Herstellen elektrokompetenter E. coli

Herstellung Elektrokompetenter Zellen
- Animpfen einer 10ml Übernachtkultur mit E.coli BL21 codon plus RIL (Stratagene) in
LB Medium, am nächsten Morgen Messen der Optischen Dichte (OD) bei 600 nm
- Animpfen von 2x 250 ml LB (in 1000 ml EM, vorgewärmt auf 37 o C) mit soviel von der
Übernachtkultur, dass die OD 0.01 beträgt (typischerweise eine 1:200 Verdünnung)
- bei 37 o C im Schüttler wachsen lassen für 5-6 Verdoppelungen, 3-4 h, bis die OD 0.5-1.0
beträgt
- in dieser Zeit alles Material für das weitere Arbeiten vorkühlen, die Waschlösung, die
Zentrifugenflaschen und –röhrchen. Die 1,5 ml Mikrotubes für die fertigen
elektrokompetenten Zellen bei –20 o C einfrieren
- ungefähr eine Stunde bevor die Kulturen soweit sind, die Glycerinlösung in Eis stellen,
das Eis seitlich ein wenig anhäufeln, die Flasche von Zeit zu Zeit schwenken, damit die
Lösung wirklich gut durchgekühlt ist, alle Zentrifugenflaschen und –röhrchen ebenfalls
ins Eis stellen, darauf achten, dass der Rotor ebenfalls 4 o C hat
- wenn die Bakterienkultur die gewünschte OD hat die Kultur im Erlenmeyerkolben auf
Eis stellen und durch Schütteln die Bakterienkultur schockkühlen, erst dann in gekühlte
Zentrifugenbecher überführen
- abzentrifugieren (RC-3B, H6000A, 3000 UpM, 4 o C, 15 min), Überstand abgiessen
- Niederschlag in 250 ml kalter, steriler Glycerinlösung aufnehmen, dazu Pellet erst in
wenig Glycerinlösung durch Auf- und Abpipettieren in 10 ml Glaspipette lösen,
anschliessend restliche Lösung dazugeben
- abzentrifugieren (Parameter wie gehabt), Waschlösung abgießen
- Pellet erneut in 250 ml kalter, steriler Glycerinlösung suspendieren
- abzentrifugieren (Parameter wie gehabt), Waschlösung abgießen
- Bakterienpellet in 20 ml kalter, steriler Glycerinlösung suspendieren, mit kalter Pipette
in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführen

- abzentrifugieren (Parameter wie gehabt), Waschlösung abgießen
- den Niederschlag in 1 ml kalter, steriler Glycerinlösung resuspendieren, es soll eine
schöne, gleichmäßige Suspension entstehen, diese dann in die vorgekühlten Mikrotubes
in 40 µl Portionen aufteilen, in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei –80 o C
aufbewahren
Sterile Lösungen und Gerätschaften:
500 ml Zentrifugenflaschen, 50 ml Zentrifugenröhrchen, 10ml Glaspipetten, 1,5 ml
Micro-tubes,
1000 ml 10% Glycerin in H 2 O
10 ml LB in 100er EM für die Übernachtkultur
2x 250 ml LB in 1000er EM für die Hauptkultur
Bei der Messung der OD sollte bei Werten über 1.0 immer eine Verdünnung gemacht werden
und zwar so lange, bis der Messwert unter 1.0 liegt. Nur in diesem Bereich gilt die lineare
Beziehung zwischen Extinktion und Konzentration. Bei der Berechnung dann den
Verdünnungsfaktor berücksichtigen.