Kemisk Fagprojekt Hemoglobin og Myoglobin Studier af det Aktive Site

26010 - Kemisk Fagprojekt
EXAFS undersøgelse af hæmproteiner
Udarbejdet af
David Westergaard, s093629
Torben Schwartz, s092946
Røntgenkrystallografi
DTU Kemi
Danmarks Tekniske Universitet
Lyngby, Danmark
Vinter 2010

Resumé
Denne rapport omhandler undersøgelse af metalloproteiner ved
metoden EXAFS. Der er gjort rede for de forskellige niveauer af proteiner,
mekanismer og klassificeringer af metalloproteiner herunder
hæmproteinerne hæmoglobin og myoglobin. Endvidere er den basale
teori, m˚aleteknik og databehandling omhandlende EXAFS-metoden
beskrevet. Databehandlingen er illustreret ved tolkningen af eksperimentelle
data omhandlende metalproteinet cytochrome c. M˚aledata
ligger i omr˚adet 2,5-12,5 ˚A −1 og er opsamlet ved stuetemperatur.
Ved brug af single-scattering er bindingslængderne Fe-N (porphyrinring
samt Nitrogen i imidazol fra histidin) bestemt til 1,98(8)˚A og
Fe-S bestemt til 2,30(0) ˚A. Disse er sammenlignet med andre studier,
b˚ade EXAFS og røntgenkrystallografiske, og det er fundet bindingslængderne
stemmer godt overens. Der gives udtryk for, at EXAFSdatabehandlingen
stadig bygger p˚a subjektive skøn, idet splinen tilnærmes,
og grænser for afskæring af data vælges. Endeligt er muligheden for
forfining af bindingslængder og residualværdier under databehandlingen
afhængig af hvilket computerprogram, der benyttes.
i

Forord
”EXAFS undersøgelse af hæmproteiner”, Udarbejdet af David Westergaard
(s093629) og Torben Schwarts (s092946), vejledt af Pernille Harris og Christian
Grundahl Frankær. Arbejdet har været fordelt s˚aledes at David er
ansvarlig for afsnit 2+3, og Torben for 4+5, i resten af afsnittene har arbejdet
været ligeligt fordelt
Rapporten er forsøgt opbygget for at opn˚a den bedst mulige forst˚aelse hos
læseren. I kapitel 1 vil det basale omkring proteiner blive gennemg˚aet. Næste
kapitel vil omhandle hæmproteiner, herunder hæmoglobin og myoglobin.
Dernæst vil der være en kort gennemgang af XAFS, og til slut vil der foreg˚a
en databehandling samt sammenligning med eksperimenter fra litteraturen.
Det forventes at læseren er bekendt med simple kemiske strukturer og fysiske
fænomener.
Vi vil gerne sige stor tak til vores vejledere, Pernille Harris og Christian
Grundahl Frankær, for kompetent vejledning, samt l˚an af data. Derudover
en tak til MAX-lab, Lunds Universitet, Sverige, for at give os muligheden for
at se deres synchroton.
Rapporten er skrevet i L ATEX, med Knuth’s Computer Modern font, i dokumentklassen
article.
ii

Indhold
1 Indledning 1
2 Generelt om proteiner 2
2.1 Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2 Metalloproteiner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3 Hæmproteiner 6
3.1 Hæm-gruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2 Proteinstruktur af hæmoglobin og myoglobin . . . . . . . . . . 8
3.3 Hæmoglobin og myoglobins iltoptag . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.4 Bohreffekten [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
4 XAFS[15] 12
4.1 XANES- og EXAFS-spektre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4.2 Single- og multiplescattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.3 XAFS m˚alinger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.4 EXAFS studier af myoglobin og hæmoglobin . . . . . . . . . . 17
5 Databehandling 18
6 Resultater 23
7 Diskussion 26
7.1 Bindingslængder i hæm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
7.2 Sammenligning af resultater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
7.3 Modellering af data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
7.4 Afvigelser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
8 Konklusion 28
Litteraturliste 31
A Bølgetal 32
B Aminosyrer 33

Forkortelser
EXAFS Extended X-ray Absorption Fine Structure
XAFS X-ray Absorption Fine Structure
XANES X-ray Absorption Near Edge Structure
Hb Hemoglobin
Mb Myoglobin
PDB Protein Data Bank (www.pdb.org)
iv

1 Indledning
1 INDLEDNING
Proteiner, som best˚ar af aminosyrer, udgør en stor del af den levende organismes
makromolekyler og er essentialle for mange processer i biologiske systemer,
s˚asom elektrontransport, katalyseringen, transport af molekyler, cellegenkendelse,
DNA replikeringen osv. Kortlægningen af proteiners struktur
er derfor af stor betydning for at udforske mekanismen ved hvilken proteiner
udfører sin rolle. To af de mest veldefinerede proteiner gennem tiderne,
hæmoglobin og myoglobin, er beskrevet i denne rapport. Der er fokuseret
p˚a proteinets struktur og funktion. Røntgenkrystallografi har siden 60’erne
været den foretrukne metode til at kortlægge proteiner og bindingslængder,
men i de seneste 20˚ar er Extended X-ray Absorption Fine Structure (EX-
AFS) blevet mere udbredt, i takt med at m˚alinger er blevet lettere tilgængelige
samt data er er blevet mere præcise. Der gives i denne rapport en
basal forst˚aelse for det grundlæggende omkring EXAFS, samt hvorledes data
behandles. Til illustration af databehandling er der indhentet data fra
hestehjerte cytochrom c protein.
I rapporten vil referencer st˚a direkte hvor de er brugt. Hvis en reference ikke
er givet ved en figurtekst eller tabeltekst, er det egne figurer eller tabeller.
Atomer i figurer for proteiner og cofaktorer vil være ensrettet med hensyn
til farver:
• Nitrogen: Bl˚a
• Carbon: Grøn
• Svovl: Gul
• Jern/Kobber: Orange
• Oxygen: Rød
1

2 Generelt om proteiner
2 GENERELT OM PROTEINER
[1] Proteiner er en vigtig bestandel i enhver organisme. Disse makromolekyler
fungerer som katalysatorer (enzymer), membranmolekyler (Den aktive transport
af det polære molekyle glucose indover den upolære cellemembran,
Na + /K + -pumpen, elektrontransport, aquaporiner, cellegenkendelse), transport
rundt i kroppen af ellers hydrophope molekyler (O 2 bundet til hemoglobin).
Førnævnte processer er blot et lille udsnit af de mange funktioner proteiner
varetager i biologiske organismer.
Proteiner dannes ved hydrolyse af aminosyrer, og holdes sammen af de s˚akaldte
peptidbindinger, se figur 1.
Figur 1: Peptidsyntese af 2 aminosyrer. Carboxylenden bindes til aminoenden
ved fraspaltning af vand under forbrug af energi
Ialt findes 20 essentielle aminosyrer, som hver især har forskellige egenskaber,
afhængig af sidegrupperne, som tit inddeles efter polaritet og ladning under
fysiologiske forhold (pH ≈ 7,4), se tabel 1. En komplet oversigt er givet i
appendix B
Tabel 1: De 20 essentielle aminosyrer. Ved ladning og bindingsmuligheder forst˚as
udelukkende dem p˚a sidegruppen
Polaritet Aminosyrer Bindingsmuligheder
Neutralt Hydrofob Ala, Val, Leu, Ile, Por, Phe, Trp, Met van der Waals
Neutral Hydrofil Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Hydrogenbindinger
Ladet hydrofil Asp – , Glu – , Lys + , Arg + , His +
Hydrogenbindinger
Alle proteiner udgøres af en kombination af disse. Selve syntesen sker i kroppen
ved en translation af RNA, proteinsyntesen, denne vil vi dog ikke beskrive
nærmere her.
Vi vil i dette afsnit beskrive den generelle opbygning af naturlige proteiner.
Hvad der forst˚aes ved den primære, sekundære, tertiere og kvarternære
struktur, samt de indbyrdes intermolekylære kræfter vil kort blive beskrevet,
derudover vil vi kort klassificere hvad et metalloprotein er.
2

2.1 Struktur 2 GENERELT OM PROTEINER
2.1 Struktur
Den Primære struktur beskriver sekvensen af aminosyrer (AA) i et givent
protein.
Sekundære struktur beskriver en polypeptidkædes foldning, der er et resultat
af de indbyrdes hydrogenbindinger mellem amino og carboxylsyregruppen,
der ved fysiologisk pH er henholdsvis protoneret og deprotoneret. (Røde
streger i figur 2).
(a) Alfahelix [2] (b) Betasheet [3]
(c) Alfahelix [1] (d) Betasheet [1]
Figur 2: Udsnit af en foldning i 2 forskellige proteiner, optaget ved
røntgenkrystallografi. (a) og (b) viser foldningen p˚a protein niveau, figur (c) og
(d) viser de indbyrdes hydrogenbindinger p˚a molekylært niveau.
Resultatet af disse vekselvirkninger er, at proteiner enten foldes som et αhelix
(Figur 2a+2c), β-sheets (Figur 2b+2d), eller en blanding af disse.
Sekvenserne indimellem disse foldninger beskrives som loops.
Tertiære struktur er beskrivelsen af hele peptidkædens foldning, og hvordan
de sekundære elementer ligger i forhold til hinanden. Denne struktur
dannes af intermolekylære kræfter, best˚aende af hydrogenbindinger, kovalente
disulfid broer, ionbindinger og van der Waals kræfter.
De nævnte kovalente disulfidbroer dannes ved en oxidation af −SH termi-
3

2.1 Struktur 2 GENERELT OM PROTEINER
nalen i cysteins sidegruppe:
R−SH + HS−R + 1
2 O 2 → R−S−S−R + H 2O (2.1)
Hvor R refererer til resten af aminosyren cystein.
Kvarternær struktur er det proteinkompleks som flere proteinkæder tilsammen
danner. I figur 3 er strukturen for et protein i fotosyntese processen
Figur 3: Plante fotosystem I [4]
(≈3100 Aminosyrer), best˚aende af 18 subunits.
En proteinkæde i et proteinkompleks vil videre blive benævnt som en subunit
i p˚agældende kompleks
En monomers kvarternære struktur vil være den samme som den tertiære
struktur.
Det aktive site er det sted p˚a et enzym, hvor substratet bindes, og katalyseringen
af den kemiske reaktion finder sted. Ogs˚a kendt som reaktionscentret.
Allosteriske effekter er n˚ar binding af et molekyle ændrer et proteins
affinitet for et substrat. (Virker b˚ade aktiverende og deaktiverende) Dette
fremkommer oftest som en konformationsændring omkring det aktive site.
Den kooperative effekt er et tilfælde af en allosterisk effekt, hvor bindingen
af et substrat p˚avirker resten af proteinets affinitet for substratet. (Underforst˚aet
forekommer det kun p˚a proteiner, der har mere end et aktivt site)
4

2.2 Metalloproteiner 2 GENERELT OM PROTEINER
2.2 Metalloproteiner
Metalloproteiner er proteiner der indeholder en cofaktor (Uorganiske ioner),
oftest koordineret til nitrogen, oxygen eller svovl, som er nødvendig for at
proteinet kan udføre dets biologiske funktion.
Tabel 2: Metalioner der hyppigt indg˚ar i naturlige proteiner
Protein Metal Funktion
Cytochromer Cu 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ Elektrontransport
Hemoglobin Fe 2+
Jern-svovl coenzymer Fe 3+
Klorofyl Mg 2+
Nitrogenase Mo 4+
Nukleinsyre
boxypeptidase
polymerase, car- Zn 2+
Ferrodoxiner Fe 3+ , Fe 2+
Binder O2 reversibelt
Elektrontransport
Lysenergi til kemisk energi
Fikserer nitrogen
DNA/RNA Syntese, hydrolyserer
peptidbindinger
Elektrontransport
I tabel 2 ses en kort liste over nogen af de proteiner der findes i naturen indeholdende
metaller i forskellige oxidationstrin. Metallerne kan indg˚a i proteiner
bundet p˚a forskellige m˚ader.
P˚a figur 4a er vist enzymet Aconitase[5] der katalyserer processen
citrat Aconitase
−−−−−⇀ ↽−−−−− isocitrat (2.2)
som er en del af citronsyrecyklus 1 (Krebs cyklus). Figur 4b viser en photoporphyrin
XI, fra deoxy-hemoglobin [2]. Figur 4c viser en Cu(II)ion koordineret
til 2 imidazolgrupper fra histidin, samt svovl fra cystein og methionine, i
plastocyanin. et protein der st˚ar for elektrontransport i planters fotosyntese
[6].
1 En delprocess i omsætningen af glucose til energi
5

(a) Jern(II)-svovlklynge i Aconitase, kovalent
bundet som Fe 4 S 4 [5]
(c) Kobber(II)ion i plastocyanin, tetrakoordineret
med 2 imidazolringe fra histidin
aminosyrer, samt svovl fra cystein
og methionine[6]
3 HÆMPROTEINER
(b) Fe(II)-photoporphyrin IX. Jern er
koordineret til lonepair elektroner p˚a
porphyrin[2]
Figur 4: Eksempler p˚a metaller der indg˚ar i naturlige proteiner
3 Hæmproteiner
N˚ar en organisme trækker vejret, ind˚andes atmosfærisk luft ned i lungerne,
hvori oxygen diffunderer over kapilærerne og ind i blodet, og binder reversibelt
til hæmoglobin, som cirkulerer videre rundt i kroppen. Ilten frigøres
hvor det er p˚akrævet, eller lagres i Myoglobin til senere brug.
Myoglobin bliver primært brugt til lagring af oxygen, og findes udelukkende
i muskler, mens hæmoglobin forekommer i store koncentrationer i de røde
blodlegemer og øger opløseligheden af det ellers upolære O 2 molekyle i blodet.
Myoglobin og Hæmoglobin kan binde hhv. 1 og 4 O 2 molekyler.
Hb + nO 2 ⇋ Hb(O 2)n n = 0..4 (3.1)
Mb + nO 2 ⇋ Mb(O 2)n n = 0..1 (3.2)
6

3.1 Hæm-gruppen 3 HÆMPROTEINER
Myoglobin og hæmoglobin er blandt de mest studerede proteiner i den mod-
Tabel 3: Sammenligning af Hæmoglobin og Myoglobin
Analoger Forskelle
1. Cofaktor (Hæmegruppen) 1. Primær struktur
2. Mekanismen for binding af ilt 2. Mb monomer, Hb tetramer
3. Tertiært struktur af subunit 3. O 2 affinitet
4. Omr˚adet omkring Hæmegruppen 4. Allosteriske effekter
5. Koordinationskemien omkring Fe 5. Placering i organismen
6. Cellulærplacering
erne videnskab, og er nogle af de første proteiner der blev kortlagt med krystalstrukturer
i 1960 [7], [8]. I tabel 3 er givet de mest nærliggende sammenligninger
af de to proteiner.
I denne sektion vil opbygningen af de to proteiner, deres biologiske funktion
og aktive site blive beskrevet.
3.1 Hæm-gruppen
En hæm-gruppe best˚ar af en Jern(II) ion bundet til en protoporphyrin IX.
Porphyrin er et organisk heterocyclisk makromolekyle, hvor basis strukturen
er 4 pyrrole grupper (C 4H 4NH), der danner et konjugeret system. De fire
nitrogenatomer kan, med deres lone-pair, fungere som ligander og kompleksbinde
et metal, som det er tilfældet med Fe(II) (Refereres fremover som
Fe−N p). Der er dog ogs˚a eksempler p˚a andre cofaktorer i organismen der
best˚ar af et metal koordineret til en porphyrin gruppe, som ses i tabel 4.
Tabel 4: Metalioner bundet i porphyrin
Metalion Proteinnavn
Fe(II) Hæmoglobin
Mg(II) Klorofyl
Zn(II) Cytochrome c (subunit)
I deoxy formen findes Fe(II) svagt forskudt fra porphyrinringen, se figur 5b.
Dette skyldes uparrede elektroner, der skaber en sterisk hindring. Ved binding
af ilt mindskes den steriske hindring ved parring af elektronerne, og den
mest favorable position er nu plant med porphyringruppen, som i figur 5a.
7

3.2 Proteinstruktur af hæmoglobin og myoglobin 3 HÆMPROTEINER
(a) Oxygeneret hæmgruppe i Hæmoglobin
[2]
(b) Deoxygeneret hæmgruppe i Hæmoglobin
[2]
Figur 5: Oxygeneret og deoxygeneret struktur af hæmgruppen i Humant hæmoglobin
3.2 Proteinstruktur af hæmoglobin og myoglobin
Humant hæmoglobin er en tetramer best˚aende af 2 α- og 2 β subunits, indeholdende
hhv. 141 og 146 aminosyrer, symmetrisk koordineret omkring
et centrum. Alle subunits danner α-helixer (α-subunits indeholdende 7, og
β-subunits 8), som vist i figur 6a. Hver subunit indeholder en hæm gruppe,
(a) Oxygeneret Hæmoglobin[2] (b) Oxygeneret Myoglobin [9]
Figur 6: Humant Hæmoglobin og myoglobin
som ikke vekselvirker med de andre subunits. His93 2 koordinerer vinkelret p˚a
porphyrinringen til Fe atomet, se Figur 5 (Denne binding vil fremover blive
refereret til som Fe−N ɛ). Humant myoglobin er en monomer, best˚aende af
153aminosyrer. Myoglobin indeholder kun en hæm-gruppe, og er vist p˚a figur
6b. I begge proteiner er porphyrinringen bundet af van der Waals kræfter fra
2 Ved den notation forst˚aes den 93aminosyre, som er histidin, i en subunit
8

3.3 Hæmoglobin og myoglobins iltoptag 3 HÆMPROTEINER
aminosyrernes upolære sidegrupper, der danner en hydrofob lomme [10]. Den
deprotonerede carboxylsyre fra protoporphyrin XI stabiliserer hæm gruppen
ved hydrogenbindinger til proteinet. Bindingen af O 2 stabiliseres yderligere
af His64 der danner en hydrogenbinding til det bundne ilt.
Der er væsentlig forskel p˚a den oxygenerede og deoxygerenede form af hæmoglobin.
Dette skyldes kooperative effekter, hvilket bevirker en konformationsændring
i hæmoglobin molekylet. α2β2 rykker sig 15 o relativt til α1β1
[10], idet saltbroer brydes ved binding af ilt.
Der er teoretisk evidens for, at bindingen opst˚ar ved at der bliver overført
en elektron fra hæm-Fe(II) til O 2, hvorved der opst˚ar en reversibel hæme-
Fe(III)-O –
2 binding [11].
I myoglobin er bindingsvinklen ∠Fe−O−O = 115 ± 5 o , og ∠O−O· · ·H = 96 o
[12]. (Hydrogenbindingen skabes mellem His64 og O 2, som nævnt)
Fe−O−O bindingen kan underg˚a et nukleofilt angreb af vand, H + eller OH – ,
Fe(II) ⇌ Fe(III)−O−O − H 2 O,OH− ,H +
−−−−−−−−→ Fe(III) + O − 2
(3.3)
en irreversibel reaktion der danner en fri O – 2 ion, samt hæm-Fe(III), som ikke
længere kan optage ilt, og er deaktiveret [12] (Se reaktion 3.3).
3.3 Hæmoglobin og myoglobins iltoptag
Mættedheden af oxygen som funktion af partialtrykket af oxygen kan fremstilles
ved det s˚akaldte Hills plot,
y = Kfp(O 2) n
1 + Kfp(O 2) n
(3.4)
hvor n er Hills koefficienten (3 for hæmoglobin[10], 1 for myoglobin). At
n > 1 indikerer en kooperativ effekt, hvorved hæmoglobin binder oxygen
med højere affinitet [10].
Som det se p˚a figur 7, er myoglobins optagelse af ilt er uafhængig af trykket
ved fysiologiske forhold (Lunger: p(O 2) ≈ 100mmHg, andet væv: p(O 2) ≈
30−40mmHg), men for hæmoglobin stiger affiniteten for oxygen med trykket.
Myoglobin afgiver kun ilt igen ved meget lave partialtryk, og er derfor velegnet
til intracellulær oxygentransport, idet trykket ved mitokondrierne netop
er lavt, grundet det store forbrug af O 2 til citronsyrecyklusen samt elektrontransportkæden.
[13]
Hills plottet er dog ikke helt korrekt for hæmoglobin, da hæmoglobins optagelse
af hvert oxygen molekyle er en delprocess, og der derved er fire
9

3.4 Bohreffekten [1] 3 HÆMPROTEINER
Figur 7: Hillsplot for forskellige værdier af n
ligevægtskonstanter (Se reaktion 3.1), og en fyldestgørende funktion kræver
at der tages hensyn til alle. Dette er videre beskrevet i [14].
3.4 Bohreffekten [1]
Hæmoglobins affinitet for oxygen sænkes ved højt indhold af protoner, idet
den optager protoner under fraspaltning af ilt.
Hb−O 2 + H + ⇋ Hb−H + + O 2
(3.5)
Ved respiration omsættes glukose til energi, under dannelse af CO 2 som biprodukt
C 6H 12O 6 + 6 O 2 → 6 CO 2 + 6 H 2O + energi (3.6)
som diffunderer over cellemembranen og ud i blodet, hvor det indg˚ar i en
ligevægt med kulsyre.
CO2 + H2O Carbonicanhydrase
−−−−−−−−−−−⇀
↽−−−−−−−−−−− H2CO3 ⇌ H + + HCO − 3
(3.7)
Le Chateliers princip dikterer, at i lungerne vil reaktion (3.5) være forskudt
mod venstre grundet høje partialtryk af O 2, mens ved lavere tryk vil ligevægten
ligge mod højre.
Hæmoglobins optagelse af protoner bidrager til at fastholde en konstant pH,
hvilket kan karakteriseres som en puffereffekt.
Puffereffekten har hovedsageligt to form˚al:
10

3.4 Bohreffekten [1] 3 HÆMPROTEINER
• blodets pH-værdi stabiliseres, s˚aledes at blodets plasma ikke tager
skade ved varierende pH
• organismen kommer af med CO2, idet der dannes HCO 3 .
Flere molekyler og mekanismer stabiliserer deoxyformen i iltfattige omr˚ader.
Ved lav pH (pK a for histidin er 6,8-7,6) vil de positivt ladede histidiner
danne saltbroer. Hæmoglobin har ogs˚a en større affinitet for det naturligt
forekommende organiske molekyle glycerat-2,3-biphosphat under disse omstændigheder,
og alle 3 mekanismer virker som allosteriske regulatorer.
11
– 3

4 XAFS[15]
4 XAFS[15]
Til undersøgelse af det aktive site i metalloenzymer kan metoden XAFS
(X-ray Absorption Fine Structure) benyttes. N˚ar et atom bestr˚ales med
røntgenstr˚aling, vil dets inderste elektroner kunne exciteres - sendes fra den
inderste skal til en skal længere ude under absorption af den indkommende
foton. Minimumsenergien der skal til for at excitere et atom kaldes ”den
kritiske energi”og ligger for almindelige metalatomer i røntgenstr˚alers energiomr˚ade.
Den exciterede tilstand er dog ikke stabil, s˚a før eller siden vil
det exciterede atom henfalde til sin oprindelige tilstand under udsendelse af
en foton - den s˚akaldte fotoelektriske effekt, hvilken man udnytter i XAFS.
Energien af de udsendte fotoner kaldet fluorescensenergier er ligesom den kritiske
energi karakteristisk fra stof til stof. Rammer den henfaldende elektron
imidlertid en anden elektron i en mellemliggende skal, vil den henfaldende
elektrons energi ikke g˚a til udsendelse af en foton, men i stedet absorberes
af elektronen som den rammer, hvorved den ramte elektron enten exciteres
eller helt skydes ud af atomet. Dette benævnes Auger-effekten.
Egentlig kan b˚ade fluorescenseffekten og Auger effekten bruges til bestemmelse
af absorptionskoefficienten, men da metalatomer exciteres af fotoner
i røngtenstr˚aleomr˚adet (Efoton > 2keV), hvor fluorescenseffekten dominerer,
vil kun denne benyttes her.
4.1 XANES- og EXAFS-spektre
Ved at sammenholde intensiteten af fluorescens lyset med intensiteten af det
indkommende lys f˚as absorptionskoefficienten µ som funktion af energien, E
(se ligning 4.1).
µ(E) ∝ If
I0
(4.1)
If betegner intensiteten af fluorescens lyset, og I0 betegner intensiteten af
det indkommende lys. Undersøges absorptionskoefficienten som funktion af
energien af det indkommende lys, f˚as et spektrum (se den røde linje i figur 8,
der indikerer spektret for et isoleret jernatom). Det er disse spektre, som er
karakteristiske for XAFS metoden. I figur 8 ses, at absorptionskoefficienten
ved lavere energier er tæt p˚a nul, hvilket svarer til at ingen elektroner exciteres.
Absorptionskanten fremkommer, n˚ar den kritiske energi n˚as, hvorefter
absorptionen aftager, efterh˚anden som energien af det indkommende lys øges.
Undersøges en kemisk forbindelse best˚aende af flere forskellige atomer, vil
XAFS spektret blive mere avanceret (se den bl˚a linje i figur 8). Fluktuationerne
i kurven efter den kritiske energi skyldes, at fluorescenslyset udsendt
af centralatomet reflekteres, idet det rammer naboatomerne til det
12

4.1 XANES- og EXAFS-spektre 4 XAFS[15]
atom, hvis elektron blev exciteret. Det reflekterede lys vil interferere med
fluorescenslyset, hvorved dette enten forstærkes eller udslukkes (hhv. konstruktiv
og destruktiv interferens, se figur9) Dette ses som den varierende
absorptionskonstant. XAFS spektret opdeles i to sektioner. Omr˚adet lige før
Figur 8: Afbildning af µ(E). Den røde kurve indikerer µ(E) for et isoleret jernatom
uden naboer, hvorimod den bl˚a linje indikerer µ(E) for FeO.
Figur 9: XAFS. Den indkommende røntgenstr˚aling givet ved den sorte bølge
absorberes af jernatomet, som udsender fluorescenslys givet ved de bl˚a bølger.
Fluorescenslyset vil reflekteres af naboatomerne, N. Det reflekterede lys givet ved
de røde bølger vil interferere med fluorescenslyset og danne konstruktiv-, a. eller
destruktiv interferens, b.
og omkring den kritiske værdi betegnes XANES, og omr˚adet efter betegnes
EXAFS. XANES indeholder informationer om centralatomets art, oxidationsnummer
og koordinationskemi. EXAFS derimod indeholder informationer
13

4.2 Single- og multiplescattering 4 XAFS[15]
om de omkringliggende naboatomer - afstande og antal. Beskrivelsen gøres
ud fra EXAFS-funktionen χ(E), som defineres ved følgende funktion:
χ(E) =
µ(E) − µ0(E)
∆µ0(E)
(4.2)
µ0(E) betegner absorptionskoefficienten for et isoleret centralatom, og ∆µ0(E)
betegner forskellen i absorptionskoefficienten omkring den kritiske værdi E0.
Tælleren s˚a at sige ”fjerner”funktionen lige før og ved den kritiske energi,
og nævneren normaliserer funktionen, s˚aledes at EXAFS- omr˚adet træder
tydeligt frem.
EXAFS beskrives traditionelt vha. bølgeegenskaberne af fluorescenslyset, s˚a
derfor konverteres energien af røntgenstr˚alingen til str˚alingens bølgetal, se
ligning (4.3) (Denne er udledt i appendix A).
2me(E − E0)
k =
(4.3)
hvor me betegner en elektrons masse, og E0 betegner den kritiske energi. k
har enheden ˚A −1 og leder til EXAFS ligningen, se ligning (4.4)
χ(k) =
Hvor parametrene er følgende:
j
ℏ 2
Njfj(k)e −2k2 σ 2 j
kR 2 j
sin[2kRj + δ(k)] (4.4)
• Nj: Antallet af naboatomer af type j til det exciterede atom
• R: Afstand til det enkelte naboatom
• σ 2 : Varians i afstandene givet ved R.
• f(k) og δ(k): Naboatomernes spredningsfaktorer.
f(k) og δ(k) afhænger af naboatomernes atomnummer, s˚a kendes disse kan
naboatomernes art bestemmes.
4.2 Single- og multiplescattering
I takt med at kvaliteten af XAFS m˚alinger er steget de seneste ˚ar, er multiple
scattering blevet mere anvendeligt og præcist.
Ved single scattering forst˚as, at der under modelleringen kun inddrages de
vejlængder, hvor flourouscenslyset udelukkende rejser mellem centralatomet
14

4.3 XAFS m˚alinger 4 XAFS[15]
og et naboatom.
I Multiscattering modelleres efter et mere kompliceret billede. Her inkluderes
ogs˚a de pathways, hvor fluorescenslyset rejser fra centralatomet mellem 2 eller
flere naboatomer, se figur 10.
Figur 10: De røde pile er et eksempel p˚a single scattering, hvor fluorescenslyset
kun er mellem central- og et naboatom. De bl˚a pile er det eksempel p˚a multiple
scattering, hvor fluorescenslyset er mellem central- og flere end et naboatom.
4.3 XAFS m˚alinger
Til EXAFS-m˚alinger bruges typisk en opstilling som vist i figur 11
De centrale dele i opstillingen er som følger (Bogstaver med fed og kursiv
henviser til figur 11):
S: Synchroton Røntgenstr˚alingen som bruges i XAFS m˚alingerne genereres
i en synchroton, en ringformet partikelaccelerator. I acceleratoren sendes
partiklerne rundt i en polygon formet bane, hvorved de i polygonens hjørner
accelereres under udsendelse et bredt elektromagnetisk spektrum.
M: Monochromator Til selektion af lyset L fra synchrotronen bruges en
monochromator. Monochromatoren best˚ar af to krystaller, som diffrakterer
lyset. Ved at dreje p˚a krystallerne kan lys uden den ønskede bølgelængde
sorteres fra. Se figur 12
P : Prøven Idet røntgenstr˚alingen X0 rammer prøven, man undersøger, vil
ikke alle str˚alerne absorberes af de ønskede atomer og danne fluorescenslys
(se de grønne bølger figur 11 ). En del af str˚alingen X1 vil fortsætte gemmen
prøven med intensiteten I1, og andet vil absorberes af andre metalatomer i
prøven, som herefter vil udsende uønsket fluorescenslys, se de røde bølger i
figur 11.
F : Filter Da ionkamrene ikke kan skelne mellem str˚aling af forskellig energi,
opstilles mellem prøven, P, og detektoren, D, et metalfilter, F, som vil
15

4.3 XAFS m˚alinger 4 XAFS[15]
Figur 11: Skematisk tegning af XAFS-opstilling. Elktromagnetisk str˚aling dannes
i synchrotonen betegnet S, hvorefter den ønskede bølgelængde selekteres i
monochromatoren, M. Det indkommende lys X0 rammer prøven P , hvorved der
udsendes fluorescenslys givet ved de grønne bølger og uønsket flourescenslys givet
ved de røde bølger. Det uønskede fluorescenslys filtreres fra vha. filteret F , inden
det rammer detektoren D, hvormed intensiteten If af fluorescenslyset m˚ales. Noget
af det indkommende lys betegnet X1 vil fortsætte gennem prøven, hvorefter
det rammer referencefoliet R. En del af røntgenstr˚alingen, som rammer referencefoliet,
vil fortsætte gennem dette. Denne del betegnes X2. Intensiteten af
røntgenstr˚alingen X0, X1 og X2 m˚ales ved hjælp af ionkamre og betegnes henholdsvis
I0, I1 og I2.
Figur 12: Skematisk tegning af en monochromator. a og c betegner henholdsvis
den elektromagnetiske str˚aling fra synchrotonen og det selekterede lys. Den
ønskede bølgelængde vælges ved at dreje p˚a krystallerne givet ved b. θ betegner
vinklen mellem krystal og str˚ale.
exciteres af det uønskede fluorescenslys, hvorved det uønskede fluorescenslys
filtreres fra.
R: Referenceprøve I den efterfølgende databehandling ønskes en referenceværdi
for metalatomets kritiske energi. Værdien bestemmes ud fra et ref-
16

4.4 EXAFS studier af myoglobin og hæmoglobin 4 XAFS[15]
erencefolie best˚aende af det rene metal, idet intensiteten af det indkommende
røntgenstr˚aling I1 og intensiteten af den transmitterede røntgenstr˚aling I2
m˚ales. Str˚alingsintensiteter m˚ales ved brug af ionkamre. Absorptionskoefficientrne
for rene metaller er nøje bestemt, og dette referenceeksperiment
bruges derfor til kalibrering af den kritiske energi.
4.4 EXAFS studier af myoglobin og hæmoglobin
I et XAFS (Extended Absorbtion Fine Structure) studie blev myoglobin
fra hest undersøgt og modelleret ved multiplescattering. Bindingslængden
af Fe−O i Met-Myoglobin er m˚alt til 2, 08 − 2, 09˚A, Fe−N p = 2, 04 − 2, 05˚A
og Fe−N ɛ = 2, 16 − 2, 17˚A. Tilsvarende blev de m˚alt for Deoxy-Myoglobin,
Fe−N p = 2, 06˚A og Fe−N ɛ = 2, 16˚A [16]. Sammenlignes de to værdier for
nitrogenatomet i porphyrinringern, stemmer det overens med det tidligere
beskrevne, nemlig at jernionen er svagt udenfor planet i deoxy-myoglobin,
men ved oxidation af Fe(II) til Fe(III) er i samme plan, hvilket resulterer i en
kortere afstand. Forskydningen er beregnet til 0, 2˚A± 0,1
0,2 udfra triangulering
med EXAFS data [17], og 0,15-0,20˚A i et senere forsøg ved brug af XANES
[18]. De angivne værdier var blevet fundet b˚ade ved brug af Multiple Scattering
(MS) samt Single Scattering (SS). MS er dog at foretrække, da de flere
parametre giver en mere sandfærdig og fuldkommen beskrivelse af miljøet
omkring jernionen, men stiller ogs˚a større krav til m˚aledata.
XAFS studierne af hæmoglobin er utrolig sparsomme, idet proteinet indeholder
4 aktive sites, som alle er i ligevægt med oxygen. Dette giver usikkerheder
ved m˚alinger, da der ingen garanti er for hvilken form der m˚ales p˚a.
Dette er en af svaghederne ved EXAFS, nemlig den m˚ade data behandles
p˚a. EXAFS bygger p˚a, at en model tilnærmes de m˚alte data, og der kræves
derved en forh˚andsviden om molekylet og geometrien omkring det.
Idet myoglobin og hæmoglobin begge er hæm-proteiner, og har utrolig mange
ligheder især omkring hæm-gruppen, m˚a det med rimelighed kunne antages,
at de m˚alte bindingslængder for myoglobin m˚a være omtrentlig de samme i
hæmoglobin. Med andre ord kan det siges, at myoglobin næsten kan regnes
som værende det samme som en af de fire subunits i hæmoglobin, alts˚a en
simplificeret model.
17

5 Databehandling
5 DATABEHANDLING
Idet XAFS-m˚alingerne er afsluttet, haves et dataset best˚aende af værdier
for intensiteter af den fluorescerede str˚aling, If med tilhørende værdier for
den indkommende str˚aling, I0. Før disse data kan bruges i forbindelse med
EXAFS-ligningen, benyttes følgende metode best˚aende af 9 trin:
Til illustration er et datasæt omhandlende hæm-proteinet cytrochrom c behandlet.
Trin 2-9 de illustreret ved figur 13-19. Data er behandlet i programmet
WinXAS 3 og de mest sandsynlige single scattering pathways er beregnet
ved brug af FEFF 4 .
1. Hvis der haves flere spektre findes gennemsnittet af disse ud fra den
kritiske værdi bestemt ved referenceeksperimentet.
2. Funktionsværdierne før den kritiske værdi tilnærmes med et førstegrads
taylorpolynomium, som subtraheres fra hele spektrummet, hvorved baggrundsstøj
og toppe for˚arsaget af andre metaller end jern vil mindskes.
3. Normalisering: Spekteret normaliseres ved at tilnærme ∆µ0, der defineres
til 1. Dette medfører at spektre optaget af prøver med forskellige
koncentrationer kan sammenlignes.
4. Kritisk energi: Den kritiske energi bestemmes ud fra den højst afledte af
µ(E). Her kan den kritiske energi bestemt ved referenceeksperimentet
bruges som reference.
5. Konvertering til k-space: X-aksen konverteres fra energi til bølgetal.
6. Modellering af spline: I dette skridt opstilles en model for en tænkt absorption
fra et enkeltst˚aende centralatom, her jern. Modellen er matematisk
og ikke, som antydet tidligere, mulig at m˚ale eksperimentelt.
Idet den modellerede funktion trækkes fra spekteret, st˚ar kun EXAFSfunktionen
χ(k) tilbage.
7. Vægtning: For at gøre EXAFS-spekteret mere tydeligt ved højere kværdier,
vægtes det med k 3 .
8. Spekteret Fourier-transformeres. Er splinen modelleret godt, vil der
ikke forekomme elektrontæthed før første koordinationssfære her i den
Fouriertransformerede radialdistributionsfordeling.
3 http://www.chem.ucalgary.ca/research/groups/faridehj/Quick_manual.pdf
4 http://leonardo.phys.washington.edu/feff/
18

5 DATABEHANDLING
9. Modellering: Den eksperimentielt bestemte χ(k) tilnærmes nu med en
teoretisk EXAFS-funktion. N˚ar den bedste tilnærmelse er opn˚aet, kan
afstandene (R), koordinationsnummeret (N), og variansen σ 2 aflæses.
(a) (b)
Figur 13: Trin 1, (a) De opsamlede data er indikeret ved den røde kurve. Den
bl˚a kurve er et førstegrads taylorpolynomium, som tilnærmer værdierne før den
kritiske energi (b) Taylorpolynomiet er subtraheret fra den røde kurve, hvorved
toppe for˚arsaget af andre metaller i prøven minimeres
19

(a) (b)
5 DATABEHANDLING
Figur 14: Trin 2, (a) Absorptionskoefficienten µ0 er afbilledet som den bl˚a funktion
i spekteret. (b) Spekteret er blevet normaliseret, idet absorptionskoefficienten
definerer 1.0.
Figur 15: Trin 3, Figuren viser den første henholdsvis den anden afledte af spekteret.
Den bl˚a indikerer den højst afledte. Den kritiske energi E0 bestemmes ved
at bestemme det første maksimum af den højst afledte
20

5 DATABEHANDLING
Figur 16: Trin 4, Energien er her konverteret til bølgetal
(a) (b)
Figur 17: Trin 5, (a) Spekteret afbilledet sammen med en modelleret spline - givet
ved den grønne kurve. (b) Idet splinen subtraheres fra spektret træder EXAFSfunktionen
χ(k) frem. Her givet ved den røde kurve
21

Figur 18: Trin 6, χ(k) vægtet med k 3
Figur 19: Trin 7, χ(k) Fouriertransformeres
22
5 DATABEHANDLING

6 Resultater
6 RESULTATER
Den eksperimentelle χ(k) skal nu tilnærmes med en teoretisk model.
I databehandlingen er der udelukkende brugt singlescattering, og der er i
modellen inkluderet Fe−N p (bl˚a), Fe−N ɛ (bl˚a), Fe−S (gul), de 10 carbonatomer
bundet til nitrogen (rød), de 4 carbonatomer mellem ringene + de
2 carbonatomer bundet til svovl (hvid), de yderliggende 11 carbonatomer
(lyserød), vist p˚a figur 20.
Figur 20: Hæmgruppe i cytochrome c[19]
Det anses, at denne modellering er kemisk forsvarlig. De 5 nitrogenatomer
er alle i 5 ledede ringe, og m˚a forventes at have tæt p˚a den samme afstand.
Carbonatomerne indg˚ar ogs˚a i den 5 ledede ring, og der følger samme argumentation
som for nitrogen (I imidazolringen er en af carbonatomerne dog
substitueret med et nitrogen, ift. porphyrin. Dette forventes dog ikke at gøre
nogen forskel). Kun for de inderste skaller vil der kunne gives en præcis bindingslængde.
De ydre skaller giver et langt mindre bidrag til EXAFS-spektret
(den 3. ryg i figur 22), men er alligevel nødvendig for at give et bedre billede
af systemet og derved en mere præcis model for de inderste skaller. Der er
valgt at fiksere koordinationsnummer, samt 0, 001 ≤ σ 2 ≤ 0, 01 for nitrogen
23

6 RESULTATER
atomer i porphyrinringen og 0, 001 ≤ σ 2 ≤ 0, 02 for resten af liganderne
ved forfiningen. Bindingslænger for Fe−N ɛ blev fundet til 1,98˚A og 2,30˚A
for Fe−S i cytochrome c. Resultater er opsummeret i tabel 5. I figur 21
+ 22 ses de endelige resultater for modellen, sammenlignet med de fundne
eksperimentelle.
Tabel 5: Resultater fra egen datamodellering af XAFS data for cytochrome c
Fe-Ligand binding Afstand (˚A) σ 2
Fe−N p 1,98(8) 0,0039
Fe−S 2,30(0) 0,016
Fe−C r 3.02(1) 0,0087
Fe−C h 3.36(4) 0,0030
Fe−C lr 4.39(3) 0,0042
Ved Fe-C afstandene betegner r, h og lr de henholdsvis røde, hvide og lyserøde
carbonatomer som illustreret i figur 20
Residualværdien, R, er en værdi der beskriver hvor godt det fittede plot
passer med det eksperimentelt bestemte, og udregnes i WINXAS efter ligning
(6.1)
N
[yeks(i) − yteo(i)]
i=1
R =
N
(6.1)
yeks(i)
i=1
og des lavere R-værdi, des bedre er det simulerede plot fittet. Residuelværdien
for modelleringen er 6,96%, hvilket indikerer en meget god tilnærmelse.
Tilnærmelsen er vist sammen med de eksperimentelle data nedenfor i figur
21 og 22
24

6 RESULTATER
Figur 21: Fourier transformeret kurve for tilnærmelsen. Den røde kurve er eksperimentelle
data, mens den bl˚a er den tilnærmede kurve for egen modellering
Figur 22: Sammenligning af de modellerede og eksperimentelle data. Den røde
kurve angiver de eksperimentelle, hvorimod den bl˚a kurve angiver modellen.
25

7 Diskussion
7.1 Bindingslængder i hæm
7 DISKUSSION
Bindingslængderne i hæmgruppen er undersøgt for cytochrom c og myoglobin.
Som det ses i tabel 6, er der ikke væsentlig forskel p˚a den oxygenerede og
deoxygenerede myoglobin. Selvom myoglobin og cytochrom c begge er hæm
proteiner, er der en forskel i bindingslængderne.
Ingen af m˚aleresultaterne kan ved singlescattering konkludere, hvorvidt der
er forskel p˚a bindingslængden mellem Fe−N ɛ eller Fe−N p i cytochrome c,
hvorimod der med multiscattering er fundet en forskel. For myoglobin derimod
er det ret tydeligt, der ligger en forskel - p˚a næsten en faktor 10. Dette er
muligvis relateret til det mere elektronegative oxygenatom, der koordinerer
til jern i myoglobin.
7.2 Sammenligning af resultater
I tabel 6 er angivet resultater fra et lignende studie af bindingslængderne i
cytochrome c.
De fundne afstande fra egne data stemmer overens med undtagelse af Fe−S,
der afviger med 0,02˚A. Forskellen mellem de to Debye-Walle faktorer (σ 2 )
for Fe−S bindingen er p˚a 0,001˚A 2 .
At Debye-Walle faktoren er høj under egen databehandling i forhold til
andre studier, skyldes den temperatur data blev optaget ved. Egne data
blev optaget ved 298K, mens andre eksperimenter foregik i heliumkøling ved
10K, hvor systemet næsten er stilst˚aende. Derudover g˚ar egne data kun til
k = 12, 5˚A (Dette er en effekt af den høje temperatur), hvor andre referencer
har data helt op til k = 14, 5 − 15˚A [19][16]. En residualværdi p˚a blot 6,69%
fra egne data m˚a siges at være exceptionel lav. R-værdierne er, uheldigvis,
ikke direkte sammenlignelige. De beskriver dog alle sammen hvor godt fittet
tilnærmelsen er, men som det fremg˚ar i tabel 6, er de forskellige R-værdier
vægtede.
I tabel 6 ses ogs˚a indsamlede røntgenkrystallografiske data og bindingslænger
for Fe−N p er fundet til at være lidt kortere end dem i EXAFS: For metmyoglobin
= 2,01˚A −1 ved XRD mod 2,04-2,05˚A −1 ved EXAFS. Helt markant
er dog den forskel for Fe−N ɛ binding fundet i cytochrome c og deoxy-myoglobin
(MS modeller), hvor der er en forskel p˚a 0,13-0,15˚A −1
26

7.2 Sammenligning af resultater 7 DISKUSSION
Tabel 6: Oversigt over forskellige studier af Fe-Ligand bindingslængder i Hæmproteiner fra hestehjerte
EXAFS
Længder (˚A) Debye-Walle (˚A 2 )
Protein Metode Fe−Np Fe−Nɛ Fe−X Fe−Np Fe−Nɛ Fe−X T/K R (%) Rv 1 (%) Ref
Met-Mb MS 2,04-2,05 2,16-2,17 2,08-2,09O 0,001-0,002 0,001 0,001 10 - 18,8-20,8 [16]
Met-Mb SS 2,05-2,06 2,18-2,19 1,97-2,08O 0,001-0,002 0,001-0,010 0,005-0,010 10 - 17,5-21,8 [16]
Deoxy-Mb MS 2,06 2,16 - 0,002 0,001 - 10 - 17,7 [16]
Deoxy-Mb SS 2,07 2,18 - 0,002 0,011 - 10 - 21,4 [16]
Cyto c MS 1,98 2,01 2,33S 0,002 0,001 0,002 10 - 14,4 [19]
Cyto c SS 1,99 1,99 2,28S 0,001 0,001 0,003 10 - 18,4 [19]
Cyto c SS 1,98 1,98 2,30S 0,004 0,004 0,002 298,15 6,96 - *
27
Røntgenkrystallografi
Længder (˚A)
Protein Res (˚A) Fe−N p Fe−N ɛ Fe−X T/K R (%) Rfri Ref
Met-Mb 1,9 2,01 2,26 2,29O 298,15 15,5 - [20]
Deoxy-Mb 1,7 1,95 2,31 - 277,15 15,7 - [21]
Cyto c 1,94 1,96-2,30 2,16 2,30S 293,15 17 - [22]
1: Den vægtede R-faktor, *: Egne data, O: Fe−O, S: Fe−S,

7.3 Modellering af data 8 KONKLUSION
7.3 Modellering af data
Ved modellering af EXAFS kræves der en forudg˚aende forst˚aelse for, hvordan
systemet ser ud rent geometrisk. Under egen databehandling er det bl.a.
antaget, at systemet har origo omkring jernatomet, og at alle nitrogenafstande
er lige lange. Skulle dette ikke være tilfældet, er resultaterne forkerte.
Dette ville naturligvis p˚avirke R-værdien, men ved brug af nok tilnærmelser
ville det alligevel være muligt at opn˚a en god R-værdi, selvom modellen er
forkert.
Ved selve databehandlingen indg˚ar en vis subjektivitet, idet fastsættelsen
og afskæring af grænser er et skøn. Spliningen er ogs˚a en tilnærmelse, og
disse to faktorer tilsammen kan give en stor forskel i det endelige spektrum.
Derudover ligger, som ved andre fag, ogs˚a en del erfaring og ekspertise i at
modellere den bedste model.
Endvidere er der ogs˚a et sæt ekstra parametre, som kan l˚ases afhængigt af
computerprogrammet, der benyttes. Eksempler er artikler, der angiver største
værdier for σ 2 , maksimale bindingslændger, vinkler mellem atomerne[16]
samt vægter disse, bl.a. maksimal forskel i σ 2 mellem indbyrdes ligander,
størst tilladte margin for ændringer i bindingslængder/vinkler varierende for
hver ligand[19].
7.4 Afvigelser
De fundne resultater i litteraturen har alle afvigelser p˚a < ±0, 02 − 0, 03˚A.
Afvigelserne best˚ar af
8 Konklusion
De fundne afstande for ligander omkring jern-atomet i cytochrome c stemmer
godt overens med dem fra andre XAFS studier, men afviger dog lidt fra
dem fundet ved røntgenkrystallografi. Geometrien omkring porphyrinringen
i hhv. myoglobin og cytochrome c er ogs˚a forskellig, og dette kan kædes
sammen med forskellen i liganden, som udgøres af dioxygen (Met-Mb), Svovl
(cytochrome c), eller ingenting (Deoxy-Mb).
Selvom røntgenkrystallografi er en velkendt og p˚alidelig metode, har EXAFS
stadig fordele. Med EXAFS er det muligt at m˚ale p˚a substanser der ikke kan
krystalliseres. Endvidere i takt med at data forbedres, vil det være muligt
at opstille endnu mere præcise modeller for miljøet omkring metalatomer i
proteiner.
En svaghed ved EXAFS er dog stadig, at med nok parametre kan enhvert
28

LITTERATUR LITTERATUR
molekyle tilpasses, og EXAFS er derfor ikke en metode til at bestemme
strukturen af en fuldstændig ukendt forbindelse.
Litteratur
[1] Geoffrey Zubay. Biochemistry. Wm. C. Brown Publishers, 3rd edition,
1993.
[2] S. Y. Park, T. Yokoyama, N. Shibayama, Y. Shiro, and J.R. Tame.
1.25 a resolution crystal structures of human haemoglobin in the oxy,
deoxy and carbonmonoxy forms. The Journal of Biological Chemistry,
360(3):690–701, 2006. PDB 2DN1 og 2DN2.
[3] P. Andrew Chong, Hong Lin, Jeffrey L. Wrana, and Julie D. Forman-
Kay. Coupling of tandem smad ubiquitination regulatory factor (smurf)
ww domains modulates target specificity. Proceedings of the National
Academy of Sciences, 107(43):18404–18409, 2010. PDB 2KXQ.
[4] A. Amunts, H. Toporik, A. Borovikova, and N. Nelson. Structure determination
and improved model of plant photosystem i. The Journal of
Biological Chemistry, 285(5):3478–3486, 2010. PDB 2LW5.
[5] J. Dupuy, A. Volbeda, P. Carpentier, C. Darnault, J. M. Moulis, and
J. C. Fontecilla-Camps. Crystal structure of human iron regulatory
protein 1 as cytosolic aconitase. Structure, 14(1):129–139, 2006. PDB
2B3Y.
[6] Y. S. Bukhman-DeRuyter, R. Fromme, I. Grotjohann, B. Schlarb-Ridley,
H. Mi, and P. Fromme. To be published. PDB 2Q5B.
[7] Kendrew J. C., Dickerson R. E., Strandberg B. E., Hart R. G., Davies D.
R., Philips D. C., and Shore V. C. Structure of myoglobin, a threedimensional
fourier synthesis at 2˚A resolution. Nature, 185:422–427,
1960.
[8] Perutz M. F., Rossmann M. G., Ann F. Cullis, Hilary Muirhead, Georg
Will, and North A. C. T. Structure of hæmoglobin: A three-dimensional
fourier synthesis at 5.5-˚A. resolution, obtained by x-ray analysis. Nature,
185:416–422, 1960.
[9] M. Unno, H. Chen, S. Kusama, S. Shaik, and M. Ikeda-Saito. Structural
characterization of the fleeting ferric peroxo species in myoglobin: experiment
and theory. Journal of the American Chemical Society, 129:13394–
13395, 2007. PDB 2Z6S.
29

LITTERATUR LITTERATUR
[10] M. F. Perutz, A. J. Wilkinson, M. Paoli, and G. G. Dodso. The stereochemical
mechanism of the cooperative effects in hemoglobin revisited.
Annual Reviews Back Volume Collection, 27(1):1–34, 1998.
[11] Hui Chen, AMasao Ikeda-Saito, , and Sason Shaik. Nature of the Fe−O2
Bonding in Oxy-Myoglobin: Effect of the Protein. Journal of the american
chemical society, 130(44):14778–14790, 2008.
[12] Keiji Shikama. Nature of the feo2 bonding in myoglobin and hemoglobin:
A new molecular paradigm. Progress in Biophysics and Molecular Biology,
91:83–162, 2005.
[13] Bruce D. Sidell. Intracellular oxygen diffusion: the roles of myoglobin and
lipid at cold body temperature. The Journal of Experimental Biology,
201:1118–1127, 1998.
[14] Adair G. S. The hemoglobin system. vi: The oxygen dissociation curve
of hemoglobin. The Journal of Biological Chemistry, 63:529–45, 1925.
[15] Matthew Newville. Fundamentals of xafs, 2004.
[16] Anne M. Rich, Robert S. Armstrong, Paul J. Ellis, Hans C. Freeman,
and Peter A. Lay. Determination of iron-ligand bond lengths in horse
heart met- and deoxymyoglobin using multiple-scattering xafs analyses.
Inorg. Chem., 37:5743–5753, 1998.
[17] Shulman R. G. On extended x-ray absorption fine structure studies of
hemoglobin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 84(no.
4):973–974, 1987.
[18] Paola D’Angelo, Andrea Lapi, Valentina Migliorati, Alessandro Arcovito,
Maurizio Benfatto, Otello Maria Roscioni, Wolfram Meyer-Klaucke,
and Stefano Della-Longa. X-ray absorption spectroscopy of hemes and
hemeproteins in solution: Multiple scattering analysis. Inorg. Chem.,
47(21):9905–9918, 2008.
[19] Ming-Chu Cheng, Anne M. Rich, Robert S. Armstrong, Paul J. Ellis,
and Peter A. Lay. Determination of iron-ligand bond lenghts in ferric
and ferrous horse heart cytochrome c using multiple-scattering analyses
of xafs data. Inorg. Chem, 38(25):5703–5709, 1999.
[20] Stephen V. Evansa and Gary D. Brayer. High-resolution study of the
three-dimensional structure of horse heart metmyoglobin. J. Mol. Biol,
213(4):885–897, 1990. PDB 1YMB.
30

LITTERATUR LITTERATUR
[21] Yang F. and Phillips GN Jr. Crystal structures of co-, deoxy- and metmyoglobins
at various ph values. J. Mol. Biol, 256(4):762–774, 1996.
PDB 1VXD.
[22] Gordon W. Bushnell, Gordon V. Louie, and Gary D. Brayer. Highresolution
three-dimensional structure of horse heart cytochrome c. J.
Mol. Biol., 214:585–595, 1990.
31

A Bølgetal
A BØLGETAL
k = 2π 2πv
=
λ c
(idet c = λ · v) (A.1)
= 2π ∗ p
h
(Broglie: λ = h
=
v p
⇔ = )
p c h
(A.2)
p mc
=
ℏ ℏ
(jf definitionen af impuls) ⇔ (A.3)
k 2 = m2c2 2mE
=
ℏ2 ℏ2 (idet E = mc 2
2mE
k =
) ⇔ (A.4)
(A.5)
ℏ 2
Der antages vacuum idet c sættes lig hastigheden af fotonen.
32

B Aminosyrer
Figur 23: De 20 essentielle aminosyrer
33
B AMINOSYRER