Forschungs-Innovationen 95..97 - Ultrasonic Scientific

Forschungs-Innovationen
Ultraschallanalyse
Hochauflæsende Ultraschallspektroskopie
fçr die Analyse von Biokolloiden
Vitaly Buckin*), Evgeny Kuryashov*) und Siobhan Morrissey*),
Cormac Smith**) und Breda O’Driscoll**)
Ultraschallspektroskopie ist
eine zerstörungsfreie analytische
Technik, die auf Messung
der Ultraschallwellenparameter
niedriger Energie, die sich
durch die analysierten Proben
fortpflanzen, beruht. Die analytische
Kraft der Ultraschallwellen
ist in medizinischer
Anwendung bekannt, wo das
Vermögen für Fortpflanzen
durch lichtundurchlässiges
biologisches Gewebe, zum
Sichtbarmachen innerer
Organe eines Patienten, zum
Analysieren des Blutstromes
usw. genutzt wird.
Trotz dieser und anderer erfolgreicher
Anwendungen der Ultraschallwellen in
bestimmten Bereichen der Materialanalyse,
hat die begrenzte Auflösung
der Messungen und komplizierte Reinigung
und Handhabung der Proben die
weitgehende Ausbreitung dieser Technik
in Forschungs- und Analysenlabors
verhindert. Jüngste Fortschritte in modernen
Techniken haben aber zu hoch
auflösenden Spektrometern geführt,
die diese Begrenzungen überwinden,
so dass heute handelsübliche Ultraschallinstrumente
für ein breites Spektrum
analytischer Aufgaben erhältlich
sind. Mit diesen Instrumenten kann
man Probenvolumen von 0,03...20 ml
analysieren und unter verschiedenen
Bedingungen Protokolle bereitstellen.
In dieser Abhandlung beschreiben wir
die Anwendung der hochauflösenden
Ultraschallspektroskopie für die Analyse
von Gelierprozessen und Koagulation
in Milch sowie die Bildung von Mizellen
und Ligand-Proteinbindung.
Vorzüge
Die zerstörungsfreie Analyse der eigentlichen
Materialeigenschaften beinhaltet
Messungen der Signale (Wellen),
die sich durch die analysierte
Probe fortpflanzen. Bis heute hat nur
eine Wellenart im Bereich der Materialanalyse
dominiert, d.h. die elektromagnetische
Welle. Sie prüft die elektromagnetischen
Materialeigenschaften
und wird in optischer sowie in NMR-,
Mikrowellenspektroskopie usw. genutzt.
Ultraschall ist eine Alternativwelle.
Sie ist einer akustischen Welle gleich,
hat aber eine höhere Frequenz (Ton im
akustischen Sinne). In dieser Welle verursacht
oszillierender Druck Oszillation
der Kompressionen, sie ist folglich dem
Wesen nach eine rheologische Welle.
Kompression in der Ultraschallwelle ändert
die Entfernungen zwischen den
Molekülen der Probe, die mit intramolekularen
Repulsionen reagiert. Deswegen
können wir mit Ultraschallspektroskopie
die intramolekularen Kräfte in
der Probe prüfen und somit neue Informationen
über deren Innenraum gewinnen.
Die Amplitude der Verformungen, die
durch die in analytischer Ultraschallspektroskopie
verwendeten Wellen verursacht
werden, ist äußerst klein, deswegen
ist die Ultraschallanalyse zerstörungsfrei.
Da die meisten Materialien
ultraschallwellendurchlässig sind, können
wir mit ihnen viele verschiedene
Proben einschließlich lichtundurchlässige
Materialien analysieren. Ultraschalltechnologie
hat andere Vorteile, u.a.
fehlen große Betätiger wie bei dynamischer
Rheologie, sperrigen Lichtquellen,
anderen optischen Geräten oder kostspieligen
Verbrauchsgütern. Wir können
also solide Vielzweckinstrumente bauen,
die für ein breites Spektrum schneller,
zerstörungsfreier und reeller Analysen
geeignet sind.
Gemessene Parameter
Ultraschallspektroskopie basiert auf der
Messung der 2 unabhängigen Parameter
Ultraschalldämpfung und Ultraschallgeschwindigkeit.
Die Ultraschalldämpfung
wird von Energieverlusten
im Laufe von Kompression und Dekompression
in der Ultraschallwelle bestimmt
und kann in Form von Viskosität
des Mediums oder deren Längsverlustmoduls
ausgedrückt werden. Mit ihr
kann man die Kinetik schneller chemischer
Reaktionen analysieren, Mikrogefüge
der Materialien und Partikelgrößen
bestimmen sowie Anhäufung,
Gelbildung, Kristallisierung und andere
Prozesse charakterisieren.
Die Ultraschallgeschwindigkeit wird
von der Dichte und der elastischen
Reaktion der Probe auf den oszillierenden
Druck der Ultraschallwelle bestimmt
und folglich in Form von Zusammendrückbarkeit
oder Speichermodul
(Längsrichtung) ausgedrückt.
Dieser Parameter ist äußerst empfindlich
gegen die molekulare Organisation,
Zusammensetzung und intramolekularen
Wechselwirkungen im analysierten
Medium und wird bei den
meisten Anwendungen der hochauflösenden
Ultraschallspektroskopie zur
Analyse chemischer Materialeigenschaften
genutzt.
Die breite Anwendung der Ultraschallgeschwindigkeit
verlangt aber
ein äußerst hohes Auflösungsvermögen
der Messungen, und das war früher ein
Problem. Bei dieser Arbeit haben wir
das hoch auflösende Ultraschallspektrometer
HR-US 101 von Ultrasonic
Scientific Ltd. benutzt, das eine 1-ml-
Differentialzelle hat. Das Instrument hat
ein Auflösungsvermögen von 10 -5 % bei
der Ultraschallgeschwindigkeit und
0,2 % bei der Dämpfung. Diese Technik
ist das Ergebnis multinationaler
Forschungs- und Entwicklungsarbeit in
Deutschland (Max-Planck-Institut für
biophysikalische Chemie in Göttingen)
sowie in der UdSSR, in den USA und in
Irland.
__________
*) Department of Chemistry, University College
Dublin, Belfield, Dublin 4, Irland
**) Ultrasonic Scientific Ltd., 1 Richview Office
Park, Clonskeagh, Dublin 14, Irland
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LABO März 2003 S. 95 bcym

Forschungs-Innovationen
Bildung von Mizellen in Surfactantlösungen
Man kann Surfactants, d.h. Moleküle
mit hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften,
in den meisten Kolloidsystemen
finden. Wenn die Konzentration
des gelösten Surfactants ein bestimmtes
Niveau, die so genannte KMK
(kritische Mizellenkonzentration), überschreitet,
dann bilden sich Mizellen.
Direkte Ermittlung dieses Prozesses in
der Lösung und Charakterisierung der
Mizellenstruktur ist keine leichte Aufgabe.
eintritt, ist die KMK, die bei jedem Surfactant
verschieden ist. Die Gesamtänderung
des Konzentrationsinkrementes
der Ultraschallgeschwindigkeit
wird von der Elastizität des hydrophoben
Kerns der Mizelle bestimmt. Anhand
der Kurve kann berechnet werden,
dass die Elastizität (Zusammendrückbarkeit)
des Kerns zu der Länge
des hydrophoben Schwanzes des Surfactants
proportional ist.
Bild 1: Ultraschallüberwachung der Mizellenbildung in wässrigen Lösungen
der Alkyltrimethylammoniumbromide, C n TAB (n = 12, 14 oder 16) bei 25 o C.
Bild 1 zeigt die Ultraschallanalyse
der Mizellenbildung in 3 verschiedenen
Surfactants, die einen positiv geladenen
Kopf und einen hydrophoben
Schwanz (CH 2 ) n-1 CH 3 haben, hier ist
n = 12, 14 oder 16. In diesem Experiment
wurde der Surfactant schrittweise
dem Wasser zugegeben und das
Konzentrationsinkrement der Ultraschallgeschwindigkeit
(Unterschied
zwischen Ultraschallgeschwindigkeit in
Lösung und Wasser geteilt durch die
Konzentration des Surfactants und den
absoluten Wert der Ultraschallgeschwindigkeit)
wurde gemessen. Jeder
Surfactant hat sein eigenes Konzentrationsinkrement
der Ultraschallgeschwindigkeit,
deshalb haben wir nur
die Änderung des Inkrements zum
Vergleich in Bild 1 eingetragen. Das
Bild zeigt, dass das Konzentrationsinkrement
der Ultraschallgeschwindigkeit
bei kleinen Konzentrationen
konstant bleibt, und das demonstriert
also den Mangel an Wechselwirkungen
zwischen den Molekülen des
Surfactants.
Bei einer bestimmten Surfactantkonzentration
nimmt das Inkrement
aber ab und zwar mit gewisser Sättigung
bei hoher Konzentration. Die
Konzentration, bei der die Abweichung
Bild 2: Ultraschalltitrierung für die Bindung von Cytidin-2’-Monophosphat (2’-CMP) an Ribonuclease
A (C RNase A = 0,4 mM) in 50 mM Kaliumacetatpuffer (pH 5,5) bei 30 o C.
Ligand-Proteinbindung
Bild 2 zeigt die Ultraschallanalyse der
Ligand-Polymerbindung, d.h. die Bindung
von Cytidin-2’-Monophosphat
(2’-CMP) an Ribonuclease A (RNase A).
2’-CMP, das mit der natürlichen RNA-
Struktur isomerisch ist, hemmt die
RNase-A-Aktivität. Die Bindungsstelle
für 2’-CMP liegt tief im Spalt des
Enzyms. Eine konzentrierte 2’-CMP-
Lösung wurde schrittweise zu 1 ml der
wässrigen Proteinlösung in der Ultraschallprüfzelle
und zu 1 ml Puffer in der
Ultraschallbezugszelle zugesetzt. Das
Spektrometer HR-US 101 hat den Unterschied
zwischen den Ultraschallparametern
der Proben in der Prüf- und
Bezugszelle gemessen, somit wurde der
2’-CMP-Beitrag subtrahiert. Die eingetragenen
Änderungen der Ultraschallgeschwindigkeit
repräsentieren also
nur die Wechselwirkung zwischen
Ligand und Protein.
Die Bindung von 2’-CMP an das
Enzym führt zuerst zur Abnahme der
Ultraschallgeschwindigkeit, die durch
Freisetzen des Hydrationswassers aus
der koordinierten Schale des Ligands
und den Atomgruppen des Polymers
verursacht wird. Die Zusammendrückbarkeit
von Wasser in den Hydrationsschalen
des Ligands und Polymers ist
kleiner als die des ungebundenen
Wassers, so dass beim Transfer des Hydrationswassers
ins ungebundene
Wasser die Gesamtzusammendrückbarkeit
der Lösung zunimmt und die
Ultraschallgeschwindigkeit abnimmt.
Wenn Liganden alle vorhandenen
Stellen am Polymer besetzt haben,
gleicht sich die Kurve ab. Der Gesamtabfall
der Ultraschallgeschwindigkeit
ist mit der Anzahl der Wassermoleküle
verbunden, die aus der koordinierten
Schale innerhalb der Bindungsstelle
ausgestoßen werden, so dass der
Komplex strukturell charakterisiert werden
kann. Die Bindungskonstanten und
Stöchiometrie können anhand der
Kurvenform berechnet werden.
Kaseinmizellen
in Milchgetränken
Bild 3 zeigt die Anwendung von hochauflösender
Ultraschallspektroskopie für
die Optimierung der Zusammensetzung
von calciumangereicherter Milch.
Calciumangereicherte Milchgetränke
werden heute produziert, weil Verbraucher
einen gesunden Lifestyle verlangen.
Der Zusatz von Calcium ändert
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Sciences
Life
auf Seite 23 im
Innovations -Teil.
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LABO März 2003 S. 96 bcym

Forschungs-Innovationen
einer Auflösung von 0,1 °C gewinnen.
Das große Bild 3 zeigt die Ergebnisse
der Ultraschallmessungen der Auswirkungen,
die verschiedene, zugesetzte
Zutaten/Stabilisatoren auf die Koagulationstemperatur
der Milch haben.
Diese Kurven ermöglichen einfache
Optimierung der calciumangereicherten
Milchgetränke, so dass sie bei
Temperaturen unter dem Siedepunkt
nicht koagulieren.
Gelbildung
in Milch (Jogurt)
Bild 3: Ultraschallanalyse der Koagulation in calciumangereicherter Milch (25 mM Calciumchlorid).
Eingefügtes Bild: Temperaturprofil der Ultraschallgeschwindigkeit und -dämpfung.
Großes Bild: Abhängigkeit der Koagulationstemperatur von der Konzentration der zugesetzten
Stabilisatoren.
das Gleichgewicht der Kolloidwechselwirkungen
in Milch und führt zur
Koagulation während der Wärmebehandlung
oder wenn es heißen Getränken
zugesetzt wird. Koagulation ist
das Ergebnis der Anhäufung der
Kaseinmizellen, die von Calciumionen
überbrückt werden. Die Lösung dieses
Problems verlangt ein analytisches
Instrument, mit dem man den
Koagulationspunkt schnell, genau und
einfach bestimmen kann.
Das eingefügte Bild 3 zeigt die typische
Temperaturabhängigkeit der
Ultraschalldämpfung und Ultraschallgeschwindigkeit
in calciumangereicherter
Milch, die mit einem Temperaturanstieg
gewonnen wurde. Koagulation
wird von einer starken Zunahme in
der Ultraschalldämpfung angezeigt,
die von der Streuung der Ultraschallwellen
und von einer Abnahme der
Ultraschallgeschwindigkeit wegen hoher
Zusammendrückbarkeit der Aggregate
verursacht wird. Mit einem
hohen Auflösungsvermögen bei Messungen
der Ultraschallparameter kann
man die Koagulationstemperatur mit
Bild 4: Überwachung der Gelbildung in bakteriell angesäuerter Milch (Jogurt). Evolution der Ultraschallgeschwindigkeit
und -dämpfung in Magermilch nach Einimpfung eines 2%igen Bakterienzusatzes (Streptococcus
thermophilus und Lactobacillus delbreuckii) bei 43 o C.
Die langsame Ansäuerung von Milch
ändert das Mikrogefüge der Kaseinmizellen
und deren elektrische Ladung.
Sie „kleben” also zusammen
und bilden ein ununterbrochenes Partikelgelnetz.
Die Netzstruktur bestimmt
die Qualität der Produkte wie Jogurt,
Käse usw. Bild 4 zeigt die Ultraschallüberwachung
des Gelierprozesses in
Milch. Um 0 Uhr wurde 1 ml Milch in
die Ultraschallzelle gegossen und Bakterienkultur
zugesetzt. Bakterielle Aktivität
reduziert den pH, das führt zur
Gelbildung, die – wie vom starken
Anstieg der Ultraschalldämpfung angezeigt
– um 1 Uhr beginnt. Die Ultraschallgeschwindigkeit
steigt im Vorgelierstadium
und zeigt eine Änderung
der Milchzusammensetzung wegen
bakterieller Aktivität. Danach steigt die
Ultraschallgeschwindigkeit nochmals
im Gelierstadium. Das Abgleichen der
Ultraschallgeschwindigkeit nach 1,7 h
zeigt einen Abfall der bakteriellen Aktivität.
Wie die Kurven der Ultraschalldämpfung
zeigen, ändert sich die
Gelstruktur bis zu 2,5 h später. In der Zeit
zwischen 1,7 und 2,5 h hängen die
Ultraschallgeschwindigkeitskurven von
der Frequenz ab, das ist ein guter Hinweis
auf die fehlende Homogenität der
Gelstruktur der Probe. Diese Ergebnisse
zeigen die Leistung kombinierter,
hochauflösender Messungen der Geschwindigkeits-
und Dämpfungsparameter,
die die Charakterisierung der
Vorgelierprozesse, der verschiedenen
Stadien der Gelbildung und späteren
Gelbildung ermöglichen sowie die
strukturelle und rheologische Charakterisierung
des Gelnetzes bereitstellen.
Für weitere Informationen kontaktieren
Sie bitte Ultrasonic Scientific Ltd
unter info@ultrasonic-scientific.com oder
unter www.ultrasonic-scientific.com
oder +353 1 218 0600 anrufen.
Auf den in der Ausgabe International Labmate
vom April 2002 veröffentlichten Artikel
gestützt.
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LABO März 2003 S. 97 bcym