Exon-Skipping-Bericht, März 2013 - Duchenne Muskeldystrophie

Dr. Günter Scheuerbrandt
Forschungsbericht, März 2013
Wege der Forschung nach einer Therapie der Duchenne-Muskeldystrophie.
Im Jahr 2000 fand in der amerikanischen Gesundheitsbehörde
National Institutes of Health in Bethesda nahe Washington
in den USA eine Tagung zur Erforschung von
Therapiemethoden für Duchenne Muskeldystrophie statt.
Dort wurde mir bewusst, dass es für Familien mit an Duchenne
erkrankten Jungen, ihren Ärzten und anderen pflegenden
Personen wichtig wäre zu wissen, welche Informationen
Wissenschaftler und Klinikärzte während dieser
Tagung über den aktuellen Stand ihrer Forschungsprojekte
miteinander austauschten.
Ich habe daraufhin meinen ersten Bericht geschrieben.
Es sollten viele weitere Berichte folgen. Ich schrieb sie alle
nicht in einer schwer verständlichen Fachsprache, ich erklärte
vielmehr in einfachen Worten, was in den Laboratorien
für Ihre Jungen geleistet wird. Die Erklärungen sollten
auch für alle verständlich sein, die nicht moderne Biochemie
oder Genetik studiert haben. Auf meinen Internetseiten
www.duchenne-information.eu können Sie die letzten
dieser Berichte auf Englisch, Deutsch und Spanisch lesen.
Zudem finden Sie dort einige Interviews, die seit 2008
veröffentlicht wurden.
Ich beginne den ersten Teil meines Berichtes mit der
Erklärung, wie Dystrophin in den Muskelzellen hergestellt
wird und wie das Fehlen dieses wichtigen Proteins die
Krankheit Duchenne-Muskeldystrophie verursacht. Da das
Exon-Skipping momentan die am weitesten vorangekommene
Technik für eine wirkungsvolle Therapie ist,
wird es in diesem Teil des Berichtes ausführlich beschrieben.
Für dieses Verfahren wurden schon viele klinische
Studien an Duchenne-Patienten durchgeführt, andere Studien
laufen noch oder sind geplant.
Im zweiten Teil dieses Berichtes, der später im Jahr
2013 zu lesen sein wird, werde ich die wichtigsten Forschungsansätze
außerhalb der Skipping-Methode beschreiben.
Dazu gehören Gentransfer, das Verwenden von
Stammzellen, die Utrophin-Hochregulierung, die Hemmung
von Myostatin, die Verwendung von Steroiden und
die diagnostischen Verfahren, um die Mutationen des Dystrophin-Gens
unserer jungen Duchenne-Patienten zu finden.
Beide Teile des Berichtes enthalten hauptsächlich Informationen
über therapeutische Forschung. Ich weiß, dass
mir viele von Ihnen nach dem Lesen des Berichtes E-Mails
senden werden. Sie werden mich zu den Forschungsansätzen
fragen, besonders aber zu dem Thema, welche Regio-
Teil 1 Exon Skipping
nen mit genetischer Information – Exons – übersprungen,
geskippt werden müssten, damit eine Behandlung Ihres
kranken Kindes oder von Ihnen selbst möglich wird, wenn
Sie ein erwachsener Patient sind.
Am Ende dieses Berichtes werde ich in einem separaten
Kapitel erklären, wie ich mit diesen Anfragen umgehen
werde und wie ich die wenigen persönlichen Daten verwalten
werde, die Sie mir schicken, damit wir in Kontakt
bleiben können.
In meinen Zusammenfassungen erwähne ich nur die
Namen der Laborleiter, auch wenn diese Kollegen und
Studenten haben, die als Team an den Projekten arbeiten,
von denen hier berichtet wird. Es ist jedoch unmöglich,
alle Namen aufzuführen. Ich habe die Namen der Wissenschaftler
ohne ihre akademischen Titel aufgeführt. Die
meisten von ihnen sind Professoren und alle haben einen
Doktortitel in Medizin oder in Naturwissenschaften.
Eine Liste der wichtigsten Veröffentlichungen finden
Sie am Ende dieses Berichtes. Mit einer in Klammern gesetzten
Nummer, z.B. (12) weise ich in meinen Zusammenfassungen
an der Stelle im Text auf diese Artikel hin,
zu der diese Ihnen mehr Einzelheiten zu dem betreffenden
Thema geben können. Diese Veröffentlichungen sind für
Sie als Laien sicher nicht einfach zu verstehen. Wenn Sie
jedoch die eine oder andere Veröffentlichung gerne per
E-Mail erhalten möchten, lassen Sie es mich wissen.
Bitte stören Sie sich nicht daran, wenn ich das so häufig
verwendete Exon-Skipping nicht ändere und das dazugehörige
Verb wie ein deutsches schreibe: skippen, skippte, geskippt.
Das ist einfacher als immer „überspringen“ schreiben
zu müssen.
Ich danke Frau Pat Furlong, Leiterin der amerikanischen
Elterngesellschaft Muskeldystrophie Parent Project
Muscular Dystrophy, PPMD, www.parentprojectmd.org
und Frau Professor Kate Busby, Koordinatorin von
TREAT-NMD, dem europäischen Netzwerk für neuromuskuläre
Erkrankungen www.treat-nmd.eu für die Erlaubnis,
ihre Logos verwenden zu dürfen. Dies zeigt, dass
sie meine Arbeit, Ihnen die Forschungen nach einer Therapie
Ihrer Kinder zu erklären, unterstützen und befürworten.
Diesen Bericht habe ich zuerst auf Englisch geschrieben
und im Januar 2013 veröffentlicht. Diese deutsche
Übersetzung davon wurde von meinem Sohn Ralph
Scheuerbrandt im Februar 2013 angefertigt.
1

Gene sind Funktionseinheiten des genetischen Materials
Desoxyribonukleinsäure, DNA. Seine Struktur sieht aus
wie eine Wendeltreppe, die sogenannte Doppelhelix
Doppelhelix. Sie
wurde von James Watson und Francis Crick 1953 be-
schrieben. Jede Stufe dieser Treppe enthält zwei der vier
verschiedenen kleinen Moleküle, die Basen Adenin, Gua-
nin, Cytosin und Thymin. Sie werden mit A, G, C und T
abgekürzt, wir nennen sie die genetischen hen Buchstaben
Buchstaben.
Auf den Stufen der Treppe sind nur zwei Basenkom Basenkombinationen
möglich, die Basenpaare A-T T und GG-C,
die genau
zwischen die beiden Stränge der Doppelhelix passen.
Wenn zum Beispiel an einem Strang der DNA die Ba Basenfolge,
die Sequenz, GGCTTAATCGT ist, muss die
Basenfolge am anderen Strang komplementär dazu sein.
Die Base A steht immer gegenüber der Base T und G gegenüber
von C.
-GGCTTAATCGT-
|||||||||||
-CCGAATTAGCA-
Die Folge dieser Basen, dieser genetischen Buchsta Buchstaben, ist
die genetische Information, , die notwendig ist für die
Entwicklung und die Erhaltung von lebenden Organismen.
Sie wird von einer Generation an die nächste weitergeg weitergegeben.
Die meisten Gene enthalten Anweisungen für die biologische
Synthese von Proteinen. Im Zellkern werden die
genetischen Anweisungen von aktiven Genen kopiert, in
eine andere genetische Substanz
umgeschrieben, , die uunfertige
oder
Prä-Boten-Ribonuklein Ribonukleinsäure premRNA,
die auch TTranskript
ge-
nannt wird.
Die meisten Gene ene haben aktiv
codierende Bereiche, ddie
Exons,
die die Information n für die Produ Produk-
tion der Proteine enthalten. Zw Zwischen
den Exons liegen die oft sehr
viel längeren Intron Introns, die wichtige
Informationen für die Steuerung
der Aktivität der Gene enthalten.
Die e Ribonukleinsäuren
Ribonukleinsäuren, RNAs,
verwenden die Base UU,
Uracil, anstatt
der ähnlichen Base T der
DNA. Da die Struktur der RNA
wichtig ist für das Exon Exon-Skipping,
wird sie auf Seite 6 im Absatz über
die beiden Arten von Antisense-
Oligos erklärt.
Nach dem m Kopie Kopiervorgang werden
noch innerhalb des Zellkerns
die Introns aus der pre-mRNA entfernt und die Exons zusammengespleißt
zur Boten-Ribonukleinsäure
Ribonukleinsäure mRNA.
Wie stellen Gene Proteine her?
Englisch messenger RNA. Diese enthält dann nur Exons
mit der genetischen Information für die Biosynthese eines
Proteins.
Auch in deutschen wissenschaftlichen Texten werden,
wie auch hier, die englischen Abkürzungen DNA, RNA,
pre-RNA RNA und mRNA verwendet.
Die mRNA verlässt den Kern und wandert zu den Ri-
bosomen, den Protein aufbauenden Strukturen, die sich im
Zellplasma außerhalb des Zellkerns befinden. Spleißstellen
sind kurze Basensequenzen an den Grenzen von Exons
und Introns, die wichtig sind für die korrekte Entfernung
der Introns aus der pre-mRNA. mRNA. Das Splei Spleißen selbst geschieht
in Spleißosomen, , einem Komplex aus vielen Proteinen
und kleinen RNAs.
Der genetische Code. Um die „Sprache“ der Gene in die
der Proteine übersetzen zu können, ist die genetische In-
formation der mRNA in genetische Worte gefasst. Jedes
Wort besteht aus drei aufeinanderfolgenden Basen, den
Codons. Diese bedeuten – mit drei Ausnahmen – eine der
20 verschiedenen Aminosäuren
Aminosäuren, den Bauelementen des
Proteins, nach dem genetischen Code. Es gibt 64 verschi verschie-
dene Code-Wörter, die aus s je drei Buchstaben bestehen.
Hier sind einige Beispiele:
GUU = Valin, ACC = Serin, AUG = Methionin,
ACG = Threonin, onin, CAC = Histidin, CCA = Prolin,
UUU = Phenylalanin, CGA = Alanin, GCG = Alanin.
Die meisten Aminosäuren ha haben mehr als ein RNA-Code-
Wort. Es gibt keine Abstände zwischen den Codewörtern.
So bedeutet beispielsweise die kurze Basen- Sequenz
AUG-AGC-GCA-CCA- am Anfang eines Genes, dass das
Protein, das vom Gen „herge gestellt“ wird, mit den Aminosäuren
Methionin, Serin, Alanin und Proli Prolin beginnt. Es
gibt also einen Leseraster, ein aus drei Buchstaben best bestehendes
Wort nach dem anderen ohne Abstand zwischen
ihnen. . Dieses Raster wird von dem ersten Code Code-Wort festgelegt,
das immer AUG ist. Die Bindestriche in diesem
Beispiel existieren nicht wirklich, sie verdeutlichen nur das
Leseraster. Wenn im Beispiel oben der rote Buchstabe G
zufällig entfernt wird durch eine Mutation, ändert sich die
Sequenz in AUG-ACG-CAC CAC-CA.... Das Leseraster wird
verschoben und die Code-Wörter Wörter ändern nach der Mutati-
on ihre Bedeutung. Sie stehen hen dann für andere Aminosä Aminosäuren,
in diesem Fall für Methionin, Threonin, Histidin. Di Diesen
folgen dann weitere falsche Aminosäu Aminosäuren. Solche Leseraster-Verschiebungen
Verschiebungen sind für das Verständnis des
Exon-Skippings sehr wichtig. .
In den Ribosomen werden die genetischen Code Code-Wörter
der mRNA RNA gelesen und in die Sprache der Proteine
übersetzt. . Diese setzen sich aus vielen tausenden Amin Aminosäuren
zusammen. Die drei Ausnahmen, die zuvor erwähnt
wurden, sind die Worte UAA, UAG und UGA. Diese ssind
Stopp-Codons, Stoppzeichen, an denen der Zusammenbau
des Proteins in den Ribosomen beendet wird.
Dystrophin-Gen und -Protein Protein. Duchenne Muskeldys-
trophie trifft nur Jungen. Die Häufigkeit beträgt etwa
2

1:3500 aller neugeborenen Jungen. Frauen haben, wenn sie
Überträgerinnen dieser geschlechtsgebundenen Krankheit
sind, eine Mutation, einen Fehler, im Dystrophin-Gen auf
einem ihrer beiden X- Chromosomen. Sie übertragen diesen
Fehler im Durchschnitt auf jeden zweiten ihrer Söhne,
die dann nur dieses eine X-Chromosom mit der Mutation
haben. Da sie kein intaktes Dystrophin-Gen auf einem
zweiten Chromosom haben wie die Frauen, verursacht diese
Mutation die immer noch unheilbare Erbkrankheit Duchenne-Muskeldystrophie.
Manchmal taucht eine derartige
Mutation ganz neu in einer Familie auf.
Das Dystrophin-Gen ist das zweitgrößte unserer
20.488 Gene. Das Gen für das Muskelprotein Titin, das
wichtig ist für die Elastizität der Muskelzellen, ist ungefähr
100mal größer als das Dystrophin-Gen.
Das nächste Bild zeigt den Ort des Gens auf dem kurzen
Arm des X-Chromosoms. Seine DNA besteht aus
2.220.381 genetischen Buchstaben, deren aktive Sequenzen
in 79 Exons zusammengefasst sind. Es sind auch 7
Promoter zu sehen. Das sind Sequenzen, die für den Beginn
der Produktion des normalen Proteins sowie seiner 6
Varianten notwendig sind. Nach dem Spleißen enthält die
mRNA nur noch 11.058 genetische Buchstaben, das sind
0,5% der Buchstaben des gesamten Gens.
In den Ribosomen wird das Dystrophin-Protein nach
der genetischen Information in der mRNA aus 3.685 Aminosäuren
zusammengesetzt. Diese Bausteine werden von
einer anderen Art von RNA, der Transfer-RNA oder
tRNA an den Ort der Biosynthese im Innern der Ribosomen
gebracht.
Die nicht aktiven Sequenzen zwischen den Exons, die
99,5% des gesamten Gens ausmachen, sind die Introns.
Es ist jetzt bekannt, dass einige dieser Sequenzen wichtig
sind für die Regulierung der genetischen Aktivitäten. Sie
könnten auch noch andere, bisher unbekannte Funktionen
haben, die zu den manchmal unterschiedlichen Symptomen
von Duchenne-Patienten führen, obwohl diese die
gleichen Mutationen in den Exons haben.
Das Dystrophin-Protein ist ein langgestrecktes Molekül
mit 24 sich wiederholenden Aminosäure-Sequenzen, die
von 4 Gelenkregionen getrennt sind. Seine beiden Endregionen
werden N- und C-Terminals genannt. Es gibt auch
eine Region mit vielen Cysteinen, das sind Aminosäuren
die Schwefel enthalten. Im Bild wird auch ein Schnitt
durch gesundes Muskelgewebe gezeigt. Die Dystrophin-
Moleküle in den Zellmembranen wurden durch leuchtende,
fluoreszierende Antikörper sichtbar gemacht.
Größe des Dystrophin-Gens und seines Proteins. Die
Doppelhelix-Struktur des Dystrophin-Gens ist 0,75 mm
lang. Zusammen mit den etwa 20.000 anderen menschlichen
Genen passt es in einen Zellkern, der einen Durchmesser
von etwa 0,01 mm hat. Das ist möglich, weil das
genetische Material darin extrem dicht gepackt ist.
Ein Molekül des normalen Dystrophin-Proteins ist viel
kürzer als sein Gen, es ist 125 nm, Nanometer, lang. Das
sind 0,000125 mm. 8000 dieser Moleküle würden, wenn
sie in einer geraden Linie aneinandergereiht wären, gerade
einmal 1 mm lang sein. In einem Gramm Muskel gibt es
114 Milliarden Dystrophin-Moleküle.
Die Rolle des Dystrophins. Dystrophin wird für die mechanische
Stabilität der Muskelzellen benötigt. Es befindet
sich auf der Innenseite der Muskelzellmembranen. Sein
C-terminales Ende ist mit einer Gruppe anderer Proteine in
der Membran verbunden, dem Dystrophin-Glykoprotein-
Komplex. Das andere Ende, das N-terminale, hat Verbindung
zu den zusammenziehbaren, kontraktilen, Strukturen
innerhalb der Muskelzellen. Die zentrale Struktur des Dystrophins
besteht aus ineinander verdrehten Aminosäure-
Ketten, die mehrfach auf sich selbst zurückgeklappt sind.
Wenn das Zusammenziehen, die Kontraktion, der Muskelzelle
das Dystrophin-Protein zwingt, seine Länge zu ändern,
funktioniert seine gefaltete Struktur wie eine Feder
oder wie ein Stoßdämpfer.
Das Dystrophin übermittelt also die mechanische Energie,
die im Actin-Myosin-Kontraktionsgefüge entsteht, an
die Muskelzellmembranen und die Strukturen außerhalb
der Zellen, dem Bindegewebe und den Sehnen. Dies geschieht
in einer ausgeglichenen Art und Weise, die alle beteiligten
Strukturen nicht überstrapaziert.
Der Dystrophin-Glykoprotein-Komplex. Dystrophin hat
mehrere Aufgaben: Es reguliert die komplizierte Struktur
des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes und die Position
vieler anderer Proteine. Es reguliert aber auch biologische
Prozesse wie z.B. die Steuerung des Muskelwachstums
und den richtigen Kalziumgehalt in den Zellen. Viele Einzelheiten
dieser verschlungenen gegenseitigen Abhängigkeiten
zwischen den zahlreichen Komponenten in einer
lebenden Zelle sind noch nicht bekannt.
3

Duchenne-Jungen haben entweder gar kein oder nur
sehr wenig Dystrophin in ihren Muskelzellen. Wenn die
Schutz- und Regulationseffekte von Dystrophin fehlen,
verursacht das Zusammenziehen der Muskeln Risse und
Löcher in den Muskelmembranen. Dadurch kann relativ
viel Kalzium in die Fasern fließen.
Überschüssiges Kalzium aktiviert Enzyme wie zum
Beispiel Kalpain oder die Proteasen. Diese Enzyme spalten
Muskelproteine auf und verursachen Zelltod-Programme,
Apoptosen. Dann kommt es zu einer Reihe von Reaktionen
wie Entzündungen und einer Aktivierung von Fibroblasten.
Diese führen zur Fibrosen oder Narbengewebe,
das die Regeneration der Muskeln verlangsamt und typische
Symptome bei älteren Duchenne-Patienten hervorruft.
Jungen mit der langsamer verlaufenden Becker-Muskeldystrophie
haben weniger Dystrophin-Protein in ihren
Muskelzellmembranen, das oft auch in verkürzter Form
vorliegt. Es kann seine Funktion zwar noch erfüllen, funktioniert
meist jedoch weniger wirksam als das normale
Dystrophin.
Es leiden jedoch nicht nur die Skelettmuskeln, wenn
Die Aufgabe der Forschung. Ein gesunder 5jähriger Junge,
der 30 kg wiegt, hat ungefähr 12 kg Muskeln. Diese
enthalten 1,5 Billiarden (1,5 x 10 15 ) Dystrophin-Moleküle.
Ein 5jähriger Duchenne-Junge hat schon 30% seiner Muskeln
verloren und hat demnach nur noch 8 kg Muskelmasse.
Diese verbleibenden Muskeln haben nur noch Spuren
oder gar kein Dystrophin mehr. Die Information des geschädigten
Gens kann nicht korrekt gelesen werden für die
Biosynthese des Proteins. Die geringe Zahl der Muskelzellen,
die Spuren von Dystrophin enthalten, weniger als 3%,
werden revertierte Fasern genannt. Ihr Dystrophin ist
durch spontanes Exon-Skipping entstanden.
Es ist nicht bekannt, wie viel Dystrophin notwendig ist,
um das Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, es ist
jedoch besser als nichts (1). Das neue Dystrophin, das
durch Exon-Skipping entsteht, muss nicht genauso lang
sein wie das normale Dystrophin, es kann kürzer sein, aber
es muss richtig arbeiten können.
Exon-Skipping, eine Gentherapie für Duchenne. Während
einer Diskussion Mitte der 1990-Jahre erklärte mir
Gertjan van Ommen von der Universität Leiden in den
Niederlanden, wie eine Gentherapie diese Aufgabe lange
Zeit ohne ernste Nebenwirkungen erfüllen könnte. Diese
Therapie wird jetzt Exon-Skipping genannt. Sie wurde in
den letzten 15 Jahren von vielen Forschungsgruppen, vor
allem in den Niederlanden, in Frankreich, Japan, Australien,
dem Vereinigten Königreich und den Vereinigten Staaten
von Amerika weiter entwickelt und zwar so intensiv,
dass dieses Verfahren nicht nur an Tieren in Labors, sondern
auch in klinischen Studien an Duchenne-Patienten
getestet wird .
Exon-Skipping bedeutet das Springen von einem Exon
zum nächsten. Exons sind die aktiven Abschnitte der Basen-Sequenzen
eines Gens. Im Dystrophin-Gen von Duchenne-Jungen
ist es zu Mutationen gekommen, so dass
ein oder mehrere Exons fehlen, das Gen hat dann Deletio-
Exon Skipping
Dystrophin fehlt, sondern auch die glatten Muskeln und
die Herzmuskeln. Schäden an den Herzmuskeln führen zu
Kardiomyopathien, Herzmuskelerkrankungen. Die
Schwächung der glatten Muskulatur hat viele Folgen:
Blutgefäße können schlechter entspannen, wenn sich der
Blutdurchfluss erhöht. Dies wiederum führt zu Atemschwierigkeiten
und anderen Problemen. Der Magen-
Darmtrakt wird in Mitleidenschaft gezogen, wenn die Bewegungen
der Därme eingeschränkt werden. Ein einziges
beschädigtes Gen kann also große Teile des Körpers in
Mitleidenschaft ziehen.
Auf Seite 12 habe ich ein Kapitel unter der Überschrift
„Muskelreparatur, eine allgemeine Einführung“ eingefügt.
Sie wurde von Annemieke Aartsma-Rus geschrieben mit
vielen Einzelheiten über die Entwicklung und den Verlauf
der Duchenne-Muskeldystrophie. Hier wird auch empfohlen,
das Exon-Skipping, das ich als nächstes beschreiben
werde, sobald wie möglich nach der Geburt zu beginnen,
wenn die meisten Muskeln der Duchenne-Jungen noch
vorhanden sind.
nen. Es gibt auch Verdopplungen, Duplikationen, oder
Fehler in der Buchstabenfolge eines Wortes, Punkt-Mutationen.
Solche Mutationen haben das Leseraster bei den
kranken Jungen um einen oder zwei Buchstaben verschoben,
so daß ein normales Raster, in-frame, zu einem nicht
normalen Raster wird, out-of-frame. Kurz nach der Mutation
entsteht dann ein vorzeitiges Stopp-Codon.
Der Leseprozess der genetischen Information für die
Biosynthese des Proteins ist unterbrochen an solch einem
Stoppzeichen. Es kann kein Dystrophin mehr produziert
werden. Diese Fehler können korrigiert werden, d.h. die
Protein-Produktion kann wieder gestartet werden, wenn
ein oder mehrere der noch vorhandenen Nachbar-Exons in
der pre-mRNA so blockiert werden, dass der Mechanismus,
der die Exons verbindet, spleißt, sie überspringt, sie
skippt, und sie nicht mehr in die mRNA aufnimmt (2).
Für diese Blockade sind Antisense-Oligonukleotide,
notwendig, abgekürzt Antisense Oligos, oder in diesem
Bericht oft nur Oligos genannt. Sie sind kurze Stücke von
genetischem RNA-Material, die eine besondere Sequenz
von nur 20-30 genetischen Buchstaben haben. Sie können
sich innerhalb der zu skippenden Exons durch die Watson-
Crick-Basenpaarung an komplementäre, genau passende
Sequenzen anlagern und so deren Spleißen mit den anderen
Exons verhindern.
Wo geschieht das Exon-Skipping? Wie zuvor beschrieben,
werden die 2,2 Millionen genetischen Buchstaben des
Dystrophin-Gens im Muskelzellkern kopiert und in die
pre-mRNA umgeschrieben. Die meistens sehr langen Intron-Sequenzen
werden dann herausgeschnitten und nur
die 79 Exon-Sequenzen – diese sind nur insgesamt 11.000
Buchstaben lang – werden zu der sehr viel kürzeren
mRNA gespleißt, zusammengesetzt. Das Exon-Skipping
passiert während dieses Spleißens. Die verkürzte Boten-
Ribonukleinsäure, mRNA, ohne die durch Mutation entfernten
und die geskippten, übersprungenen, Exons ver-
4

lässt den Kern und wandert zu den Ribosomen im Zellplasma.
Dort wird die genetische Information der mRNA
gelesen und in die Sprache der Proteine übersetzt, in die
Aminosäure-Frequenz des Dystrophins, das dort produziert
wird.
Duchenne- wird in Becker-Dystrophie umgewandelt.
Wegen der fehlenden Exons – der durch die Mutation entfernten
und der zusätzlich geskippten – werden auch die
Aminosäuren, die durch die fehlenden Exons bestimmt
werden, in dem neu hergestellten Dystrophin fehlen. Das
neue Dystrophin hat also eine Aminosäuren-Kette, die weniger
als die normale Zahl, 3.685, an Aminosäuren enthält.
Oft jedoch ist es noch fähig, die Muskelzellmembranen
bis zu einem gewissen Ausmaß vor den mechanischen Belastungen
einer Muskelkontraktion zu schützen.
Bei den klinischen Versuchen mit Patienten wird zunächst
Exon 51 geskippt. Hier erkläre ich die molekularen Einzelheiten
dieses Skippings bei einem Patienten mit der Deletion
von Exon 50. Das Ziel dieses Skippens ist es, das
Leseraster in der mRNA wiederherzustellen, das durch die
Deletion von Exon 50 im Gen verschoben worden war.
Zunächst zeige die Basensequenzen vom Anfang und
Ende der Exons 50 und 51 der normalen mRNA des Gens
und auch vom Ende von Exon 49 und dem Anfang von
Exon 52. Im Exon 50 sind 29 Codons nicht aufgeführt und
auch nicht 52 Codons im Exon 51. Unter jedem Codon
Molekulare Einzelheiten des Skippens von Exon 51.
Die Symptome der Krankheit werden dadurch weniger
ausgeprägt, der Abbau der Muskeln erfolgt langsamer und
die Lebenserwartung der Patienten steigt deutlich. Sie erreicht
in manchen Fällen sogar die normale Lebenserwartung.
Die Duchenne-Dystrophie wäre dann in eine Becker-
Muskeldystrophie, die mildere Variante der Krankheit,
umgewandelt worden.
Eine Therapie, jedoch noch keine Heilung. Das Ziel des
Exon-Skippings ist es also, die Krankheit in eine mildere
Variante umzuwandeln und dadurch das Fortschreiten der
Krankheit zu verlangsamen. Exon-Skipping ist also nur
eine Therapie, keine Heilung. Mit dieser Gentechnologie
wird das geschädigte Gen selbst nicht verändert, es wird
weder ersetzt noch repariert, es wird lediglich der Mechanismus
seines Informationsflusses korrigiert.
steht der abgekürzte Name der Aminosäure im Dystrophin-Protein,
die von dem Codon determiniert wird. Die
Aminosäuren werden in den Ribosomen aneinandergereiht.
Sie sind nicht, wie hier gezeigt, mit den Codons verbunden.
Die Codons folgen aufeinander ohne Zwischenräume,
die Bindestriche zeigen nur das Leseraster an und
die senkrechten Striche die Grenzen der Exons. Die drei
Basen des versteckten Stoppsignals UGA sind rot markiert.
Exon 50 hört nach der ersten Base des letzten Codons auf,
das dann zu UCU mit den ersten beiden Basen von Exon
51 komplettiert wird (blau markiert).
Ende Exon 49 | Start Exon 50 Ende Exon 50 | Start Exon 51
---CAG-CCA-GUG-AAG | AGG-AAG-UUA-GAA---AUU-GGA-GCC-U | CU-CCU-ACU-CAG-ACU-
gln pro val lys | arg lys leu glu ile gly ala ser| pro thr gln thr
verstecktes Stoppcodon
---GUU-ACU-CUG-GUG-ACA-CAA---AAA-CUA-GAA-AUG-CCA-UCU-UCC-UUG-AUG-UUG-GAG---
val thr leu val thr gln lys leu glu met pro ser ser leu met leu glu
Ende Exon 51 | Start Exon 52
---AUG-AUC-AUC-AAG-CAG-AAG | GCA-ACA-AUG-CAG-GAU-UUG---
met ile ile lys gln lys | ala thr met gln asp leu
Wenn Exon 50 im Gen und also auch in der mRNA deletiert
ist, folgt auf Exon 49 direkt das Exon 51. Dies verschiebt
das Leseraster im Exon 51 um eine Base nach
rechts mit der Konsequenz, dass in den Ribosomen acht
falsche Aminosäuren in die wachsende Dystrophinkette
eingebaut werden, bis schließlich das zuvor versteckte,
Ende Exon 49 | Start Exon 51
---CAG-CCA-GUG-AAG | CUC-CUA-CUC-AGA-CUG-UUA-
gln pro val lys | leu leu leu arg leu leu
aber jetzt aktivierte, vorzeitige Stoppsignal UGA erreicht
wird. Die verschobenen Basensequenzen und die falschen
Aminosäuren sind rot markiert. Die Biosynthese des Proteins
Dystrophin wird vorzeitig abgebrochen, es bleibt unfertig
und wird zerstört. Dadurch entwickelt sich Duchenne-
Muskeldystrophie.
aktives Stoppcodon Antisense-Oligoribonukleotid
UC-UUU-ACG-GUA-GAA-GGA-ACU
-CUC-UGG-UGA-CAC AAG---AAC-UAG-AAA-UGC-CAU-CUU-CCU-UGA-UGU-UGG--
leu trp STOPP!
Ende Exon 51 | Start Exon 52
---AU-GAU-CAU-CAA-GCA-GAA-G | GC-AAC-AAU-GCA-GGA-UUU---
5

Das von den holländischen Forschern verwendete exonskippende
Antisense-Oligoribonukleotid PRO051, hier
blau markiert, bindet sich durch Watson-Crick-Paarung an
20 Basen im Exon 51. Es blockiert dort die ESE-Sequenz,
die zum Spleißen notwendig ist, und verursacht das Skippen
von Exon 51 in der mRNA des mutierten Gens, die in
diesem Beispiel die Sequenz des Exons 50 nicht enthält.
Wenn zusätzlich zum deletierten Exon 50 das Exon 51
durch Skippen entfernt wurde, dann folgt auf Exon 49 direkt
Exon 52. Das Leseraster ist nicht mehr gestört, weil
Exon 49 mit einem vollständigen Codon aufhört und Exon
52 mit einem vollständigen Codon von drei Basen anfängt.
Ende Exon 49 | Start Exon 52
---CAG-CCA-GUG-AAG | GCA-ACA-AUG-CAG-GAU-UUG---
gln pro val lys | ala thr met gln asp leu
Jetzt gibt es kein vorzeitiges Stoppsignal mehr im Exon 52
oder später, aber 77 Aminosäuren fehlen von den 3.685
des normalen Proteins, diejenigen, deren Information in
den Sequenzen der Exons 50 und 51 enthalten war. Sie
fehlen im mittleren Teil des verkürzten Dystrophins, des-
sen Funktion aber wahrscheinlich wenig beeinträchtigt ist,
so daß die schweren Symptome der Duchenne- in die weniger
schweren der Becker-Muskeldystrophie abgeschwächt
werden.
Antisense Oligoribonukleotide, die potentiellen Exon-Skipping-Medikamente.
Verschiedene Typen von Antisense-Oligos. Für die Tierversuche
und die ersten klinischen Exon-Skipping Studien,
die von den Firmen Prosensa und Sarepta ausgeführt wurden,
wurden zwei Arten von Antisense-Oligos verwendet.
Sie haben die Basis-Struktur von Ribonukleinsäuren,
RNAs, die neben der DNA die zweitwichtigste natürliche
Nukleinsäure ist.
Die RNA besteht aus einer langen Kette von sich abwechselnden
Einheiten der zuckerartigen Substanz Ribose
und einer Phosphorsäure. Jede Ribose-Einheit trägt eine
der 4 genetischen Buchstaben: Adenin (A), Guanin (G),
Cytosin (C) und, in diesem Fall, Uracil (U), welches ähnlich
dem Buchstaben T (Thymin) der DNA ist. Die Reihenfolge
dieser Buchstaben ist wichtig für die Funktion
von vielen langen und kurzen RNAs, da sie sich selbst an
die komplementären Sequenzen von DNAs und anderen
RNAs durch die Watson-Crick-Basenpaarung anlagern
können. G steht dann gegenüber von C und A gegenüber
von U (oder T in der DNA). Dies funktioniert wie ein effizienter
Reißverschluss mit 4 verschiedenen Zähnen.
Die potentiellen Medikamente zum Exon-Skipping, die
Antisense-Oligos, sind kurze RNA-Stücke mit nur ca. 20-
30 genetischen Buchstaben. Diese kurzen Sequenzen genügen,
um sicherzustellen, dass sie sich nur an diejenigen
RNA- oder DNA-Sequenzen anlagern, die blockiert werden
sollen. Das passiert, obwohl unsere gesamte DNA in
all unseren 46 Chromosomen in jeder Zelle Sequenzen von
mehr als 3 Milliarden Buchstaben aufweist, von denen ungefähr
1%, also nur 30 Millionen zu unseren 20.000 Genen
gehören und daher in RNA kopiert wird, wenn es nötig ist.
Dies ist sehr wichtig, weil ein Antisense-Oligo gegen
Duchenne nur die genetische Information des Dystrophin-
Gens auf dem X-Chromosom von kranken Jungen beeinflussen
darf und keine anderen Gene. Jegliche Art von falschen
Verbindungen zu anderen Genstrukturen könnte
schwere Nebenwirkungen zur Folge haben, wenn ein zukünftiges
Exon-Skipping-Medikament einem Duchenne-
Jungen gegeben wird während der hoffentlich vielen Jahre
seines verlängerten Lebens.
Die Antisense Oligos müssen nach der Injektion so lange
wie möglich im Blutkreislauf überleben. Sie müssen
Zeit haben, von den Blutgefäßen in die Zellen aller Mus-
keln zu gelangen. Dort müssen sie die vielen Kerne in jeder
Zelle eindringen und ihre Aufgabe erfüllen: Ein oder
mehrere Exons der mutierten pre-mRNA während des
Spleißens blockieren, um so eine verkürzte, mRNA zu erzeugen.
Wenn die ankommenden Oligos die normale
RNA-Struktur hätten, würden sie von Enzymen als fremde
Nukleinsäuren erkannt und zerstört werden. Aus diesem
Grund müssen die Oligos chemisch geschützt werden, so
dass diese Enzyme sie nur sehr langsam oder gar nicht zerstören.
Die niederländischen Wissenschaftler verwenden 2’O-
Methyl-Phosphorothioate, in diesem Bericht auch 2’O-
Methyle genannt. Sie haben eine Methylgruppe, die aus
einem Kohlenstoff- mit drei Wasserstoff-Atomen besteht,
an dem Sauerstoffatom des zweiten Kohlenstoffatoms der
Ribose-Einheiten, sowie ein Schwefelatom anstatt eines
der Sauerstoffatome an den Phosphatbrücken. Die Morpholinos,
die von der Firma Sarepta verwendet werden,
haben eines der Phosphat-Sauerstoffatome durch eine
Dimethylamid-Gruppe ersetzt. Dies ist ein Stickstoff-Atom
mit zwei Methylgruppen. Und alle Ribose-Einheiten sind
durch Morpholinoringe ersetzt. Dies sind sechsgliedrige
Ringe, die aus 4 Kohlstoffatomen, 1 Sauerstoffatom und 1
Stickstoffatom bestehen.
Ich zeige Ihnen auf der nächsten Seite die chemische
Struktur dieser zwei Arten von geschützten Antisense-
Oligos mit nur zwei ihrer genetischen Buchstaben, die als
„Base“ gekennzeichnet sind. Die Kohlenstoffatome werden
nicht gezeigt, sie sitzen an den Ecken und den Enden
der Linien dieser vereinfacht dargestellten Strukturen. Jedes
Kohlenstoffatom hat ein oder mehrere Wasserstoffatome,
die auch nicht gezeigt werden. Eine dritte Art von
Antisense-Oligos wird Vivo-Morpholino genannt. Es wird
in einem Absatz über das Multiexon-Skipping auf Seite 21
beschrieben.
Um das Exon 51 in den zahlreichen klinischen Studien
mit Patienten zu skippen, wird das 2’O-Methyl Antisense-
Oligo verwendet. Diese Studien werden von den Firmen
Prosensa und GlaxoSmithKline, GSK, durchgeführt. Dieses
Oligo PRO051, das jetzt Drisapersen genannt wird,
hat 20 genetische Buchstaben mit folgender Sequenz:
6

UCUUUACGGUAGAAGGAACU
Das Morpholino-Antisense-Oligo, das von der Firma Sarepta,
die früher AVI hieß, in den Studien eingesetzt wurde,
hieß zunächst AVI-4658 und heißt jetzt Eteplirsen. Es
hat 30 Buchstaben, die 20 Buchstaben des niederländischen
Oligos sind darin enthalten und hier unterstrichen:
GAUCUUUACGGUAGAAGGAACUACAACCUC
2’O-Methyl-Antisense-Oligo
Morpholino-Antisense-Oligo
Die Moleküle dieser Antisense-Oligos mit ihren 20
oder 30 genetischen Buchstaben haben recht komplizierte
chemische Strukturen. Drisapersen besteht aus 699 Atomen
und Eteplirsen aus mehr als 1000. Dies zeigt, dass
diese möglichen Medikamente für unsere Duchenne-Jungen
sich von kleineren Arzneimittel-Molekülen stark unterscheiden.
Sie können mit jeder gewünschten Sequenz
ihrer Buchstaben von automatischen Maschinen in denjenigen
Labors hergestellt werden, die vorklinische Versuche
an Gewebekulturen und Tieren durchführen. Wenn bei
diesen Versuchen ein vielversprechendes Oligo gefunden
wurde, werden klinische Studien an Duchenne-Jungen geplant
und durchgeführt. Die Oligos dafür müssen als klinische
Reagenzien unter strengen Regeln und Vorschriften
von spezialisierten Firmen hergestellt werden.
Verschiedene Eigenschaften der Antisense-Oligos. Die
Moleküle der Antisense-Oligos sind nicht so groß wie Proteine
und Nukleinsäuren. Deswegen werden sie vom Körper
durch die Nieren schnell ausgeschieden. Die 2’O-Methyle
sind elektrisch geladen und verbinden sich mit verschiedenen
Proteinen im Blut. Sie werden daher nicht so
schnell mit dem Urin ausgeschieden wie die Morpholinos,
die elektrisch neutral sind.
Wie bei Versuchen mit Mäusen gezeigt wurde, beträgt
die Halbwertzeit im Serum, d.h. die Zeit, bis die Hälfte der
Oligos aus dem Serum entfernt wird, bei 2’O-Methylen ca.
4-5 Wochen und bei Morpholinos nur etwa 2-3 Stunden.
Daher haben die 2’O-Methyle viel mehr Zeit als die Morpholinos,
um in die Muskelzellen aufgenommen zu werden,
wo sie dann ihre therapeutische Wirkung entfalten
können. Die Situation beim Menschen ist wahrscheinlich
ähnlich, da bei diesen zwei verschiedenen Typen von An-
tisense Oligos – und das werde ich später erklären – bei
ersten klinischen Studien an Patienten zur Erzielung von
ähnlichen Ergebnissen viel höhere Dosen und längere Behandlungszeiten
für Morpholinos nötig waren als bei den
2’O-Methylen.
Da eine Exon-Skipping-Behandlung wahrscheinlich
während des ganzen Lebens der Jungen notwendig sein
wird, sind Injektionen unter die Haut praktischer als intravenöse
Injektionen in den Blutkreislauf. Solche subkutane
Injektionen können zu Hause von Laien oder dem Patienten
selbst durchgeführt werden. Injektionen in die Vene
setzen häufige Besuche in einer Arztpraxis voraus. Aus
diesem Grunde werden die in Wasser löslichen 2’O-Methyle
während der klinischen Studien bereits subkutan angewendet.
Morpholinos können in hohen Dosen jedoch
nicht in Wasser aufgelöst werden und erfordern daher Injektionen
oder Infusionen in ein Blutgefäß.
Wie zuvor erklärt, haben die Muskelzellen von Duchenne-Jungen
kein oder nur sehr wenig Dystrophin unter
den Zellmembranen. Die vielen verschiedenen Proteine,
die mit Dystrophin in Verbindung stehen, fehlen ebenso.
Die Membranen haben also keinen „Stoßdämpfer“ mehr,
der normale Membranen vor der mechanischen Belastung
muskulärer Kontraktionen schützt. Mit der Zeit lösen sich
diese Membranen auf oder bekommen Risse und Löcher.
Durch sie gelangen Teile des Zellinhalts in den Blutkreislauf
wie zum Beispiel das Enzym Creatinkinase, CK. Die
Konzentration dieses Enzyms steigt dramatisch an und gibt
einen ersten Hinweis darauf, dass ein Junge Muskeldystrophie
haben kann.
Andererseits können Substanzen von außen die beschädigten
Zellmembranen einfacher und schneller passieren
als gesunde Muskelzellmembranen. Für Techniken wie das
Exon-Skipping, die darauf angewiesen sind, dass ihre aktiven
Substanzen so schnell und so wirksam wie möglich in
die Muskelzellen gelangen, ist diese defekten Zellmembranen
also ein Vorteil. Es wurde sogar schon gesagt, dass
die Duchenne-Muskeldystrophie die Zellmembranen öffnet,
um die Arzneimittel einzulassen, weil sie „gerne geheilt
werden möchte“.
Wie wird die therapeutische Wirkung eines möglichen
Duchenne Arzneimittels gemessen? In den klinischen
Studien mit dem Exon-Skipping muss bewiesen werden,
dass die Antisense-Oligos tatsächlich den Abbau der dystrophen
Muskeln bei Duchenne-Jungen über viele Jahre
hinweg verlangsamen. Eine Möglichkeit dies zu tun ist der
Sechs-Minuten-Gehtest, 6MWT – englische Abkürzung.
Dies ist eine sogenannte „outcome measure“, eine Ergebnis-Messung,
die von der US-amerikanischen Gesundheitsbehörde
FDA und der Europäischen Arzneimittelbehörde
EMA akzeptiert wird, um die Wirkung einer Behandlung
auf die Muskelfunktion zu messen. Duchenne-
Jungen, die noch unabhängig gehen können, sollen 6 Minuten
lang so schnell sie können gehen, nicht laufen, z.B.
hin und zurück im Flur eines Krankenhauses.
Die durchschnittliche Entfernung, die an verschiedenen
Tagen vor der ersten Injektion zurückgelegt wurde, ist der
durchschnittliche 6MWT-Ausgangswert. Ein 10 Jahre alter
Junge kann in 6 Minuten etwa 300 bis 400 Meter gehen.
Während der Studie – z.B. alle 6 Wochen – wird dieser
7

Test wiederholt. Normalerweise nimmt die zurückgelegte
Strecke ab, weil der Muskelabbau voranschreitet. Die Abnahme
in Metern zu verschiedenen Zeiten wird in einem
Diagramm festgehalten, das damit das Schlechterwerden
der Muskelfunktionen und das Fortschreiten der Krankheit
dokumentiert. Um die kombinierten Ergebnisse größerer
Patientengruppen zu zeigen, wird der durchschnittliche
6MWT-Ausgangswert für alle Patienten dieser Gruppe auf
null gesetzt. Dort starten die Kurven, die durch verschiedene
Dosen und die Ergebnisse der Placebo-Gruppe zustande
kommen.
Die Punkte in den Kurven stehen für die durchschnittlichen
Veränderungen aller Jungen einer Gruppe in Metern
zu verschiedenen Zeiten. Diese Veränderungen sind wegen
der geringeren Gehstrecken in 6 Minuten, meist negativ.
Der Zweck dieser graphischen Darstellung ist es zu
zeigen, ob die Behandlung in der klinischen Studie den
gewünschten Effekt hat oder nicht. Um dies jedoch zuverlässig
und objektiv und ohne „menschliche“ Einflüsse zu
bewerkstelligen, muss die Studie doppelblind durchgeführt
werden. Ein Drittel, manchmal auch die Hälfte der Patienten
in einer Studie erhalten nicht das aktive Arzneimittel,
sondern ein Placebo. Das ist Material wie z.B. Milchzucker,
das wie das Arzneimittel aussieht, aber keine medizi-
Die Linie in der Mitte wurde mit den Jungen in der Placebo-Gruppe
erhalten. Die obere Linie zeigt die Ergebnisse
der Jungen, die die niedrigere Dosis erhielten, 40 mg Ataluren/kg/Woche.
Die untere Linie zeigt die Ergebnisse der
Jungen, die die höhere Dosis erhielten, 80 mg Ataluren/kg/
Woche. Sie können sehen, dass die Linien der Placebo-
und der Hochdosis-Gruppe sehr ähnlich sind. Die Linie der
Niedrigdosis-Gruppe zeigt jedoch, dass die Distanz, die in
6 Minuten zurückgelegt wurde, nicht so schnell abnahm
wie bei den anderen beiden Gruppen. Es sieht also so aus,
als ob die niedrige Dosis die Krankheit in einem Jahr wirksam
verlangsamt hat im Vergleich zu den Jungen, die keine
Behandlung erfuhren. Eine hohe Dosis hat den Verlauf
der Krankheit nicht beeinflusst. Ich werde im zweiten Teil
meines Berichtes auf dieses unerwartete und noch nicht zu
erklärende Ergebnis und seine Folgen zurückkommen.
nische Wirkung hat.
Die Entscheidung, ob ein Patient das Arzneimittel oder
das Placebo erhält wird per Zufall gefällt, denn er wird zufällig
einer der Teilnehmergruppen in der Studie zugeteilt.
Weder die Eltern noch die Patienten noch das Klinik- oder
Laborpersonal wissen, zu welcher Gruppe der Patient gehört
bevor die Studie abgeschlossen und analysiert wird.
Solch eine graphische Darstellung, die auch Daten einer
Placebo-Gruppe enthält, gibt es noch nicht für die klinischen
Studien, mit denen das Exon-Skipping geprüft wird.
Wir werden noch auf das Ende der langen Phase III-Studie
zum Skippen des Exons 51 und die Auswertung aller Daten
warten müssen. Vor Ende 2013 werden wir sie wohl
nicht sehen.
Eine solche Darstellung mit Placebo-Daten existiert jedoch
für die Phase- IIb-Studie mit Ataluren, das auch als
PTC124 bekannt war. Diese Studie wurde im März 2010
unterbrochen, da das vorher bestimmte primäre Messergebnis
nicht erreicht wurde. Die Ergebnisse des 6-Minuten-Gehtests
bei 174 Patienten über 48 Wochen hinweg
wurden im April 2010 (3) veröffentlicht. Es gab 2 Patientengruppen
mit verschiedenen Dosen und eine Placebo-
Gruppe. Ich zeige Ihnen hier die Ergebnisse als Beispiel,
wie die Daten einer klinischen Studie präsentiert werden.
Sobald die Ergebnisse der Phase III der Exon-51-Studie
analysiert und in ähnlicher Weise veröffentlicht sind, werde
ich sie in die aktualisierte Fassung dieses Berichtes aufnehmen,
wenn ich diese Forschungsberichte weiterhin
schreiben kann.
Die Mutationen des Dystrophin-Gens. Nach der Veröffentlichung
von Annemieke Aartsma-Rus und ihren Kollegen
im Jahr 2006 (4) machen die Deletionen, das Fehlen
eines oder mehrerer Exons bis zu 72% aller Mutationen
aus. Verdoppelungen eines oder mehrerer Exons werden
in 7% aller Patienten gefunden, 20% der Patienten haben
Punktmutationen. Das sind kleine Deletionen oder Einschübe
oder Änderungen von einem oder einiger weniger
genetischer Buchstaben. Das verbleibende 1% setzt sich
aus mehreren seltenen Mutationen zusammen – wie z.B.
8

diejenigen die Spleißstellen stören oder große Teile der
Genstruktur neu ordnen.
Die Leseraster-Regel. Die Autoren kommen zu dem
Schluss, dass für 91% aller Patienten diese Regel gilt. Das
bedeutet, dass out-of-frame-Mutationen Duchenne verursachen,
hier bleibt das Raster nicht erhalten, und inframe-Mutationen
Becker Muskeldystrophie. Sie sagen
weiterhin, dass bei den meisten Patienten, deren Mutationen
Ausnahmen zu dieser Leseraster-Regel sind, die Struktur
ihrer mRNA dieser Regel jedoch folgt. In den meisten
Fällen wird die mRNA-Sequenz aber nicht bestimmt,
wenn eine Genanalyse durchgeführt wird. Bevor eine
Exon-Skipping-Behandlung begonnen wird, ist es anzuraten,
in einem Gewebe-Kultur-Versuch zu bestätigen, dass
diese Behandlung zu einer in-frame-mRNA führen würde.
Anwendbarkeit des Exon-Skippings. Obwohl Duchenne
Patienten mehr oder weniger ähnliche klinische Symptome
haben, gibt es viele verschiedene Ursachen für ihre Krankheit.
Das liegt daran, dass Mutationen auf dem sehr langen
Dystrophin-Gen an vielen verschiedenen Stellen auftreten
können. Exon-Skipping ist daher mutations-spezifisch. Es
wird eine personalisierte Therapie sein. Jeder Patient benötigt
eine ganz bestimmtes Antisense-Oligo, aber jedes
Antisense-Oligo kann oft für eine Gruppe von Patienten
mit verschiedenen Mutationen verwendet werden, bei denen
ein oder mehrere ganz bestimmte Exons geskippt werden
müssen.
Annemieke Aartsma-Rus und ihre Kollegen haben die
Anwendbarkeit des Skippens für Duchenne-Patienten mit
Deletionen, Punktmutationen und Verdoppelungen aufgelistet
(5), die in den Leiden Duchenne Muscular Dystrophy
Seiten verzeichnet sind. Ihre Liste enthält 130 Patientengruppen,
die das Skippen eines oder zweier ganz bestimmter
Exons benötigen in Prozent aller Duchenne-Patienten
mit allen möglichen verschiedenen Mutationen. Die Autoren
fanden heraus, dass 83% aller Duchenne-Patienten
Mutationen haben, die durch das Exon-Skipping möglicherweise
„repariert“ werden können.
Die verbleibenden 17% haben Mutationen, die zu
schwierig für eine „Reparatur“ mit der Exon-Skipping-
Methode sind. Diese Patienten würden aber von pharmakologischen
und anderen Therapien profitieren, die nicht
mutationsspezifisch sind und daher allen Patienten zugutekommen
würden. Im zweiten Teil dieses Berichtes werde
ich die Ergebnisse der wichtigsten dieser Forschungsprojekte
zusammenfassen.
Die ersten 11 der 130 Patientengruppen sind in der folgenden
kurzen Liste aufgeführt. Unter ihnen sind auch diejenigen,
für die in den nächsten Jahren Skipping-Medikamente
von den Firmen GSK/Prosensa und Sarepta entwickelt
werden.
Wie Sie sehen können, benötigen 13% aller Patienten
das Skippen ihres Exons 51. Das 51-Antisense-Oligo ist
damit ein mögliches Skipping-Medikament für die größte
Gruppe aller Duchenne-Patienten. Daher wurde für die ersten
abgeschlossenen und noch laufenden klinischen Studien
des Exon-Skippings dieses Exon ausgesucht, da es der
größten Patientengruppe möglichst bald helfen würde.
Rang zu skippendes Exon % aller Patienten
1 51 51 51 13.0
2 45 45 45 8.1
3 53 53 53 7.7
4 44 44 6.2
5 46 4.3
6 52 52 4.1
7 50 50 4.0
8 43 3.8
9 6+7 3.0
10 8 2.3
11 55 55 2.0
Rot: Prioritätsliste von Prosensa/GSK, 41.1%
Blau: Prioritätsliste von Sarepta, 32.8%
Wird das Exon-Skipping eine Therapie für meinen
Sohn sein? Viele Duchenne-Familien aus der ganzen Welt
stellen mir diese Frage. Ich erkläre Ihnen daher hier, wie
Sie selbst das mögliche Skipping-Medikament für Ihren
Sohn finden können.
Da das Exon-Skipping jedoch eine mutations-spezifisches
Verfahren ist, besteht der erste Schritt darin, die genaue
Mutation im Dystrophin-Gen Ihres kranken Jungen
zu kennen. Die Mutation kann am besten mit der MLPA-
Methode (multiplex ligation-dependent probe amplification)
in einem modernen genetischen Labor bestimmt werden,
die alle 79 Exons bei Duchenne-Jungen, ihren Müttern
und anderen weiblichen Verwandten analysiert. Diese
und andere diagnostische Verfahren werden im zweiten
Teil dieses Berichtes ausführlich beschrieben.
Wenn die genaue Mutation bekannt ist – hauptsächlich
Deletionen, Verdoppelungen oder Punktmutationen – können
Sie selbst die Sequenz der 11.040 genetischen Buchstaben
der kombinierten 79 Exons der Dystrophin-mRNA
anschauen, die die Anweisungen für die Zusammensetzung
der 3.685 Aminosäuren des normalen Dystrophin-
Proteins enthält. Sie können sich die 15 Seiten mit diesen
elftausend Buchstaben dieser Sequenz von den Leiden
Muscular Dystrophy Pages im Internet herunterladen:
www.dmd.nl/seqs/murefDMD.html. Aus dieser Sequenz
können Sie bestimmen, ob die Mutation Ihres Sohnes das
Leseraster verschiebt oder beibehält. So lässt sich feststellen,
ob diese genetische Information auf eine Duchenne-
oder Becker-Muskeldystrophie bei Ihrem Kind hinweist.
Wenn Sie die Sequenzen an den Grenzregionen der
Exons betrachten, können Sie auch bestimmen, welches
Exon oder welche Exons geskippt werden müssen, um das
Leseraster aus einer „out-of-frame“-Situation zurück in
eine „in-frame“-Situation zu bringen.
Es gibt noch einen einfacheren Weg, das Exon oder die
Exons zu finden, die geskippt werden müssen, wenn Sie
die Mutation des Dystrophin-Gens kennen. Die Anordnung
der 79 Exons in der mRNA können Sie in dem Bild
auf der nächsten Seite sehen, das ich von Annemieke
Aartsma-Rus erhalten habe:
Um bei einer Deletion herauszufinden welches Exon
geskippt werden muss, streichen Sie das fehlende oder die
fehlenden Exons und entscheiden, ob das Exon vor oder
nach der Deletion oder eventuell beide geskippt werden
9

müssen, so dass das Ende des vorangehenden Exons mit
dem Anfang des folgenden Exons zusammenpaßt, wenn
das deletierte Exon und das oder die geskippten Exons fehlen.
Wenn z.B. die Deletion aus den 8 Exons 45-52 besteht,
kann man sehen, dass die beiden Exons 44 und 53, die vor
und nach der Deletion kommen, nicht zusammenpassen.
Wenn jedoch Exon 53 übersprungen wird, würde das Ende
von Exon 44 zum Anfang von Exon 54 passen. Sie werden
auch sehen, dass die Deletion der Exons 44-50 repariert
werden könnte, indem man die beiden benachbarten Exons
43 und 51 skippt, so dass die Exons 42 und 52 zusammenpassen.
Sie werden auch erkennen, dass die Deletion von
Exon 44 nicht zusammenpassende Exon-Enden verursacht,
also das Leseraster verschiebt und so zu Duchenne führt.
Eine Deletion der Exons 48-51 hingegen produziert passende
Exon-Enden, die das Leseraster nicht verschieben,
was zu einer Becker-Dystrophie führen könnte. Diese
Vorgehensweise funktioniert auch für Verdoppelungen
und Punktmutationen.
Dieses Bild zeigt die relative Größe der Exons, die Linie
am linken unteren Rand zeigt die Länge von 100
Nukleotiden, genetischen Buchstaben. Hellblaue Exons
sind „in-frame“-Exons. Wenn sie fehlen oder geskippt
werden müssen, wenn sie eine Punktmutation enthalten,
würden sie das Leseraster nicht verschieben. Dunkelblaue
Exons sind „out-of-frame“-Exons. Ihre Deletion kann repariert
werden, wenn sie und ein benachbartes Exon geskippt
werden, so dass die Enden der verbleibenden Exons
wieder zueinanderpassen.
Die dritte und einfachste Möglichkeit besteht darin, auf
die Exon-Skipping-Listen der Doktorarbeit von Annemieke
Aartsma-Rus zu schauen. Hier können Sie direkt ablesen,
welches Exon oder welche Exons geskippt werden
müssen, wenn Sie die Einzelheiten der Mutation Ihres
Sohnes kennen. Diese Listen können Sie im Internet wie
folgt finden:
Deletionen. www.humgen.nl@lab-aartsmarus/Table%20deletions.pdf
Verdoppelungen: www.humgen.nl/lab-aartsmarus/Table%20duplications.pdf
Punktmutationen: www.humgen.nl/lab-aartsmarus/Table%20point%20mutations.pdf
Als Beispiel habe ich hier 10 Einträge aus der Liste der
Deletionen aufgeführt:
Deletierte Exons zu skippende Exon(s)
40 – 43 44
43 – 45 46
43 – 50 51
43 – 52 53
44 43 oder 45
44 – 50 43+51
46 – 47 45
46 – 52 45+53 oder 53+54
48 – 50 51
51 – 53 50
Wenn Sie die genaue Mutation Ihres Duchenne-Jungen in
seinem Dystrophin-Gen kennen und wenn Sie das Exon
oder die Exons gefunden haben, die in seiner mRNA geskippt
werden müssen, dann haben Sie meine Erklärungen
hier verstanden. Sie sollten wissen, dass dies keine Garantie
dafür ist, dass seine schweren Duchenne-Symptome in
die milderen Symptome der Becker-Dystrophie umgewandelt
werden, wenn er seine personalisierte Exon-Skipping-
Arznei bekommt, die auf diesem Weg bestimmt wurde.
Alles was gesagt werden kann, ist, dass das spezielle
Skippen, das Sie korrekt identifiziert haben, das Leseraster
der genetischen Information der mRNA von einer „out-offrame“-Situation
zurück in eine „in-frame“-Situation verschiebt.
Es besagt nicht, dass diese „in-frame“-Situation in
jedem Fall eine Becker-Dystrophin produzieren wird, da
die Leseraster-Regel Ausnahmen hat.
Die Gründe für diese Ausnahmen sind nicht für alle
Fälle bekannt. Die Grenzen der Deletionen im Dystrophin-
Gen stimmen in den meisten Fällen beispielsweise nicht
mit den Grenzen der Exons überein, sondern liegen etwas
innerhalb der oft sehr langen Introns zwischen den Exons.
Diese Grenzen werden normalerweise nicht durch die üblichen
genetischen Testmethoden gefunden und können
unterschiedlich sein bei Patienten, die die gleichen Deletionen
haben. Da die Introns Sequenzen haben, die wichtig
für die Regulierung der Gene sind, kann ihr Vorhanden-
oder Nicht-Vorhandensein verschiedene Krankheitssymptome
hervorrufen.
Andererseits hat das Dystrophin-Protein eine Struktur
mit Regionen, die unterschiedlich wichtig sind. Einige Deletionen
können zusammen mit den geskippten Exons in
einigen Fällen eine veränderte Proteinstruktur zur Folge
10

haben, die es nicht erlaubt, dass das verkürzte Dystrophin
mehr oder weniger normal funktioniert.
Obwohl also die Exon-Skipping-Therapie in vielen Fällen
ein Protein produziert, das die Duchenne-Symptome
verringern könnte, kann es Überraschungen geben, die
während der klinischen Studien und den eigentlichen Behandlungen
zutage treten werden.
Mutationen, die nicht mit dem Exon-Skipping repariert
werden können. Wie ich zuvor erwähnte, haben
17% aller Duchenne-Jungen Mutationen, die nicht mit
Exon-Skipping behandelt werden können. Dies ist zum
Beispiel der Fall, wenn das erste oder letzte Exon fehlt
oder wenn die Mutationen in der Region der Exons 64-70
auftreten, die für das wichtige Cystein-reiche Ende des
Proteins notwendig ist. Ebenfalls nicht behandelbar sind
lange Deletionen oder wenn sie die Actin-bindenden Teile
des Proteins betreffen. Nicht reparabel sind auch große
Umstrukturierungen wie das Verdrehen der Reihenfolge
oder das Platzieren von Sequenzen an andere Stellen des
Gens, was die genetische Information unkontrollierbar
durcheinanderbringt.
Wenn die genetischen Testergebnisse Ihres Sohnes Ihnen
nicht erlaubt, nach meiner Anleitung hier das zu skippende
Exon, oder die Exons, zu finden, oder wenn Sie andere
Fragen haben, was für ihren Sohn getan werden könnte,
bitte schreiben Sie eine persönliche E-Mail an mich:
gscheuerbrandt@t-online.de, und ich werde sobald wie
möglich antworten.
Wie werden Exon-Skipping-Medikamente entwickelt?
Nachdem Sie meine Erklärungen gelesen haben, wissen
Sie, welche Art von Exon-Skipping möglicherweise eine
Therapie für Ihren Sohn sein könnte. Jetzt erkläre ich Ihnen,
wie diese möglichen Medikamente entwickelt werden.
Das geschieht in drei Teilen: Im ersten wird beschrieben,
welche klinischen Studien gemacht werden müssen.
Dann beschreibe ich, welche Skippings zuerst entwickelt
werden und schließlich beschreibe ich, welche klinischen
Studien schon abgeschlossen sind, welche gerade laufen
und welche für die nähere Zukunft geplant sind.
Welche Art von klinischen Studien müssen durchgeführt
werden? Die US-amerikanische Gesundheitsbehörde
FDA in Atlanta, die Europäische Arzneimittelbehörde
EMA in London und andere Regulierungsbehörden verlangen,
dass die „normale“ Entwicklung eines klassischen
Medikamentes mit den folgenden Phasen durchlaufen
werden muss:
Vorklinische Phase. Laborstudien und Tierversuche, um
die Sicherheit, die biologische Aktivität und die beste Verabreichungsmethode
des neuen Arzneimittels zu prüfen.
Klinische Phase I. Studien an 20 – 100 gesunden Freiwilligen,
um die Sicherheit bei Menschen zu prüfen.
Klinische Phase II. Studien an 100 – 500 Patienten, um
optimale Dosierungen, die Sicherheit und die Wirksamkeit
zu prüfen.
Klinische Phase III. Studie an 1.000 – 5.000 Patienten,
um die Sicherheit und Wirksamkeit des Arzneimittels zu
bestätigen, wenn es über einen längeren Zeitraum eingenommen
wird.
Die Kosten aller drei klinischer Forschungsstudien
können sich auf bis zu 500 Millionen US-Dollar für ein
Arzneimittel belaufen. Es kann bis zu 15 Jahre von der ersten
Idee für ein neues Medikament bis zu seiner Marktzulassung
dauern.
Diese Vorschriften wurden entstanden zu einer Zeit, als
patientenspezifische Forschungsansätze wie das Exon-
Skipping noch nicht existierten. Um ein personalisiertes
„genetisches“ Duchenne-Medikament durch diese Phasen
zu bekommen, müssen verschiedene Herausforderungen
gemeistert und überwunden werden.
Die Studien mit Antisense-Oligos an gesunden Freiwilligen
in Phase I könnte zum Beispiel das Leseraster in einer
normalen Dystrophin mRNA verschieben und so,
wenn sie wirksam genug sind, zu Duchenne-Dystrophie
bei diesen gesunden Freiwilligen führen. Dies wäre eine
sehr ernstzunehmende Nebenwirkung, die nichts mit normalen
widrigen Umständen zu tun hat.
Eine andere große Sorge besteht in unerwünschten
Wirkungen, sogenannten „off-target“-Effekten. Es könnten
Exons in den genetischen Informationen anderer Gene als
dem Dystrophin-Gen geskippt werden und somit schwerwiegende
und möglicherweise unbekannte Krankheiten
verursachen.
Ein weiteres Problem, das nicht in der normalen Arzneimittelentwicklung
auftritt, könnte spezifisch für die
Duchenne- Dystrophie sein: Da Dystrophin fehlt, haben
die Zellmembranen der Duchenne-Muskeln Risse und Löcher,
durch die die Exon-Skipping Arzneien in das Zellplasma
der Zellen gelangen und auch in die Kerne, wo sie
für ihre therapeutischen Wirkungen gebraucht werden. Es
könnte also nur bei Duchenne-Patienten zu negativen
Auswirkungen kommen, die bei Personen ohne diese
Krankheit nicht auftreten. Daher können klinische Studien
der Phase I mit gesunden Freiwilligen mit möglichen
Exon-Skipping Arzneimitteln nicht durchgeführt werden.
Teilnahme an klinischen Studien. Klinische Studien an
Patienten sind unverzichtbare Bestandteile in der Entwicklung
einer Exon-Skipping-Therapie. Es ist verständlich,
dass Familien versuchen, dass ihre kranken Kinder für diese
Studien akzeptiert werden. Sie hoffen, dass ihr Kind
dann eine Chance hat, früher eine Therapie zu bekommen
anstatt noch mehrere Jahre auf die endgültige Zulassung
dieser personalisierten Medikamente warten zu müssen.
Klinische Studien sind jedoch nur Experimente an
Menschen, die auch schiefgehen können. Familien sollten
also den Informationen der Klinikärzte, die diese Studien
durchführen, genau beachten, bevor sie ihre Einwilligung
nach Aufklärung geben. Eine Teilnahme hat auch Nachteile,
die von Kate Bushby von TREAT-NMD in einem Interview
erklärt wurden, das ich mit ihr im März 2009 aufgezeichnet
habe:
„Ich glaube nicht, dass es praktisch für die Kinder ist,
von weit her zu kommen, um an klinischen Studien teilzunehmen,
da sie jede Woche für Injektionen in den klini-
11

schen Zentren sein müssen und eine Menge Blutproben
genommen werden. Es ist also besser, wenn sie in der Nähe
dieser Zentren wohnen.
Auch wenn sie in der Nähe wohnen, müssen die Familien
ihr gesamtes Leben umstellen. Sie sollten sich im Klaren
sein, dass die Studien nur Studien sind. In den späteren
Wirksamkeitsstudien könnte ihr Kind in der Placebo-Gruppe
sein. Das kann ihm während der Studie nicht helfen und
es kann unvorhergesehene Nebenwirkungen geben. Studien
bedeuten wirklich harte Arbeit. Ich würde sogar sagen,
dass die Kinder in den Studien fast einen Nachteil haben.
Sie müssen diese ganzen Unannehmlichkeiten über sich
ergehen lassen, um etwas zu bekommen, von dem später
jeder profitieren wird – vorausgesetzt, dass es funktioniert.
Wir sind den Familien und Jungen wirklich sehr dankbar,
die all die Zeit und Anstrengung investieren, um an diesen
Studien teilzunehmen, die hoffentlich die Sache für jeden
ein Stück voranbringt.“
Es gibt jedoch einen wichtigen, potenziellen Vorteil für
die Studien-Teilnehmer: Wenn die Studien der Phase II
oder Phase III zeigen, dass sie bis zu einem gewissen Grad
wirksam sind, dann kann der Studie eine offene Verlängerungs-Phase
über mehrere Jahre folgen, in der alle Jungen
– auch die, die während der Studie Placebos erhalten haben
– die wirksamste Dosis, die in der Studie verwendet
wurde, erhalten und zwar bis die Arznei in ihrem Land zugelassen
wird.
Muskelreparatur, eine allgemeine Einführung. Der
Text dieses Abschnittes wurde von Annemieke Aartsma-
Rus nach einer Tagung über Muskelstammzellen geschrieben,
die im Juli 2012 in New Orleans in den USA
stattfand.
„Muskeldystrophien wie zum Beispiel die Duchenne-
Muskeldystrophie zeichnen sich durch eine kontinuierliche
Schädigung von Muskelgewebe aus, die schließlich zum
Verlust von Muskelgewebe und Muskelfunktion führt.
Wie die meisten Gewebe sind Muskeln fähig sich zu regenerieren,
wenn sie beschädigt wurden. Im Gegensatz zu
den meisten anderen Gewebsarten, bestehen Muskeln jedoch
nicht aus Einzelzellen, sondern aus Fasern, die aus
Einzelzellen zusammengeschmolzen wurden. Danach
können sich die Muskelfasern mehr teilen oder regenerieren.
Auf den Muskelfasern liegen spezialisierte Einzelzellen,
sogenannte Satellitenzellen, die sich teilen können, um
Muskelzellen zu reparieren. Sobald Muskelfasern beschädigt
sind, werden Proteine als Schadenssignale ausgesendet,
die die Satellitenzellen aktivieren. Diese fangen sich
dann an zu teilen, wandern zu den beschädigten Stellen
und reparieren sie, indem sie mit den Muskelfasern zu-
Die Entwicklung von personalisierten, genetischen Exon-
Skipping-Medikamenten muss durch Firmen erfolgen, die
über genügende finanzielle Mittel verfügen, um technische
und ethische Probleme zu überwinden, die mit dieser neuen
Art von Arzneimitteln einhergehen, die aber nicht ein
Gen des Menschen verändern, sondern nur seine genetische
Information reparieren.
Klinische Studien zum Exon-Skipping
sammenschmelzen oder – wenn die Beschädigung sehr
groß ist – sie schmelzen untereinander zusammen um eine
neue Faser zu bilden. Um sicherzustellen, dass der Muskel
nach der nächsten Beschädigung auch repariert werden
kann, wird eine dieser Zellen eine inaktive Satellitenzelle,
die sich wieder auf der neuen oder reparierten Muskelfaser
ansiedelt.
Jeder erleidet gelegentlich Schäden an seinen Muskeln.
Das Regenerationssystem stellt sicher, dass die Beschädigung
repariert wird und die Muskeln dicker und stärker
wachsen, damit einer zukünftigen Beschädigung vorgebeugt
wird. Das Problem bei Duchenne-Muskeldystrophie
besteht darin, dass die Muskelfasern sehr viel empfindlicher
gegenüber Beschädigungen sind, da ihnen wichtige
Proteine fehlen, die die Muskelfasern während der Kontraktion
stabilisieren. Diese Proteine sind z.B. Dystrophin
und die mit ihm verbundenen anderen Proteine.
Muskelfasern von Duchenne-Patienten werden leichter
und öfter beschädigt als bei gesunden Personen. Dies verursacht
chronischen Stress im Reparatursystem und führt
zu Entzündungen. Normalerweise spielen Entzündungszellen
bei Muskelbeschädigungen eine wichtige Rolle. Sie
lösen nämlich das beschädigte Gewebe auf, um neuen
Muskelfasern Platz zu machen. Sie sind also eine Art Abfallbeseitigungssystem.
Aufgrund der chronischen Natur
der Krankheit, liegt eine ständige Entzündung vor, die
schließlich zur Fibrose führt.
Dabei wird statt neuem Muskelgewebe ein Bindegewebe
geformt, da die Entzündungszellen Signalpeptide aussondern,
die dazu führen, dass Satellitenzellen Fibroblasten
werden anstatt muskelaufbauende Zellen.
Fibroblasten produzieren Signalpeptide, kurze Aminosäureketten,
die die Fibrose verstärken bzw. aufrechterhalten.
Es kommt zu einem Teufelskreis, indem mehr und
mehr Fibrose produziert wird und Muskelreparaturen immer
weniger stattfinden. Da Muskelgewebe weiterhin beschädigt
wird, werden schließlich die meisten Muskelfasern
durch Fibrose-Gewebe ersetzt, die Muskelfunktion
geht verloren.“
Nach dieser Erklärung versteht man, wie wichtig das
ist, was die Exon-Skipping-Therapie mit sich bringen
wird: das Wiedererlangen des stabilisierenden Proteins
Dystrophin und der mit ihm im Dystrophin-Komplex verbundenen
Proteine in den überlebenden Muskelfasern.
Dies verlangsamt oder stoppt den Fibroseprozess. Das bereits
bestehende Bindegewebe bleibt allerdings erhalten.
Exon-Skipping sollte daher so früh wie möglich im Leben
eines Duchenne Jungen gestartet werden, möglichst bevor
der Fibrose-Prozesse einsetzt und die meisten Muskelfasern
noch vorhanden sind.
Ich nenne hier drei Firmen, die das Exon-Skipping zu
dem am weitest entwickelten Verfahren zur Therapie von
Duchenne-Muskeldystrophie gebracht haben. Mit weltweit
etwa 400.000 Patienten, gehört Duchenne-Muskeldystrophie
zusammen mit Mukoviszidose zu den häufigsten Erbkrankheiten
des Kindesalters.
12

Ich beschreibe Ihnen diese Firmen hier nicht mit meinen
eigenen Worten, sondern gebe Ihnen ihre Namen und
Adressen, so dass Sie sich auf ihren Internet-Seiten über
ihre Duchenne-Forschungsarbeiten informieren können:
Prosensa Therapeutics BV in Leiden, Niederlande,
www.prosensa.com
GlaxoSmithKline PLC (GSK) mit Zentrale in London,
www.gsk.com. Geben Sie „Duchenne“ in das Suchfeld
oben rechts ein und klicken Sie auf „go“.
Sarepta Therapeutics (ehemals AVI Biopharma) in
Cambridge, MA, USA, www.sareptatherapeutics.com
Die vier ersten klinischen Studien über das Skippen von Exon 51 bei Duchenne-Jungen.
Es erforderte viele Jahre von vorklinischen Arbeiten an
Antisense-Oligos mit Muskelkulturen im Labor, mit dystrophen
mdx-Mäusen, die ein vorzeitiges Stopp-Codon in
ihrem Exon 23 haben, und mit Mäusen, die das menschliche
Dystrophin-Gen haben, bevor die vier klinischen Studien
zum Exon- 51-Skippen mit Duchenne-Jungen in den
Jahren 2006 bis 2009 durchgeführt werden konnten.
Zwei von ihnen waren lokale Studien, bei denen nur
unwichtige einzelne Muskeln behandelt wurden. Von ihnen
konnten die teilnehmenden Jungen daher keine Änderung
ihrer Symptome erwarten. Die beiden anderen Studien
waren systemische Studien, bei denen die Exon- 51-
Antisense-Oligos in die Blutbahn gespritzt wurden, um
alle Muskeln zu erreichen.
Diese vier Studien sollten vor allem die Frage beantworten,
ob diese Antisense-Behandlung sicher ist, ob es
Beweise für neu gebildetes Dystrophin gibt und ob eine
Verbesserung der Muskelfunktion zu erwarten ist. Wenn
das neue Medikament Wirkung zeigt, muss es später den
Jungen schließlich jahrelang während ihres hoffentlich
verlängerten Lebens gegeben werden. Sie sollte daher keine
ernsten Nebenwirkungen haben und sie sollte vor allen
Dingen nur die genetischen Informationen des Dystrophin-
Gens reparieren und nicht die anderen mehr als 20.000
menschlichen Gene und ihre Informationen beeinflussen.
Lokale offene-Phase-II-Studie in den Niederlanden
zum Skippen von Exon 51. Die erste an Menschen vorgenommene
Studie mit der Exon-Skipping-Technik wurde
von Judith van Deutekom, Jan Verschuuren und anderen
Mitarbeitern der Firma Prosensa Therapeutics und des
medizinischen Universitätszentrums in Leiden zwischen
Januar 2006 und März 2007 vorgenommen. Sie war lediglich
darauf ausgelegt, einen Grundsatzbeweis zu erbringen.
Es war eine lokale Studie an einer kleinen Stelle des
Tibialis-anterior-Muskels, des vorderen Schienbeinmuskels,
der mit PRO051, dem 2’O-Methyl-Antisense-Oligo
gegen Exon 51 behandelt wurde.
Die vier nicht mehr gehfähigen Jungen in dieser offenen
Studie ohne Placebos waren zwischen 10 und 13 Jahren
alt. Sie hatten Deletionen der Exons, 50, 52, 48-50 und
49-50. Jeder Junge erhielt eine einmalige Dosis von 0,8
mg PRO051, die direkt in den Schienbeinmuskel gespritzt
wurde. Nach 4 Wochen wurde in einer Biopsie Muskelgewebe
von der Injektionsstelle entnommen und auf die geskippte
mRNA und neues Dystrophin-Protein hin untersucht.
Bis zu 94% der Muskelfasern in den Biopsie-Proben
zeigten neues Dystrophin an seiner normalen Position unter
den Muskelzellmembranen. Verglichen mit gesundem
Muskelgewebe lag das Dystrophin in Konzentrationen von
33%, 35%, 17% und 25% vor. Die mRNAs wurden isoliert
und zeigten Sequenzen, bei denen die genetischen Buchstaben
der deletierten und des geskippten Exons fehlten.
Dies bewies, dass das Exon-Skipping tatsächlich das gewünschte
Exon nicht nur in Mäusen, sondern auch im
menschlichen Muskel überspringt, skippt.
Diese erste Anwendung des Exon-Skipping Verfahrens
an Duchenne-Jungen wurde am 27. Dezember 2007 in der
Zeitschrift „New England Journal of Medicine“ veröffentlicht
(6).
Systemische Studien der Phase IIa in Schweden und
Belgien zum Skippen von Exons 51 bei Duchenne-
Jungen. Im nächsten Schritt dieser Entwicklung mussten
die Wissenschaftler zeigen, dass das Antisense-Oligo
PRO051 auch systemisch durch eine Injektion in den Blutkreislauf
angewendet werden kann, so dass es alle Muskelzellen
erreichen und therapieren kann.
Zwischen Juli 2008 und Januar 2009 führte Prosensa
seine erste systemische Studie mit 12 Duchenne-Jungen
durch, die 5-13 Jahre alt waren. Dabei wurde das Antisense
Oligo PRO051 unter die Haut, subkutan, gespritzt.
Die Injektionen wurden von den Teams um Nathalie M.
Goemans an der kinderneurologischen Abteilung der Universität
in Löwen in Belgien und um Mar Tulinius im
Königin-Silvia-Kinderkrankenhaus in Göteborg in Schweden
vorgenommen.
In dieser offenen Dosis-Eskalationsstudie haben vier
Gruppen mit jeweils drei Jungen das 51-Antisense-Oligo
einmal pro Woche über 5 Wochen hinweg erhalten. Die
Dosen betrugen 0,5, 2, 4 und 6 mg/kg. In der ersten Gruppe
wurde Muskelgewebe in Biopsien vor und nach der Behandlung
entnommen. In der höher dosierten Gruppe wurden
die Muskel-Proben zwei und sieben Wochen nach der
Behandlung entnommen. Damit wollte man erfahren, ob
das neu geformte Dystrophin stabil ist.
Die Struktur der mRNA und des neuen Dystrophin-
Proteins aus allen Biopsie-Proben wurden wie bei der lokalen
Studie untersucht und zeigten, dass das Exon-Skipping-Antisense-Oligo
die vorgesehenen Exons geskippt
hatte und dass das neue Dystrophin wie erwartet ein leicht
geringeres Molekulargewicht hatte als normales Dystrophin.
Zwei Wochen nach Ende der Studie, enthielten 56-
100% der Muskelfasern immer noch neues Dystrophin,
wobei die höchsten Prozentsätze bei denjenigen Jungen
gefunden wurden, die die höchste Dosis bekommen hatten.
Wegen der kurzen Behandlungszeit, war, wie erwartet,
keine Verbesserung der Muskelfunktionen zu verzeichnen.
Diese Studie zeigte jedoch, dass zum ersten Mal die
subkutane Anwendung von PRO051 zu einem Skippen
13

Exons 51 führte und die Produktion von neuem Dystrophin
begonnen hatte. Das Ausmaß der Produktion hing mit der
Dosierung zusammen, die höchste Dosis brachte die größte
Menge an Dystrophin.
Diese erste systemische Studie mit der Exon-Skipping-
Technik bei Duchenne sollte die wichtigste Frage beantworten:
Ist diese genetische Behandlung sicher? Die Gesamtkörper-Therapie
wurde gut vertragen, es gab keine
negative Immunreaktion auf das neue Protein und es wurden
keine anderen bedeutsamen klinischen Probleme bei
den 12 Duchenne-Patienten der Studie festgestellt.
Alle Einzelheiten dieser Studie wurden in der Zeitschrift
„New England Journal of Medicine“ im März 2011
veröffentlicht (7).
Dieser Studie folgte und folgt immer noch eine offene
Verlängerungsstudie, die auf Seite 16 beschrieben wird.
Zusammenarbeit Prosensa – GSK. Das positive Resultat
dieser zwei klinischen Studien der Phase II hat die Firmen
Prosensa und GlaxoSmithKline, GSK, noch vor Bekanntgabe
aller Einzelheiten davon überzeugt, dass eine weltweite
exklusive Zusammenarbeit für die Entwicklung und
Vermarktung ihrer Exon-Skipping-Technik unter Verwendung
der 2’O-Methyl-Antisense-Oligoribonuleotide sinnvoll
ist. In dieser Übereinkunft erhält GSK die Exklusiv-
Lizenz für die Entwicklung und Vermarktung von Prosensas
Antisense-Oligo für das Skippen des Exons 51 auf dem
Dystrophin-Gen. Beide Firmen werden weiter zusammenarbeiten,
um dieses Oligo fortzuentwickeln.
Als erster gemeinsamer Schritt wurde 2010 mit der entscheidenden,
internationalen klinischen Studie der Phase
III begonnen, an der mindestens 180 Duchenne-Jungen
teilnehmen sollten, die ein Skippen des Exons 51 benötigen.
GSK wird alle Kosten dieser großen Studie übernehmen.
Außerdem erhält GSK die Option, drei weitere Antisense-Oligos
zu lizensieren und zwar für das Skippen des
Exons 44, und entweder der Exons 45 und 53 oder 52 und
55. Das Skippen von Exon 44 wird schon in einer Phase-
II- Studie getestet. Ergebnisse werden hier im Laufe des
Jahres 2013 erwartet. Klinische Studien zum Skippen der
Exons 45 und 53 werden im Jahr 2013 beginnen. GSKs
Optionsrechte können bei einem erfolgreichen Abschluss
der Exon-44-Studie in Anspruch genommen werden.
Erste klinische Studien mit Morpholino-Antisense Oligos für das Skippen von Exon 51.
Bevor ich die Studien, die von Prosensa und GSK durchgeführt
werden, weiter beschreibe, fasse ich zwei Exon-
Skipping-Studien und eine Erweiterungsstudie zusammen,
die ähnlich waren wie die von Prosensa vorgenommenen
Studien, die jedoch eine andere Art von Antisense-Oligos,
die Morpholinos, verwendeten. Diese wurden von der Firma
AVI BioPharma in Bothell nahe Seattle in den USA
entwickelt. Die Firma heißt heute Sarepta Therapeutics
und hat ihre Zentrale in Cambridge in der Nähe von Boston
im US-Bundesstaat Massachusetts.
Diese beiden Studien wurden im Vereinigten Königreich
und nicht in den USA durchgeführt, da eine „ Starterlaubnis“
von der Europäischen Arzneimittelbehörde
EMA einfacher und schneller zu bekommen war, als von
der US-amerikanischen Gesundheitsbehörde FDA.
Erste lokale klinische Studie mit einem Morpholino-51
Antisense Oligo im Vereinigten Königreich. Diese
Exon-Skipping-Studie der Phase IIa wurde im Vereinigten
Königreich zwischen Herbst 2007 und Ende 2008 unter
Leitung von Kate Bushby von TREAT-NMD in Newcastle
und Francesco Muntoni vom Imperial College in London
durchgeführt.
Während der vorklinischen Versuche zeigte Dominic
Wells in London, dass sich das von Steve Wilton in Perth
in Australien entwickelte Morpholino-Antisense-Oligo
AVI-4658 als genügend stabil für eine langfristige klinische
Behandlung eignet.
Die Studie war lokal und diente dazu, die Sicherheit
und die biochemische Wirksamkeit dieses Morpholino-
Exon-51-Oligos zu untersuchen. Es wurde mit einer einzigen
Injektion in den kleinen, unwichtigen Muskel, extensor
digitorum brevis, EDB-Muskel, an der Außenseite des
Fußes gespritzt. Sieben 11-16jährige Duchenne-Jungen,
die das Skippen des Exons 51 benötigen, nahmen an der
Studie teil. Einige von ihnen konnten nicht mehr laufen.
Jeder der 7 Patienten hatte weniger als 5% revertierter
Fasern in seinen Muskeln. Das wurde im Muskelgewebe
nach einer Biopsie vor der Behandlung festgestellt. Geringe
Mengen dieser Dystrophin-haltigen Muskelfasern gibt
es bei vielen Duchenne-Jungen. Sie entstehen durch spontanes
Exon-Skipping.
Diese Studie war eine einfachblinde Studie. Die Forscher,
die die Muskelproben untersuchten, wussten nicht,
ob das Gewebe vom behandelten Muskel des Jungen
stammte oder vom Vergleichsmuskel seines anderen Fußes.
Zwei Jungen erhielten 0,09 mg des Morpholinos, die
anderen fünf Jungen erhielten die 10fache Dosis, 0,90 mg.
Drei bis vier Wochen nach den Injektionen wurden fast die
gesamten behandelten EDB-Muskeln bei Biopsien entnommen.
Die höhere Dosis führte zu einer neuen Dystrophin-
Produktion in allen behandelten Muskeln. Die Menge des
Dystrophins schwankte zwischen 22 und 32% verglichen
mit der Intensität in Muskeln bei gesunden Menschen. Sie
war 11-21% größer als die Menge des revertierten Dystrophins
im Kontrollmuskel des anderen Fußes. Zusätzliche
Tests ergaben, dass das neue Dystrophin tatsächlich ein
reduziertes Molekulargewicht hatte, wie es vom verkürzten
Becker-Dystrophin erwartet wird.
In den Patienten, die die sehr geringe Dosis des Oligos
erhalten hatten, wurde mRNA ohne die geskippten Exons
gefunden. Es konnte jedoch keine Zunahme des Dystrophin-Proteins
nachgewiesen werden, da der Protein-Test
nicht empfindlich genug war, um sehr kleine Unterschiede
in der Proteinmenge feststellen zu können.
Diese in-vivo-Studie zeigte, dass das Antisense-Oligo
AVI-4658 das gewünschte Skippen des Exons 51 verursachte
und auch die Produktion des neuen Dystrophins.
Dieses war an seinen normalen Platz an der Unterseite der
Muskelzellmembran gewandert und hatte sich dort korrekt
14

mit den Proteinen des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes
verbunden.
Wie bei allen lokalen Behandlungen war kein therapeutischer
Nutzen für die teilnehmenden Jungen erwartet worden.
Beide Lokalstudien, die niederländische und die englische
Studie, sollten vor allem das Prinzip beweisen, dass
das Skippen von Exons beim Menschen funktioniert.
Beide Studien haben gezeigt, dass das tatsächlich der
Fall ist. Es gab einige technische Unterschiede zwischen
den beiden Studien. Die Ergebnisse können daher nicht in
allen Einzelheiten direkt verglichen werden. Die Einzelheiten
dieser lokalen Studie wurden 2009 in der Fachzeitschrift
„The Lancet Neurology“ (8) veröffentlicht.
Erste systemische klinische Studie mit einem Morpholino-51-Antisense-Oligo
im Vereinigten Königreich. In
dieser offenen Studie der Phase II wurden 19 Jungen behandelt,
die 6-13 Jahre alt waren, noch laufen konnten und
ein Skippen des Exons 51 benötigten. Die Studie wurde im
Laufe des Jahres 2009 in London und Newcastle upon
Tyne, ebenfalls unter Leitung von Kate Bushby und
Francesco Muntoni durchgeführt. Die Jungen erhielten
12 Wochen lang Dosen von 0,5 bis 20 mg/kg des AVI-
4658 Antisense-Oligos. Dieses wurde durch wöchentliche
intravenöse Injektionen in den Blutkreislauf gespritzt, damit
alle Muskeln erreicht werden konnten. Ziel der Studie
war es, die Sicherheit der Methode und die Verträglichkeit
zu testen, nicht die Veränderungen der Muskelfunktionen
und der Muskelstärke.
Es wurde Muskelgewebe mit zwei Biopsien aus dem
Bizeps jedes Jungen vor und nach der Behandlung entnommen.
Hiermit sollte die niedrige Menge an Dystrophin
in den revertierten Fasern vor dem Start der Studie und die
Zunahme nach der Behandlung bestimmt werden.
Bei den 7 Patienten, die höhere Dosen zwischen 2 und
20 mg/kg/Woche erhalten hatten, wurde, verglichen mit
der normalen Menge in gesunden Menschen, zwischen 9
und 16% neues Dystrophin gefunden und zwar oberhalb
der Menge des revertierten Dystrophins im Kontrollmuskel.
Diese Ergebnisse wurden durch Analyse der geskippten
mRNA und des verkürzten Proteins erhalten. Drei der
vier Patienten, die die höchste Dosis von 20 mg/kg erhielten,
wiesen nach der Behandlung in 21%, 15% und 55%
ihrer Fasern Dystrophin auf.
Nach der Behandlung traten auch einige mit Dystrophin
assoziierten Proteine wieder an gewohnter Stelle in den
Muskelzellmembranen auf, die bei Duchenne-Patienten
mit dem Dystrophin verloren gehen. Während der gesamten
Studie, gab es keine Nebenwirkungen, die mit dem
Medikament in Verbindung gebracht werden konnten.
Eine Verbesserung der Muskelfunktion war nicht erwartet
worden, da die Studie zu kurz war, um eine Veränderung
der Muskelleistung herbeizuführen, die zuverlässig
gedeutet werden kann.
Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die Sicherheit
der Behandlung und der Beweis, dass die systemisch angewandte
Oligo AVI-4658 tatsächlich das Exon 51 geskippt
hat, dass also AVI 4658 wahrscheinlich den Verlauf
der Duchenne Muskeldystrophie beeinflussen kann (9).
Verlängerungsstudie mit Sareptas Morpholino-51 Antisense-Oligo.
NCT01396239. Diese Studie, die 4658-
US-201 genannt wird, ist der doppelblinde Teil der von
Sarepta durchgeführten Verlängerung der vorangegangenen
systemischen Studie. Es wurden jedoch zwei höhere
Dosen von Eteplirsen, 30 und 50 mg/kg/Woche und ein
Placebo über 24 Wochen injiziert. Mithilfe von mehreren
Muskelproben, die durch Biopsien nach Ende dieses doppelblinden
Teils der Studie entnommen wurden, sollte herausgefunden
werden, ob neues Dystrophin in den Muskeln
entstanden war.
Meine Zusammenfassung über die Durchführung und
die Ergebnisse dieser Studie basieren auf einer Reihe von
Veröffentlichungen von Sarepta. Die letzte Veröffentlichung
erschien am 7. Dezember 2012 (10). Die Studie begann
im Februar 2012 und wurde unter Leitung von Jerry
Mendell und seinen Kollegen am Nationwide Children’s
Hospital in Columbus im US-Bundesstaat Ohio durchgeführt.
Während der ersten 24 Wochen haben 12 Duchenne-
Jungen in 3 Gruppen wöchentliche intravenöse Injektionen
erhalten. 4 Jungen bekamen eine Dosis von 30 mg/kg, 4
weitere eine Dosis von 50 mg/kg, die restlichen 4 Jungen
bekamen Placebos. Vor der ersten Injektion, nach 12 Wochen
mit der 50 mg/kg-Dosis und nach 24 Wochen mit der
30 mg/kg-Dosis wurden Proben nach Biopsien entnommen,
um den Dystrophin-Gehalt zu bestimmen. Nach 48
Wochen wurde von allen Jungen eine dritte Biopsie vorgenommen.
Um festzustellen, ob diese Behandlungen die klinischen
Symptome verbessert haben, wurden verschiedene Muskelfunktionstests
durchgeführt. Am Ende des doppelblinden
Teils der Studie zeigte jedoch der wichtigste Test, der
6-Minuten-Geh-Test, bei der Gruppe mit den 30 und 50
mg/kg-Dosierungen keine bedeutsamen Veränderungen
nach 12 bzw. 24 Wochen.
Nach 24 Wochen wurde daher die Studie ohne Zeitbegrenzung
als offene Verlängerung unter dem Namen
4658-US-202 fortgeführt, um zu sehen, ob unter diesen
Umständen die Verbesserung der Muskelfunktion hauptsächlich
durch den 6-Minuten-Geh-Test gemessen werden
kann.
Zwei der Placebo-Patienten wurden den 4 Jungen der
Gruppe zugeordnet, die die 50 mg/kg-Dosis erhielt. Die
anderen beiden Jungen wurden in die 30 mg/kg-Gruppe
integriert. In der Zwischenzeit verloren zwei Jungen der 30
mg/kg-Gruppe die Gehfähigkeit, so dass sie den 6-Minuten-Geh-Test
nicht mehr ausführen konnten. Es gibt jetzt
also 3 Gruppen: 4 Jungen, die die 50 mg/kg-Dosis jede
Woche von Beginn an erhielten, 4 Jungen, die die 30
mg/kg-Dosis jede Woche von Beginn an erhielten – von
denen aber nur zwei noch am 6-Minuten-Geh-Test teilnehmen
konnten – und 4 „Placebo-delayed“-Jungen, die
24 Wochen lang Placebos erhielten und dann mit 30 bzw.
50 mg/kg pro Woche behandelt wurden. Sie sind die Jungen,
die eine durch Placebos verzögerte Behandlung erhalten
haben. Ich werde für sie hier die englische kurze Bezeichnung
„placebo-delayed“ verwenden.
Da es über 62 Wochen hinweg keine merklichen Unterschiede
in den Ergebnissen des 6-Minuten-Geh-Tests zwischen
den 30 und 50 mg/kg-Dosierungen mit Eteplirsen
15

gab, sollen hier nur die Ergebnisse von zwei Patientengruppen
diskutiert werden: Gruppe I mit 6 Jungen, die von
Beginn der Studie über 62 Wochen behandelt wurden, und
Gruppe II mit den 4 „Placebo-delayed“-Jungen, die zunächst
24 Wochen Placebos erhalten hatten und dann 38
Wochen lang die 30 oder 50 mg/kg-Dosis Eteplirsen.
Nach 62 Behandlungswochen liefen die 6 behandelten
Jungen der Gruppe I 16 Meter weniger im 6-Minuten-Geh-
Test als zu Beginn der Studie. Die 4 „Placebo-delayed“-
Jungen liefen 78 Meter weniger.
Die behandelten Jungen hatten gegenüber den „Placebo“-Jungen
also den bedeutenden Vorteil, dass sie 62 Meter
weiter laufen konnten. Diese Ergebnisse wurden unter
den Jungen gemittelt und auf volle Meter gerundet.
Die Tatsache, dass die behandelten Jungen in 62 Wochen
(1 Jahr und 2,5 Monate) nur 16 Metern an Laufleistung
einbüßten, bedeutet, dass sie weniger als 5% der 400
Meter Laufleistung verloren hatten, die sie zu Beginn der
Studie in 6 Minuten erbringen konnten. Die 4 „Placebodelayed“-Jungen
verloren während der 38wöchigen Behandlung
weniger als 10 m Laufleistung. Dies bedeutet,
dass durch die Exon-Skipping Behandlung die Duchenne-
Muskeldystrophie, wie erwartet, deutlich gebremst wurde
und der Becker-Dystrophie ähnlicher wurde.
Annemieke sagte dazu: „Diese Ergebnisse müssen mit
Vorsicht betrachtet werden, da die Gruppen sehr klein sind
und es bekannt ist, dass es bei den einzelnen Jungen erhebliche
Unterschiede im Fortschreiten der Krankheit gibt.
Dies wird noch dadurch unterstrichen, dass zwei der be-
handelten Patienten während der Studie ihre Gehfähigkeit
verloren.“
Die positiven Ergebnisse der Dystrophin-Bestimmung
im Muskelgewebe nach Biopsien, sind ein weiterer Hinweis,
dass diese Art von Exon-Skipping funktioniert. Nach
24 Wochen Behandlung führte das Morpholino-51 Antisense-Oligo
Eteplirsen bei einer Dosis von 30 mg/kg pro
Woche zu einem deutlichen Anstieg der Zahl der Fasern
mit neuem Dystrophin zwischen 16 und 29%. Bei einer
kürzeren Behandlung von 12 Wochen wurde selbst bei der
höheren Dosis von 50 mg/kg pro Woche keine nennenswerte
Zunahme von neuem Dystrophin gefunden. Dies
zeigt, dass eine längere Behandlung als 6 Monate notwendig
ist, bevor durch das Eteplirsen eine nennenswerte Zunahme
von neuem Dystrophin bewirkt wird.
Bei den Jungen, die über 48 Wochen behandelt wurden,
stieg bei beiden Dosierungen der Prozentsatz der Muskelfasern,
die neues Dystrophin erhielten, von weniger als 5%
auf 47% der normalen Menge. Bei den „Placebo-delayed“-
Jungen, die erst nach den ersten 24 Wochen wirklich behandelt
wurden, enthielt nur 38% der Fasern neues Dystrophin.
Eteplirsen erwies sich über den gesamten Zeitraum der
Studie von 62 Wochen in beiden Dosierungen als sicher.
Sarepta hat angekündigt, dass es diese Ergebnisse mit
der US-amerikanischen Gesundheitsbehörde FDA besprechen
will und im Jahr 2014 eine entscheidende, doppelblinde
Studie der Phase III beginnen möchte.
Klinische Studien zum Skippen des Exons 51,
die von GlaxoSmithKline (GSK) und Prosensa durchgeführt werden
Zum Zeitpunkt des Niederschreibens dieses Berichtes, waren
die ersten vier klinischen Studien zum Skippen des
Exons 51 beendet und ihre Ergebnisse veröffentlicht.
Eine recht große Anzahl von zusätzlichen Studien zum
Skippen des Exons 51 ist derzeit am Laufen. Sie werden
von GSK mit dem 51 Antisense-Oligo PRO051 von Prosensa
ausgeführt. Dieses Oligo heißt jetzt Drisapersen und
GSK2402968. Jede dieser Studien hat eine GSK-Identifikationsnummer,
die mit DMD beginnt sowie eine NCT-
Nummer unter der sie im Internet von den US-amerikanischen
National Institutes of Health, NIH, dokumentiert
sind und häufig aktualisiert werden.
Um aktuelle Informationen über eine besondere Studie
zu finden, gehen Sie bitte auf www.clinicaltrials.gov,
geben die NCT-Nummer im Kästchen „search for study“
ein und klicken dann auf „search“. Danach müssen Sie auf
den Titel der Studie klicken.
In den jetzt folgenden Absätzen gebe ich Ihnen kurze
Zusammenfassungen der wichtigsten dieser Duchenne-
Studien und erwähne ihre NCT-Nummern und ihre GSK-
Namen, wenn sie von GSK durchgeführt werden.
Prosensa offene Verlängerungsstudie PRO051-02.
Nachdem Prosensa zwei offene 51-Studien durchgeführt
hatte – eine lokale und eine systemische, siehe Seite 13 –
erhalten jetzt alle 12 Jungen, die an der systemischen Studie
teilgenommen hatten, die höchste Dosis an Drisapersen,
6 mg/kg pro Woche, subkutan gespritzt in der offenen
Verlängerungsstudie, die schon mehr als 3 Jahre läuft.
Bisher sind noch keine ernstzunehmenden Sicherheitsprobleme
aufgetreten.
Bei der Tagung des Parent Projet Muscular Dystrophy,
die im Juni 2012 in Fort Lauderdale im US-Bundesstaat
Florida stattfand, wurden die vorläufigen Ergebnisse des
6-Minuten-Geh-Tests nach 96 Wochen, = 22 Monate, vorgestellt.
In dieser Zeit hatten 7 Jungen ihre Gehfähigkeit
erhalten oder verbessert. Von den 10 Jungen, die zu Beginn
der Studie den 6-Minuten-Geh-Test ausführen, konnten
zwei nicht mehr allein gehen. Sie befanden sich bereits
am Ende der Laufphase, als sie begannen, an der Studie
teilzunehmen. Dies bedeutet, dass die Jungen mit einer
besseren Laufleistung zu Beginn der Studie von der Behandlung
im stärkeren Maße profitiert haben.
Dies ist ein Indiz für die langfristige positive Wirkung
des Exon-Skippings. Die Ergebnisse müssen jedoch vorsichtig
interpretiert werden, da alle Jungen behandelt wurden
und es keine Placebo-Kontrollen gab. Ein Vergleich
mit dem normalen Verlauf der Krankheit ist daher nicht
möglich. Eine graphische Darstellung ähnlich wie für die
Ataluren-Studie auf Seite 8 ist noch nicht verfügbar.
Phase III der Exon-51 GSK-Studie GSK DMD 114044.
NCT 01254019. Diese wichtige und entscheidende Studie
ist eine Doppelblind-Studie der Phase III. Sie soll definitiv
beweisen, dass das Skippen des Exons 51 die Geschwindigkeit
der Duchenne-Muskeldegeneration verlangsamt,
16

die mit dem 6-Minuten-Geh-Test gemessen wird. Dadurch
könnte das 51-Antisense-Oligo des Typs 2’O-Methyl, Drisapersen,
durch die Regulierungsbehörden FDA in den
USA und EMA in Europa zum Vertrieb zugelassen werden.
Diese große Studie wird in 45 klinischen Zentren in
21 Staaten durchgeführt: in Argentinien, Belgien, Brasilien,
Chile, Dänemark, Deutschland, Frankreich, Italien, Japan,
Kanada, in den Niederlanden, in Norwegen, Polen,
Russland, Serbien, Spanien, Südkorea, Taiwan, in der
Tschechischen Republik und in der Türkei.
Die Vereinigten Staaten fehlen in dieser Liste, da die
FDA andere Anforderungen stellte. Daher wird hier eine
ähnliche Studie mit zwei verschiedenen Dosen durchgeführt.
Sie wird in der rechten Spalte dieser Seite beschrieben.
Die Injektionen dieser Phase-III-Studie begannen im
Dezember 2010. Die letzten Jungen wurden im dritten
Quartal 2012 aufgenommen. Die Studie wird also Ende
2013 abgeschlossen sein, wenn die letzten Jungen ein Jahr
lang behandelt wurden. Ihre Ergebnisse werden voraussichtlich
2014 zur Verfügung stehen. Sie werden dann auf
dem ersten dafür geeigneten medizinischen Kongress vorgestellt
und in einer wichtigen wissenschaftlichen Fachzeitschrift
veröffentlicht.
Für diese wichtige Studie wurden 186 Duchenne-Jungen
aufgenommen, die mindestens 5 Jahre alt waren und
vor Teilnahme an der Studie mindestens 6 Monate lang
Steroide erhalten hatten. Die Jungen erhalten entweder 6
mg/kg des potenziellen Medikaments oder eine nicht aktive
Substanz als Placebo 48 Wochen lang jede Woche unter
die Haut gespritzt.
Es mußten mindestens 180 Jungen an der Studie teilnehmen,
um sicherzugehen, dass die Ergebnisse statistisch
signifikant sind, d.h. zuverlässig zumindest einen Unterschied
von 30 Metern zwischen den behandelten und den
Placebo-Jungen zeigen können, falls das 51-Antisense-
Oligo wirksam ist.
Die wichtigste Methode, eine Verbesserung der Muskelfunktion
festzustellen, wird, wie in den meisten anderen
Exon-Skipping-Studien auch, der 6-Minuten-Geh-Test
sein. Es werden jedoch auch andere Tests durchgeführt,
die beispielsweise die Muskelstärke und die Atemleistung
messen.
Am Ende der Behandlung wird Muskelgewebe durch
Biopsien entnommen, um auf neu entstandenes verkürztes
Dystrophin zu testen. Während der gesamten Studie werden
klinische Analysen in wiederholten Blutproben durchgeführt,
um nachzuweisen, dass die Behandlung weiterhin
sicher ist. Mit Fragebögen sollen die Eltern Veränderungen
in der Lebensqualität dokumentieren.
Das Vorhandensein des neuen, verkürzten Dystrophins
in den Muskeln der behandelten Patienten reicht nicht aus,
um zu beweisen, dass dieses Exon-Skipping tatsächlich
funktioniert. Das neue Dystrophin könnte entstanden, jedoch
nicht an seinem normalen Platz gewandert sein. Dann
könnte es die Muskeln nicht stabiler machen und ihre
Funktion verbessern. Der 6-Minuten-Geh-Test ist die beste
Methode, um Änderungen der Muskelfunktion zu beweisen.
Wenn das Medikament eine positive Wirkung hat,
dann können die behandelten Jungen mehr Meter in 6 Minuten
gehen als die Placebo-Patienten. Positive Ergebnisse
Des 6-Minuten-Geh-Tests werden von der FDA und der
EMA als der zuverlässigste Beweis akzeptiert, dass ein
neues Medikament bei Muskelkrankheiten wirksam ist.
Offene GSK Verlängerungsstudie DMD 114349, NCT
01480245. Ähnlich wie die von Prosensa durchgeführte,
systemische Studie der Phase II, siehe Seite 13, ist diese
Studie eine Fortführung der Behandlung derjenigen Patienten,
die die 48 Wochen der Injektionen der Phase III-Studie
GSK 114044 und der Studie GSK 114117 mit periodischer
Dosierung, siehe unten auf dieser Seite, abgeschlossen
hatten.
Alle teilnehmenden Patienten erhalten eine Dosis von 6
mg/kg pro Woche, auch diejenigen, die während der ersten
Studie Placebos erhalten hatten. Die Behandlung mit Steroiden
muss ebenfalls ohne Unterbrechung aufrechterhalten
werden. Diese Studie begann im September 2011 und
wird im Dezember 2014 abgeschlossen werden. Die Jungen
werden in den gleichen klinischen Zentren behandelt,
in denen sie auch während der doppelblinden Studien behandelt
wurden. Wahrscheinlich werden bis zu 200 Jungen
teilnehmen. Die Ergebnisse werden Anfang 2015 zur Verfügung
stehen und in einer wichtigen medizinischen Fachzeitschrift
veröffentlicht.
GSK Phase II-Studie mit zwei Dosen in den USA, DMD
114876, NCT 01462292. Diese Studie ist ähnlich wie die
internationale Studie der Phase III. Es werden jedoch zwei
Dosen angewendet, 3 und 6 mg/kg pro Woche. Sie wird
nur in den USA durchgeführt und zwar in Sacramento,
Stanford (beide Kalifornien), Gulf Breeze (Florida), Iowa
City (Iowa), Kansas City (Kansas), Baltimore (Maryland),
Minneapolis (Minnesota), St. Louis (Missouri), New York,
Durham (North Carolina), Cincinnati, Columbus (beide
Ohio), Portland (Oregon) und Dallas (Texas).
Es werden 54 Duchenne-Jungen, die mindestens 5 Jahre
alt sind und noch allein gehen können, an der Studie
teilnehmen. Jeder von ihnen erhält jede Woche einmal das
potenzielle Medikament oder ein Placebo. Die Studie dauert
24 Wochen lang. Danach schließt sich eine Beobachtungsperiode
von 24 Wochen an, die auch GSK DMD
114501 Verlängerungsstudie heißt. Die Injektionen wurden
im Oktober 2011 begonnen, der letzte Junge wird seine
ein Jahr dauernde Behandlung Ende 2013 abschließen.
Die Methoden, um die Ergebnisse der Studien zu messen,
sind der 6-Minuten-Geh-Test, das Bestimmen von
Dystrophin in Muskelgewebe nach einer Biopsie und viele
andere Tests, die die Sicherheit feststellen. Es werden auch
Methoden zur Anwendung kommen, die die Pharmakokinetik
untersuchen. Hier wird gemessen, wie schnell ein
Medikament in die Muskeln gelangt und wie schnell es
abgebaut und aus dem Körper ausgeschieden wird. Außerdem
wird die neue und teure Magnetresonanzuntersuchung,
MRI, angewendet werden, die den Zustand der
Gliedmaßen, des Herzens und des Zwerchfellmuskels
überprüft, um zu prüfen, welche Wirkung das 51-Antisense-Oligo
hier hat.
Skippen von Exon 51 mit periodischer Behandlung,
GSK Studie DMD 114117, NCT01153932. Das Ziel dieser
Studie der Phase II war es herauszufinden, ob eine pe-
17

iodische Behandlung mit dem Antisense-Oligo 2402968
von GSK zu einer besseren langfristigen Sicherheit mit
gleicher therapeutischer Wirkung führt als eine Behandlung
mit wöchentlichen Injektionen. Diese Studie wurde
von September 2010 bis Ende 2012 in 13 klinischen Zentren
in 9 Ländern durchgeführt: in Australien, Belgien,
Deutschland, Frankreich, Israel, den Niederlanden, Spanien,
in der Türkei und im Vereinigten Königreich.
Es nahmen 53 Duchenne-Jungen teil, die mindestens 5
Jahre alt waren und noch selbst gehen konnten. Sie mussten
vorher mindestens 6 Monate lang Steroide erhalten haben
und diese Behandlung auch während der Studie fortsetzen.
Etwa ein Drittel der Jungen erhielt 6 mg/kg des
Anti-51-Oligos 48 Wochen lang jede Woche unter die
Haut gespritzt. Ein weiteres Drittel wurde in fünf 10-
Wochen-Zyklen behandelt. In den Wochen 1, 3 und 5 erhielten
die Jungen zweimal Injektionen von 6 mg/kg, in
den Wochen 2, 4 und 6 nur einmal, in den Wochen 7-10
fand keine Behandlung statt. Das letzte Drittel der Patienten
erhielt Placebos unter den gleichen Bedingungen. Diese
Studie war also eine Doppelblind-Studie. Das primäre
Ergebnis dieser Studie war die Wirksamkeit nach einer
Behandlungszeit von 24 Wochen.
Als Ergebnis wurde gemessen die Veränderung der
Muskelfunktion mit dem oft wiederholten 6-Minuten-Geh-
Test. Außerdem wurde die Pharmakokinetik bestimmt, das
Verhalten des Oligos im Körper, sowie die Sicherheit
durch mehrere Blut- und Urinanalysen. Vor und nach der
Studie wurde in Muskelgewebe nach Biopsien die Menge
an neuem und verkürztem Dystrophin bestimmt, das durch
das Skipping entstanden war. Die Ergebnisse werden veröffentlicht,
sobald sie vollständig analysiert und ausgewertet
sind.
Skipping des Exons 51 bei Rollstuhlpatienten, GSK
Studie DMD 114118, NCT01128855. Das Ziel dieser systemischen
Studie war es, die Sicherheit und Verträglichkeit
des Skippens von Exon 51 bei 19 Patienten zu untersuchen,
die nicht mehr gehen konnten. Die Patienten waren
älter als 9 Jahre und mussten schon mindestens 1 Jahr,
jedoch nicht länger als 4 Jahre, einen Rollstuhl benutzen.
Da die anderen Studien mit Jungen, die noch gehen
konnten, bisher zu keinen Sicherheitsproblemen führten,
sollte diese Studie sicherstellen, dass bei Rollstuhlpatienten
keine bisher unbekannten Sicherheitsprobleme auftreten.
Weil diese Jungen weniger aktiv sind als die noch gehenden
und sie deutlich weniger Muskeln haben, könnte
sich das neue Medikament in den Muskeln anders verhalten
und auch sein Ausscheiden aus dem Körper anders
sein. Dies könnte zur Folge haben, dass sie eine andere
Dosis bekommen müssten. Die Ergebnisse dieser Studie
Klinische Phase-II-Studie zum Skippen von Exon 44.
NCT 01037309. Prosensa führt diese offene Studie mit
seinem Antisense-Oligo PRO044-CLIN-01 in vier klinischen
Zentren durch: in Löwen in Belgien, in Leiden in
den Niederlanden, in Göteborg in Schweden und in Ferrara
in Italien. Die Studie wurde im Dezember 2009 begonnen
werden wichtige Informationen zu weiteren Studien an älteren
Duchenne-Jungen und jungen Männern liefern.
Die 19 Teilnehmer dieser Studie wurden in zwei Gruppen
von je 8 Jungen eingeteilt und in eine von 3 Jungen.
Bei den zwei ersten Gruppen erhielten jeweils 6 Jungen
einmalig subkutane Injektionen von 3 oder 6 mg/kg des
GSK Anti-51-Oligos 2402968. Zwei Jungen in jeder dieser
Gruppen erhielten die gleiche Dosis einer nicht aktiven
Substanz als Placebo. Diese Studie war also eine Doppelblind-Studie.
In der dritten Gruppe erhielten 2 Jungen 9
mg/kg und 1 Junge ein Placebo. Eine und 4 Wochen nach
den Injektionen wurden ausgedehnte klinische Tests
durchgeführt. Es gab keine ernsten Nebenwirkungen.
Die Studie wurde in Columbus im US-Bundesstaat Ohio
und in Paris durchgeführt. Sie fand von Juli 2010 bis Februar
2012 statt. Die Ergebnisse werden veröffentlicht, sobald
sie vollständig analysiert sind.
Die Exon-51-Studien müssen beweisen, dass das Exon-
Skipping wirkt. Die Studien über das Skippen des Exons
51 sind die wichtigsten, um Antisense-Oligos gegen Duchenne
Muskeldystrophie in Europa und den Vereinigten
Staaten für den Vertrieb zugelassen zu bekommen. Wenn
die Ergebnisse aller Exon-51-Studien die beiden wichtigsten
Zulassungsbehörden FDA und EMA überzeugen können,
dass das Skippen des Exons 51 wirksam und über viele
Jahre hinweg eine sichere Therapie für Patienten ist,
könnte das erste genetische Medikament zur Behandlung
einer schweren Erbkrankheit innerhalb der nächsten Jahre
für den Verkauf zugelassen werden.
Das Skippen von Exon 51würde jedoch nur 13% aller
Duchenne-Patienten helfen. Um eine Skipping-Therapie
für die restlichen 70% der Patienten anbieten zu können,
die Exon-Skipping brauchen, die aber weniger häufige
oder seltene Mutationen haben, müssten mehr als 100 verschiedene
Antisense-Oligos entwickelt werden. Um das
Exon-51-Medikament bis zur Zulassung zu entwickeln,
werden schließlich mehr als 10 Jahre vergangen sein. Es
werden zudem viele Millionen Euro und Dollar in vorklinische
Arbeiten und in die 3 Phasen der klinischen Studien
investiert worden sein. Diese Zeitspanne und diese Kosten
müssen deutlich reduziert werden, um die vielen anderen
Skipping-Medikamente für die Mehrheit der Duchenne-
Patienten zu entwickeln.
Es laufen Diskussionen und Verhandlungen zwischen
TREAT-NMD, PPMD sowie anderen Patienten-Organisationen
und den Behörden FDA und EMA, um sie davon zu
überzeugen, dass eine schnellere Entwicklung der vielen
anderen Oligos unbedingt nötig ist, wenn sich das 51-
Oligo und das 44-Oligo als zweites nach ausgiebiger Überprüfung
als sicher und wirksam erwiesen haben, die zusammen
schon 19,2% aller Patienten helfen würden.
Klinische Studien zum Skippen anderer Exons als 51.
und wird in der zweiten Hälfte des Jahres 2013 abgeschlossen
werden.
Die 18 teilnehmenden Duchenne-Jungen sind zwischen
5 und 16 Jahre alt. Es gibt 3 Jungen in jeder Dosierungsgruppe.
Sie erhalten pro Woche subkutane Injektionen mit
ansteigender Dosierung, 0,5-1,5-5-8-10 und 12 mg/kg. Ei-
18

nige der Jungen werden mit intravenösen Injektionen von
1,5, 5 und 12 mg/kg 5 Wochen lang nachdosiert.
Dreizehn Wochen nach der Behandlung wird Muskelgewebe
in Biopsien entnommen, um zu bestimmen, wie
viel neues Dystrophin in den Muskelzellen entstanden ist.
Außerdem werden andere Tests durchgeführt, um die Sicherheit,
mögliche Nebenwirkungen und die Pharmakokinetik
zu überprüfen.
Wenn die Resultate dieser Studie der Phase II zeigen,
dass das Skippen von Exon 44 genauso wirksam und sicher
ist wie das Skippen von Exon 51, verlangen FDA und
EMA vielleicht nicht eine zeitaufwendige und teure Studie
der Phase III für dieses Exon 44, bevor sie beide Skipping-
Medikamente zulassen.
Skipping von anderen Exons. In verschiedenen Pressemitteilungen
hat Prosensa angekündigt, dass vorklinische
Arbeiten für das Skippen der vier Exons 45, 52, 53 und 55,
die neben den Exons 51 und 44 ebenfalls auf der Prioritätenliste,
siehe Seite 9, stehen, bald abgeschlossen sein
werden. Die ersten klinischen Studien zum Skippen der
Exons 45 und 53 werden 2013 beginnen, die Studien für
die Exons 52 und 55 werden bald folgen.
Sarepta plant ähnliche Studien zum Skippen der Exons
45, 50 und 53.
Neugeborenenscreening und klinische Studie mit sehr
jungen Duchenne-Patienten. GSK plant, im Jahr 2013
eine klinische Studie über das Skipping des Exons 51 bei
Jungen zu beginnen, die jünger als 5 Jahre alt sind
Da Exon-Skipping nur Muskelfasern behandeln kann,
die noch vorhanden sind und von dem Dystrophie-Prozess
noch nicht zu sehr geschädigt wurden, können verschwundene
Muskelfasern nicht ersetzt werden.
Aus diesem Grund könnte Exon-Skipping wirksamer
bei Jungen sein, die noch keine Symptome haben und die
noch genügend Muskeln haben bevor die Krankheit mit
etwa drei Jahren sichtbar wird.
Die beste Lösung wäre es, die Skipping-Behandlung im
ersten Jahr nach der Geburt zu beginnen. Um diese Jungen
zu finden, wäre ein Screening männlicher Neugeborener
mit einem Suchtest auf sehr hohe Aktivitäten des Enzyms
Creatinkinase, CK, nötig. Dabei wird ein trockener Blutfleck
der Neugeborenen auf Filterpapier untersucht. Sehr
hohe CK-Aktivitäten von mehr als 1.000 U/L im Blut eines
neugeborenen Jungen deuten auf Duchenne-Dystrophie
oder eine andere muskuläre Erkrankung wie z.B. eine
der Gliedergürteldystrophien hin.
In einem Pilot-Screeningprogramm an Neugeborenen,
das von der Gruppe um Jerry Mendell in Columbus im
US-Bundesstaat Ohio durchgeführt wurde, war es sogar
möglich, die Sequenz des Dystrophin-Gens in der DNA zu
bestimmen, die man von den Leukozyten, den weißen
Blutzellen in den trockenen Blutflecken der Jungen mit
hohen CK-Aktivitäten, erhalten hatte (11).
Man könnte damit nicht nur die Duchenne-Jungen
gleich nach ihrer Geburt finden, sondern man wüsste auch
kurz danach ihre Gen-Mutation und könnte innerhalb sehr
kurzer Zeit eine Diagnose stellen. Eine wirksame Exon-
Skipping-Therapie könnte dann sofort eingeleitet und ein
Degenerieren der Muskeln gleich verhindert werden. Diese
Duchenne-Jungen würden dann keine Duchenne-Muskeldystrophie
haben!
In naher Zukunft werden in vielen Staaten solche Duchenne
Screening-Programme wahrscheinlich zusätzlich
zu den schon bestehenden Neugeborenen-Untersuchungen
derjenigen Krankheiten durchgeführt werden, die behandelt
werden können. Der internationale Workshop des
European Neuromuscular Center ENMC über Duchenne-
Screening, der vom 14. – 16. Dezember 2012 in Naarden
nahe Amsterdam stattfand, wird die Akzeptanz für diese
Art von frühen Untersuchungen erhöhen, sobald Drisapersen,
das von Prosensa und GSK entwickelte Medikament
zum Skippen von Exons 51, sich definitiv als sicher und
wirksam erwiesen hat.
Viele Leser meiner Berichte wissen sicherlich, dass ich
1974 ein privates Labor in meinem Haus in Breitnau, einem
Dorf im Schwarzwald 30 km östlich von Freiburg,
gegründet hatte und seitdem auf dem Gebiet der Muskeldystrophien
arbeite. Von März 1977 bis November 2011
führte ich mit meinen Mitarbeitern in diesem Testlaboratorium
Breitnau ein freiwilliges Früherkennungsprogramm
auf Duchenne-Muskeldystrophie für ganz Deutschland
durch. Zusammen mit Kollegen habe ich dieses Programm
und den neuen Bioluminiszenz-Test zur Bestimmung der
Creatinkinase in trockenen Blutflecken im Jahr 1986 beschrieben
(12). Wir haben 537.000 Jungen getestet, unter
denen wir 155 mit Duchenne- (1:3.600) und 35 Jungen mit
Becker- Muskeldystrophie (1:15.300) innerhalb ihrer ersten
Lebenswochen fanden.
Exon-Skipping mit Gentransfer. Die Wissenschaftler
Luis García, Aurélie Goyenvalle, Dame Kay Davies und
ihre Kollegen an den Universitäten in Versailles und Oxford
arbeiten an einer Kombination des Exon-Skippings
mit einer Gentherapie. Ziel ist es, die Muskelzellen dazu
zu bringen, die Antisense-Oligos selbst zu erzeugen. Sie
hoffen, dass nur eine Injektion von Viren notwendig sein
wird, die die genetische Sequenz zur kontinuierlichen Produktion
von Antisense-Oligos in die Muskelzellen transportieren.
Ständige, sich wiederholende Injektionen von
freien Antisense-Oligos während des möglicherweise verlängerten
Lebens der Patienten wären dann nicht mehr nötig.
Im Jahr 2004 haben die Wissenschaftler bereits den
gentherapeutischen Teil dieses Verfahrens entwickelt, in
dem sie die RNA-Antisense-Sequenzen an U7-snRNAs
angefügt haben. Diese sind kleine RNAs, die Teil der
Spleißosomen sind, der biochemische Maschinerie, die die
79 Exons im Kern zur aktiven mRNA zusammensetzen,
die dann die Information für das Protein Dystrophin enthält.
Die veränderten U7-snRNAs wurden mit Vektoren,
mit harmlosen adeno-assoziierten Viren, AAV, in die
Muskelzellen transportiert, wo sie in die Zellkerne wandern,
um dort das Exon-Skipping während des Spleiß-
Prozesses zu veranlassen.
Diese beladenen Viren wurden zunächst lokal in einzelne
Muskeln von mdx-Mäusen gespritzt, danach dann
systemisch in den Blutkreislauf. In den Muskelzellen hat
das Skipping des Exons 23 das Leseraster wieder hergestellt.
Das neue, etwas kürzere Dystrophin trat in bis zu
80% der Fasern der behandelten Muskeln auf. Es wanderte
19

dann zu seiner normalen Position unterhalb der Zellmembranen
und war dort mehr als ein Jahr stabil. Es gab keine
Immunreaktionen.
Die dystrophischen Prozesse in den mdx-Muskeln, d.h.
ihre beschleunigte Degeneration und Regeneration, kamen
komplett zum Erliegen. Die mdx-Mäuse, die systemisch
behandelt wurden, entwickelten keine Muskelschäden, die
normalerweise an nicht behandelten mdx-Mäusen auftreten
(13).
Vor fünf Jahren wurde dieses U7-Gentransferverfahren
angewendet, um Golden-Retriever-Hunde klinisch zu behandeln,
die wirklich krank waren wie Duchenne-Patienten.
Diese Hunde haben eine Mutation an der Spleißstelle
des Exons 7, die durch ein Skipping der Exons 6 und 8 behoben
werden kann. Die Verwendung der für Hunde adaptierten
U7-snRNAs, die Antisense-Sequenzen gegen die
Exons 6 und 8 enthielten, führte dazu, dass verkürztes
Dystrophin in beinahe normalen Konzentrationen in vielen
Muskeln gebildet wurde. Hierzu wurden Injektionen in die
Muskeln vorgenommen und eine regionale, systemische
Injektion in ein Bein, dessen Blutkreislauf mit einer Blutdruckmanschette
blockiert war.
Jetzt, fünf Jahre nach diesen Experimenten sind die
langfristigen Ergebnisse dieser Behandlung von Adeline
Vulin, Aurélie Goyenvalle, Luis García und ihren Mitarbeitern
veröffentlicht worden (14). Nach dieser Zeit war
das verkürzte Dystrophin in den 6 behandelten Hunden
noch vorhanden, die Zahl der Fasern mit dem neuen Dystrophin
hatte sich jedoch langsam verringert.
Dies geschah nicht wegen einer Immunreaktion, sondern
wahrscheinlich, weil es, wie bei der menschlichen
Becker-Muskeldystrophie, zu einem langsam fortschreitenden
dystrophischen Prozess kam. Der Hauptgrund ist
jedoch wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass bei
dem geretteten, verkürzten Dystrophin nicht nur das Exon
7 und die beiden geskippten Exons 6 und 8 fehlten, sondern
aus unerklärlichen Gründen auch das Exon 9, das je-
Annemiekes Liste mit 130 Skipping-Medikamenten (5)
enthält 77 zum Skippen eines einzelnen Exons und 53, die
zwei Exons skippen würden. Das bedeutet, dass 64% aller
Patienten vom Skippen einzelner Exons profitieren würden,
19% bräuchten das Skippen von zwei Exons.
Wie ich auf Seite 9 erwähnte, gibt es sieben Skippings
auf den Prioritätenlisten von Prosensa/GSK und Sarepta,
die zusammen 45,1% aller Patienten helfen würden. Es
handelt sich um die Exons 44, 45, 50, 51, 52, 53 und 55.
Nur einige wenige Arbeiten befassten sich bisher mit dem
Skippen von zwei Exons, zwei benachbarten oder zwei getrennten.
Es gibt noch keine klinischen Studien für Doppelskipping,
da die drei aktiven Firmen auf diesem Gebiet
mit großem finanziellem Engagement sich vorerst auf die
Entwicklung des Skippings der einzelnen Exons auf ihren
Prioritätslisten konzentrieren.
Wenn diese sich als sicher und wirksam erweisen und
ohne Verzögerung zugelassen werden, können wir hoffen,
dass die Skipping-Medikamente für die weniger häufigen
oder seltenen und komplizierten Mutationen nicht die gleiche
Zahl von Studien wie bisher durchlaufen müssen. Für
Multiexon-Skipping.
doch das Leseraster nicht verschiebt. In dem Protein fehlten
also 158 Aminosäuren, die von den fehlenden Exons
6-9 definiert sind. Diese sind Teil der Struktur an einem
Ende des Proteins, die es mit dem Actin-Netzwerk des
Zellgerüsts der Muskelzellen verbindet. Da diese Verbindung
dann nicht mehr perfekt ist, könnte dies zu der langsamen
Degeneration der Muskeln beitragen.
Die Autoren schlagen vor, dass dieses genetische Exon-
Skipping als Beginn einer Langzeit-Therapie dienen könnte,
die dann nach ein paar Jahren von normalen Exon-
Skipping- Injektionen abgelöst werden könnte.
Nachdem mit diesem Verfahren 2004 das Skippen des
Exons 23 in mdx-Mäusen möglich war, die aber nur wenig
krank sind, wurde die gleiche Methode bei sogenannten
doppel-KO-Mäusen angewandt. Diese hatten weder Dystrophin
noch Utrophin in ihren Muskeln und waren daher
so krank wie die Duchenne-Jungen (15). Nach einer einzigen
intravenösen Injektion des AAV-Virus, das die Antisense-Sequenzen
an der U7-snRNA gegen das Exon 23 der
Mäuse mitbrachte, wurden fast normale Konzentrationen
von Dystrophin in allen Muskeln gefunden, auch in den
Herzmuskeln. Dies führte zu einer deutlichen Verbesserung
ihrer Muskelfunktionen, einer Normalisierung der
Muskelstrukturen und zu einer bemerkenswerten Verlängerung
ihrer Lebenszeit von ca. 10 Wochen auf mehr als 1
Jahr.
Die Wissenschaftler haben jetzt spezifische U7snRNAs
entwickelt, um Exons in menschlichen Dystrophin-Genen
zu skippen, damit diese Strategie auch bei DMD-Patienten
angewandt werden kann (16). Sie haben auch gezeigt, dass
mehrere verschiedene U7snRNAs durch dieses AAV-
Virus transportiert werden kann, die dann das gleichzeitige
Skippen mehrerer Exons ermöglicht.
Diese Arbeiten bedeuten einen wichtigen Schritt zur
klinischen Anwendung an Patienten, die von Génethon zusammen
mit dem Institut de Myologie und Forscherteams
in Nantes für das Jahr 2015 geplant sind.
ihre Entwicklung wäre dann wesentlich weniger Geld und
Zeit nötig.
Erster Versuch zum Skippen der Exons 45 bis 55 mit
2’O-Methylen. Es gibt jedoch eine Ausnahme zu dem
eben beschriebenen Szenario. Es geht um das Skippen von
mehr als zwei Exons mit einem Gemisch, einem Cocktail,
von mehreren Antisense-Oligos.
Im Jahr 2007 haben Christophe Beroud und seine Mitarbeiter
an der Universität von Montpellier in Südfrankreich
ihre Prognose veröffentlicht (17), dass das gleichzeitige
Skippen der 11 Exons 45 bis 55 zu einem verkürzten
Dystrophin führen würde, das eine Becker-Dystrophie mit
sehr milden oder gar keinen Symptomen in bis zu 63% aller
Duchenne-Patienten zur Folge hätte. Tatsächlich wurde
bei einigen Becker-Patienten eine natürliche Deletion der
Exons 45 bis 55 beschrieben. Diese Patienten hatten fast
keine Beeinträchtigungen.
Im Jahr 2008 haben Annemieke Aartsma-Rus und ihre
Kollegen versucht, in Zellkulturen diese 11 Exons von
der Dystrophin mRNA einer gesunden Person und von
20

zwei Duchenne-Patienten zu entfernen. Ein Cocktail von
2’O-Methyl-Oligos gegen alle 11 Exons verursachte jedoch
unregelmäßige Spleißprozesse, die eine Mischung
von mRNAs produzierte, bei denen unterschiedlich viele
Exons geskippt wurden. Die Autoren kamen zu dem
Schluss, dass dieses Verfahren eine klinische Entwicklung
eines multiplen Skippings der Exons 45-55 zu der Zeit
damals nicht rechtfertigte (18).
Multiples Skipping bei dystrophen Hunden. Als nächster
Schritt wurde das Skippen von zwei oder mehr Exons
mit einem Oligo-Cocktail versucht. In den Jahren 2008
und 2009 haben Eric Hoffmann und Terence Partridge
in Washington und Shin’ichi Takeda in Tokio mit ihren
Kollegen Cocktails von 2’O-Methylen und Morpholino-
Antisense-Oligos entwickelt, um mehrere Exons in dystrophen
Beagle-Hunden zu skippen (19). Im Gegensatz zu
den mdx-Mäusen, die nur eine milde Dystrophie haben,
haben diese Hunde Duchenne-ähnliche Symptome.
Diese dystrophen Hunde haben eine Mutation an der
Spleißstelle des Exons 7 in ihrem Dystrophin-Gen. Sie
verursacht die Deletion von Exon 7 in ihrer mRNA. Das
Leseraster wird verschoben, es kommt zu einem vorzeitigen
Stopp-Codon bald danach. Das Skippen der beiden
benachbarten Exons 6 und 8 würde das Leseraster wieder
herstellen.
Verschiedene Mischungen von 2’O-Methylen und Morpholinos
wurden in Zellkulturen getestet, bis die wirksamste
Cocktail-Mischung gefunden wurde. Diese enthielt
zwei Oligos gegen Exon 6 und ein Oligo gegen Exon 8.
Nach lokalen Injektionen in einen Muskel produzierten
beide Typen von Oligo-Cocktails bis zu 80% an verkürztem
mRNA und fast normale Konzentrationen an verkürztem
Dystrophin. Es wurden jedoch aus unerklärlichen
Gründen nicht nur die beiden gewünschten Exons 6 und 8,
sondern auch das Exon 9 geskippt. Dies ist ein „in-frame“
Exon. Wenn es weggelassen wird, verschiebt sich das Leseraster
nicht.
In Tokio wurde eine systemische Behandlung an 3 zwei
Monate alten Hunden durchgeführt. Diesen wurden drei
Morpholino-Antisense Cocktails in die Venen im Bein gespritzt.
Diese Injektionen wurden nach 5, 7 und 50 Wochen
wiederholt. In allen getesteten Skelettmuskeln, jedoch
nicht im Herzmuskel, wurde neues Dystrophin gefunden
und zwar in einer Konzentration von bis zu 50%
verglichen mit einer normalen Konzentration.
Wie zuvor wurde auch das Exon 9 geskippt. Die körperliche
Situation der Hunde stabilisierte sich und war wie
zu Beginn der Behandlung. Ohne Behandlung hätte sie
sich während dieser Zeit sehr verschlechtert.
Diese Behandlung schien ihren Muskelverfall aufgehalten
zu haben. Morpholino-Antisense-Oligos funktionieren
also in größeren Säugetieren, die eine ähnliche Körperstruktur
wie Menschen haben. Sie sind nicht giftig.
Exon-Skipping mit Vivo Morpholinos. Im Jahr 2009
begann die gleiche Gruppe von Forschern in Washington
und Tokio mit einem anderen Typ von Antisense-Oligos
zu arbeiten. Diese waren zuvor von Qi Long Lu und seinen
Kollegen am Carolinas Medical Center in Charlotte
im US-Bundesstaat North Carolina entwickelt worden. An
das eine Ende eines normalen Morpholino-Oligos hatten
sie eine verzweigte Struktur aus 8 Guanidin-Gruppen angehängt.
Dieses Octa-Guanidin-Morpholino wird Vivo-Morpholino
genannt. Seine Struktur erlaubt es ihm, sehr wirksam
in Skelettmuskeln einzudringen, auch in die Herzmuskeln.
Es wurden mdx-Mäuse mit Vivo-Morpholinos gegen
ihr Exon 23 behandelt, das ein vorzeitiges Stopp-Signal
enthält. Eine systemische Behandlung, die im 2-Wochen-
Rhythmus über 10 Wochen erfolgte, führte zu bis zu 50%
neuem Dystrophin in allen Fasern der Skelettmuskeln und
in bis zu 10% der Herzmuskeln. Auch die glatte Muskulatur
der Blutgefäße und des Darms wiesen positive Veränderungen
auf. Die Muskelfunktion verbesserte sich sichtbar,
es kam zu keinen ernstzunehmenden Nebenwirkungen
(20).
Multiples Skipping mit Vivo-Morpholinos bei Hunden.
Nachdem Vivo-Morpholinos bei der Behandlung von
mdx-Mäusen positive Ergebnisse zeigten, haben die Wissenschaftler
das Skippen der 3 Hunde-Exons mit einem
Cocktail aus Vivo-Morpholinos wiederholt (21).
Sie arbeiteten mit 3-5 Monate alten Beagle-Hunden, die
schon milde dystrophische Symptome aufwiesen. Ihnen
wurde in fünf verschiedene Muskeln ein Milliliter eines
Cocktails gespritzt, der 120 mg einer Mischung von 4 verschiedenen
Vivo-Morpholino-Oligos enthielt. Zwei davon
waren gegen das Exon 6 gerichtet und zwei gegen das
Exon 8. Zwei und acht Wochen nach der Injektion wurde
Gewebe bei Muskelbiopsien entnommen.
Nach zwei Wochen enthielt bis zu 70% der Muskelfasern
neues Dystrophin. Nach zwei Monaten waren es noch
bis zu 60%. Obwohl nur die Exons 6 und 8 Ziel der Antisense-
Oligos waren, wurde wie im vorangegangenen Experiment
auch Exon 9 geskippt.
Annemieke erklärt dies wie folgt: „Das Intron 7 ist
110.000 Buchstaben lang. Intron 8 hat nur 1.100 Buchstaben.
Daher werden Exon 8 und 9 früher zusammengespleißt
als Exon 7 und 8. Wenn Sie also Exon 8 alleine
skippen möchten, skippen Sie auch Exon 9, da es schon
mit Exon 8 verbunden ist.“
Nach diesen Versuchen mit Hunden wurden noch keine
Studien über Giftigkeit, Pharmakokinetik und zur biologischen
Verteilung gemacht. Man muss sie aber durchführen,
bevor ähnliche Vivo-Morpholinos in klinischen Studien
bei Duchenne-Patienten angewendet werden.
Multiexon-45-55-Skipping mit Vivo-Morpholinos bei
mdx52-Mäusen. Bald nach den Hundestudien mit Vivo-
Morpholinos haben die gleichen Forschergruppen in Tokio
und Washington mit Vorbereitungen für das Skippen der
21

11 Exons 45-55 bei Duchenne-Patienten begonnen. Dies
würde, wie ich zuvor erklärt hatte, eine Therapie für 63%
aller Patienten bedeuten (22).
Natürlich kannten die Forscher Annemiekes enttäuschende
Ergebnisse bei ihrem Versuch, alle 11 Exons mit
2’O-Methyl-Oligos zu skippen. Die japanisch-amerikanische
Forschergruppe wählte daher Vivo-Oligos mit Sequenzen
aus, die Reaktionen zwischen den verschiedenen
Oligos vermeiden. Auch Selbstreaktionen zwischen den
beiden Enden ein und desselben Oligos wurden unterbunden.
Zunächst mussten Experimente mit Mäusen durchgeführt
werden. Es sollten aber keine normalen mdx-Mäuse
verwendet werden, bei denen das Exon 23 geskippt werden
muss, sondern speziell gezüchtete mdx52-Mäuse, bei
denen das Exon 52 fehlt. Ihre unterbrochene Dystrophin-
Produktion sollte durch das Skippen von Exon 52 neu gestartet
werden. Das Exon 52 ist eines der Exons, die beim
multiplen Exon-Skipping entfernt werden würden.
Das Experiment wurde im Labor mit Tests an Myotuben,
Vorläufern von Muskelzellen, dieser Mäuse gestartet.
Eine Mischung von 10 Vivo-Oligos gegen die ESE-
Sequenzen der 10 Exons 45-51 und 53-55, nicht Exon 52,
wurden für das Skippen verwendet. Das Ergebnis war tatsächlich,
dass der gesamte Block der 10 ausgewählten
Exons geskippt wurde. Dies wurde durch eine Sequenzierungen
der mRNAs nach dem Skipping bewiesen. Erstaunlicherweise
gab es keine teilweise geskippten mRNAs.
Die nächsten Experimente wurden an lebenden, 45
Wochen alten mdx52-Mäusen durchgeführt, die 1,5 Mikrogramm,
1,5 Tausendstel Milligramm, des 10-Vivo-
Oligo-Cocktails in einen Schienbeinmuskel injiziert bekamen.
Nach 2 Wochen enthielten 70% der Muskelfasern
das korrekt gekürzte Dystrophin ohne die Aminosäuren,
deren genetische Codewörter in den 10 geskippten Exons
und im deletierten Exon 52 enthalten sind. Wiederum gab
es keine Teilskippings, weder als mRNA noch als Protein.
Alle Proteine des Dystrophin-Komplexes hatten wieder
100% ihrer normalen Konzentration erreicht. Einzige Ausnahme
war das Enzym Stickoxid-Synthase, NOS, das nicht
so wichtig ist.
Dann erhielten diese Mäuse systemische Injektionen.
Fünf zweiwöchentliche intravenöse Injektionen mit 12
mg/kg wurden vorgenommen. Das Ergebnis war, dass die
Skelettmuskeln das Becker-Dystrophin in einer Konzentration
von 8-15% und im Herzen von 2% der normalen Menge
enthielten. Diese behandelten Mäuse zeigten eine bessere
Muskelfunktion und eine längere Muskelausdauer. Die
Bluttests zeigten keine Toxizität, und die vorher sehr hohe
CK-Aktivität war stark herabgesetzt.
Der Grund für die milde Becker-Dystrophie bei Patienten
ohne die Exons 45-55 ist nicht bekannt. Man weiß jedoch,
dass dem Dystrophin dieser Patienten ein Teil der
Aminosäurekette fehlt, die die dämpfende Funktion des
Proteins nicht allzu sehr stört, nämlich die Zellmembranen
vor dem mechanischem Stress durch die Muskelkontraktionen
zu schützen.
Vorteile dieses 45-55-Skippings. Bis zu 63% der Duchenne-Patienten
könnte von diesem Multi-Skipping profitieren.
Die daraus resultierende Becker-Muskeldystrophie
wäre sehr schwach oder überhaupt nicht ausgeprägt. Es
gäbe aber eine erhöhte CK-Aktivität.
Dieses Skipping könnte auch schwerer betroffenen Becker-Patienten
helfen, die „in-frame“-Deletionen in dieser
Region haben. Wenn nur ein oder einige wenige der Vivo-
Oligos von diesem Cocktail verwendet werden, könnte
denjenigen Patienten eine Skipping-Therapie angeboten
werden, bei denen in dieser Region ein oder mehrere
Exons geskippt werden müssten. Der nächste und wichtigste
Schritt wird jetzt der Start von klinischen Studien an
Patienten sein.
Annemieke meint dazu: „Es gibt noch viele Herausforderungen
beim Multiexon-Skipping. Vivo-Morpholinos
sind giftig. Es wird sehr teuer werden, diese Mischung von
11 Antisense-Oligos herzustellen, selbst wenn andere Antisense-Oligos
verwendet werden. Es ist nicht bekannt, wie
hier Sicherheitstests durchgeführt werden können. Wenn
Sie manchmal nur 2 oder 3 Oligos aus dem Cocktail verwenden
möchten, oder auch nur ein Oligo für eine andere
Mutation, müssten Sie alles individuell testen. Sie würden
also nicht davon profitieren, dass Sie einen einzigen Cocktail
für eine Gruppe an Leuten mit verschiedenen Mutationen
haben. Wenn Sie es als Cocktail entwickeln wollen, ist
nicht bekannt, ob Sie diese Reagenzmischung als Ganzes
testen können oder ob Sie individuelle Sicherheitstests mit
den verschiedenen Komponenten durchführen müssen.“
Exon-Skipping für Verdoppelungen, Punktmutationen und seltene Mutationen.
Exon-Skipping zum Reparieren von Verdoppelungen.
Verdoppelungen eines oder mehrerer Exons, die ein Verschieben
des Leserasters verursachen, kommen bei ungefähr
7% aller Duchenne-Patienten vor.
Prinzipiell können Verdoppelungen auch mit Exon-
Skipping behandelt werden. Wenn es möglich wäre, die
zusätzlichen Exons zu entfernen ohne die originalen Exons
zu beeinträchtigen, würde das neue Dystrophin-Protein eine
normale Größe haben. Wenn genügend neues und normales
Dystrophin produziert würde, um die Degeneration
der Muskeln zu stoppen, würde diese Behandlung zu einer
Heilung führen. Sie wäre nicht nur eine Therapie.
Das Problem besteht darin, dass die Antisense-Oligos
beide Exon-Gruppen, das Original und die Kopie, erken-
nen würden, da beide genau gleich sind. Wenn also versucht
wird, ein Exon davon zu skippen, würden beide geskippt
werden. Für Verdoppelungen eines einzelnen Exons
gäbe es eventuell einen Ausweg, da es in manchen Fällen
möglich ist, ein drittes Exon vor oder nach dem doppelten
Exon zu skippen, um dadurch das Leseraster wiederherzustellen.
Größere Verdoppelungen zu reparieren wird sehr
komplex und schwierig werden, hier ist eventuell auch gar
keine Lösung möglich.
Kevin Flanigan und seine Mitarbeiter am Nationwide
Children’s Hospital in Columbus im US-Bundesstaat Ohio
haben ein neues Projekt begonnen, um Verdoppelungen zu
korrigieren.
Da die Verdoppelung von Exon 2 die häufigste Ver-
22

doppelung eines einzelnen Exons bei Duchenne-Patienten
ist, wurde eine neue Labor-Maus durch genetische Manipulation
entwickelt. Sie hat eine solche Exon- 2-Verdoppelung
in ihrem Dystrophin-Gen und entwickelt Symptome
einer schweren Muskelkrankheit. Sobald eine genügende
Zahl von diesen Mäusen vorhanden ist, werden an ihnen
Experimente durchgeführt, um einen Weg zu finden, diese
Verdoppelung zu reparieren.
Die Wissenschaftler haben auch schon Zellkulturen von
Patienten mit verschiedenen Verdoppelungen. Sie versuchen
nun, diese Verdoppelungen mit den üblichen Exon-
Skipping-Antisense-Oligos zu korrigieren, aber auch mit
dem AAV-U7-snRNA-Verfahren.
Dieses Projekt wird von der amerikanischen Elternvereinigung
Cure Duchenne finanziert.
Exon Skipping zum Reparieren von Punktmutationen.
Punktmutationen sind kleine Veränderungen von einem
oder einigen wenigen genetischen Buchstaben im Gen
selbst. Wenn die Mutation z.B. einen einzigen oder zwei
Buchstaben hinzugefügt oder entfernt hat, wird das Leseraster
verschoben. Manchmal wird auch ein Buchstabe gegen
einen anderen ausgetauscht. Dann wird zwar das Leseraster
nicht verschoben, das genetische Code-Wort kann
jetzt aber eine andere Aminosäure bedeuten.
Wenn diese Veränderungen die Struktur des Dystrophins
so gut wie nicht verändern, geschieht nichts. Wenn
jedoch einer der drei Stopp-Codons TGA, TAG oder TAA
durch die Mutation gebildet wird, dann verschiebt sich
zwar das Leseraster nicht, die Protein-Produktion wird
aber an solch einem vorzeitigen Stoppsignal angehalten.
Das Ergebnis ist Duchenne-Muskeldystrophie.
Solch eine Punktmutation kann oft repariert werden,
indem das Exon geskippt wird, das dasn Stopp-Codon enthält.
Dies gelingt jedoch nur, wenn es sich um ein „inframe“
Exon handelt, das Ränder zwischen ganzen Codons
hat, so dass sein Skippen das Leseraster nicht verschiebt.
Wenn das Skippen aber doch eine Verschiebung verursacht,
kann in einigen Fällen ein benachbartes Exon mitgeskippt
werden, um das Leseraster zu erhalten.
Das Medikament Ataluren, früher PTC124 genannt,
wurde von der Firma PTC Therapeutics im Bundesstaat
New Jersey in den USA entwickelt. Es sah so aus, als könne
Ataluren die durch Punktmutationen verursachten vorzeitigen
Stopp-Codons „überlesen“, also ignorieren.
Schwierigkeiten während einer großen klinischen Studie
haben jedoch zum vorzeitigen Abbruch der Studie geführt.
Wie ich schon erwähnte, wird Exon Skipping am wirksamsten
sein, wenn es sehr früh im Leben eines Duchenne-
Jungen begonnen wird, da dann die meisten Muskeln noch
vorhanden sind. Exon-Skipping wird sehr wahrscheinlich
die Degeneration der überlebenden Muskelfasern verlangsamen
oder sogar stoppen können, jedoch verlorene Muskelfasern
nicht erneuern. Gertjan van Ommen und Annemieke
Aartsma-Rus haben in ihren Interviews gesagt,
dass ältere Patienten gerne eine Stabilisierung ihrer verbliebenen
Muskeln wünschen könnten, auch wenn ihre
Exon Skipping für ältere Patienten
.
Im zweiten Teil dieses Berichtes werde ich über den aktuellen
Stand der Forschung an Ataluren berichten.
Exon Skipping zum Reparieren von seltenen Mutationen.
Auf Seite 9 hatte ich Ihnen Annemiekes Liste von
130 Gruppen von Patienten vorgestellt, die das Skippen
von ein oder zwei Exons benötigen. Exon Skipping Methoden
werden zur Zeit aber nur für 7 der ersten 11 Gruppen
mit den häufigsten Mutationen entwickelt. Die restlichen
38% der Patienten, denen ebenfalls mit Exon Skipping
geholfen werden könnte, gehören zu den anderen 123
Patienten-Gruppen, für die derzeit keine Skipping-Medikamente
entwickelt werden. Die große Mehrheit, nämlich
114 Gruppen, enthalten jeweils nur bis zu 1%, die 30
kleinsten Gruppen nur bis zu 0,02% aller Patienten.
Wenn derzeit etwa 400.000 Duchenne-Patienten auf der
gesamten Welt leben, so sind 1% davon 4.000 Patienten
und 0,02% davon sind 80 Patienten. Es bestehen nur sehr
geringen Chancen, dass „ihr“ Exon Skipping-Medikament
bald entwickelt wird!
Dazu zitiere ich aus meinem Interview mit Annemieke
vom letzten Jahr: „Dies ist ein anderes Problem, denn es
gibt weltweit nur sehr wenige Patienten für jede der mehr
als 100 Gruppen an Jungen mit seltenen Mutationen. Es ist
dann sehr schwierig, etwas zu entwickeln. Selbst wenn Sie
klinische Studien durchführen wollen, gibt es so wenige
Patienten, dass das statistisch sehr problematisch wird.
Das Problem besteht darin, dass die meisten Jungen mit
seltenen Mutationen, die eine richtige Diagnose bekommen
haben, in der westlichen Welt leben. Die Mehrheit der
Patienten lebt aber in China und in Indien. Es gibt einige
Regionen in China und Indien, in denen Diagnosen sehr
gut durchgeführt werden und die Patienten auch eine Betreuung
erfahren. Für die große Mehrheit der Patienten
gibt es aber keine richtige Betreuung wie in der westlichen
Welt. Es gibt keine Diagnose, keiner kennt ihre Mutation
und man kennt ihre Krankheit nicht einmal. Ich denke,
dass das das erste Problem ist. Theoretisch könnte es mehr
als 1.000 Patienten in einigen Gruppen mit seltenen Mutation
geben, aber wir kennen sie nicht.“
Es sollte also etwas getan werden, um diese Situation
zu ändern. Ich denke z.B. daran, dass man die internationale
Rotary-Organisation, zu der ich gehöre, fragen könnte,
bei der Suche nach unerkannten Patienten zu helfen. Man
könnte Kinder- und Familienärzten in den Rotary-Clubs
sagen, wie diese Patienten gefunden werden und was vor
allem in den weniger entwickelten Staaten für sie getan
werden könnte.
Krankheit fortgeschritten ist. Dies könnte ihnen helfen,
trotz ihrer Behinderung ein sinnvolles Leben zu führen.
Gertjan sagte: „Ich denke, dass Exon Skipping eine
große Erleichterung für die Jungen sein wird, aber ihr Leben
wird nicht gänzlich ohne Beeinträchtigungen verlaufen.
Und wenn wir von Duchenne-Patienten sprechen, so
verstehen die 10-16-Jährigen unter ihnen schon sehr oft,
was mit ihnen passiert. Sie sehen auch, dass die Ärzte denken,
dass sie alle lediglich länger leben wollen.
Der größte Wunsch ist jedoch, besser zurechtzukom-
23

men“, ihre Muskeln besser bewegen zu können oder z.B.
auch ihre Hände auf den Tisch legen zu können, so dass
sie mit einem Computer schreiben können. Ich habe ältere
Duchenne-Jungen gesehen, die auch unter einer Steroid-
Behandlung zu schwach wurden, um ihre Hände auf den
Tisch legen und die Tastatur eines Computers bedienen zu
können.
Diese Fähigkeit zu verlieren, ist für diese Patienten
wirklich ein großer Verlust. Wenn man dies hinauszögern
könnte, würde das ihnen schon sehr helfen.
Ich weiß, dass es Projekte in technischen Schulen und
Firmen gibt, in denen moderne Hilfsmittel, „Bio-Roboter“,
entwickelt werden, die den Duchenne-Jungen und den jungen
Männern helfen würden, Bewegungen auszuführen,
die sie wegen ihrer Schwäche nicht mehr selbst machen
können.“
Ich habe Annemieke gefragt: „Ist es denn wirklich die
Mühe wert, das Leben von älteren Duchenne-Patienten mit
modernen Betreuungs-Methoden zu verlängern, wenn sie
durch die Krankheit schon sehr beeinträchtigt sind?“
Annemieke antwortete: „Das ist eine gute Frage. Es
gibt nur eine Person, der Sie sie stellen können: den Patienten
selbst. Der Patient muss entscheiden, ob er eine Behandlung
und Betreuung wünscht oder nicht. Aus unserem
Blickwinkel heraus ist die Vorstellung, nur die Finger be-
wegen oder heben zu können oder nur die Augen bewegen
zu können, ein Horrorszenario. Ich kenne jedoch Patienten,
die in dieser Situation sind und die sagen, dass ihr Leben
ihnen sehr viel wert ist, dass sie ihr Leben lieben, dass sie
einen Computer haben, ins Theater, ins Kino oder zu einem
Fußballspiel gehen können und glücklich sind.“
Ich denke, dass es die Entscheidung des Patienten ist,
wenn er glücklich ist und leben will. Wenn er jedoch sagt:
„Ich möchte nicht leben, ich möchte diese Art von Leben
nicht haben“, dann ist das auch seine Entscheidung. Sobald
der Patient erwachsen ist, kann er sich dafür entscheiden,
eine Betreuung nicht weiterzuführen. Die positive Haltung
von Duchenne-Patienten beschämt einen selbst. Wie oft
beklagen wir uns über viele Dinge, wo wir doch laufen
können und alles tun können, was wir wollen. Diese Menschen
können nur so wenig tun und sind trotzdem sehr zufrieden
und glücklich.
Vor 20 oder 30 Jahren gab es keine maschinelle Beatmung
für Duchenne-Patienten. Jetzt gibt es sie und die
Qualität ihres Lebens wurde dadurch erheblich verbessert.
Es ist einfach gut, wenn man genug Luft zum Atmen hat.
Es wurde nicht nur ihr Leben verlängert, sondern auch ihre
Lebensqualität verbessert, und das ist eigentlich noch
wichtiger.“
Eine zukünftige Duchenne-Therapie für Sie oder Ihren Sohn hängt
von Ihrer bzw. Ihres Sohns persönlicher Dystrophin-Mutation ab.
Nachdem Sie diesen Bericht gelesen haben, werden viele
von Ihnen – Familien mit Duchenne-Jungen oder auch Sie,
die älteren Duchenne-Patienten selbst – mir schreiben und
mich bitten, Ihnen persönlich zu erklären, welche Forschung
zu einer möglichen Behandlung für Sie oder Ihren
kranken Sohn führen könnte. Insbesondere werden Sie fragen,
welches Exon oder welche Exons geskippt werden
sollten. Jedes Mal, wenn ich einen neuen Bericht an alle
meine etwa 1.500 Adressen verschickt habe, die auf meinen
deutschen, englischen und spanischen E-Mail-Listen
stehen, erreichen mich Ihre E-Mails in großer Zahl von
überall auf der Welt. Es sind meist die Mütter, die mir oft
verzweifelte Briefe schreiben. Sie benötigen besondere
Aufmerksamkeit und sind manchmal der Beginn einer langen
persönlichen Korrespondenz.
Ich werde Ihnen ziemlich sicher eine ausführliche Antwort
auf Ihre Fragen geben können, wenn Sie mir das Ergebnis
eines Gentests mitteilen, der mir sagt, welche genaue
Mutation im Dystrophin-Gen Ihres Sohnes oder bei
Ihnen selbst gefunden wurde, die möglichst mit der
MLPA-Methode bestimmt wurde. Bitte lassen Sie mich
auch Ihr Alter bzw. das Ihres Sohnes wissen und auch das
Land und in oder in der Nähe welcher größeren Stadt Sie
wohnen. Ich brauche nicht das Geburtsdatum und auch
nicht ihre Adresse. Die E-Mail-Adresse genügt mir, um
Ihnen zu schreiben, wenn etwas für Sie Wichtiges passiert.
Nach meiner Antwort auf Ihren E-Mail-Brief werde ich
Ihre wenigen Daten in meine persönliche Duchenne-Familienliste
aufnehmen. Diese ist nach dem oder den Exons
geordnet, die geskippt werden müssen, oder auch nach
dem Namen einer anderen Therapiemethode, die Ihnen
möglicherweise helfen wird.
Bitte verstehen Sie, dass diese persönliche Liste nichts
mit den offiziellen Duchenne-Datenbanken zu tun hat, die
es in vielen Ländern gibt. Diese sind sehr anspruchsvoll
und enthalten viel mehr persönliche Daten als meine Liste.
Meine Liste enthält nur ein Minimum an Daten, die ich
brauche, um mit Ihnen in Kontakt zu bleiben. Ich erwarte
aber von Ihnen, denen ich antworte, dass Sie sich bzw. Ihren
Sohn in Ihrem nationalen DMD-Register registrieren
lassen! Das deutsche Duchenne-Patientenregister erreichen
Sie unter der Adresse www.treat-nmd.de.
Wenn Sie ein Duchenne-Register in einem anderen
Land finden möchten, gehen Sie auf die Homepage von
TREAT-NMD www.treat-nmd.eu, klicken Sie auf
Ressources und dann auf Global Patient Registries. Auf
der linken Seite klicken Sie dann auf registries: patient
information, danach auf national DMD registries. Dann
müssen Sie das Land suchen und schließlich auf click to
register klicken. Dort werden Sie Hinweise dazu finden,
wie Sie sich bzw. Ihren Sohn registrieren lassen können.
Außerdem gibt es dort sehr viele Informationen über das
jeweilige nationale Register.
Ich möchte noch erwähnen, dass ich einen deutschen
naturwissenschaftlichen Doktortitel von der Universität
Freiburg habe, Dr. rer. nat., ich bin also kein Arzt und darf
deswegen keine medizinischen Ratschläge geben und kann
auch keine gesetzliche Haftung für die Informationen
übernehmen, die ich Ihnen in diesem Bericht oder in meinen
Briefen gebe. Sie sollten daher immer einen Arzt oder
medizinischen Genetiker bitten, meine Informationen zu
überprüfen und zu bestätigen.
24

Andere Wege der Forschung. In n diesem eersten
Teil meines
Berichtes habe ich Ihnen ausführlich die Exon-Skip-
ping-Technik beschrieben und ihre Anwenddung
als Therapie
für Duchenne Muskeldystrophie. Sie wird jedoch nicht
alle Patienten in naher Zukunft helfen können können. Das liegt
daran, dass bei diesen Patienten entweder die Mutation
nicht durch das Skippen eines oder mehrerer Exons rep repariert
werden kann oder dass es sich um eine so seltene MMu-
tation handelt, dass das Skipping-Medikament
Medikament dafür in der
übersehbaren Zukunft nicht entwickelt werden erden kann kann.
Gertjan van Ommen hatte dazu in seinem einem von mir
aufgezeichneten Interview im April 2012 gesagt:
„Es Es werden Therapien entwickelt für Duchenne Duchenne-Patien-
ten unabhängig von ihren Mutationen. Ich erwähne davon
hier nur zwei: Die Verbesserung der Myogenese, genese, des Mus-
kelwachstums, wachstums, durch die Hemmung von Myostatin, oder
der Ersatz von Dystrophin durch die Hochregulierung von
Utrophin.
Fibrose, das Entstehen von Bindegewebe ewebe dort, wo Mus-
kelzellen zellen untergegangen sind, ist auch ein Grund für die
Muskelschwäche. kelschwäche. Wenn man in einem Duchenne Duchenne-Patienten
die Fibrose vermindern könnte, würde seine Krankheit
wahrscheinlich der sehr milden der mdx-Maus Maus ähneln.
Ich denke also, dass mehrere dieser pharmazeutischen
Methoden die Muskelsymptome verbessern werden. Sie
könnten allein oder in Kombination mit Exon Exon-Skipping
angewendet werden.“
Im zweiten Teil dieses Berichtes, der in einigen Mona-
ten fertig sein wird, werde ich diese wichtigsten anderen
Verfahren beschreiben.
Dies ist mein letzter Bericht. Leider muss ich Ihnen mi mitteilen,
dass dies mein letzter Bericht sein wird. Ich bin jetzt
82 Jahre alt und sollte nun wirklich jemanden finden, der
meine Arbeit fortsetzt und Ihnen hnen und vielen anderen DDu-
chenne-Familien Familien in der Welt erklärt, was die Forscher in
vielen Laboratorien auf der Welt tun, , um Therapien und
möglicherweise sogar eine Heilung für Ihre Duchenne
Muskeldystrophie oder die Ihres Sohnes zu entwickeln. Ich
habe versucht, einen Nachfolger zu finden, bisher jedoch
ohne Erfolg.
(1) Li D, Yue Y, Duan D. Marginal level dystrophin eex
pression improves clinical outcome in a strain of dystr dystrophin/utrophin
double knockout mice. PLoS One 2010; 5;
e15286
(2) van Ommen GJ, van Deutekom JT, Aartsma Aartsma-Rus A.
The therapeutic potential of antisense-mediated mediated exon ski skipping.
Curr. Opin. Mol. Ther. 2008; 10; 140--149.
(3) Sarepta Therapeutics Announces Significant Clinical
Benefit With Eteplirsen After 36 Weeks in Phase IIb Study
for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy Dystrophy. News
Release, 24 July 2012.
Die Zukunft meiner Berichte.
Referenzen
Wenn Sie ie also jemanden kennen, der fähig wäre, meine
Berichte in ähnlicher Weise fortzuführen, wie ich es die
vergangenen 12 Jahre getan habe, dann lassen Sie es mich
bitte wissen. Er oder sie sollte die Krankheit Duchenne
und die Duchenne-Forschung Forschung kennen kennen, in Englisch und
vielleicht in ein paar anderen Sprachen schreiben können können,
und die Duchenne-Forscher Forscher persönlich kennenlernen und
mit ihnen sprechen wollen. Außerdem sollte meine Nach-
folgerin rin oder mein Nachfolger viel Zeit haben, dies alles
zu tun und möglichst nicht auf eine Bezahlung ange angewiesen
sein.
Bis jemand anderes meine Berichte fortsetzt fortsetzt, werde ich
wahrscheinlich hin und wieder kurze Berichte schreiben,
wenn etwas Wichtiges passiert. ssiert. Vielleicht werde ich auch
einfach diesen Bericht ab und zu aktualisieren. Auf jeden
Fall werde ich weiterhin alle EE-Mails,
die mich aus der
ganzen Welt mit oft verzweifelten Fragen über diese
schreckliche Krankheit erreichen, so gut ich kann beantworten,
, nicht immer gleich, aber so schnell wie möglich.
Ich bedanke mich bei allen, die mir geholfen haben, diese
Berichte zu schreiben, vor allem Annemieke Aartsma-
Rus und Gertjan van n Ommen von der Universität Lei-
den, Pat Furlong von PPMD PPMD, Kate Bushby von TREAT-
NMD und bei den vielen anderen Wissenschaft
Wissenschaftlern, über
deren Arbeit ich berichtet habe und die sichergestellt hha
ben, dass ich nicht zu viele Fehler gemacht habe.
Auf Wiedersehen an alle!
Dr. rer.nat. Guenter Scheuerbrandt
Im Talgrund 2, 79874 Breitnau
e-mail: gscheuerbrandt@t-online.de online.de,
Internet: www.duchenne-information.eu
information.eu
8. März 2013
(4) Aartsma-Rus Rus A, van Deutekom JCT, van Ommen GJB,
den Dunnen JT. Entries in the Leiden Duchenne muscular
dystrophy mutation database: An overview of mutation
types and paradoxical aradoxical cases that conform the reading readingframe
rule. Muscle & Nerve 2006; 34; 135 135-144.
(5) Aartsma-Rus Rus A, et al. and van Deutekom J, van
Ommen G-J, J, den Dunnen JT. Theoretic applicability of
antisense-mediated mediated exon skipping for Duchenne muscular
dystrophy mutations; Human Mutation 2009; 30; 293 293-299.
25

(6) Van Deutekom JC, et al. and van Ommen GJB. Local
dystrophin restoration with antisense oligonucleotide
PRO051. N Engl J Med 2007; 357; 2677-86. Hoffman, EP.
Skipping toward personalized molecular medicine. N Engl
J Med 2007; 357; 2719-22.
(7) Goemans NM, Tulinius M, et al. and van Deutekom
JC. Systemic administration of PRO051 in Duchenne’s
muscular dystrophy. N Enbg J Med 2011; 364; 1513-22.
(8) Kinali M, Arechavala-Gomeza V, et al. and Bushby K
and Muntoni F. Local restoration of dystrophin expression
with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne
muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled,
dose-escalation, proof-of-concept study. The Lancet Neurology
2009; 8; 918-928.
(9) Cirak S, Arechavala-Gomeza V, et al. and Bushby K,
Muntoni F. Exon skipping and dystrophin restoration in
patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic
phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an
open-label, phase 2, dose escalation study. Lancet 2011;
378; 595-605.
(10) Sarepta Therapeutics announces a continued benefit
on walking test through 62 weeks in phase IIb open-label
extension study of Eteplirsen in Duchenne muscular dystrophy.
News Release, 7 December 2012.
(11) Mendell JR, et al. and Weiss RB. Evidence-based
path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.
Ann Neurol 2012; 71; 304-313.
(12) Scheuerbrandt G, Lundin A, Lövgren T, Mortier W.
Screening for Duchenne muscular dystrophy: An improved
screening test for creatine kinase and its application in an
infant screening program. Muscle & Nerve, 1986; 9;11-23.
(13) Goyenvalle, A, et al. and García L: Rescue of dystrophic
muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping.
Science, 2004, 306, 1796-1799.
(14) Vulin A, et al, and Goyenvalle A, García L: Muscular
function recovery in golden retriever muscular dystrophy
after AAV1-U7 exon skipping, Molecular Therapy, 2012,
20, 2120-2133.
Aus dem Englischen ins Deutsche übersetzt von:
Ralph Scheuerbrandt
Dipl.-Übersetzer für Deutsch, Englisch, Spanisch
Dorfstr. 2, 79874 Breitnau
(15) Goyenvalle A, et al. and García L, Davies K.E.: Rescue
of severely affected dystrophin/utrophin-deficient
mice through scAAV-U7snRNA-mediated exon skipping,
Hum. Mol. Genetics, 2012, 21, 2559-2571.
(16) Goyenvalle A, et al. and Garcia L, Davies KE. “Engineering
multiple U7snRNA constructs to induce single and
multiexon-skipping for Duchenne muscular dystrophy”.
Mol Ther 2012; 20;1212-21.
(17) Béroud C, Matsuo M, et al. Multiexon skipping leading
to an artificial DMD protein lacking amino acids from
exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients
with Duchenne muscular dystrophy. Human Mutation
2007; 28; 196-202.
(18) Van Vliet L, et al. and van Deutekom JCT, van Ommen
G-JB, Aartsma-Rus A. Assessment of the feasibility
of exon 45-55 multiexon skipping for Duchenne muscular
dystrophy. BMC Medical Genetics 2008; 9; 105
(19) Yokota T, Lu QL, Partridge T, Kobayashi M, Nakamura
A, Takeda S, and Hoffman E. Efficacy of systemic
morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.
Annals of Neurology 2009; 65; 667-676.
(20) Wu B, et al., and Lu QL. Octa-guanidine morpholino
restores dystrophin expression in cardiac and skeletal muscles
and ameliorates pathology in dystrophic mdx mice.
Molecular Therapy 2009; 17; 864-71.
(21) Yokota T, et al., and Partridge T, Hoffman EP, Takeda
S. Extensive and prolonged restoration of dystrophin
expression with vivo-morpholino-mediated multiple exon
skipping in dystrophic dogs. Nucleic Acid Ther. 2012;
22;306-15.
(22) Yoshitsugu A, Yokata T, et al. and Hoffman EP, Partridge
T, Takeda S. Bodywide skipping of exons 45-55 in
dystrophic mdx52mice by systemic antisense delivery.
Proc Natl Acad Sci 2012;109;13763-8.
26