B. 

ANitratum Co Kultur). 

Sukkerforgæringer. 

Forgæringsglas med sukkerarter fra SSI anvendes, således at den udvalgte række først tilsås med 

BANCO og herefter med den anaerobe bakteriestamme som ønskes undersøgt. Resultatet bliver 

bedst, hvis de anaerobe stammer udsås med et synligt inoculum. Brug altid en sukkerfri 

KONTROL. 

Bacteroides fragilis gruppen og Clostridiumarterne behøver ikke yderligere vækstfaktorer, men 

Prevotella spp. og Porphyromonas spp. kræver Hæmin + K vitamin, som kan tilsættes fra en 

koncentreret opløsning som en dråbe per forgæringsglas. Opløsningen kan fås på SSI. 

Aflæsning én gang dagligt for omslag til gul farve eller ændring mod gul i forhold til 

kontrolglasset. 

Hvis en anaerob bakteriestamme overhovedet er i stand til at forgære en sukkerart, drejer det sig 

praktisk talt altid om glucose. En positiv ONPG og en negativ glucose tolkes som manglende 

vækst i glucoseglasset og glucosen regnes så for positiv. 

OBS! Nogle bakterier særlig visse clostridiearter er i stand til at reducere bromthymolblåt (0,2%) 

til en farveløs forbindelse, hvorved glassets indhold ofte får en strågul farve. For ikke at 

forveksle denne reaktion med forgæring, må 1 dråbe bromthymolblåtopløsning evt. tilsættes. 

Ved "ægte" forgæring forbliver glasset gult medens det bliver blåt igen, hvis det kun var en 

reduktion. 

Esculinhydrolyse. 

Esculin spaltes af nogle bakterier ved en hydrolyse til esculetin og glucose. Ved en effektiv 

spaltning dannes så meget glucose, at en glucoseforgæring også kan foregå, så glasset slår om til 

gult som ved en almindelig forgæring med syredannelse. 

Selv små mængder esculetin kan imidlertid påvises, selv om der tilsyneladende ikke er sket en 

syredannelse (farven er stadig grønblå), ved at der tilsættes nogle dråber ferriammoniumcitrat 

1% i vandig opløsning. Sortfarvning = + Esculinhydrolyse. 

Gelatinesmeltning. 

Vigtig ved skelnen mellem proteolytiske og non-proteolytiske Clostridium spp. 

Desuden ved ikke- pigmenterede Prevotella spp.. 

19-06-03 T. Justesen 14


To typer gelatinase kan påvises og er begge et udtryk for at gelatinesmeltning er tilstede. Den 

ene type gelatinase spalter gelatinekæderne effektivt til aminosyrer og gelatinen er herefter 

flydende selv ved 4°. 

En anden type gelatinase spalter kun til polypeptidkæder så gelatinen ikke flyder ved 4°. Der 

skal derfor altid anvendes et kontrolgelatineglas ved udførelse af gelatinesmeltningsprøven. 

Udførelse: 

To gelatineglas (SSI) holdes under den varme hane til de bliver flydende. Begge glassene tilsås 

først med B. anitratum. Testglasset tilsås derpå med stammen, som ønskes undersøgt, det andet 

tjener som kontrolglas. 

Glassene anbringes sammen i alm. termostat v. 35°og aflæses herefter én gang i døgnet i op til en 

uge. 

Aflæsning: 

1) Først afkøles glassene i køleskab til kontrolgelatinen er stiv (v. 4° i ca.15 min). 

2) Testglasset vippes forsigtigt og en kraftig smeltning (++) vil kunne ses umiddelbart ved at 

indholdet i testglasset er blevet flydende. 

Hvis indholdet i begge glas er stift, opvarmes glassene langsomt med håndvarme til 

stuetemperatur idet de med korte mellemrum holdes i skrå stilling. Hvis der iagttages 

begyndende flydning i testglasset før 

kontrolglasset er dette også gelatinesmeltning (+). (F.eks. Cl. difficile er en svag smelter der 

evt. først er positiv efter 3 døgn) 

3) Hvis begge gelatiner bliver flydende på samme tid, bør glassene inkuberes påny og aflæses på 

samme måde som beskrevet i op til en uge, før gelatinesmeltningen aflæses som negativ. 

Nitratreduktion. 

Nitratreduktionen kan udføres som co-kultur i halvflydende kaliumnitratsubstrat fra SSI. 

(Alm. flydende nitratglas kan ikke anvendes !) 

Nitratreduktion er en vigtig egenskab hos en række mikroaerofile gram negative stave og en 

del uregelmæssige gram positive ikke-sporedannende stave. 

Substratet er tilberedt med serum som derfor ikke skal tilsættes for vækst. 

Tilsætning af sædvanlige nitratreagenser, når man er sikker på at der er god vækst i glasset. Ved 

undersøgelse af langsomt voksende bakterier kan en mindre portion evt. afpipetteres sterilt og 

undersøges for nitrit så resten kan geninkuberes til senere undersøgelse - eller to glas kan 

fremstilles fra starten. 

Vækst i halvflydende nitrat af mikroaerofile nitratreducerende bakterier vil ofte være 

meget karakteristisk idet den er lokaliseret i en zone ½ - 1 cm under overfladen. 

19-06-03 T. Justesen 15


Hovedgrupper efter følsomhed for primær id-disks. 

Metronidazol 

5 µg 

Kanamycin 

1000 µg 

Vancomycin 

5 µg 

Colistin 

10 µg 

Fluorescens 

Bacteroides fragilis 

gruppen 

S R R 

0 

(koralrød) 

Prevotella S R R V Rubinrød 

Porphyromonas S S R Rubinrød 

Fusobacterium S R S Grøngul 

B. ureolyticus gruppen S/R R S 0 

Desulfovibrio og 

Desulfomonas 

S S R R 

RØD m.2% 

NaOH 

Veillonella S R S (rød) 

Peptostreptococcus spp. 

Clostridium 

S S 0 

S S 

Eubacterium 

S S 

rød) 

Bifidobacterium S/R S S R 0 

Actinomyces S/R 0 

Propionibacterium R S/R 0 

0 (C.ramosum evt. 

rød og C. difficile og C. 

innocuum gulgrøn) 

0 (E.lentum evt. 

Lactobacillus S/R S/R 0 

Clost. innocuum S S S/R gulgrøn 

Anaerobe bakterier og katalasereaktionen 

Anaerobe bakterier som 

kan være Katalase 

positive 

Anaerobe bakterier 

som er 

Katalase negative 

Gram negative stave Gram positive stave uden Gram negative Forskellige gram 

sporer 

kokker 

positive 

Bacteroides fragilis Propionibacterium acnes Visse Veillonella Clostridium spp. 

og granulosum 

spp. 

Prevotella oulorum Actinomyces viscosus Peptostreptococcus 

spp. 

Bilophila Eubacterium lentum Bifidobacterium spp. 

Campylobacter 

Desulfovibrio 

Desulfomonas 

B. ureolyticus 

Pigmenterede arter fra 

dyr 

Bacteroides putredenis 

Lactobacillus spp. 

Defekte fakultative stave 

19-06-03 T. Justesen 16



som kan være 

UREASE positive 

Gram negative stave 

Bacteroides ureolyticus 

Gram positive stave u. 

sporer 

(Actinomyces naeslundii) 

Clostridium Gram positive kokker 

C. sordellii 

Bilophila wadsworthii Actinomyces viscosus (C. celatum) 

(Helicobacter sp) (Actinomyces meyerii) 


som kan være 

INDOL positive 

(Peptostreptococcus 

prevotii/tetradius) 

Gram negative stave Gram positive stave 

u. sporer 

Clostridium Gram positive kokker 

Bacteroides ovatus Propionibacterium C. sordellii Peptostreptococcus 

acnes 

asaccharolyticus 

B. uniformis C. bifermentans (P. indolicus) 

B. thetaiotaomicron (Eubacterium tenue) C. cadaveris (P. hydrogenalis) 

(B. splancnicus) C. clostridioforme 

(B. stercoris) C. sphenoides 

(B. eggerthii) (C. tetani) 

(B. putredenis) (C. novyi B) 

(B. coagulans) (C. indolis) 

(C. ghonii) 

Prevotella intermedia (C. malenominatum) 

P. heparinolytica (C. mangenotii) 

Porphyromonas spp. 

Fusobacterium 

necrophorum 

F. nucleatum 

F. varium 

(F. naviforme) 

(F. gonidiaformans) 

19-06-03 T. Justesen 17


KOKKER 

GRAM NEGATIVE 

STAVE 

ANAEROBE BAKTERIER 

SPOREDANNERE 

STAVE 

GRAM POSITIVE 

IKKE-SPOREDANNERE 

Veillonella spp. Bacteroides spp. Clostridium spp. Propionibacterium 

Prevotella spp. Actinomyces 

Porphyromonas spp. 

Bifidobacterium 

Fusobacterium spp. Lactobacillus 

Leptotrichia buccalis 

B.ureolyticus 

Bilophila wadsworthii 

Eubacterium 

KOKKER 

Peptostreptococcus 

[Acidaminococcus] Campylobacter spp. [Peptococcus] 

[Megasphera] Selenomonas spp. [Coprococcus] 

Helicobacter [Sarcina] 

[Mitsoukella mitsoukii] 

[Dialister pneumosintes] 

[Anarorhabdus furcosus] 

[B. coagulans] 

[B. putredinis] 

[B. forsythus] 

[Tisierella praeacuta] 

19-06-03 T. Justesen 18

Anaerobe bakterier, isolation og identifiaktion

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?