Dissertation Amrei Steinhoff - Universität zu Lübeck

2. MATERIAL UND METHODEN
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„Preclearen“ versetzt und für 2h bei 4°C schüttelnd inkubiert. Anschließend wurde
die Agarose durch Zentrifugation abgetrennt und der Proteinlösung der
entsprechende Antikörper zugegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C
wurden die Protein-Antikörper-Komplexe mit 100µl Protein G-Agarose Suspension
gefällt und der Komplex durch Aufkochen der Agarose in 30µl Probenpuffer
denaturiert, auf ein SDS-Gel aufgetragen und mittels Western Blot analysiert.
2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
2.2.3.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration von Zelllysaten und aufgereinigten
rekombinanten Proteinen wurde die Methode nach Bradford verwendet. In einer
Mikrotiterplatte wurde zunächst eine Standardreihe angelegt, indem BSA von 0 bis
10,5µg in physiologischer Kochsalzlösung auf ein Endvolumen von 21µl verdünnt
wird. Ebenso wurde die Proteinlösung entsprechend auf ein Endvolumen von 21µl
in Kochsalzlösung verdünnt. Nach Zugabe von 200µl Bradford-Reagenz konnte
die Absorption bei 595nm im ELISA-Reader gemessen und darüber die
Proteinkonzentration der Probe ermittelt werden.
2.2.3.2 SDS-PAGE
Die Proteine wurden je nach der molekularen Masse der Zielproteine in 7,5%-igen,
10%-igen, 12,5%-igen oder 15%-igen denaturierenden Polyacrylamidgelen
aufgetrennt. Die Proteinproben wurden für 5min bei 96°C in Probenpuffer
aufgekocht, und anschließend auf das Gel aufgetragen
(Lösungszusammensetzung siehe Tabelle 7). Die Elektrophorese erfolgte bei
120V, als Größenstandard diente die vorgefärbte Proteinleiter PageRuler TM der
Firma Fermentas Life Sciences.
2.2.3.3 COOMASSIE FÄRBUNG
Um Proteine im Gel sichtbar zu machen, wurden diese mit Coomassie Brilliant
Blue angefärbt. Hierfür wurde das Gel zunächst 20-30min in Färbelösung
geschwenkt, und anschließend in Entfärbelösung wieder entfärbt. Da Coomassie
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