Aus dem Institut für Rechtsmedizin - www.lieske.de
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<strong>Aus</strong> <strong><strong>de</strong>m</strong> <strong>Institut</strong> <strong>für</strong> <strong>Rechtsmedizin</strong><br />
<strong>de</strong>r Medizinischen Fakultät<br />
<strong>de</strong>r Otto-von-Guericke-Universität Mag<strong>de</strong>burg<br />
Kartierung <strong>de</strong>r forensischen Marker in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong><br />
- eine Datenbankanalyse<br />
D i s s e r t a t i o n<br />
zur Erlangung <strong>de</strong>s Doktorgra<strong>de</strong>s<br />
Dr. med.<br />
(doctor medicinae)<br />
an <strong>de</strong>r Medizinischen Fakultät<br />
<strong>de</strong>r Otto-von-Guericke-Universität Mag<strong>de</strong>burg<br />
vorgelegt von Sebastian Lieske aus Mag<strong>de</strong>burg<br />
Mag<strong>de</strong>burg 2004
Meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet<br />
2
3I<br />
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................................... I<br />
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................ II<br />
1 Einleitung ........................................................................................................................... 7<br />
1.1 Polymorphe genetische Marker ……………………………………………………. 9<br />
1.1.2 Blutgruppen, Erythrozyten ................................................................................ 9<br />
1.1.1 Serumpolymorphismen ................................................................................... 10<br />
1.1.2 Erythrozytäre Enzympolymorphismen ............................................................ 11<br />
1.1.3 HLA.................................................................................................................. 12<br />
1.1.4 DNA- Polymorphismen ................................................................................... 13<br />
1.1.4.1 Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) ................................................. 14<br />
1.1.4.2 Short-Insertions/ Deletions Polymorphismen (SIDPs) ................................ 14<br />
1.1.4.3 Repetetive DNA und damit assoziierte Polymorphismen............................ 14<br />
1.1.5 Übersicht zur forensischen DNA-Analyse....................................................... 17<br />
1.1.6 Untersuchung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen ................... 18<br />
1.1.7 Mitochondrien Polymorphismen...................................................................... 22<br />
1.2 Zur Lokalisierung von Genen und molekularen Markern auf <strong>de</strong>n Chromosomen .. 24<br />
1.3 Richtlinien <strong>de</strong>r ISFHG ……………………………………………………………. 26<br />
1.4 Lokalisation von Markern/Kopplung …………………………………………….. 28<br />
1.4.1 Be<strong>de</strong>utung <strong>de</strong>r Kartierung von Markern ......................................................... 28<br />
1.4.2 Radio-Hybrid-Mapping.................................................................................... 29<br />
1.4.3 Contig- Datenbanken ....................................................................................... 31<br />
1.5 Zielstellung ……………………………………………………………………….. 32<br />
2 Material und Metho<strong>de</strong>n ................................................................................................... 33<br />
2.1 Gendatenbanken ………………………………………………………………….. 34<br />
2.1.1 Genome Database: GDB .................................................................................. 34<br />
2.1.2 National Center for Biotechnology Information: NCBI .................................. 35<br />
2.1.3 Center for Medical Genetics: CFMG .............................................................. 35<br />
2.1.4 Cooperative Human Linkage Center: CHLC .................................................. 36<br />
2.2 Medline- Recherche ………………………………………………………………. 36<br />
2.3 Darstellung <strong>de</strong>r Befun<strong>de</strong> ………………………………………………………….. 36<br />
2.4 Erstellung von Retentionsprofilen ausgewählter Marker ………………………… 37<br />
2.4.1 Amplifikation mittels <strong>de</strong>r Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................ 37<br />
2.4.2 PCR-Reaktionsansätze .................................................................................... 37<br />
4
3 Ergebnisse ........................................................................................................................ 41<br />
3.1 Rh-Mapping ………………………………………………………………………. 42<br />
3.1.1 Das Rh-Mapping <strong>de</strong>s Markers D3S1758 ........................................................ 42<br />
3.1.2 Das Rh-Mapping <strong>de</strong>s Markers D7S1517 ......................................................... 44<br />
3.1.3 Das Rh-Mapping <strong>de</strong>s Markers Se33................................................................. 46<br />
3.2 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 1 ……………………………………... 49<br />
3.3 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 2 ……………………………………... 50<br />
3.4 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 3 ……………………………………... 51<br />
3.5 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 4 ……………………………………... 52<br />
3.6 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 5 ……………………………………... 53<br />
3.7 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 6 ……………………………………... 54<br />
3.8 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 7 ……………………………………... 55<br />
3.9 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 8 ……………………………………... 56<br />
3.10 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 9 ……………………………………... 57<br />
3.11 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 10 ……………………………………. 58<br />
3.12 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 11 ……………………………………. 59<br />
3.13 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 12 ……………………………………. 60<br />
3.14 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 13 ……………………………………. 61<br />
3.15 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 14 ……………………………………. 61<br />
3.16 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 15 ……………………………………. 62<br />
3.17 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 16 ……………………………………. 62<br />
3.18 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 17 ……………………………………. 63<br />
3.19 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 18 ……………………………………. 63<br />
3.20 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 19 ……………………………………. 64<br />
3.21 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 20 ……………………………………. 64<br />
3.22 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 21 ……………………………………. 65<br />
3.23 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 22 ……………………………………. 65<br />
4 Diskussion ........................................................................................................................ 66<br />
4.1 Demonstrationsbeispiel …………………………………………………………... 69<br />
4.2 Zusammenfassung und <strong>Aus</strong>sicht ………………………………………………..... 72<br />
5 Literatur ........................................................................................................................... 74<br />
6 Abbildungsverzeichnis..................................................................................................... 89<br />
7 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 91<br />
5
Danksagung ........................................................................................................................... III<br />
Ei<strong>de</strong>sstattliche Erklärungen ................................................................................................... IV<br />
Curriculum Vitae .................................................................................................................... V<br />
Publikationsverzeichnis …….................................................................................................. VI<br />
6
1 EINLEITUNG<br />
7
Die Aufgabe dieser Dissertationsschrift besteht darin, eine Übersicht zur genetischen<br />
Lokalisation <strong>de</strong>r zurzeit bekannten genetischen Marker, die in <strong>de</strong>r forensischen Wissenschaft<br />
genutzt wer<strong>de</strong>n, zu erstellen.<br />
Im Aufgabenspektrum <strong>de</strong>s Faches <strong>Rechtsmedizin</strong> nimmt die Entwicklung und Anwendung<br />
von I<strong>de</strong>ntifizierungsmetho<strong>de</strong>n einen breiten Raum ein. Die Skala <strong>de</strong>r dazu genutzten<br />
Arbeitsgebiete ist breit. Anatomisch-morphologische, anthropologische, radiologische,<br />
odontologische und einige an<strong>de</strong>re Techniken <strong>de</strong>r forensischen Medizin sollen hier nicht<br />
berücksichtigt wer<strong>de</strong>n. Diese Arbeit soll einen Beitrag zum Arbeitsgebiet <strong>de</strong>r I<strong>de</strong>ntifizierung<br />
von Spuren, Personen, Leichen und Leichenteilen durch Analyse von biochemischen,<br />
immunologischen und molekularen Markern leisten. All diesen in Betracht gezogenen<br />
Markern ist ihre genetische Determiniertheit gemeinsam. <strong>Aus</strong> diesem Zusammenhang ergibt<br />
sich, dass die gleichen Marker auch <strong>für</strong> forensische Abstammungsuntersuchungen von<br />
Be<strong>de</strong>utung sind. Molekulare I<strong>de</strong>ntifizierungsstrategien und Abstammungsuntersuchungen<br />
nutzen die gleichen Marker. Diese sind in neuerer Zeit fast ausschließlich DNA-Marker<br />
unterschiedlicher Natur.<br />
Für die Analyse <strong>de</strong>r verschie<strong>de</strong>n gearteten DNA-Polymorphismen steht eine große Anzahl<br />
unterschiedlicher Hilfsmittel und Techniken zur Verfügung. Diese wer<strong>de</strong>n in Tabelle 1 - 1 in<br />
einer Übersicht dargestellt.<br />
Bevor es jedoch zur Etablierung <strong>de</strong>r DNA-Analyse kam, bediente sich die <strong>Rechtsmedizin</strong> <strong>de</strong>r<br />
Untersuchung <strong>de</strong>r so genannten klassischen Marker. Karl Landsteiner beschrieb 1901 („Über<br />
Agglutinationserscheinungen normalen menschlichen Blutes“) <strong>de</strong>n ersten bekannt<br />
gewor<strong>de</strong>nen genetischen Polymorphismus <strong>de</strong>s Menschen, das AB0-Blutgruppensystem.<br />
Infolge<strong>de</strong>ssen kam es zu einer rasanten Entwicklung auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r<br />
Blutgruppenserologie, die zu einer Vielzahl bestimmbarer Blutgruppenmerkmale führte. Bis<br />
zur Einführung <strong>de</strong>r Stärkegelelektrophorese durch Smithies (1955) waren jedoch neben <strong><strong>de</strong>m</strong><br />
AB0-System nur einige wenige, ebenfalls auf <strong>de</strong>n Antigeneigenschaften <strong>de</strong>r<br />
Erythrozytenmembran beruhen<strong>de</strong>, Polymorphismen bekannt. Smithies gelang es nun <strong>de</strong>n<br />
Polymorphismus <strong>de</strong>s Haptoglobins darzustellen. Nachfolgend konnten durch die<br />
Weiterentwicklung elektrophoretischer Trennverfahren zahlreiche Polymorphismen von<br />
Serumproteinen und erythrozytären Enzymen gefun<strong>de</strong>n wer<strong>de</strong>n. Eine herausragen<strong>de</strong> Rolle<br />
erlangte die isoelektrische Fokussierung als Metho<strong>de</strong> <strong>de</strong>r Trennung von Proteinen. Hierdurch<br />
konnten Allele, die zuvor durch die konventionelle Elektrophorese nicht zu unterschei<strong>de</strong>n<br />
waren, in verschie<strong>de</strong>ne Subtypen differenziert wer<strong>de</strong>n. Zunächst wenig informativ<br />
erscheinen<strong>de</strong> Serumproteinpolymorphismen wur<strong>de</strong>n so zu wertvollen Markern.<br />
8
Die Bestimmung von Blutgruppenmerkmalen ist seit vielen Jahren Bestandteil <strong>de</strong>r<br />
Abstammungs- und I<strong>de</strong>ntitätsbegutachtung. Mittlerweile sind zahlreiche Untersuchungen über<br />
die Allelverteilung von Blutgruppensystemen <strong>für</strong> weltweit untersuchte Populationen<br />
zugänglich.<br />
Obwohl die Analyse <strong>de</strong>r klassischen Marker zunehmend durch die DNA-Analyse verdrängt<br />
wird, sind die traditionellen Untersuchungsmetho<strong>de</strong>n auch heute noch im Gebrauch und nicht<br />
be<strong>de</strong>utungslos.<br />
1.1 Polymorphe genetische Marker<br />
1.1.2 Blutgruppen, Erythrozyten<br />
1901 erkannte K. Landsteiner erstmals, dass die Blutseren bestimmter Menschen die<br />
Eigenschaft haben, die Erythrozyten an<strong>de</strong>rer zu agglutinieren. Nach weiterer intensiver<br />
Forschung beschrieb er die Blutgruppen <strong>de</strong>s klassischen AB0-Systems. Da<strong>für</strong> erhielt er 1930<br />
<strong>de</strong>n Nobelpreis.<br />
Bereits 1910 gelang Dungern und Hirszfeld <strong>de</strong>r Nachweis <strong>de</strong>r Erblichkeit <strong>de</strong>r Blutgruppen.<br />
Jedoch wur<strong>de</strong> ihr Erbgang erst im Jahre 1924 durch die 3-Gen-Theorie <strong>de</strong>s Göttinger<br />
Mathematikers Bernstein geklärt. Die Einführung <strong>de</strong>r internationalen Nomenklatur (A, B, AB<br />
und 0) erfolgte 1928. Das bis dahin ent<strong>de</strong>ckte Blutgruppensystem war über 20 Jahre hindurch<br />
als ein einfaches, leicht zu überschauen<strong>de</strong>s System mit multipler Allelie von 3 Allelen<br />
beschrieben wor<strong>de</strong>n. In <strong>de</strong>n folgen<strong>de</strong>n Jahren fand man bei Arbeiten mit Seren von<br />
Menschen, Kaninchen und Affen weitere polymorphe Blutgruppen-Systeme, welche sich gut<br />
<strong>für</strong> rechtsmedizinische Zwecke eigneten. Einen Überblick über die zeitliche Abfolge <strong>de</strong>r<br />
Ent<strong>de</strong>ckungen soll Tabelle 1 - 1 verschaffen (Krause, D. 1999).<br />
Die Blutgruppen spielen in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> schon lange eine wichtige Rolle. Eine<br />
wissenschaftlich begrün<strong>de</strong>te Vaterschaftsfeststellung mit hoher <strong>Aus</strong>sagesicherheit war lange<br />
Zeit Domäne <strong>de</strong>r Blutgruppengutachten. Derzeit wer<strong>de</strong>n die klassischen Systeme <strong>de</strong>r<br />
Serogenetik allerdings zunehmend durch DNA-Techniken ergänzt, bzw. sogar ersetzt. Bis<br />
zum heutigen Zeitpunkt wur<strong>de</strong>n mehr als 600 Erythrozytenantigene gefun<strong>de</strong>n, wobei einige<br />
von ihnen häufig vorkommen, an<strong>de</strong>re jedoch nur sehr selten und nur in einer Familie (Daniels<br />
et al. 1996).<br />
9
1900 Erytrozytäre, durch Antigen-Antikörper-<br />
Jahr<br />
Reaktion nachweisbare Merkmale<br />
A, B, 0<br />
AB 1902<br />
A 1 A 2 1911<br />
2 Allel-Theorie 1924<br />
MN P 1927<br />
RH 1940<br />
CcC W D Ee 1945<br />
Kk Lu 1946<br />
S 1947<br />
Se/se Le a/b 1948<br />
s 1951<br />
Fy(a) Fy (b) 1953<br />
Jk(a) Jk (b) 1953<br />
2000<br />
Erythrozyten- Systeme<br />
Tabelle 1 - 1: Zur zeitlichen Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Blutgruppensysteme<br />
1.1.1 Serumpolymorphismen<br />
Fast fünfzig Jahre waren Abstammungsgutachten Domäne <strong>de</strong>r Blutgruppenmerkmale. Zu<br />
einem be<strong>de</strong>uten<strong><strong>de</strong>m</strong> Durchbruch kam es 1955, als die von Smithies entwickelte<br />
Serumelektrophorese in Stärkegel erstmals die Bestimmung weiterer Serum-Systeme<br />
ermöglichte. Der erste ent<strong>de</strong>ckte Serummarker war das Haptoglobin- (Hp) mit zunächst zwei<br />
Allelen (Hp 1 , HP 2 ), wobei inzwischen 5 häufige, und zahlreiche seltene Allele durch<br />
Subtypisierung mittels isoelektrischer Fokussierung bekannt gewor<strong>de</strong>n sind.<br />
Sukzessive wur<strong>de</strong> ein Duzend polymorpher Serumgruppen- Systeme in die serogenetische<br />
Begutachtung eingeführt, von <strong>de</strong>nen die wichtigsten in Tabelle 1 - 2 dargestellt sind (Krause,<br />
D. 1999).<br />
10
1900 Protein- Systeme Jahr<br />
HP 1955<br />
Gm 1956<br />
Gc (Tf) (1957) 1959<br />
Ag Lp<br />
C3 = Pt 1968/69<br />
Or<br />
Km 1973<br />
C2/4/6/8 Bf Pi<br />
Gc, Tf, Pi (IEF) PLG<br />
2000 Protein- Systeme<br />
Tabelle 1 - 2: Zur zeitlichen Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Proteinsysteme<br />
1.1.2 Erythrozytäre Enzympolymorphismen<br />
Neben <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckung <strong>de</strong>r Serumgruppen hat sich <strong>de</strong>r Nachweis erblicher Enzymsysteme im<br />
Blut als be<strong>de</strong>uten<strong>de</strong> Erweiterung <strong>de</strong>r Untersuchungs- und <strong>Aus</strong>schlussmöglichkeiten in <strong>de</strong>r<br />
forensischen Serologie erwiesen.<br />
Durch Hämolyse <strong>de</strong>r Erythrozyten, zum Teil auch von Lymphozyten, wer<strong>de</strong>n die Enzyme<br />
freigesetzt und können nach elektrophoretischer Auftrennung in einzelne Isoenzyme<br />
entsprechend ihrer Wan<strong>de</strong>rungsgeschwindigkeit typisiert wer<strong>de</strong>n. Den größten Fortschritt in<br />
<strong>de</strong>r Bestimmungstechnik erbrachte die Anwendung <strong>de</strong>r Isoelektrofokussierung (IEF), wobei<br />
die einzelnen Komponenten entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt im Gel zu schmalen<br />
Zonen fokussieren. Häufig angewen<strong>de</strong>te erythrozytäre Enzymsysteme sind in Tabelle 1 - 3 in<br />
<strong>de</strong>r Reihenfolge ihrer Ent<strong>de</strong>ckung aufgelistet (Krause, D. 1999).<br />
11
1900 Erythrozytäre Enzympolymorphismen Jahr<br />
SEP 1963<br />
6 PDG<br />
PGM 1964<br />
ADA, AK<br />
GPT 1971<br />
PGM (IEF) ESD 1973<br />
GLO 1975<br />
2000 Enzym- Systeme<br />
Tabelle 1 - 3: Zur zeitlichen Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Enzymsysteme<br />
1.1.3 HLA<br />
Die Be<strong>de</strong>utung <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckung von Leukozytenantigenen <strong>für</strong> die gesamte Medizin wur<strong>de</strong><br />
durch die Verleihung <strong>de</strong>s Nobelpreises an Dausset gewürdigt, <strong>de</strong>r 1958 das Antigen MAC,<br />
nach neuer Nomenklatur HLA A 2 fand. Mit <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckung von Isoantigenen, die als<br />
sogenannte Transplantationsantigene im Bereich <strong>de</strong>r Histokompatibilitätsgene kodiert<br />
wer<strong>de</strong>n, begann mit <strong>de</strong>r Verwertung <strong>de</strong>r Kenntnisse <strong>de</strong>s HLA- Genkomplexes auch eine neue<br />
Ära <strong>für</strong> die Transplantationsmedizin, weil nunmehr durch Gewebetypisierung die<br />
Verträglichkeit <strong>de</strong>r übertragenen Organe geprüft wer<strong>de</strong>n konnte. Für die forensische Medizin<br />
brachte die Anwendung <strong>de</strong>s HLA-Systems eine ungewöhnliche <strong>Aus</strong>weitung <strong>de</strong>r<br />
<strong>Aus</strong>schlussmöglichkeiten, wie sie zuvor von keinem an<strong>de</strong>ren System auch nur annähernd<br />
erreicht wur<strong>de</strong>. Für Österreich errechnete Mayr bereits 1971 bei alleiniger Anwendung <strong>de</strong>s<br />
HLA-Systems eine <strong>Aus</strong>schlussquote von 80%. Sie liegt heute theoretisch bei 96%.<br />
Einen entwicklungsgeschichtlichen Überblick soll Tabelle 1 - 4 verschaffen (Krause, D.<br />
1999).<br />
12
1900 Das HLA-System Jahr<br />
HLA 1965<br />
HLA A, B, C<br />
D, DR<br />
2000 HLA- System<br />
Tabelle 1 - 4: Zur zeitlichen Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r HLA-Systeme<br />
1.1.4 DNA- Polymorphismen<br />
Die DNA <strong>de</strong>s menschlichen haploi<strong>de</strong>n Chromosomensatzes besteht aus ca. 3 Milliar<strong>de</strong>n<br />
Basenpaaren. Sichtbare und versteckte Unterschie<strong>de</strong> zwischen Menschen erklären sich durch<br />
die Variabilität <strong>de</strong>r DNA sowohl in <strong>de</strong>n kodieren<strong>de</strong>n Bereichen als auch in <strong>de</strong>n genetisch<br />
stummen Polymorphismen. Nur eineiige Zwillinge bil<strong>de</strong>n hier eine <strong>Aus</strong>nahme.<br />
Nur ein Bruchteil (2 - 3%) <strong>de</strong>r chromosomalen DNA codiert <strong>für</strong> Eiweiße und wird in eine<br />
Aminosäurefolge übersetzt. Deshalb sind die meisten Mutationen im Genom<br />
Selektionsneutral und akkumulieren sich im Laufe <strong>de</strong>r Evolution.<br />
Daraus resultieren Struktur- und Längenunterschie<strong>de</strong> zwischen homologen DNA- Sequenzen.<br />
Sie wer<strong>de</strong>n als Polymorphismen bezeichnet, wenn sie mit einer Häufigkeit > 1% in einer<br />
Bevölkerung in Erscheinung treten.<br />
Die Polymorphismen wer<strong>de</strong>n im Allgemeinen nach ihrer DNA Struktur bezeichnet [z.B.<br />
Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs), Variable Number of Tan<strong><strong>de</strong>m</strong> Repeat<br />
13
Polymorphismen (VNTR) usw.]. Teilweise gingen aber auch die Nachweistechniken in die<br />
Namensgebung mit ein, so dass gelegentlich auch ein und <strong>de</strong>rselbe Polymorphismus unter<br />
verschie<strong>de</strong>nen Rubriken geführt wird (z. B. SNP und Restiktions-Längen-Polymorphismus).<br />
Natürlich lassen sich all diese Polymorphismen auch durch Sequenzierung bestimmen, hier<br />
sollen aber nur Techniken aufgeführt wer<strong>de</strong>n, die auf die spezifische Situation abzielen.<br />
Entsprechend ihrer Struktur und Nachweistechnik kann man folgen<strong>de</strong> Systematik aufstellen:<br />
1.1.4.1 Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs)<br />
Hier sind einzelne Nucleoti<strong>de</strong> ausgetauscht. SNPs sind gewöhnlich diallel. Die Allele sind<br />
meist A/G bzw. C/T. Aber auch an<strong>de</strong>re Allelkombinationen sind möglich. Sie wur<strong>de</strong>n<br />
ursprünglich durch Dot- Hypridisierung o<strong>de</strong>r Restriktionstechnik (RFLPs) analysiert.<br />
Neuerdings kommen weitere Techniken wie Real-Time-PCR, Pyrosequenzierung und<br />
Minisequencing hinzu. Als Nachweistechnik <strong>de</strong>r Zukunft entwickelt sich zurzeit die DNA-<br />
Chip-Technologie.<br />
1.1.4.2 Short-Insertions/ Deletions Polymorphismen (SIDPs)<br />
Wie <strong>de</strong>r Name sagt, sind kurze Nucleotidfolgen <strong>de</strong>letiert bzw. insertiert. Die alternativen<br />
Allele sind die Gegensätze „short“ und „long“ (s / l). Zu diesen Polymorphismen gehört <strong>de</strong>r<br />
Amelogenin-Dimorphismus <strong>de</strong>r Gonosomen X und Y.<br />
Er wird durch PCR-Amplifikation und Elektrophorese dargestellt. Es gibt zahlreiche an<strong>de</strong>re<br />
SIDPs auf allen Chromosomen, die aber in <strong>de</strong>r forensischen Medizin bisher nicht etabliert<br />
sind.<br />
1.1.4.3 Repetetive DNA und damit assoziierte Polymorphismen<br />
Das Vorkommen von Sequenzwie<strong>de</strong>rholungen innerhalb <strong>de</strong>r DNA wer<strong>de</strong>n als repetetive<br />
DNA bezeichnet. Sie tragen auch <strong>de</strong>n Namen Satelliten, Minisatelliten und Mikrosatelliten.<br />
Sie bil<strong>de</strong>n einen hohen Anteil in <strong>de</strong>n nicht kodieren<strong>de</strong>n Abschnitten <strong>de</strong>s Genoms. Sie wer<strong>de</strong>n<br />
eingeteilt in verstreut liegen<strong>de</strong> Sequenzwie<strong>de</strong>rholungen (interspersed repeats) und strukturell<br />
hintereinan<strong>de</strong>r geschaltete Wie<strong>de</strong>rholungseinheiten (tan<strong><strong>de</strong>m</strong> repeats). Ihr Vorkommen in <strong>de</strong>r<br />
Struktur <strong>de</strong>r Kern-DNA ist aus <strong>de</strong>r Abbildung 1 (übernommen aus Strachan 1994) ersichtlich.<br />
14
menschliches Genom<br />
3 000 000 kb<br />
20-30% 70-80%<br />
90%<br />
codieren<strong>de</strong><br />
DNA<br />
Gene und genähnliche<br />
Sequenzen<br />
nichtcodieren<strong>de</strong><br />
DNA<br />
Einzelkopie<br />
o<strong>de</strong>r niedrige<br />
Kopienzahl<br />
extragene DNA<br />
70-80% 20-30%<br />
schwach- und<br />
hochrepetitiv<br />
40% 60%<br />
Pseudogene<br />
Introns, Lea<strong>de</strong>r,<br />
Trailer usw.<br />
Verstreut liegen<strong>de</strong><br />
Wie<strong>de</strong>rholungen<br />
gehäuft liegen<strong>de</strong><br />
Sequenzwie<strong>de</strong>rholungen<br />
Genfrag mente<br />
SINEs LINEs klassische<br />
Satelliten- DNA<br />
Mikosatelliten-<br />
DNA<br />
Minisatelliten<br />
DNA<br />
Abbildung 1: Die Organisation <strong>de</strong>s menschlichen Genoms (Nach Strachan, T.)<br />
Tan<strong><strong>de</strong>m</strong>-repetetive DNA-Bereiche wer<strong>de</strong>n als Satelliten-DNA bezeichnet. Diese Bezeichnung<br />
ergibt sich aus ihrer Eigenschaft, charakteristische Ban<strong>de</strong>n in <strong>de</strong>r<br />
Dichtegradientenzentrifugation zu bil<strong>de</strong>n. Satelliten-DNA fin<strong>de</strong>t sich zu einem großen Teil in<br />
<strong>de</strong>n Centromeren <strong>de</strong>r Chromosomen. Entsprechend ihrer Größe unterschei<strong>de</strong>t man<br />
Minisatelliten mit einer Repeatlänge von ca. 9 bis 100 Basenpaaren und Mikrosatelliten mit<br />
kürzeren Repeats (vorwiegend 2-5 bp Repeats). Minisatelliten-Strukturen bezeichnet man<br />
auch als VNTR’s (variable number of tan<strong><strong>de</strong>m</strong> repeats). Mikrosatelliten wer<strong>de</strong>n auch Short<br />
Tan<strong><strong>de</strong>m</strong> Repeats (STR’s) genannt.<br />
Die Entstehung <strong>de</strong>r hochpolymorphen DNA-Bereiche wird durch eine hohe Mutabilität dieser<br />
Bereiche während <strong>de</strong>r Meiose verursacht. Als hauptsächlichen Mechanismus bei <strong>de</strong>r<br />
Herausbildung von VNTR- Polymorphismen gelten ungleiches Crossing over und<br />
Fehlpaarung durch Strangverschiebung (slippage Mutationen) (Krawczak und Schmidtke<br />
1994).<br />
15
Satelliten, Minisatelliten [auch Variable Number of Tan<strong><strong>de</strong>m</strong> Repeat Polymorphismen<br />
(VNTR’s)] und Mikrosatelliten tragen zur <strong>Aus</strong>bildung von Polymorphismen bei, die nach<br />
DNA-Restriktion und Elektrophorese durch Hybridisierung mit Multilocusson<strong>de</strong>n (MLS) und<br />
Singlelocusson<strong>de</strong>n (SLS) nachgewiesen wer<strong>de</strong>n können. Wenn VNTR’s mittels PCR<br />
amplifiziert wer<strong>de</strong>n (z.B. D1S80, ApoB, YNH22 u. a), wer<strong>de</strong>n sie meist zu AmpFLPs.<br />
Mikrosatelliten wer<strong>de</strong>n auch als Short Tan<strong><strong>de</strong>m</strong> Repeats (STRs) bezeichnet. Sie wer<strong>de</strong>n durch<br />
PCR-Amplifikation und anschließen<strong>de</strong>r Elektrophorese analysiert.<br />
Polymorphismen, die auf einer variablen Anzahl von Repeats beruhen sind normalerweise<br />
durch eine multiple Allelie gekennzeichnet. Der Übergang zu <strong>de</strong>n SIDPs ist fließend, weil die<br />
molekulare Grundlage <strong>für</strong> einen SIDPs oft ein einfacher Repeat ist. Danach könnte man die<br />
SIDP-Allele s / l auch nach <strong>de</strong>r üblichen <strong>de</strong>r STR- Nomenklatur 1 / 2 bezeichnen.<br />
16
1.1.5 Übersicht zur forensischen DNA-Analyse<br />
Abstammungsuntersuchungen und I<strong>de</strong>ntitätsnachweise <strong>für</strong> nichti<strong>de</strong>ntifizierte Leichen,<br />
Skelette u.ä., sowie <strong>für</strong> Spuren sind ein wichtiges Aufgabengebiet <strong>für</strong> die <strong>Rechtsmedizin</strong>. In<br />
<strong>de</strong>r Vergangenheit wur<strong>de</strong>n <strong>für</strong> diese Tätigkeiten häufig Blutgruppen- und<br />
Proteinpolymorphismen (soweit möglich) untersucht. Seit etwa 15 Jahren zählt die<br />
Anwendung <strong>de</strong>r DNA-Analyse zu <strong>de</strong>n effektivsten Techniken.<br />
Die unterschiedlichen Polymorphismen wer<strong>de</strong>n mit <strong>de</strong>r Nennung <strong>de</strong>r Darstellungstechnik in<br />
<strong>de</strong>r Tabelle 1 - 5 aufgeführt.<br />
Sotherntechnik zum Nachweis von RFLPs<br />
Botstein et al. 1980<br />
(Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen)<br />
VNTR (variable number of tan<strong><strong>de</strong>m</strong>-repeats)<br />
Nakamura et al. 1987a<br />
Sotherntechnik mit MLS (Multilocusson<strong>de</strong>n) Jeffreys et al. 1985, 1985a<br />
Sotherntechnik mit MLS (Multilocusson<strong>de</strong>n) Schäfer et al. 1988<br />
Sotherntechnik SLS (Singlelocusson<strong>de</strong>n) Wong et al. 1987, Nakamura 1987<br />
PCR (Polymerasekettenreaktion) Saiki et al. 1985, 1988, Mullis et al 1986,<br />
Mullis und Faloona 1987<br />
Amplifikation von Fragmentlängenpolymorphismen<br />
(AmpFLP)<br />
Amplifikation von STR (Short-Tan<strong><strong>de</strong>m</strong>-Repeats,<br />
Mikrosatelliten)<br />
Amplifikation <strong>de</strong>s Amelogenindimorphismus zum:<br />
Geschlechtsnachweis<br />
ApoB: Boerwinkel et l. 1989<br />
D1S80: Nakamura et al. 1988<br />
Weber und May 1989, Edwarts et al. 1991<br />
Nakahori et al 1991<br />
Amplifikation von STRs auf Gonosomen HPRT: Hearne und Todd 1991<br />
Y-Chromosom: <strong>de</strong> Knijff et al. 1997<br />
Multiplex-PCR zur Amplifikation multipler Loci Kimpton et al. 1993<br />
Mitochondriale D-Loop Sequenzierung An<strong>de</strong>rson et al. 1981, Lutz et al. 1998<br />
Sequenzpolymorphismen-Oligotyping Saiki et al. 1989, Herrin et al. 1994<br />
Heteroduplex-Analyse<br />
Wilkin et al. 1993, Szibor et al. 1996a<br />
SSCP-Analyse (single strand conformation<br />
Orita et al. 1989, Lucas et al. 1997<br />
polymorphism)<br />
RAPD-Amplifikation (random amplified polymorphic Williams et al. 1990<br />
DNA)<br />
Genotypisierung von klassischen Blutgruppenmerkmalen<br />
mittels PCR<br />
AB0: Lee und Chang 1992<br />
MN: Nakayashiki und Sasaki 1996<br />
Digitale DNA-Typisierung (MVR) Jeffreys et al. 1990, 1991<br />
SNP(single nucleoti<strong>de</strong> polymorphisms)Analyse mittels<br />
dot-Hybridisierung (und an<strong>de</strong>rer Techniken)<br />
Tabelle 1 - 5: Metho<strong>de</strong>n und Techniken in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong><br />
Chakraborty et al. 1999<br />
Gill et al. 2000<br />
DNA-Chips : Chee et al. 1996<br />
17
1.1.6 Untersuchung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen in <strong>de</strong>r<br />
<strong>Rechtsmedizin</strong><br />
Der Nachweis einzelner Punktmutationen anhand <strong>de</strong>s Verlustes o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r Entstehung von<br />
Restriktionsschnittstellen (Wyman und White I980 [239]) war <strong>für</strong> die rechtsmedizinische<br />
Anwendung nur von untergeordneter Be<strong>de</strong>utung. Mit Hilfe von Restriktionsenzymen können<br />
die aus diesen Mutationen resultieren<strong>de</strong>n Längenpolymorphismen im menschlichen Genom<br />
nachgewiesen wer<strong>de</strong>n.<br />
Der Nachweis <strong>de</strong>r Restriktionsfragmente erfolgt mittels elektrophoretischer Auftrennung<br />
restringierter DNA im Southernverfahren und Son<strong>de</strong>nhybridisierung. Die<br />
Restriktionspolymorphismen können mit Singlelocusson<strong>de</strong>n als so genannte<br />
Restrikionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) <strong>de</strong>tektiert wer<strong>de</strong>n.<br />
Die untersuchten RFLPs sind jedoch häufig mit VNTR (Variable Number of Tan<strong><strong>de</strong>m</strong><br />
Repeats)-Polymorphismen vergesellschaftet. Hierbei han<strong>de</strong>lt es sich ebenfalls um<br />
Längenpolymorphismen. Sie wer<strong>de</strong>n hervorgerufen durch eine Variabilität <strong>de</strong>r Anzahl von<br />
Repeats in Satteliten- bzw. Minisatelliten-DNA. Der Nachweis erfolgt ebenfalls durch die<br />
Hybridisierung von Singlelocusson<strong>de</strong>n auf elektrophoretisch aufgetrennten DNA-<br />
Fragmenten. Als Singlelocusson<strong>de</strong>n fungieren längere DNA-Sequenzen, die man durch<br />
Klonierung o<strong>de</strong>r auch durch PCR gewinnt und die im Genom singulär vorkommen. Sie<br />
<strong>de</strong>tektieren <strong><strong>de</strong>m</strong>zufolge auch nur einen einzigen Locus.<br />
Wenn Oligonucletidsequenzen wie z. B. (CAC) 5 als Son<strong>de</strong>n eingesetzt wer<strong>de</strong>n, so<br />
hybridisieren diese an vielen Loci. Sie wer<strong>de</strong>n <strong>de</strong>shalb Multilocusson<strong>de</strong>n genannt. Sie bil<strong>de</strong>n<br />
bei <strong>de</strong>r Hybridisierung auf einem Southern-Blot ein strichco<strong>de</strong>ähnliches Muster das<br />
personenspezifisch ist. Für solche Muster wur<strong>de</strong> <strong>de</strong>r Begriff „genetischer Fingerabdruck“<br />
eingeführt. In <strong>de</strong>r Entwicklungszeit dieser Techniken wur<strong>de</strong>n von Wong et al. 1987<br />
Multilocusson<strong>de</strong>n eingesetzt, um aus menschlicher DNA locusspezifische Son<strong>de</strong>n (SLS) zu<br />
selektieren. Sie weisen eine höhere Sensitivität auf.<br />
Durch diese <strong>de</strong>finierten Loci waren formalgenetische Überprüfungen und exakte statistische<br />
<strong>Aus</strong>wertungen bei <strong>de</strong>r Anwendung in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> möglich.<br />
MLS- Verfahren wer<strong>de</strong>n in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> nicht mehr eingesetzt, weil die Genetik <strong>de</strong>r<br />
dadurch <strong>de</strong>tektierten Marker unübersichtlich ist.<br />
18
Die Variabilität <strong>de</strong>r Minisatelliten kann auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Wege <strong>de</strong>r Southerntechnik durch Einsatz <strong>de</strong>r<br />
SLS o<strong>de</strong>r durch Amplifikation <strong>de</strong>r AmpFLP untersucht wer<strong>de</strong>n. Bei<strong>de</strong> Verfahren sind sehr<br />
aussagekräftig.<br />
I<strong>de</strong>ntitäts- und Abstammungsuntersuchungen in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> können aus prinzipiellen<br />
Grün<strong>de</strong>n nur <strong>Aus</strong>schlussverfahren sein. Wer<strong>de</strong>n in einem Abstammungsfall keine <strong>Aus</strong>schlusskonstallationen<br />
son<strong>de</strong>rn nur Einschlüsse gefun<strong>de</strong>n, so folgt eine biostatistische Bewertung <strong>de</strong>r<br />
Analysenergebnisse. Dabei wird eine Abstammungswahrscheinlichkeit errechnet. Sie gibt<br />
darüber <strong>Aus</strong>kunft , wie hoch die Wahrscheinlichkeit ist, dass eine bestimmte Konstellation<br />
durch Abstammung bedingt ist (alternativ ausgedrückt, wie hoch die Wahrscheinlichkeit ist,<br />
dass das Ergebnis durch Zufall eingetreten ist). Grundlage <strong>de</strong>r biostatistischen Berechnung<br />
sind populationsgenetische Datenbanken. Diese geben <strong>Aus</strong>kunft darüber, wie häufig die im<br />
Test bestimmten Allele in <strong>de</strong>r Vergleichspopulation vorkommen. Im Spurenfall wird <strong>für</strong> die<br />
Zuordnung eines DNA-Musters zu <strong><strong>de</strong>m</strong> Muster einer Vergleichsperson (z.B. Opfer o<strong>de</strong>r<br />
Tatverdächtiger) ein analoges biostatistisches Verfahren angewandt.<br />
Zur Erstellung von Datenbanken müssen <strong>für</strong> je<strong>de</strong>s DNA-System anhand einer ausreichen<strong>de</strong>n<br />
Stichprobe von Individuen einer ethnisch einheitlichen lokalen Population Allel- und<br />
Genotypenfrequenzen bestimmt wer<strong>de</strong>n. Voraussetzung <strong>für</strong> die Anwendung <strong>de</strong>r ermittelten<br />
Daten ist, dass in Bezug auf die Allelverteilung keine Abweichungen vom<br />
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht vorliegen. Die ermittelten Daten sind daher mit<br />
entsprechen<strong>de</strong>n Testverfahren zu prüfen.<br />
In <strong>de</strong>r Abstammungsbegutachtung ist die Möglichkeit von Keimbahnmutationen zu<br />
berücksichtigen. Bei hochpolymorphen DNA-Systemen ist damit zu rechnen, dass es zum<br />
Auftreten neuer Mutationen kommt. Zur Bestimmung von Mutationsraten sollte eine<br />
möglichst große Zahl von Meiosen untersucht wer<strong>de</strong>n.<br />
Die Einführung <strong>de</strong>r Polymerasekettenreaktion (PCR) als eine Metho<strong>de</strong> zur Vervielfältigung<br />
von ausgewählten DNA-Abschnitten eröffnete eine neue Dimension in <strong>de</strong>r forensischen<br />
DNA-Analyse. RFLP-Systeme konnten mit dieser Technik fortgeführt wer<strong>de</strong>n.<br />
Bei <strong>de</strong>n amplifizierten Fragmentlängenpolymorphismen (AmpFLP) han<strong>de</strong>lt es sich um<br />
VNTR- Systeme mit Repeatgrößen von etwa 10 bis 70 Basenpaaren und Fragmentlängen bis<br />
zu etwa 1200 Basenpaaren.<br />
Mikrosatelliten sind Tan<strong><strong>de</strong>m</strong>- Repeats mit einer Länge von 1 bis 6 Basenpaaren (Tautz 1993)<br />
19
zw. es wird nach Edwards et al. (199I) bei Größen <strong>de</strong>r Repeatelementen von 2 bis 7<br />
Basenpaaren von Short-Tan<strong><strong>de</strong>m</strong>-Repeats (STR) gesprochen. Die Häufigkeit von tri- und<br />
tetrameren Repeatpolymorphismen im Genom wird auf ca. 200000 geschätzt (Puers et al.<br />
1993). Es sind Systeme verschie<strong>de</strong>nster Fragmentlängen und Polymorphiegra<strong>de</strong> etabliert und<br />
weltweit Populationsdaten gesammelt wor<strong>de</strong>n (Huckenbeck et al. 1997).<br />
Die PCR-Technik ermöglichte eine beachtliche Sensitivitätssteigerung. Mussten <strong>für</strong> die aufwendige<br />
Son<strong>de</strong>nhybridisierung mehrere Mikrogramm DNA eingesetzt wer<strong>de</strong>n, so können<br />
mittels PCR und anschließen<strong>de</strong>r Laserfluoreszenz<strong>de</strong>tektion Mengen von weniger als 100<br />
Pikogramm typisiert wer<strong>de</strong>n. Diese DNA-Polymorphismen sind auch <strong>für</strong> archäologische<br />
Fragestellungen interessant gewor<strong>de</strong>n (Pääbo et al. 1989).<br />
Neben <strong>de</strong>r Möglichkeit <strong>de</strong>s Geschlechtsnachweises mittels PCR (Amelogenin-System) fin<strong>de</strong>n<br />
<strong>für</strong> spezielle Fragestellungen zunehmend gonosomale STR-Systeme Anwendung. Multiplex-<br />
Systeme können <strong>de</strong>n Arbeitsaufwand bei DNA-Typisierungen erheblich minimieren.<br />
Die kombinierte Analyse einzelner DNA-Loci und damit die Erstellung eines sogenannten<br />
DNA-Profiles wird aufgrund ihrer hohen <strong>Aus</strong>sagekraft wie<strong>de</strong>r als DNA-Fingerprinting<br />
bezeichnet und hat in mehreren Län<strong>de</strong>rn zum Aufbau von DNA-Datenbanken zur besseren<br />
Verbrechensbekämpfung geführt.<br />
Neben <strong>de</strong>r weit verbreiteten STR-Analyse gibt es noch an<strong>de</strong>re Möglichkeiten DNA-<br />
Polymorphismen <strong>für</strong> forensische Fragestellungen zu nutzen. Sequenzpolymorphismen können<br />
auch über eine Hybridisierung (Dot-Blot) mit allelspezifischen Oligonukleoti<strong>de</strong>n<br />
nachgewiesen wer<strong>de</strong>n. Das ist allerdings in jüngerer Zeit kaum noch üblich. Die<br />
Heteroduplex-Analyse und Einzelstrangkonformationsanalyse (SSCP) ermöglicht ein<br />
Screening von Sequenzvarianten und Punktmutationen. Während die STR-Systeme<br />
weitgehend artspezifisch sind (Crouse und Schumm 1995), kann man mit Hilfe <strong>de</strong>r<br />
RAPD-PCR (Zufallsprimer, arbitrarily primed PCR) unter an<strong>de</strong>rem Artnachweise<br />
durchführen.<br />
Mittels PCR lassen sich auch klassische Blutgruppensysteme typisieren. lm ABO-System ist<br />
damit eine direkte Genotypisierung möglich. Auf DNA-Ebene wur<strong>de</strong> hier eine größere<br />
Variabilität gefun<strong>de</strong>n als bisher mit Hilfe von Antiseren und Agglutinationstechniken<br />
nachweisbar war.<br />
Eine kombinierte Untersuchung hochvariabler Fragmentlängen- und Sequenzpolymorphismen<br />
stellt das digitale DNA-Fingerprinting (MVR-PCR: minisatellite variant repeat mapping) dar.<br />
Die Zukunft liegt möglicherweise in <strong>de</strong>r semiautomatischen Multiplex-Typisierung von SNPs<br />
(Krawczak 1999). Es han<strong>de</strong>lt sich um die häufigste Sequenzvariation im menschlichen<br />
20
Genom, die durchschnittlich aller 1000 Nucleoti<strong>de</strong> auftritt. Damit sind im menschlichen<br />
Genom 10 6 - 10 7 SNPs zu erwarten.<br />
Die Anwendung von DNA-Polymorphismen in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> erfor<strong>de</strong>rt eine gründliche<br />
Validierung <strong>de</strong>r Systeme.<br />
Die Vielzahl polymorpher DNA-Marker im menschlichen Genom erlaubt es, die geeignetsten<br />
auszuwählen. Zu <strong>de</strong>n <strong>Aus</strong>wahlkriterien zählen in erster Linie eine gute methodische<br />
Handhabbarkeit sowie hohe forensische Effizienz. Das heißt, es sollten in <strong><strong>de</strong>m</strong><br />
anzuwen<strong>de</strong>n<strong>de</strong>n System möglichst viele verschie<strong>de</strong>ne Allele mit niedrigen Einzelhäufigkeiten<br />
existieren. Für die Charakterisierung <strong>de</strong>r Polymorphismen wer<strong>de</strong>n u.a. die Heterozygotierate<br />
(Het) bzw. <strong>de</strong>r polymorphic information content (PIC), Diskriminationskraft (power of<br />
discrimination, PD) <strong>für</strong> Individualisierungen in Spurenfällen und die Allgemeine<br />
Vaterschaftsausschlusschance (AVACH bzw. MEC [englischer Begriff]) im<br />
Abstammungsfall angegeben.<br />
Tetranukleotidmarker sind die am häufigsten eingesetzten STR-Marker in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong>.<br />
Sie sind relativ unanfällig <strong>für</strong> das Auftreten von Stotterban<strong>de</strong>n und die Fragmente lassen sich<br />
sicher auftrennen. Zunehmend wer<strong>de</strong>n Polymorphismen angewandt, die Zwischenallele (das<br />
sind unvollständige Repeats) enthalten, und sich nur um 1 bis 2 Basenpaare von <strong>de</strong>n<br />
“regulären" Repeats unterschei<strong>de</strong>n. Sie stellen höhere Anfor<strong>de</strong>rungen an die Analysetechnik<br />
und erfor<strong>de</strong>rn eine gewisse Erfahrung bei <strong>de</strong>r Typisierung. Sequenzvarianten innerhalb von<br />
Fragmenten gleicher Repeatgröße können beson<strong>de</strong>rs unter nicht<strong>de</strong>naturieren<strong>de</strong>n<br />
Elektrophoresebedingungen unterschiedliche Trennverhalten zeigen. Daher müssen die<br />
Polymorphismen auch auf ihre Sequenzstruktur untersucht wer<strong>de</strong>n, um eine internationale<br />
Standardisierung zu ermöglichen. Um <strong>de</strong>n Einsatz verschie<strong>de</strong>ner Primer und damit<br />
unterschiedlich langer Fragmente vergleichbar zu machen, wer<strong>de</strong>n die Allele entsprechend<br />
internationalen Nomenklaturfestlegungen nach ihrer Repeatanzahl bezeichnet.<br />
Wichtige Kriterien <strong>für</strong> <strong>de</strong>n forensischen Einsatz von STR-Systemen sind die Sensitivität und<br />
ihre Effektivität bei <strong>de</strong>r Typisierung <strong>de</strong>gradierter DNA. So können z.B. <strong>für</strong> stark <strong>de</strong>gradierte<br />
DNA aus biologischen Spuren nur noch Systeme mit kurzen Fragmenten (ca. 90 bis 150 bp)<br />
eingesetzt wer<strong>de</strong>n, dabei muss meist ein geringer Polymorphiegrad in Kauf genommen<br />
wer<strong>de</strong>n. Hochpolymorphe STR-Systeme weisen in <strong>de</strong>r Regel auch längere variable Regionen<br />
auf, so dass die PCR-Produkte entsprechend größer sind (ca. 200 bis 350 bp).<br />
21
1900 DNA-Polymorphismen Jahr<br />
Jeffreys MLS<br />
1985 Minisatelliten<br />
SLS: MS43/ 31/ 1 1987<br />
YNH24 1990<br />
PCR <strong>für</strong> VNTRs und STRs STR: TH0 VWA<br />
Amp FLP’s: Apo B<br />
SE33 D21S11<br />
D1S80, YNH22<br />
X- und Y- chromos. Syst.<br />
2000<br />
Tabelle 1 - 6: Zur zeitlichen Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r DNA-Systeme<br />
1.1.7 Mitochondrien Polymorphismen<br />
Das humane Mitochondrien-DNA-Molekül wur<strong>de</strong> erstmalig von An<strong>de</strong>rson et al. 1981<br />
sequenziert und ausführlich charakterisiert. Diese so genannte An<strong>de</strong>rson-Sequenz gilt seither<br />
als Referenzsequenz <strong>für</strong> die Beschreibung von individuellen mt-Sequenzen. In <strong>de</strong>r<br />
forensischen Praxis ist es üblich, nur die Abweichungen zur Referenzsequenz anzugeben.<br />
Diese wird auch als CRS (Cambridge Reference Sequence) bezeichnet. Die<br />
Mitochondrienanalyse konnte sich <strong>für</strong> <strong>de</strong>n rechtsmedizinischen Gebrauch erst mit <strong>de</strong>r<br />
Entwicklung <strong>de</strong>r Direktsequenzierung und <strong>de</strong>r Verbreitung von automatischen Genscannern<br />
etablieren. Erste größere Populationsstudien geben einen Eindruck von <strong>de</strong>r Variabilität von<br />
mtDNA-D-Loop-Sequenzen. Die ausschließlich mütterliche Vererbung gehört zu <strong>de</strong>n<br />
Eigentümlichkeiten <strong>de</strong>r mtDNA. In <strong>de</strong>r forensischen Anwendung bil<strong>de</strong>t sie die Grundlage <strong>für</strong><br />
außeror<strong>de</strong>ntlich effiziente Abstammungsnachweise, die sich in mütterlichen Linien auch über<br />
viele Generationen ausführen lassen. Die im Vergleich zur Kern-DNA höhere Mutationsrate<br />
22
edingt eine "zügige" mitochondriale Evolution. Durch diesen Umstand ist die Brauchbarkeit<br />
<strong>de</strong>r mt-Analyse <strong>für</strong> die Untersuchung von Evolutionsfragen begünstigt. Die humane<br />
mitochondriale DNA ist ringförmig und umfasst 16.569 Basenpaare. Die nicht kodieren<strong>de</strong><br />
Kontrollregion (D-Loop) mit etwa 1.300 Basen enthält drei hypervariable Regionen, in <strong>de</strong>nen<br />
sich in evolutionären Zeiträumen Punktmutationen angesammelt haben. Da sich in je<strong>de</strong>r Zelle<br />
1.000 bis 10.000 Mitochondrien befin<strong>de</strong>n, erhöht sich die Sensivität <strong>de</strong>r DNA-Spurenanalytik<br />
gegenüber <strong>de</strong>n PCR-Systemen <strong>de</strong>r Kern-DNA um eine Zehnerpotenz. Die höhere Stabilität<br />
gegenüber Degradationseinflüssen bedingt die hervorragen<strong>de</strong> Eignung auch bei extrem alten<br />
o<strong>de</strong>r ungünstig gelagerten Spuren und Knochen. Mitochondriale DNA ist neben<br />
STR-Polymorphismen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Y-Chromosom ausgezeichnet <strong>für</strong> evolutionsbiologische<br />
Studien geeignet (Stoneking et al. 1990).<br />
Die bisher umfangreichste Datensammlung mitteleuropäischer mtDNA-Sequenzen ist die "D-<br />
Loop-Base". Sie enthält über 1.700 forensisch sichere Sequenzen, die von 15<br />
Universitätsinstituten Deutschlands, Österreichs und <strong>de</strong>r Schweiz analysiert und autorisiert<br />
wur<strong>de</strong>n. Datenbankrecherchen zur Komplettierung von mtDNA-Spurengutachten wer<strong>de</strong>n auf<br />
Anfor<strong>de</strong>rungen innerhalb von Tagen zur Verfügung gestellt (http://d-Loop-Basen.<strong>de</strong>).<br />
Die Mitochondrienpolymorphismen wer<strong>de</strong>n an dieser Stelle <strong>de</strong>r Vollständigkeit halber<br />
aufgeführt. Sie sind nicht Gegenstand <strong>de</strong>r Kartierung.<br />
23
1.2 Zur Lokalisierung von Genen und molekularen Markern auf <strong>de</strong>n Chromosomen -<br />
Grundlagen <strong>de</strong>r ungekoppelten und gekoppelten Vererbung<br />
Gregor Men<strong>de</strong>l erkannte als erster die Grundprinzipien <strong>de</strong>r Vererbung und formulierte sie als<br />
Postulate in <strong>de</strong>n nach ihm benannten „Men<strong>de</strong>lschen Regeln“. Der Schlüssel zu seinem Erfolg<br />
waren seine Kreuzexperimente an Pflanzen die zwar relativ einfach, jedoch auch mühevoll<br />
waren. Er war <strong>de</strong>r erste, <strong>de</strong>r die Nachkommen eines Kreuzungspaares nach ihren<br />
Eigenschaften gruppierte und quantitativ erfasste. Men<strong>de</strong>l gilt daher nicht nur als Vater <strong>de</strong>r<br />
Genetik, er ist auch <strong>de</strong>rjenige, <strong>de</strong>r <strong>de</strong>n Einzug <strong>de</strong>r Mathematik in die Biologie vorbereitete.<br />
Die materielle Basis <strong>für</strong> die Men<strong>de</strong>lschen Regeln wur<strong>de</strong>n erst durch die Ent<strong>de</strong>ckung <strong>de</strong>r<br />
Chromosomen verständlich.<br />
Abbildung 2: Gregor Johann Men<strong>de</strong>l (1822-1884)<br />
Das experimentelle Vorgehen Men<strong>de</strong>ls diente als Grundlage <strong>für</strong> anspruchsvollere Metho<strong>de</strong>n,<br />
die, die Thomas Hunt Morgan und seine Kollegen entwickelten. Thomas Hunt Morgan<br />
erkannte, dass die Erbanlagen (Gene) offenbar in Form von perlschnurartigen Reihen auf <strong>de</strong>n<br />
Chromosomen angeordnet sind. Morgan beschrieb auch die Mechanismen <strong>de</strong>r gekoppelten<br />
und ungekoppelten Vererbung. Gene, die auf verschie<strong>de</strong>nen Chromosomen lokalisiert sind<br />
wer<strong>de</strong>n ungekoppelt vererbt. Merkmale, die auf <strong><strong>de</strong>m</strong> gleichen Chromosom liegen, wer<strong>de</strong>n<br />
umso häufiger gekoppelt vererbt, je dichter sie benachbart sind. Mit zunehmen<strong>de</strong>r Entfernung,<br />
nimmt die Häufigkeit einer Entkopplung zu. Der Mechanismus <strong>de</strong>r Entkopplung ist das<br />
„Crossing over“. Die Lockerung <strong>de</strong>r Kopplung kann mit zunehmen<strong>de</strong>r bis zur völligen<br />
Entkopplung führen. Diese ist dann erreicht, wenn die gemeinsame Vererbung zweier<br />
Merkmale ebenso häufig vorkommt, wie es nach <strong><strong>de</strong>m</strong> freien Zufall bei ungekoppelten<br />
24
Merkmalen <strong>de</strong>r Fall wäre. Dies geschieht dann in 50% <strong>de</strong>r Meiosen und entspricht<br />
<strong>de</strong>finitionsgemäß <strong><strong>de</strong>m</strong> einer genetischen Distanz von 50 Zentimorgan (cM).<br />
Wer<strong>de</strong>n gekoppelte Loci beispielsweise in 1% <strong>de</strong>r beobachteten Meiosen getrennt, so<br />
entspricht die genetische Entfernung <strong>de</strong>finitionsgemäß 1cM. Die genetische Entfernung<br />
gemessen in cM steht mit <strong>de</strong>r physischen Entfernung gemessen in bps (kb und Mb) in einem<br />
Zusammenhang. Als grobe Faustregel lässt sich angeben, dass die physische Distanz von 1Mb<br />
etwa einem Zentimorgan (cM) entspricht. Allerdings ist die Beziehung nicht streng<br />
proportional und richtet sich auch nach <strong>de</strong>r Lage <strong>de</strong>r Marker auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom.<br />
Morgan erarbeitete Chromosomenkarten, in <strong>de</strong>nen je<strong><strong>de</strong>m</strong> Gen eine spezifische Position<br />
zugeordnet wur<strong>de</strong>. Er erhielt <strong>für</strong> die Aufklärung von genetischer Kopplung und die<br />
Ent<strong>de</strong>ckung <strong>de</strong>s Crossing-overs 1933 <strong>de</strong>n Nobelpreis <strong>für</strong> Medizin.<br />
Abbildung 3: Thomas Hunt Morgan (1866-1945)<br />
25
1.3 Richtlinien <strong>de</strong>r ISFHG<br />
Die Richtlinien <strong>für</strong> die Erstattung von Abstammungsgutachten, herausgegeben vom Robert<br />
Koch-<strong>Institut</strong> (Bun<strong>de</strong>sinstitut <strong>für</strong> Infektionskrankheiten und nicht übertragbare Krankheiten),<br />
wen<strong>de</strong>n sich an <strong>de</strong>n in einem gerichtlichen Verfahren gem. §§ 144, 404 ZPO o<strong>de</strong>r § 73 stopp<br />
beauftragten Sachverständigen und gelten auch <strong>für</strong> an<strong>de</strong>re Abstammungsgutachten in<br />
behördlichem o<strong>de</strong>r privatem Auftrag. Die Richtlinien stellen <strong>für</strong> die bei <strong>de</strong>r<br />
Abstammungsbegutachtung anzuwen<strong>de</strong>n<strong>de</strong>n Untersuchungen Min<strong>de</strong>stanfor<strong>de</strong>rungen auf.<br />
So darf ohne richterlichen Beschluss die Abstammung eines Menschen nur mit seiner<br />
Einwilligung o<strong>de</strong>r bei Geschäftsunfähigkeit <strong>de</strong>r seines Sorgeberechtigten untersucht und<br />
festgestellt wer<strong>de</strong>n. Ebenso muss die I<strong>de</strong>ntität <strong>de</strong>r zu untersuchen<strong>de</strong>n Person ein<strong>de</strong>utig<br />
feststellbar sein.<br />
Das Untersuchungsgut (Blutprobe, Mundschleimhautabstrich) muss durch einen Arzt<br />
entnommen wer<strong>de</strong>n. Eine Blutprobe erlaubt hierbei die maximalen Analysemöglichkeiten.<br />
Hierbei muss auf eine eventuelle Blutübertragung in einem Zeitraum von drei Monaten<br />
geachtet wer<strong>de</strong>n. Bei Neugeborenen sollte eine Altersgrenze von 8 Monaten eingehalten<br />
wer<strong>de</strong>n, insofern Systeme untersucht wer<strong>de</strong>n, die erst nach <strong>de</strong>r Geburt ausreifen.<br />
Auch <strong>für</strong> Probenentnahme und Transport wur<strong>de</strong>n Standarts eingeführt, welche beachtet<br />
wer<strong>de</strong>n müssen. Hierbei stehen <strong>de</strong>r Schutz vor Verunreinigung und die I<strong>de</strong>ntitätssicherung im<br />
Vor<strong>de</strong>rgrund.<br />
Die Untersuchungen wer<strong>de</strong>n in doppelten, getrennt durchzuführen<strong>de</strong>n Testansätzen<br />
durchgeführt und das Mitführen einer bekannten Kontrollprobe ist in allen Ansätzen<br />
vorgeschrieben.<br />
Für die Analytik wer<strong>de</strong>n nur hinreichend evaluierte Systemkategorien benutzt. Dazu zählen<br />
(einzeln o<strong>de</strong>r in Kombination) Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP),<br />
Mikrosatelliten-Polymorphismen (min<strong>de</strong>stens Tetramere) (STR), das HLA-System<br />
und Kombinationen aus: Erythrozyten- Membranantigenen, Serum-Proteinen und<br />
Erythrozyten-Enzymen . Beweiswert und Beweissicherheit haben dabei höchste Priorität.<br />
Dabei ist unerlässlich, dass die eingesetzten analytischen Verfahren eine kombinierte<br />
Allgemeine Vaterschafts- <strong>Aus</strong>schluss-Chance (AVACH) von min<strong>de</strong>stens 99,99 Prozent<br />
erreichen. Die AVACH spiegelt die Effizienz eines Systems wie<strong>de</strong>r.<br />
Negativkriterien sind u.a.: ungünstige Reproduzierbarkeit, hohe Neumutationsraten, hohe<br />
Frequenz stummer Merkmale, Hinweise auf Abweichen <strong>de</strong>s Hardy-Weinberg-<br />
26
Gleichgewichtes, Systeme mit unbekannten chromosomalen Positionen (z.B. DNA-Multi-<br />
Locus-Systeme und Single-Locus-Systeme mit unbekanntem Genort.<br />
Hier ist noch einmal beson<strong>de</strong>rs zu erwähnen, dass nur solche Systeme mit bekannten<br />
chromosomalen Positionen untersucht wer<strong>de</strong>n sollen.<br />
Die Richtlinien empfehlen eine Kombination <strong>de</strong>r konventionellen Blutgruppensysteme mit<br />
HLA- o<strong>de</strong>r DNA-Systemen: Das Gutachten soll min<strong>de</strong>stens zehn Loci mit unabhängigem<br />
Erbgang umfassen. HLA-System o<strong>de</strong>r DNA-Polymorphismen sind im Grundsatz nur in<br />
Verbindung mit (weiteren) herkömmlichen Systemen einsetzbar. Das Standardgutachten<br />
sollte aus einer <strong>Aus</strong>wahl von min<strong>de</strong>stens je zwei Loci aus min<strong>de</strong>stens vier <strong>de</strong>r folgen<strong>de</strong>n<br />
Systemkategorien bestehen:<br />
Erythrozyten-<br />
Serum- Proteinsysteme<br />
Erythrozyten-<br />
HLA-<br />
DNA-Single-Locus-<br />
Membranantigene<br />
Enzymsysteme<br />
System<br />
Polymorphismen<br />
AB0<br />
GC (Group-specific<br />
PGM1 (Phospho-<br />
Serologisch<br />
MNSs<br />
component)<br />
glucomutase-1)<br />
nachweisbare<br />
RH (Rhesus)<br />
PI (Alpha-1-Antitrypsin)<br />
ACP (Acid<br />
Antigene <strong>de</strong>r<br />
JK (Kidd)<br />
F13B (Faktor-13B)<br />
phosphatase)<br />
weissen Blut-<br />
FY (Duffy)<br />
HP (Haptoglobin)<br />
GPT (Glutamat-<br />
körperchen<br />
A2HS (Alpha-2-HS)<br />
Pyruvat-<br />
ORM (Orosomucoid)<br />
Transaminase)<br />
TF (Transferrin)<br />
GLO (Glyoxalase)<br />
PLG (Plasminogen)<br />
ESD (Esterase D)<br />
BF (Properidin-Faktor B)<br />
C3 (3. Komplement-<br />
komponente)<br />
Eine Erweiterung <strong>de</strong>s Gutachtens verstößt nicht gegen die Richtlinien, wenn die<br />
Untersuchung im Einvernehmen mit <strong><strong>de</strong>m</strong> Auftraggeber erfolgt und es sich um Systeme<br />
han<strong>de</strong>lt, die unter Beachtung <strong>de</strong>r in <strong>de</strong>n Richtlinien dargelegten Grundsätze untersucht<br />
wor<strong>de</strong>n sind.<br />
27
1.4 Lokalisation von Markern/Kopplung<br />
Bei <strong>de</strong>r Anwendung autosomaler DNA-Marker in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> wer<strong>de</strong>n in <strong>de</strong>n meisten<br />
Fällen Marker kombiniert, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind und<br />
<strong><strong>de</strong>m</strong>zufolge unabhängig voneinan<strong>de</strong>r segregieren. Für die statistischen Berechnungen ist<br />
somit die Anwendung <strong>de</strong>r Multiplikationsregel statthaft. Sollen jedoch mehrere Marker <strong>de</strong>s<br />
gleichen Chromosoms eingesetzt wer<strong>de</strong>n, so ist eine Klärung <strong>de</strong>r Lokalisation unumgänglich.<br />
Die Richtlinien <strong>für</strong> die Erstattung von Abstammungsgutachten (Robert-Koch-<strong>Institut</strong> 1996)<br />
erfor<strong>de</strong>rn <strong>für</strong> eng gekoppelte Marker die Testung auf Kopplungsungleichgewicht. Erst wenn<br />
bekannt ist, welche Marker innerhalb <strong>de</strong>r Chromosomen so weit voneinan<strong>de</strong>r entfernt sind,<br />
dass keine Kopplung vorliegt und eine unabhängige Vererbung gesichert gilt, können diese<br />
Marker kombiniert angewen<strong>de</strong>t wer<strong>de</strong>n. An<strong>de</strong>rerseits wäre es günstig, ein Set von eng<br />
gekoppelten Markern zu fin<strong>de</strong>n und zu charakterisieren, die in <strong>de</strong>r Meiose in Form von<br />
Haplotypen erhalten bleiben. Ein solches Beispiel ist bereits mit <strong><strong>de</strong>m</strong> Rh-Locus mit <strong>de</strong>n<br />
Allelpaaren Cc/ Dd/ Ee gegeben. Wenn sich solche Konstellationen fän<strong>de</strong>n, bei <strong><strong>de</strong>m</strong> je<strong>de</strong>s<br />
Einzellocus viele Allele hat, ließen sich damit bei entsprechen<strong>de</strong>n Personenkonstellationen<br />
Defizienzfälle über mehrere Generationen aufklären.<br />
1.4.1 Be<strong>de</strong>utung <strong>de</strong>r Kartierung von Markern <strong>für</strong> die Richtigkeit forensischer<br />
<strong>Aus</strong>sagen<br />
Die Be<strong>de</strong>utung möglicher Kopplung zwischen forensischen Markern <strong>für</strong> die Richtigkeit<br />
forensischer <strong>Aus</strong>sagen ist im Prinzip bekannt, wird aber zu häufig nicht beachtet. Befin<strong>de</strong>n<br />
sich genetische Marker im Genom dicht benachbart, so ergibt sich nicht nur die Möglichkeit<br />
<strong>de</strong>r gekoppelten Vererbung son<strong>de</strong>rn in <strong>de</strong>ssen Folge können sich <strong>für</strong> eine gegebene<br />
Population auch Kopplungsungleichgewichte (linkage disequilibrium = LDE) ausgebil<strong>de</strong>t<br />
haben. In diesem Falle bil<strong>de</strong>n manche Allele <strong>de</strong>r gekoppelten Marker vorzugsweise<br />
miteinan<strong>de</strong>r Haplotypenkombinationen, <strong>de</strong>ren Frequenz sich nicht aus <strong>de</strong>n<br />
Einzelallelfrequnzen <strong>de</strong>r involvierten Systeme herleiten lassen. Bei Existenz eines LDE sind<br />
die Allelfreqenzen <strong>de</strong>r beteiligten Systeme keine voneinan<strong>de</strong>r unabhängigen Variablen. Die<br />
Häufigkeit eines im Spurenfall vorgefun<strong>de</strong>nen Genotyps ließe sich dann nicht wie üblich aus<br />
<strong>de</strong>r Allelfrequenz <strong>de</strong>r einzelnen Systeme berechnen. Es gilt das Prinzip, dass <strong>de</strong>r gleichzeitige<br />
Gebrauch von enggekoppelten Markern einen Test auf die Existenz eines möglichen LDE<br />
voraussetzt. Die Spurenkun<strong>de</strong> ist in <strong>de</strong>r Praxis vom Fehlerpotenzial dieser Problematik nur<br />
28
wenig betroffen. In Hinsicht auf die Materialökonomie wer<strong>de</strong>n heute zur Spurenanalyse<br />
ausschließlich amplifizierbare Polymorphismen eingesetzt. Hier sind die Verhältnisse meist<br />
überschaubar. Trotz<strong><strong>de</strong>m</strong> gilt die getroffene <strong>Aus</strong>sage prinzipiell auch <strong>für</strong> die Spurenkun<strong>de</strong>. Die<br />
Systemauswahl sollte immer dann kritisch geprüft wer<strong>de</strong>n, wenn Marker <strong>de</strong>s gleichen<br />
Chromosoms zum Einsatz kommen. Ob sie als Kandidaten <strong>für</strong> die Existenz eines LDE in<br />
Frage kommen, kann schon vorab entschie<strong>de</strong>n wer<strong>de</strong>n, wenn Informationen zur genetischen<br />
Distanz zwischen <strong>de</strong>n Markern eingeholt wer<strong>de</strong>n können.<br />
Im Abstammungstest ist die Notwendigkeit, Kopplung genetischer Marker zu beachten, viel<br />
gravieren<strong>de</strong>r als in <strong>de</strong>r Spurenkun<strong>de</strong>. Die Einbeziehung von Kopplungsgruppen in<br />
Abstammungsgutachten gebietet nicht nur Fragen eines eventuellen LDE zu beachten,<br />
son<strong>de</strong>rn man muss sich bewusst sein, dass Merkmale eines Markerclusters auch vorzugsweise<br />
gemeinsam vererbt wer<strong>de</strong>n. Selbst bei Fehlen eines LDE sind somit die erhaltenen<br />
Informationen nicht als voneinan<strong>de</strong>r unabhängig zu werten. Dieses Problem kann sich in<br />
sogenannten Verwandten- bzw. Defizienszfällen so stark auswirken, dass eine<br />
Nichtbeachtung dieser Zusammenhänge zu groben Fehlern führt. Dieser Sachverhalt wird an<br />
einem Fallbeispiel <strong><strong>de</strong>m</strong>onstriert.<br />
1.4.2 Radio-Hybrid-Mapping<br />
Beim Radio- Hybrid-(RH)-Mapping (Cox et al. 1990) wer<strong>de</strong>n durch radioaktive Strahlung<br />
erzeugte Chromosomenfragmente in Hybridzellen kloniert. <strong>Aus</strong> solchen Hybridzellen wer<strong>de</strong>n<br />
Zelllinien generiert aus <strong>de</strong>nen letztlich ein Set an DNA-Extrakten zusammengestellt wird.<br />
Diese stehen zur Durchführung von PCR-Versuchen mit Primern aus <strong>de</strong>r zu prüfen<strong>de</strong>n DNA-<br />
Sequenz zur Verfügung.<br />
Ein Vergleich <strong>de</strong>r Retentionsmuster verschie<strong>de</strong>ner DNA-Marker erlaubt <strong>Aus</strong>sagen über ihre<br />
physische Kopplung.<br />
29
Abbildung 4: Herstellung von Mensch-Hamster-Hybridzellkulturen<br />
Das Stanford G3 Radiation Hybrid Panel RH01 enthält 83 DNA-Proben von<br />
Hybridzellkulturen Mensch-Hamster. Da<strong>für</strong> wur<strong>de</strong> eine humane diploi<strong>de</strong> Lymphoblastoid-<br />
Donorzelllinie Röntgenstrahlung in einer Dosis von 10000 rad ausgesetzt (Abbildung 1-4).<br />
Die resultieren<strong>de</strong>n DNA-Fragmente weisen eine durchschnittliche Größe von 4 Mb auf. Nach<br />
einer Fusion <strong>de</strong>r humanen Donorzellen mit <strong>de</strong>n Thyminkinase-negativen Hamsterzellen<br />
erfolgt eine HAT-Selektion <strong>de</strong>r Hybridzellen. Die menschlichen DNA-Fragmente können in<br />
<strong>de</strong>n Hybridzellen als separate Minichromosomen vorliegen o<strong>de</strong>r mit <strong>de</strong>n Hamster-<br />
Chromosomen rekombinieren. Der Anteil <strong>de</strong>s menschlichen Genoms, <strong>de</strong>r in <strong>de</strong>n einzelnen<br />
Hybridzellen erhalten bleibt, wird mit 18% angegeben. Mit mehrfachen PCR-Ansätzen<br />
wer<strong>de</strong>n die Hybridzellen auf das Vorhan<strong>de</strong>nsein <strong>de</strong>s zu untersuchen<strong>de</strong>n Markers getestet, man<br />
erhält ein Retentionsprofil. Dieses Retentionsprofil wird mit <strong><strong>de</strong>m</strong> bereits bekannten Marker<br />
durch die Anwendung einer 2-Punkt-LOD-Score-<strong>Aus</strong>wertung verglichen. Zwischen Markern,<br />
die im menschlichen Genom eng beieinan<strong>de</strong>r lokalisiert sind, wer<strong>de</strong>n statistisch seltener<br />
DNA-Brüche beobachtet als in entfernteren.<br />
Die Maßeinheit [cR] ist damit ein Maß <strong>für</strong> die Anzahl <strong>de</strong>r Brüche zwischen zwei Markern.<br />
Die Wahrscheinlichkeit von DNA-Brüchen pro physischer Entfernung (in Basenpaaren)<br />
steigt, wenn die Bestrahlungsdosis erhöht wird. Mit TNG4 ist ein weiteres Panel erhältlich,<br />
das infolge einer Strahlendosis von 50000 rad eine höhere Auflösung ermöglicht.<br />
Mittlerweile wird die Kartierung <strong>de</strong>s menschlichen Genoms mit verschie<strong>de</strong>nen Metho<strong>de</strong>n<br />
durchgeführt, die sich gegenseitig ergänzen. Dies erlaubt die Integration genetischer,<br />
30
physischer und zytogenetischer Karten (Cohen et al. 1993). Eine Basisstrategie wur<strong>de</strong> von<br />
Hudson et al. (1995) beschrieben, <strong>de</strong>r mittels STS-content-Mapping (Green und Green 1991),<br />
RH-Mapping und genetic-linkage-Mapping (Murray et al. 1994) erstellte Karten kombinierte.<br />
<strong>Aus</strong>gehend von großen sich überlappen<strong>de</strong>n Klonen (Olson et al. 1986) wie YACs (yeast<br />
artificial chromosomes, ca. 0,5 bis 1 Mb groß) bzw. BACs (bacterial artificial chromosomes,<br />
ca. 50 kb groß) erfolgt eine so genannte Sequenzetikettierung anhand von im Genom einmalig<br />
vorkommen<strong>de</strong>n Sequenzen (STS = sequence tagged sites) bzw. ESTS = expressed sequence<br />
tagged sites, aus codieren<strong>de</strong>n DNA-Sequenzen, cDNA).<br />
Während RH-Mapping und genetische Kartierung <strong>Aus</strong>sagen zur Kopplung über große<br />
Entfernungen erlauben, können mit Hilfe von STS-Markern kurze Abschnitte charakterisiert<br />
wer<strong>de</strong>n.<br />
1.4.3 Contig- Datenbanken<br />
Im Human Genom Projekt wur<strong>de</strong> bis auf minimale Restbestän<strong>de</strong> das gesamte Humangenom<br />
sequenziert. Die Sequenziertemplates waren große DNA-Fragmente, die meist in Hefen<br />
kloniert wor<strong>de</strong>n waren. Die so hergestellten Fragmente waren überlappend, so dass eine<br />
kontinuierliche Sequenzschreibung gelang. Viele forensische Marker lassen sich in zwischen<br />
direkt in einer Contig- Datenbank auffin<strong>de</strong>n und somit genau lokalisieren. Da die Bank<br />
http://<strong>www</strong>.ensembl.org/Homo_sapiens/ erst nach Abschluss <strong>de</strong>r hier vorgelegten Recherche<br />
ins Netz kam, wur<strong>de</strong>n hier noch 3 Marker mit Hilfe <strong>de</strong>s <strong><strong>de</strong>m</strong> Rh-Mappings zugeordnet.<br />
31
1.5 Zielstellung<br />
Die Entwicklung <strong>de</strong>r DNA-Technologie hat uns eine praktisch unbegrenzte Anzahl von<br />
genetischen Markern beschert, die <strong>für</strong> forensische Fragen angewen<strong>de</strong>t wer<strong>de</strong>n können. Diese<br />
Marker lassen sich verschie<strong>de</strong>nen Kategorien zuordnen: klassische Systeme, HLA-Systeme,<br />
SLS, AmpFLP's, STR's, SNP's und neuerdings SIDP's (Short Insertion Detection<br />
Polymorphisms). In Deutschland wird vielfach da<strong>für</strong> plädiert, bei Abstammungsfragen<br />
Marker aus verschie<strong>de</strong>nen Systemkategorien einzusetzen. Die Zuordnung ist aber weitgehend<br />
willkürlich und in manchen Fällen nur historisch bzw. methodisch bedingt. Zum Beispiel<br />
ließen sich manche klassische Marker ihrer Natur nach auch als SNP's bezeichnen, manche<br />
SLS-Loci können als AmpFL's dargestellt wer<strong>de</strong>n u. manche SIDP's sind eigentlich Zwei-<br />
Allel-STR's. Für forensische Belange sollten ausschließlich Fragen <strong>de</strong>r analytischen<br />
Sicherheit sowie biologische Parameter wie zum Beispiel Mutabilität, Allelverteilung und die<br />
gesicherte Lokalisation als <strong>Aus</strong>wahlkriterien dienen. Die Be<strong>de</strong>utung <strong>de</strong>r genauen Kartierung<br />
<strong>für</strong> die Richtigkeit einer <strong>Aus</strong>sage wird nicht selten unterschätzt. Man kann beobachten, dass in<br />
komplizierten Abstammungsgutachten Marker kombiniert wer<strong>de</strong>n, <strong>de</strong>ren Lokalisation nicht<br />
bzw. nur ungenau bekannt ist. Die Datenbankrecherchen sind aufwändig und führen <strong>für</strong><br />
manche Marker auch nur zu unzureichen<strong>de</strong>n Resultaten.<br />
Diese Arbeit soll eine Übersicht zur Lokalisation <strong>de</strong>r in <strong>de</strong>r forensischen Medizin<br />
angewen<strong>de</strong>ten Marker erstellen und die Basis <strong>für</strong> eine übersichtliche Darstellung (Poster)<br />
bil<strong>de</strong>n. Die meisten Informationen lassen sich durch eine Internetstudie erarbeiten. Dazu<br />
sollen die einschlägigen Gen-Datenbanken benutzt wer<strong>de</strong>n. Für einige Marker ist die genaue<br />
Lokalisation auf diese Weise nicht zu erheben. Deshalb sollte in einigen solchen Fällen ein<br />
Radio- Hybrid- Mapping (RH-Mapping) durchgeführt wer<strong>de</strong>n.<br />
32
33<br />
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Gendatenbanken<br />
Gendatenbanken sind seit <strong><strong>de</strong>m</strong> En<strong>de</strong> <strong>de</strong>r achtziger Jahre über das Internet zugänglich. Sie<br />
wer<strong>de</strong>n seit<strong><strong>de</strong>m</strong> ständig ausgebaut und ergänzt. Durch <strong>de</strong>n schnellen Zugriff und die<br />
vielfältigen Inhalte sind sie eine wertvolle und geschätzte Informationsquelle <strong>für</strong> viele<br />
Wissenschaftler.<br />
Diese Arbeit zeigt die I<strong>de</strong>ogramme <strong>de</strong>r 22 Autosomen, die zytogenetische, physikalische und<br />
genetische Lokalisation <strong>de</strong>r im forensischen Schriftgut genannten Marker. Es berücksichtigt<br />
unabhängig von <strong>de</strong>r Systemkategorie aller Marker, die ab 1990 in <strong>de</strong>n Abstracts von drei<br />
führen<strong>de</strong>n forensischen Journalen und in <strong>de</strong>n Proceedings <strong>de</strong>r ISFH Kongresse genannt sind.<br />
Die Lokalisation wur<strong>de</strong> durch Recherche Datenbanken und in einigen Fällen mit <strong><strong>de</strong>m</strong> RH-<br />
Mapping ausgeführt.<br />
Im folgen<strong>de</strong>n Teil wer<strong>de</strong>n die in dieser Arbeit genutzten Datenbanken aufgeführt.<br />
2.1.1 Genome Database: GDB<br />
(http://<strong>www</strong>.gdb.org)<br />
Eine zentrale Sammelstelle <strong>für</strong> Genomdaten ist die 1990 an <strong>de</strong>r „John Hopkins University“ in<br />
Baltimore gegrün<strong>de</strong>te „Genome Database“. Sie ging aus <strong>de</strong>r „Humane Genome“-Initiative<br />
hervor und wur<strong>de</strong> im Frühjahr 1999 vom „Bioinformatics Supercomputing Centre“ (BiSC)<br />
am „Hospital for Sick Children“ in Toronto, Kanada, übernommen.<br />
Die „Human Genome“-Initiative ist ein weltweites Forschungsprojekt, <strong>de</strong>ssen Ziel es ist, die<br />
Struktur <strong>de</strong>r humanen DNA zu analysieren und die Lokalisationen und Sequenzen von über<br />
100.000 menschlichen Genen zu ermitteln. Dies erfolgt in enger Zusammenarbeit mit <strong><strong>de</strong>m</strong><br />
„Human Genome Project“ (HGP).<br />
Die GDB stellt eine ständig überarbeitete und aktualisierte Enzyklopädie <strong>de</strong>s menschlichen<br />
Genoms zur Verfügung, um so <strong>de</strong>n gegenwärtigen Wissensstand zu reflektieren. Das<br />
Spektrum wird ständig erweitert und ergänzt. Heute enthält die Datenbank Informationen über<br />
Sequenzen, Variationen, Beschreibungen von Variationen und Phenotypen.<br />
Für je<strong>de</strong>n ist eine Veröffentlichung von Daten möglich. Weiterhin kann man Än<strong>de</strong>rungen zu<br />
bereits bekannten Daten hinzufügen o<strong>de</strong>r „Links“ zu an<strong>de</strong>ren Datenbanken herstellen.<br />
Zur Zeit enthält die GDB Beschreibungen zu folgen<strong>de</strong>n Objekten: „Regions of the human<br />
genom“ (Gene, Klone, Amplimere, PCR Marker, zytogenetische Marker, ESTs und Repeats),<br />
„Maps of the human genome“ (zytogenetische Lokalisationen, physikalische Kartierungen,<br />
34
„Linkage Maps“, „Radiation Hybrid Maps“, „Contig Maps“) und „Variations within the<br />
human genome“ (Mutationen, Polymorphismen, Allelfrequenzen).<br />
2.1.2 National Center for Biotechnology Information: NCBI<br />
(http://<strong>www</strong>.ncbi.nlm.nih.gov)<br />
Gegrün<strong>de</strong>t wur<strong>de</strong> diese Datenbank 1988 von Clau<strong>de</strong> Pepper als ein Teil <strong>de</strong>r “National Library<br />
of Medicine” (NLM) am “National <strong>Institut</strong>e of Health” (NIH). Ziel war die Entwicklung einer<br />
neuen Informationstechnologie und die Hilfestellung beim Verständnis von<br />
molekulargenetischen Prozessen. Dazu stehen verschie<strong>de</strong>ne Datenbanken und Software zur<br />
Verfügung. Ein Informationsaustausch besteht mit internationalen Sequenzdatenbänken wie:<br />
„European Molecular Biologie Laboratory“ (EMBL) und <strong>de</strong>r „DNA Database of Japan“<br />
(DDBJ). Weiterhin unterstützt und verteilt die NCBI wissenschaftliche Informationen von<br />
medizinischen und wissenschaftlichen Organisationen, z.B. die „Online Men<strong>de</strong>lian<br />
Inheritance in Man“ (OMIM), die „Molecular Mo<strong>de</strong>ling Database“ (MMDB), die „Unique<br />
Human Gene Sequence Collection“ (UniGene), die „Gen Map of the Human Genome“, <strong>de</strong>n<br />
„Taxonomy Browser“ und das „Cancer Genome Project“ (CGAP). „Entrez“ ist das NCBI-<br />
Suchsystem, das <strong><strong>de</strong>m</strong> Benutzer Zugang zu Sequenzen, Taxonomie, Karten und Strukturdaten<br />
verschafft und welches auch Grafiken zu Sequenzen und Chromosomenmappen enthält.<br />
Eine weltweite Literatursuche ist mit „PubMed“ möglich.<br />
2.1.3 Center for Medical Genetics: CFMG<br />
(http://<strong>www</strong>.marshfieldclinic.org/)<br />
Als ein Teil <strong>de</strong>r privaten „Marshfield Medical Research Foundation“ wur<strong>de</strong> 1994 das „Center<br />
for Medical Genetics“ gegrün<strong>de</strong>t, <strong>de</strong>ssen Forschungsschwerpunkte die Suche nach<br />
krankheitsverursachen<strong>de</strong>n Genen ist. Ihr Angebot umfasst eine Datenbank mit über 8.000<br />
STR- Loci. Eine wichtige Möglichkeit innerhalb dieser Datenbank stellt die „build your own<br />
map“-Funktion dar, wodurch man in <strong>de</strong>r Lage ist bereits kartierte Marker abzurufen.<br />
35
2.1.4 Cooperative Human Linkage Center: CHLC<br />
(http://<strong>www</strong>.chlc.org)<br />
CHLC ist ein staatlich unterstütztes Genom-Zentrum unter <strong>de</strong>r Leitung von Jeffrey C.<br />
Murray. Es wur<strong>de</strong> eine Vielzahl von heterozygoten Genkarten entwickelt, die zahlreiche<br />
PCR-formatierte Mikrosatellitenmarker enthalten.<br />
Die Betonung liegt auf <strong>de</strong>r Einbeziehung von Tri- und Tetranukleotidrepeats in<br />
Genotypdaten.<br />
2.2 Medline- Recherche<br />
Die Übersicht berücksichtigt im wesentlichen Marker, die ab <strong><strong>de</strong>m</strong> Jahre 1990 in <strong>de</strong>n Abstracts<br />
<strong>de</strong>r Journale Int J Legal Med , J Forensic Sci und Forensic Sci Int und in <strong>de</strong>n Proceedings <strong>de</strong>r<br />
ISFG (vormals ISFH) genannt sind und mit <strong><strong>de</strong>m</strong> Medline-Suchsystem aufgefun<strong>de</strong>n wer<strong>de</strong>n<br />
konnten. Die Daten zur Kartierung wur<strong>de</strong>n hauptsächlich <strong>de</strong>n Datenbanken entnommen, die<br />
ohne Zugangsbeschränkungen über das World Wi<strong>de</strong> Web zugänglich sind. Diese sind<br />
untereinan<strong>de</strong>r „verlinkt“ und integrieren wie<strong>de</strong>rum Daten verschie<strong>de</strong>ner <strong>Institut</strong>e wie<br />
Genethon, Sanger Centre, Stanford usw. Allen Gendatenbanken ist lei<strong>de</strong>r gemeinsam, dass sie<br />
nicht alle gewünschten Marker enthalten.<br />
2.3 Darstellung <strong>de</strong>r Befun<strong>de</strong><br />
Die hier wie<strong>de</strong>rgegebene Übersicht zur Kartierung forensischer Marker ist eine<br />
Zusammenstellung von Daten und Darstellungen aus <strong>de</strong>n im World Wi<strong>de</strong> Web verbun<strong>de</strong>nen<br />
Datenbanken sowie <strong>de</strong>n wissenschaftlichen Printmedien und enthält nur in wenigen Fällen<br />
eigene Untersuchungsergebnisse. Die Gesamtlänge <strong>de</strong>r einzelnen Chromosomen ist in <strong>de</strong>n<br />
I<strong>de</strong>ogrammen jeweils unter <strong><strong>de</strong>m</strong> q-Telomer eingetragen. Die senkrecht eingetragenen Linien<br />
geben <strong>de</strong>n Bereich <strong>de</strong>r zytogenetischen Kartierungen von NCBI und GDB wie<strong>de</strong>r. Die in <strong>de</strong>n<br />
I<strong>de</strong>ogrammen angegebenen genetischen Lokalisationen in Cosambi cM beziffern <strong>für</strong> die<br />
genannten Marker die Distanz zum p-Telomer. Häufig wird in Datenbanken nur ein<br />
Referenzintervall angegeben. Dieses beschreibt die Lage <strong>de</strong>s Markers im Bereich zwischen<br />
zwei Ankermarkern. Das Referenzintervall lässt sich dann durch Angaben in <strong>de</strong>rselben, ggf.<br />
auch einer an<strong>de</strong>ren Datenbank beziffern. Die Herkunft <strong>de</strong>r Information von einer an<strong>de</strong>ren<br />
Datenbank wird durch ein Buchstabensymbol in Klammern angezeigt. Lagebezeichnungen<br />
aus verschie<strong>de</strong>nen Datenbanken sind meist nicht ganz i<strong>de</strong>ntisch, gelegentlich sogar durch<br />
36
größere Differenzen gekennzeichnet. Die Tatsache, dass die Crossing-over-Raten in<br />
männlichen und weiblichen Meiosen differieren, wird in <strong>de</strong>r Marshfield Datenbank<br />
angegeben. Marshfield präsentiert auch Diagramme, die <strong>de</strong>n Quotient <strong>de</strong>r genetischen Lage<br />
weiblich/männlich angeben. Diese Darstellung wur<strong>de</strong> als Abbildung 8 in diese Übersicht<br />
übernommen, um das Verständnis <strong>de</strong>r hier zusammengetragenen Daten zu erleichtern.<br />
2.4 Erstellung von Retentionsprofilen ausgewählter Marker<br />
2.4.1 Amplifikation mittels <strong>de</strong>r Polymerase-Kettenreaktion (PCR)<br />
Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ist eine Metho<strong>de</strong> zur selektiven in- vitro-<br />
Amplifikation ausgewählter DNA-Abschnitte. Oligonucleotid-Primer lagern sich unter<br />
stringenten Bedingungen an geschmolzene DNA und wer<strong>de</strong>n von einer DNA-Polymerase als<br />
Starter zur Synthese eines neuen Stranges verwen<strong>de</strong>t. Grundvoraussetzung <strong>für</strong> eine<br />
erfolgreiche PCR ist die Spezifität <strong>de</strong>r Primer, eine optimale Konzentration Nucleoti<strong>de</strong> und<br />
eine die Optimierung <strong>de</strong>s Reaktionspuffers. Die optimale Konzentration <strong>de</strong>r Magnesiumionen<br />
ist von beson<strong>de</strong>rer Be<strong>de</strong>utung. Da <strong>de</strong>r Vorgang <strong>de</strong>r DNA-Verdoppelung zyklisch wie<strong>de</strong>rholt<br />
wird, kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung <strong>de</strong>s gewünschten DNA-Abschnittes<br />
(Mullis und Faloona, 1987). Für die Amplifikation <strong>de</strong>r etablierten forensischen Marker stehen<br />
Standardprotokolle zur Verfügung. Eine große Anzahl von STR-Systemen können auch in so<br />
genannten Multiplex-Ansätzen amplifiziert wer<strong>de</strong>n. Dabei wer<strong>de</strong>n mehrere Loci parallel in<br />
einem Ansatz amplifiziert. Die Industrie bietet heute Test-Kits im Han<strong>de</strong>l an, die bis zu 16<br />
Loci kombinieren (z.B. Powerplex 16 <strong>de</strong>r Firma Promega).<br />
Wenn die PCR im Zuge <strong>de</strong>s Rh-Mappings verwen<strong>de</strong>t wird, kommt jeweils nur ein Primerpaar<br />
<strong>für</strong> <strong>de</strong>n zu untersuchen<strong>de</strong>n Genort zum Einsatz (single-PCR set- up).<br />
Wegen einer unklaren Datenlage zur Lokalisierung wur<strong>de</strong>n die folgen<strong>de</strong>n drei STRs <strong><strong>de</strong>m</strong> RHmapping<br />
Prozess unterworfen:<br />
SE33 (Synonyme: ACTBP2, ACTBP8), D3S1358 und D7S1517.<br />
2.4.2 PCR-Reaktionsansätze<br />
Für je<strong>de</strong>n getesteten Locus wur<strong>de</strong>n die 83 DNA Proben <strong>de</strong>s Rh-Panels als Templates in die<br />
PCR-Ansätze aufgenommen. Zusätzlich wur<strong>de</strong> drei Kontrollen (2x Aqua <strong>de</strong>st. als<br />
Kontaminationskontrollen und eine Positiv-Kontrolle) mitgeführt. Das Ergebnis wur<strong>de</strong> als<br />
37
eine Kombination aus 83 Zeichen aufgeführt. Dabei stand „1“ <strong>für</strong> einen Amplifikationserfolg,<br />
„0“ <strong>für</strong> keinen Amplifikationserfolg. Wenn Ban<strong>de</strong>n an <strong>de</strong>r erwarteten Stelle im Gel sehr<br />
schwach ausfielen, wur<strong>de</strong> anstatt <strong>de</strong>r „1“ bzw <strong>de</strong>r „0“ ein „R“ eingegeben. Kein<br />
Amplifikationserfolg be<strong>de</strong>utet, dass die DNA-Probe kein Amplifikations-Template enthielt.<br />
Um methodisch bedingte Zufallsausfälle zu erkennen wur<strong>de</strong>n <strong>für</strong> je<strong>de</strong>n Locus 3 Versuche mit<br />
<strong><strong>de</strong>m</strong> gesamten DNA-Panel ausgeführt. Nach<strong><strong>de</strong>m</strong> ein reproduzierbares Ergebnis erreicht<br />
wor<strong>de</strong>n war, wur<strong>de</strong> das Muster per E-Mail an <strong>de</strong>n RH-Server <strong>de</strong>s Stanford Human Genome<br />
Center eingesandt. Als Ergebnis erhält man nach kurzer Zeit einen Bericht, <strong>de</strong>r über die<br />
Kopplung zu bekannten (bereits kartierten) Markern <strong>Aus</strong>kunft erteilt. Man kann nun <strong>de</strong>n noch<br />
nicht kartieren Marker in einen Bereich (Bin) einordnen, von <strong><strong>de</strong>m</strong> die Lokalisation bekannt<br />
ist.<br />
D3S1358<br />
Der PCR-Prozess folgte <strong>de</strong>n Empfehlungen von Li et al. (1994).<br />
Der Gesamtansatz umfasste 25 µl. Die Endkonzentrationen im Test betrugen:<br />
Ca. 10 ng DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 9.0), 200µM dNTPs, 1,5 mM MgCl 2 ,<br />
0,25 µM je<strong>de</strong>s Primers, 0,6 U Taq- Polymerase (Goldstar, Eurogentec).<br />
Die Primersequenzen sind: 5‘ ACTGCAGTCCCAATCTGGGT-3‘<br />
5‘ ATGAAATCAACAGAGGCTTG-3‘<br />
Temperatur Zeit<br />
1. Initiale Denaturierung 94 o C 5 min<br />
2. Denaturierung 94 o C 50 s<br />
3. Annealing 58 o C 60 s 34x Amplifikationszyklen<br />
4. Extension 72 o C 60 s<br />
5. Finale Extension 72 o C 5 min<br />
Tabelle 2 - 1: PCR-Bedingungen <strong>für</strong> D3S1358<br />
Die amplifizierten DNA Fragmente wur<strong>de</strong>n in 0.7 mm dicken nativen horizontalen<br />
Elektrophoresegelen nach Möller et al. (1994) getrennt.<br />
Die Polyacrylamid-Gele (7.5%T, 3% C) enthielten Piperazinediacrylami<strong>de</strong> als Crosslinker<br />
a 28 mM, CHES (Cyclohexylaminomethane sulfonic acid) und 81 mM Formate (pH 9.0). Die<br />
Ban<strong>de</strong>n wur<strong>de</strong>n durch Silberfärbung visualisiert (nach Budowle et al 1991).<br />
38
Das erhaltene Retentionsmuster wur<strong>de</strong> als eine Symbolfolge aus 0, 1 und R ausgedrückt und<br />
zum RH Server eingesandt.<br />
D7S1517<br />
Der Gesamtansatz umfasste 25 µl. Die Endkonzentrationen im Test betrugen:<br />
Ca. 5 ng DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 9.0), 200µM dNTPs, 1,5 mM MgCl 2 , 0,25<br />
µM je<strong>de</strong>s Primers, 1 U Taq- Polymerase (Goldstar, Eurogentec).<br />
Die Primersequenzen sind: 5’- GTGACCAACTGAATTATGTTTTG - 3’<br />
5’- CATCTTGCCAGCTGCCT - 3’.<br />
Temperatur Zeit<br />
1. Initiale Denaturierung 94 o C 3 min<br />
2. Denaturierung 94 o C 30 s<br />
3. Annealing 51 o C 30 s 28x Amplifikationszyklen<br />
4. Extension 72 o C 75 s<br />
5. Finale Extension 72 o C 6 min<br />
Tabelle 2 - 2: PCR-Bedingungen <strong>für</strong> D7S1517<br />
Die amplifizierten DNA Fragmente wur<strong>de</strong>n in 0.7 mm dicken nativen horizontalen<br />
Elektrophoresegelen nach Möller et al. (1994) getrennt.<br />
Die Polyacrylamid-Gele (7.5%T, 3% C) enthielten Piperazinediacrylami<strong>de</strong> als Crosslinker<br />
a 28 mM, CHES (Cyclohexylaminomethane sulfonic acid) und 81 mM Formate (pH 9.0). Die<br />
Ban<strong>de</strong>n wur<strong>de</strong>n durch Silberfärbung visualisiert (nach Budowle et al 1991).<br />
Das erhaltene Retentionsmuster wur<strong>de</strong> als eine Symbolfolge aus 0, 1 und R ausgedrückt und<br />
zum RH Server eingesandt.<br />
SE33 (ACTBP2)<br />
Der PCR-Prozess folgte <strong>de</strong>n Empfehlungen von Polymeropoulos et al. (1992).<br />
Der Gesamtansatz umfasste 25 µl. Die Endkonzentrationen im Test betrugen:<br />
Ca. 5 ng DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 9.0), 200µM dNTPs, 1,5 mM MgCl 2 , 0,25<br />
µM je<strong>de</strong>s Primers, 1 U Taq- Polymerase (Goldstar, Eurogentec).<br />
Die Primersequenzen sind: 5'-AATCTGGGCGACAAGAGTGA-3'<br />
5'-ACATCTCCCCTACCGCTATA-3'<br />
39
Temperatur Zeit<br />
1. Initiale Denaturierung 94 o C 3 min<br />
2. Denaturierung 94 o C 30 s<br />
3. Annealing 58 o C 30 s 28x Amplifikationszyklen<br />
4. Extension 72 o C 75 s<br />
5. Finale Extension 72 o C 6 min<br />
Tabelle 2 - 3: PCR-Bedingungen <strong>für</strong> SE33 (ACTBP2)<br />
Die amplifizierten DNA Fragmente wur<strong>de</strong>n in 0.7 mm dicken nativen horizontalen<br />
Elektrophoresegelen nach Möller et al. (1994) getrennt.<br />
Die Polyacrylamid-Gele (7.5%T, 3% C) enthielten Piperazinediacrylami<strong>de</strong> als Crosslinker<br />
a 28 mM, CHES (Cyclohexylaminomethane sulfonic acid) und 81 mM Formate (pH 9.0). Die<br />
Ban<strong>de</strong>n wur<strong>de</strong>n durch Silberfärbung visualisiert (nach Budowle et al 1991).<br />
Das erhaltene Retentionsmuster wur<strong>de</strong> als eine Symbolfolge aus 0, 1 und R ausgedrückt und<br />
zum RH Server eingesandt.<br />
40
41<br />
3 ERGEBNISSE
3.1 Rh-Mapping<br />
3.1.1 Das Rh-Mapping <strong>de</strong>s Markers D3S1758<br />
Die dreimalige <strong>Aus</strong>führung <strong>de</strong>r PCR unter <strong>de</strong>n angegebenen Bedingungen ergab das folgen<strong>de</strong><br />
Retentionsmuster. Dieses Muster wur<strong>de</strong> an <strong>de</strong>n SHGC-Rh-Server eingesandt:<br />
Vector:000001000000000000010000000000000010000001000110001000000000000101000<br />
0100R001000000<br />
Die Antwort <strong>de</strong>s RH-Servers lautete: (gekürzte Kopie)<br />
This email message has been sent automatically by the Stanford<br />
Human Genome Center RHserver in response to your submission.<br />
Duplicate markers are indicated with a (D) after the marker name,<br />
a LOD score is now given for duplicates.<br />
Reference Number: D3s1558<br />
Stanford RH Panel: G3<br />
Lowest LOD Reported: 4<br />
Chromosome Value: 0<br />
Results for G3.exampl<br />
-----------------------------------------<br />
Submitted<br />
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100<br />
00100R001000000<br />
# SHGCNAME CHROM# LOD_SCORE DIST.(cRs)<br />
1 SHGC-79299(D) 3 14.04 0<br />
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100<br />
001001001000000<br />
2 SHGC-21606(D) 3 14.04 0<br />
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100<br />
00100R001000000<br />
3 SHGC-10592(D) 3 14.04 0<br />
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100<br />
001001001000000<br />
The number of markers searched was 9817.<br />
Thank you for using the SHGC RHSERVER.<br />
42
Ergebnis <strong>de</strong>r Suche nach SHGC-21606 in <strong>de</strong>r NCBI-Database:<br />
Damit ist D3S1358 in <strong>de</strong>n Bereich von Chromosome 3: D3S1260-D3S3582 kartiert wor<strong>de</strong>n.<br />
Das entspricht <strong>de</strong>n folgen<strong>de</strong>n Angaben (Dargestellt als Kopie von <strong>de</strong>r NCBI Seite):<br />
Top of interval:<br />
Bottom of interval:<br />
Genetic size of bin:<br />
Physical size of bin:<br />
About This Interval<br />
D3S1260 (57.8 cM)<br />
D3S3582 (65.1 cM)<br />
7 cM<br />
334 cR10000<br />
Abbildung 5: NCBI-I<strong>de</strong>ogram<br />
43
3.1.2 Das Rh-Mapping <strong>de</strong>s Markers D7S1517<br />
Die dreimalige <strong>Aus</strong>führung <strong>de</strong>r PCR unter <strong>de</strong>n angegebenen Bedingungen ergab das folgen<strong>de</strong><br />
Retentionsmuster. Dieses Muster wur<strong>de</strong> an <strong>de</strong>n SHGC-Rh-Server eingesandt:<br />
Vector:000001100000000000000000001010001000000000000001000010000000000101000<br />
10000000000000<br />
Die Antwort <strong>de</strong>s RH-Servers lautete: (gekürzte Kopie)<br />
This email message has been sent automatically by the Stanford<br />
Human Genome Center RHserver in response to your submission.<br />
Duplicate markers are indicated with a (D) after the marker name,<br />
a LOD score is now given for duplicates.<br />
Reference Number:<br />
Stanford RH Panel: G3<br />
Lowest LOD Reported: 4<br />
Chromosome Value: 0<br />
Results for D7S1517<br />
-----------------------------------------<br />
Submitted<br />
Vector:00000110000000000000000000101000100000000000000100001000000000010100<br />
010000000000000<br />
# SHGCNAME CHROM# LOD_SCORE DIST.(cRs)<br />
1 SHGC-22049 7 6.38 32<br />
Vector:00000110000000000000000000101000100000000000000100100000R00000010101<br />
00000R000000010<br />
2 SHGC-1916 7 6.28 29<br />
Vector:000000100000000000000000001010001000000000000001R0000000000000010100<br />
000000000000100<br />
3 SHGC-772 7 5.51 46<br />
Vector:00000110000000000000000000101000100001000000000110101000100000010101<br />
000001000000010<br />
The number of markers searched was 9817.<br />
Thank you for using the SHGC RHSERVER.<br />
Die Lokalisierung <strong>de</strong>r gekoppelten Marker erfolgte mit Hilfe <strong>de</strong>r NCBI Datenbank.<br />
Der gekoppelte Marker SHGC-1916 erzielte hier einen Treffer.<br />
44
Das Ergebnis ist in <strong>de</strong>r Abbildung 6 dargestellt. Damit kann <strong>de</strong>r Marker <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom 7<br />
q31 zu geordnet wer<strong>de</strong>n.<br />
NCBI gibt <strong>für</strong> diesen Abschnitt die folgen<strong>de</strong>n Werte zur Lokalisation an:<br />
Top of interval:<br />
Bottom of interval:<br />
Genetic size of bin:<br />
Physical size of bin:<br />
About This Interval<br />
D7S655 (126.5 cM)<br />
D7S686 (131.7 cM)<br />
5 cM<br />
460 cR10000<br />
Abbildung 6: NCBI-I<strong>de</strong>ogram<br />
45
3.1.3 Das Rh-Mapping <strong>de</strong>s Markers Se33<br />
Die dreimalige <strong>Aus</strong>führung <strong>de</strong>r PCR unter <strong>de</strong>n angegebenen Bedingungen ergab das folgen<strong>de</strong><br />
Retentionsmuster. Dieses Muster wur<strong>de</strong> an <strong>de</strong>n SHGC-Rh-Server eingesandt:<br />
Vector:010000010000000011000000001000000000000000000000011000000011000101100<br />
10111001000000<br />
Die Antwort <strong>de</strong>s Antwort vom RH-Servers lautete:<br />
This email message has been sent automatically by the Stanford<br />
Human Genome Center RHserver in response to your submission.<br />
Duplicate markers are indicated with a (D) after the marker name,<br />
a LOD score is now given for duplicates.<br />
Reference Number:<br />
Stanford RH Panel: G3<br />
Lowest LOD Reported: 4<br />
Chromosome Value: 0<br />
Results for G3.se33<br />
-----------------------------------------<br />
Submitted<br />
Vector:01000001000000001100000000100000000000000000000001100000001100010110<br />
010111001000000<br />
# SHGCNAME CHROM# LOD_SCORE DIST.(cRs)<br />
1 RH111861<br />
6 13.79 9<br />
Vector:01000001000000001100000000000000000000000000000001100000001000010110<br />
010111001000000<br />
2 SHGC-103889 6 12.69 13<br />
Vector:01000001000000001100000000000000000000000000000001100000001001010110<br />
010111001000000<br />
3 SHGC-79338 6 12.10 13<br />
Vector:01000001000000001100000000000000000000000000000001100000001000010110<br />
010111000000000<br />
The number of markers searched was 9817.<br />
Thank you for using the SHGC RHSERVER<br />
SHGC-79338 wird von NCBI <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom 6 zugeordnet. Die Lokalisation wird<br />
89776278-89776563 (bp) angegeben. Eine Angabe in cM vom p-Telomer ist auf direkte<br />
46
Weise nicht zu erhalten. Der NCBI-Map-Viewer lokalisiert <strong>de</strong>n Marker zu Chromosom 6<br />
q15-16. Das entspricht einem Abstand vom p-Telomer von ca. 100-110 cM. Dieser Bereich<br />
kann zusätzlich als NCBI-I<strong>de</strong>ogram dargestellt wer<strong>de</strong>n (Abbildung 7). Dieses Ergebnis<br />
stimmt überein mit Angaben in <strong>de</strong>r GDB die <strong>de</strong>n Marker mit <strong>de</strong>n Synonymen ACTPBP8 und<br />
ACTPBP2. Somit ist SE33 zweifelsfrei <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom 6 zugeordnet.<br />
Abbildung 7: NCBI-I<strong>de</strong>ogram<br />
47
Die Abbildung 8 zeigt die chromosomalen Plots genetischer Distanz weiblich / männlich in<br />
ihrer Beziehung zur physischen Position auf <strong>de</strong>r Chromosomenkarte nach Broman et al. 1998<br />
[26].<br />
Diese Darstellung ermöglicht in Fällen, in <strong>de</strong>nen nur ein Geschlechtdurchschnittswert<br />
angegeben ist, die Spannweite <strong>de</strong>r Differenz grob abzuschätzen.<br />
Abbildung 8: Distanzratio weiblich/männlich <strong>de</strong>r<br />
genetischen Lage von Markern entlang <strong>de</strong>r<br />
Chromosomen 1-22 (nach Brodman et al.).<br />
Abszisse: 0 = Position <strong>de</strong>s p-Telomers<br />
▼ = Lage <strong>de</strong>s Centromers.<br />
48
3.2 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 1<br />
D1S80 [27, 101, 114, 217], D1S339 [56], PGD [21, 162, 178], RHD [178], D1S7 [35, 147, 202], PGM1 [83, 105, 178, 205],<br />
Penta I [9], FY [178], D1S518 [226], D1S1656 [78, 120, 235], D1S549 [121], F13B (klassischer Eiweißmarker) [178], F13B<br />
(PCR Marker) [44, 50, 128, 140, 157, 228], REN [186], D1S8 [103, 153, 213]<br />
49
3.3 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 2<br />
ACP1 [54, 115, 205], TPO [5, 51, 101, 173], D2S92 [159], APOB [79, 181, 194, 220], D2S11 [46], pYNH24 [43, 41, 42],<br />
D2S436 [121], D2S1338 [17, 48, 204]<br />
50
3.4 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 3<br />
D3S1358 [129, 204, 209], plxn5 [2], HVR [64, 164, 242], D3S1359 [129, 174, 188], D3S1217 [102], TF [36, 42, 49, 167],<br />
D3S1744 [67, 199, 203], D3S1545 [88], D3S1754 [121]<br />
51
3.5 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 4<br />
D4S95 [98], D4S43 [84], GC [30, 57, 101, 231], FABP2.PCR2 [175, 229], FGA [34, 65, 77, 101, 142], GYPA [30, 101,<br />
150], D4S243 [169], D4S163 [56, 158], D4S139 [35, 80, 143, 210]<br />
52
3.6 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 5<br />
D5S818 [6, 45, 101], D5S110 [28, 43, 56], ACTBP2 [95, 93, 94], D5S373 [47, 55], PM [39], CSF1PO [33, 58, 101], CSF1R<br />
[4], D5S2360 [94], D5S43 [56]<br />
53
3.7 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 6<br />
D6S477 [14, 68], F13A1 [97, 101, 176, 185], BF [73, 74, 214], HLA-A [86, 137, 187], HLA-B [132, 137], HLA-C [137,<br />
187], HLA-DNA [61, 62, 161], HLA-DQa [60, 195, 232], GLO1 [22, 178, 207], RHAG [99, 107, 135], ACTBP8 [148],<br />
DHFRP2 [3, 101, 168, 177], D6S366 [165, 191, 192], Penta F [9], D6S132 [182, 198]<br />
54
3.8 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 7<br />
D7S21 [90, 93, 211], D7S460 [136], D7S809 [212], D7Z2 [118, 233], D7S820 [87, 101, 183], Penta B [9], D7S1517 [149],<br />
D7S8 [30, 101], D7S480 [102], D7S467 [198]<br />
55
3.9 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 8<br />
LIPOL [101, 141], D8S639 [196], D8S384 [139], D8S306 [15, 155], D8S1132 [218, 236], D8S320 [104, 184], Penta A [9],<br />
D8S1179 [12, 34, 101], D8S358 [56, 191], D8S344 [53, 224], D8S345 [134], D8S347 [134, 172], GPT [91, 230], D8S323<br />
[53, 134]<br />
56
3.10 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 9<br />
ak3 [178, 240], D9S157 [102], Penta C [9], D9S302 [121], D9S926 [169], AB0 [117, 178], ak1 [110, 163, 178, 179]<br />
57
3.11 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 10<br />
D10S2325 [8, 234, 235], D10S28 [19, 89, 95]<br />
58
3.12 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 11<br />
TH01 [34, 101], D11S2010 [169], D11S554 [1, 78, 171], D11S35 [66], APOA1 [7, 41, 106], D11S488 [25, 196, 227]<br />
59
3.13 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 12<br />
VWF [101, 108, 145, 190], cd4 [59, 101, 113], D12S391 [81, 122, 123], COL2A1 [16, 23, 181], D12S375 [38, 121],<br />
D12S1090 [199, 203, 245], PAH [124, 125], PLA2A1 [166], D12S11 [31, 85, 92]<br />
60
3.14 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 13<br />
D13S325 [126], ESD [22, 29, 178, 244], D13S153 [102], D13S317 [69, 70, 146], D13S767 [169]<br />
3.15 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 14<br />
D14S608 [40], D14S306 [18, 226], D14S299 [243], PI [217, 218, 219, 8], D14S543 [160], D14S13 [11, 96, 151], D14S118<br />
[160], IGHG3 [75, 76, 100]<br />
61
3.16 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 15<br />
D15S233 [243], CYP19 [101, 138, 229], Penta E [9, 63], FES/FPS [13, 101, 111, 177]<br />
3.17 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 16<br />
D16S85 [229], D16S83 [237], D16S309 [153, 189], D16S537 [222], D16S310 [169], D16S543 [131], D16S3253 [40], HP<br />
[82, 178, 215, 216], D16S539 [32, 130, 191], D16S422 [102]<br />
62
3.18 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 17<br />
D17S5 [133, 208, 217], D17S976 [112], D17S795 [144], D17S26 [96, 152, 156], D17S79 [10, 11, 35], D17S766 [217]<br />
3.19 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 18<br />
D18S535 [119, 193, 235], D18S51 [12, 101, 200, 201, 206], D18S849 [199], D18S1270 [40], D18S848 [169], D18S17<br />
[170], MBP [127, 154, 225]<br />
63
3.20 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 19<br />
LDLR [26, 30, 101], D19S253 [24, 52, 71], D19S433 [17, 68, 204], Lu [178], D19S246 [197]<br />
3.21 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 20<br />
D20S470 [126], ADA [21, 37, 238], D20S85 [109, 221, 223], D20S161 [8], D20S15 [170]<br />
64
3.22 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 21<br />
D21S11 [32, 101, 219], Penta D [9], D21S1437 [40], D21S168 [66]<br />
3.23 Die forensischen Marker <strong>de</strong>s Chromosom 22<br />
p1 [72, 178, 180, 241], Penta H [9], D22S683 [14, 20], Penta G [9]<br />
65
66<br />
4 DISKUSSION
Die Kartierung genetischer Merkmale <strong>de</strong>s Menschen war schon früh ein Gegenstand <strong>de</strong>r<br />
humangenetischen Forschung. Ursprünglich war damit das Ziel verbun<strong>de</strong>n, Kopplungsdaten<br />
bei <strong>de</strong>r Erstellung von Erbprognosen zu nutzen. Die klassische Genetik <strong>de</strong>r Schule von<br />
Thomas H. Morgan hatte durch die Forschungen an Drosophila das Phänomen <strong>de</strong>r<br />
gekoppelten Vererbung gezeigt. Man konnte nachweisen, dass bestimmte Merkmale immer,<br />
bzw. statistisch gehäuft, miteinan<strong>de</strong>r vererbt wur<strong>de</strong>n. Die Genetiker um Morgan erkannten,<br />
dass dieses durch die physische Nähe <strong>de</strong>r entsprechen<strong>de</strong>n Gene bedingt ist. Somit war die<br />
Möglichkeit gegeben, auf <strong>de</strong>r Basis <strong>de</strong>r Ermittlung von Rekombinationshäufigkeiten<br />
genetische Karten zu erstellen. Auch in <strong>de</strong>r Humangenetik wur<strong>de</strong>n bald darauf die ersten<br />
Kopplungsgruppen gefun<strong>de</strong>n. So fand man schon mit <strong>de</strong>n Metho<strong>de</strong>n <strong>de</strong>r klassischen Genetik<br />
die Kopplung <strong>de</strong>s Nagel-Patella-Syndroms mit <strong>de</strong>r AB0-Blutgruppe auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom 9.<br />
Die Kopplung zwischen <strong>de</strong>r dominanten Eliptozytose und <strong><strong>de</strong>m</strong> Rh-System, <strong>de</strong>r Hämophilie A<br />
mit <strong>de</strong>n Rot-Grün-Sehstörungen sind weitere Beispiele. In einer späteren Phase <strong>de</strong>r<br />
Humangenetik versuchte man, das Phänomen <strong>de</strong>r Kopplung zur Verbesserung von<br />
Erbprognosen zu nutzen. Für die meisten rezessiv vererbten Erkrankungen bestand die<br />
Schwierigkeit, heterozygote Genträger zu erkennen. Solche Personen tragen natürlich ein<br />
erhöhtes Risiko, Kin<strong>de</strong>r mit <strong>de</strong>r betreffen<strong>de</strong>n Erkrankung zu bekommen. Es bestand daher ein<br />
Bedarf, die Heterozygoten zu erkennen, die Risiken zu ermitteln und die Betroffenen zu<br />
beraten. Diese Strategie entwickelte sich erfolgreich, als es gelang, DNA-Polymorphismen zu<br />
analysieren. Erst jetzt war man in <strong>de</strong>r Lage, <strong>für</strong> Gene die <strong>für</strong> schwere genetische<br />
Erkrankungen von Be<strong>de</strong>utung sind, gekoppelte Polymorphismen zu fin<strong>de</strong>n und diese im<br />
beschriebenen Sinne zu nutzen. Solche Polymorphismen wur<strong>de</strong>n nun als Kopplungsmarker<br />
sowohl <strong>für</strong> die Heterozygotenerkennung als auch <strong>für</strong> die pränatale Diagnostik genutzt. Als<br />
beson<strong>de</strong>rer Vorteil erwies sich, dass die Diagnostik nicht mehr an die Untersuchung<br />
bestimmter Gewebe gebun<strong>de</strong>n war, son<strong>de</strong>rn dass als Voraussetzung die Gewinnung von DNA<br />
ausreichte. Auf diese Weise wur<strong>de</strong>n pränatale Diagnosen und Hetererozygotentests auch <strong>für</strong><br />
solche Erkrankungen möglich, <strong>für</strong> die <strong>de</strong>r Basis<strong>de</strong>fekt noch unbekannt war. In <strong>de</strong>r<br />
Anfangsphase <strong>de</strong>r genomischen Dignostik waren hier Erkrankungen wie die Cystische<br />
Fibrose, die Phenylketonurie, die Duchenne Muskeldystrophie, die Chorea Huntington u.a.m.<br />
zu nennen. Inzwischen kann man <strong>für</strong> eine große Anzahl <strong>de</strong>r monogen bedingten<br />
Erkrankungen schon eine direkte Mutationsbestimmung vornehmen, so dass die Frage <strong>de</strong>r<br />
Lokalisierung von genetisch bedingten Erkrankungen und geeigneten Kopplungsmarkern in<br />
<strong>de</strong>n Hintergrund rückt.<br />
67
Große Be<strong>de</strong>utung hat dieses Feld jedoch nach wie vor <strong>für</strong> die forensische Genetik. Während<br />
<strong>für</strong> die normale Vaterschaftsbestimmung, bei <strong>de</strong>r man Proben von <strong>de</strong>r Mutter, <strong><strong>de</strong>m</strong> strittigen<br />
Kind und <strong><strong>de</strong>m</strong> Eventualvater untersuchen kann, die Lokalisation <strong>de</strong>r Marker kaum eine Rolle<br />
spielt, liegen die Verhältnisse bei <strong>de</strong>r Erstellung schwieriger Defizienzgutachten<br />
komplizierter. Das Prinzip besteht hier ja darin, dass anstatt <strong>de</strong>s Eventualvaters <strong>de</strong>ssen<br />
Verwandte in die Untersuchung einbezogen wer<strong>de</strong>n (z.B. bei Tod <strong>de</strong>s betreffen<strong>de</strong>n<br />
Eventualvaters). Die Häufigkeit <strong>de</strong>r Übereinstimmung von Merkmalen zwischen <strong><strong>de</strong>m</strong> Kind<br />
und <strong>de</strong>n Verwandten dient dann als Berechnungsgrundlage <strong>für</strong> die<br />
Verwandtschaftswahrscheinlichkeit. Wenn man be<strong>de</strong>nkt, dass die Übereinstimmung von<br />
Merkmalen zwischen <strong><strong>de</strong>m</strong> verstorbenen Putativvater und <strong>de</strong>ssen Verwandten nicht nur<br />
hinsichtlich einzelner Marker son<strong>de</strong>rn auch in Bezug von ganzen Kopplungsgruppen<br />
betrachtet wer<strong>de</strong>n kann, muss die Kopplung <strong>de</strong>r Marker beachtet wer<strong>de</strong>n. Dieses Problem soll<br />
im Folgen<strong>de</strong>n durch ein Beispiel illustriert wer<strong>de</strong>n.<br />
Zuvor soll hier noch darauf hingewiesen wer<strong>de</strong>n, dass <strong>de</strong>n Forensischen Gutachtern die<br />
Lokalisation <strong>de</strong>r von ihnen benutzten Marker oft gar nicht bekannt ist. Inzwischen ist es aber,<br />
nicht zuletzt durch die Erfolge <strong>de</strong>s Human Genom Projekts möglich, die Lokalisation <strong>de</strong>r<br />
genomischen Marker in <strong>de</strong>n geeigneten Gendatenbanken aufzufin<strong>de</strong>n und <strong>de</strong>ren Lokalisierung<br />
genau zu bestimmen. Während <strong>de</strong>r Erarbeitungsphase zu dieser Arbeit war dies jedoch nur in<br />
eingeschränkter Weise zutreffend und <strong>für</strong> manche Marker war lediglich die chromosomale<br />
Zuordnung, aber keine genauere Lagebestimmung möglich. Für drei wichtige Marker wur<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>shalb im Rahmen dieser Arbeit die Kartierung mittels <strong>de</strong>r RH-Mapping-Metho<strong>de</strong>n<br />
vorgenommen: D7S1517, D3S1358 und SE 33.<br />
Die schnelle Entwicklung auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Genomanalyse und <strong>de</strong>r Internet-<br />
Kommunikation haben dazu geführt, dass eine solche Arbeit zum jetzigen Zeitpunkt nicht<br />
mehr nötig gewesen wäre. Man kann jetzt die entsprechen<strong>de</strong>n Marker in <strong>de</strong>r Bank<br />
http://<strong>www</strong>.ensembl.org/Homo_sapiens/ auffin<strong>de</strong>n. Das gibt uns die Möglichkeit die eigenen<br />
Kartierungsergebnisse zu überprüfen.<br />
Die Grün<strong>de</strong> <strong>für</strong> die hier erfolgte Überprüfung <strong>de</strong>r Lage <strong>de</strong>s Markers SE33 sind an<strong>de</strong>rs geartet.<br />
SE 33 ist ein beson<strong>de</strong>rs hochpolymorphes System. Für die <strong>de</strong>utsche Population sind 79 Allele<br />
aufgeführt wor<strong>de</strong>n. Dementsprechend ist die Diskriminationskraft (PD) und die AVACH sehr<br />
hoch. SE 33 wird vor allem in Deutschland eingesetzt. Der eigentliche Name ist ACTBP2<br />
(human beta-actin related pseudogene H-beta-Ac-psi-2). Unglücklicherweise wird das Gen in<br />
<strong>de</strong>r GDB aber unter ACTBP8 geführt und unter ACTBP2 erscheint eine Sequenz, die <strong><strong>de</strong>m</strong><br />
68
Chromosom 5 zugeordnet wer<strong>de</strong>n muss. Daraus folgt eine komplette Verwirrung. Die<br />
Lokalisation SE 33 wird <strong>de</strong>shalb nach wie vor sowohl auf Chromosom 5 [251] als auch auf<br />
Chromosom 6 [252] angegeben. Es kam <strong>de</strong>shalb darauf an, die Lage endgültig durch eigene<br />
Untersuchung zu klären. Das hier gefun<strong>de</strong>ne Resultat zeigt SE 33 auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom 6.<br />
Abschließend konnte dieses Resultat auch durch die Datenbankarbeit bestätigt wer<strong>de</strong>n: Die<br />
SE33-Primer passen in eine Sequenz die GDB ACTBP8 nennt und <strong><strong>de</strong>m</strong> Chromosom 6<br />
zuordnet.<br />
4.1 Demonstrationsbeispiel<br />
Zur Illustration <strong>de</strong>r Tragweite <strong>de</strong>r unkritischen Verwendung gekoppelter Marker im<br />
Abstammungsgutachten wird ein realer Fall aus <strong>de</strong>r Praxis gezeigt. Hier war die Vaterschafts-<br />
Wahrscheinlichkeit eines <strong>de</strong>fizienten Putativvaters zu bestimmen, von <strong><strong>de</strong>m</strong> aber bei<strong>de</strong> Eltern<br />
zur Untersuchung zur Verfügung stan<strong>de</strong>n. Es wer<strong>de</strong>n die hypothetischen aber praxisnahen<br />
Situationen berechnet, in <strong>de</strong>nen jeweils nur einer von <strong>de</strong>n Putativgroßeltern untersucht wer<strong>de</strong>n<br />
kann. Gekoppelte Marker wer<strong>de</strong>n alternativ einbezogen bzw. eliminiert. Zur Berechnung <strong>de</strong>r<br />
Verwandtschaftswahrscheinlichkeit kam das Programm DNA-View von C. Brenner<br />
(<strong>www</strong>.dna-view.com) zum Einsatz. Die Tabelle 4 - 1 zeigt die Markerprofile, die in einem<br />
strittigen Abstammungsfall erhoben wur<strong>de</strong>n.<br />
69
Marker Mutter Kind PGM PGV<br />
1 Chr 1 Rh CcD Ee CcD Ee CcD Ee Ccd ee<br />
2 Chr 1 F13B 8 / 10 8 / 10 9 / 10 7 / 8<br />
(STR)<br />
3 Chr 2 acP B AB B AB<br />
4 Chr 3 D3S1358 17 / 19 17 / 15 16 / 15 17 / 18<br />
5 Chr 4 Gc 1F 1F-1S 1F 1F –1S<br />
6 Chr 4 FGA 21 / 22 22 /22.2 19 / 23 21 /22.2 MKG<br />
7 Chr 4 MNSs MSs MNS Mss MNS MKG<br />
8 Chr 5 ACTBP2 17 / 26 26 / 28.2 20 / 24 17 /28.2<br />
9 Chr 7 D7S1517 20 / 22 20 / 23 18 / 23 19 /20<br />
10 Chr 8 D8S1179 15 / 15 15 / 13 16 / 13 17 / 19<br />
11 Chr 9 AB0 A1 A1 0 0<br />
12 Chr 11 TH01 7 / 8 7 / 9.3 9.3 / 9.3 7 / 9.3<br />
13<br />
14 Chr 12 VWA 17 / 19 19 / 14 15 / 17 18 / 14 MKG<br />
15 Chr 12 CD4 5 / 10 10 / 11 6 / 6 10 / 11 MKG<br />
16 Chr 12 D12S391 19 / 21 19 / 24 18 / 25 20 / 24 MKG<br />
17 Chr 15 FES/FPS 10 / 11 11 / 11 11 / 12 8 /10<br />
18 Chr 18 D18S51 17 / 18 18 / 20 18/ 21 19/20<br />
19 Chr 21 D21S11 37 / 28 28 /31 30 / 31 28 / 30<br />
20 Wahrscheinlichkeiten:<br />
21 PGM + PGV mit allen MKG p = 99,99992 18Systeme/13Chr.<br />
22 PGM + PGV ohne MNSs, D12S391,CD4 p = 99,996 15Systeme/13Chr.<br />
23 nur PGM mit allen MKG p = 13,71 18Systeme/13Chr.<br />
24 nur PGM ohne MNSs, D12S391, CD4 p = 55,98 15Systeme/13Chr.<br />
25 nur PGV mit allen MKG p= 99,996 18Systeme/13Chr.<br />
26 nur PGV ohne MNSs, D12S391, CD4 p= 99,59 15Systeme/13Chr.<br />
Tabelle 4 - 1: Abstammungstest in einer Defizienzfamilie mit verstorbenem Putativvater, an <strong>de</strong>ssen Stelle<br />
die Putativgroßmutter (PGM) und <strong>de</strong>r Putativgroßvater (PGV) untersucht wer<strong>de</strong>n konnten. Die Zeilen<br />
21, 23 und 25 enthalten das Ergebnis <strong>de</strong>r Berechnung <strong>de</strong>r Verwandtschaftswahrscheinlichkeit berechnet<br />
unter Einbeziehung mehrerer Marker einer Kopplungsgruppe (MKG). In Zeile 22, 24 und 25 wur<strong>de</strong><br />
richtigerweise pro Kopplungsgruppe nur ein Marker in die Berechnung einbezogen. Das wechselseitige<br />
Weglassen jeweils einer Person aus <strong>de</strong>r Großelterngeneration (Zeilen 23-26) veranschaulicht das Problem.<br />
Mit <strong>de</strong>n in Abstammungstests häufig angewandten 18 Markern von 13 Chromosomen sollte<br />
die Frage nach <strong>de</strong>r Verwandtschaftswahrscheinlichkeit zwischen <strong><strong>de</strong>m</strong> strittigen Kind und <strong>de</strong>n<br />
Putativgroßeltern und somit zum Putativvater geklärt wer<strong>de</strong>n. Das Spektrum enthält mit FGA<br />
und MNSs Marker einer Kopplungsgruppe auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Chr. 4 und mit VWA, CD4 und D12S391<br />
Marker einer Kopplungsgruppe vom Chr. 12. Berechnet man die<br />
Verwandtschaftswahrscheinlichkeit p unter Einbeziehung aller Personen, ist die Frage <strong>de</strong>r<br />
Kopplung einiger Marker nicht von größerer Be<strong>de</strong>utung. Stün<strong>de</strong> aber jeweils nur eine Person<br />
aus <strong>de</strong>r großelterlichen Generation zur Untersuchung an, wür<strong>de</strong> die unkritische Einbeziehung<br />
gekoppelter Marker zu groben Fehleinschätzungen führen. Erst wenn man bei <strong>de</strong>r Berechnung<br />
<strong>de</strong>r Großmutterwahrscheinlichkeit einen Marker <strong>de</strong>r Kopplungsgruppe FGA-MNSs und zwei<br />
Marker <strong>de</strong>r Kopplungsgruppe CD4-VWA-D12S391 aus <strong>de</strong>r Berechnung eliminiert, kommt<br />
70
man zu <strong>de</strong>r realen Verwandtschaftswahrscheinlichkeit von p = 55,98% im Gegensatz zum<br />
falschen Ergebnis von p = 13,71% . Das Beispiel <strong><strong>de</strong>m</strong>onstriert die bekannte Tatsache, dass im<br />
Abstammungsgutachten gekoppelte Marker nicht wie voneinan<strong>de</strong>r unabhängige<br />
Informationen behan<strong>de</strong>lt wer<strong>de</strong>n dürfen. Die Tatsache, dass die Nutzung von gekoppelten<br />
genetischen Markern <strong>für</strong> forensische Anwendungen zu Fehlern führen kann, ist allgemein<br />
bekannt. Sie wird aber im Schrifttum <strong>de</strong>r forensischen Medizin bis auf wenige <strong>Aus</strong>nahmen<br />
kaum diskutiert. Kopplungsungleichgewichte spielen außer <strong>für</strong> das HLA-System [178] im<br />
forensisch relevanten Schrifttum zu autosomalen forensischen Markern kaum eine Rolle. De-<br />
Benedictis et al [54] veröffentlichen allerdings Untersuchungen zu einem möglichen Linkage<br />
disequilibrium zwischen TPOX und APO B und schließen ein solches aus.<br />
Probleme von gekoppelter Vererbung und von Kopplungsungleichgewicht kann man<br />
vollständig umgehen, wenn man nur solche Marker kombiniert einsetzt, die auf<br />
unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Eigentlich wäre ein <strong>de</strong>rartiges Vorgehen<br />
uneingeschränkt realisierbar, <strong>de</strong>nn bei 22 Autosomen könnte man ein komfortables 22-<br />
Markerset mit Lokalisationen auf 22 unterschiedlichen Chromosomen evaluieren. Es ist<br />
jedoch zu konstatieren, dass in vielen Fällen auch ungekoppelte Marker bereitgestellt wer<strong>de</strong>n<br />
können, die auf einem und <strong><strong>de</strong>m</strong>selben Chromosom liegen. Somit ist <strong>de</strong>r Spielraum noch<br />
größer optimale Systeme auszuwählen. Die heute üblichen Testkits sind bereits weitestgehend<br />
bedarfsgerecht und umgehen die Problematik von Kopplung und Kopplungsungleichgewicht.<br />
Nur ganz ausnahmsweise enthalten sie gekoppelte Marker. Eine solche <strong>Aus</strong>nahme ist mit <strong><strong>de</strong>m</strong><br />
Powerplex 16 (Promega) hinsichtlich <strong>de</strong>s Chr22 gegeben. Hier sind die enggekoppelten<br />
Systeme D21S11 und Penta-D kombiniert - ein Umstand, <strong>de</strong>r bei Anwendung <strong>de</strong>s Kits<br />
bedacht wer<strong>de</strong>n muss.<br />
Für <strong>de</strong>n Spurenfall bzw. <strong>für</strong> <strong>de</strong>n unkomplizierten Abstammungstest (Terzettenfall) ist<br />
normalerweise die Nutzung einer Multiplex-PCR rechnerisch ausreichend. Son<strong>de</strong>rfälle<br />
erfor<strong>de</strong>rn eine Erweiterung <strong>de</strong>s Markerspektrums. Auch die Philosophie, Systeme aus<br />
unterschiedlichen Systemkategorien einsetzen zu wollen, ist zu unterstützen. In je<strong><strong>de</strong>m</strong> Fall<br />
muss die <strong>Aus</strong>wahl <strong>de</strong>r Zusatzsysteme sinnvoll, d. h. unter Berücksichtigung <strong>de</strong>r Lokalisation<br />
vorgenommen wer<strong>de</strong>n. Unser Anwendungsbeispiel zeigt, dass im Defizienzfall eine<br />
diesbezüglich unkritische <strong>Aus</strong>wahl zu falschen <strong>Aus</strong>sagen führen kann. Analoges gilt <strong>für</strong><br />
vermeintlich „normale Terzettenfälle“ mit isoliertem <strong>Aus</strong>schluss. Hier ist gelegentlich <strong>de</strong>r<br />
Mutationsfall vom Verwandtschaftsfall, in <strong><strong>de</strong>m</strong> <strong>de</strong>r Bru<strong>de</strong>r o<strong>de</strong>r Vater <strong>de</strong>s PV wahrer Vater<br />
ist, nicht ohne größere Anstrengungen zu unterschei<strong>de</strong>n. Zu Beginn eines<br />
71
Abstammungsgutachtens ist es aber meist unbekannt, ob ein PV-Verwandtschaftsfall vorliegt.<br />
Für <strong>de</strong>n Einsatz gekoppelter Marker im Verwandtschaftsfall gilt: Ebenso wie ChrY-Marker in<br />
PV-Geschwisterfällen keine <strong>Aus</strong>schlusskraft besitzen, bil<strong>de</strong>n autosomale Kopplungsgruppen<br />
eine abgeschwächte Analogie zum ChrY. Das Allelsharing zwischen Kind und PV betrifft<br />
hier naturgemäß häufig gleich die ganze Kopplungsgruppe gemeinsam o<strong>de</strong>r alternativ nicht<br />
gemeinsam. Deshalb ist die Nutzung gekoppelter Marker nur dann zulässig, wenn man sich<br />
<strong>de</strong>r Kopplung bewusst ist und die Ergebnisse sachkundig interpretiert. Die hier vorgestellte<br />
Übersicht zur Kartierung forensisch genutzter genetischer Marker soll die Beurteilung<br />
erleichtern. Sie soll in <strong>de</strong>r Zukunft in einer regelmäßig aktualisierten Form zugänglich sein.<br />
4.2 Zusammenfassung und <strong>Aus</strong>sicht<br />
Die kombinierte Anwendung genetischer Marker in <strong>de</strong>r forensischen Spurenkun<strong>de</strong> und im<br />
Abstammungsnachweis erfor<strong>de</strong>rt eine genaue Kenntnis <strong>de</strong>ren Lokalisation. Diese Arbeit<br />
lokalisiert die forensischen Marker zytogenetisch und genetisch in <strong>de</strong>n I<strong>de</strong>ogrammen <strong>de</strong>r 22<br />
Autosomen. Diesbezügliche Informationen wur<strong>de</strong>n aus Gendatenbanken zusammengetragen,<br />
die ohne Zugangsbeschränkungen im World Wi<strong>de</strong> Web aufgesucht wer<strong>de</strong>n können. Es fan<strong>de</strong>n<br />
Marker Berücksichtigung, die mittels Medline <strong>für</strong> <strong>de</strong>n Zeitraum von 1990 bis 06/2001 aus <strong>de</strong>n<br />
Zeitschrifen Int J Legal Med, J Forensic Sci und Forensic Sci Int herausgefiltert wer<strong>de</strong>n<br />
konnten. Auch Marker, die im gleichen Zeitraum in <strong>de</strong>n Proceedings <strong>de</strong>r ISFG (vormals<br />
ISFH) genannt wor<strong>de</strong>n sind, wur<strong>de</strong>n aufgenommen.<br />
Mit <strong>de</strong>r Fokussierung <strong>de</strong>r Forensischen Genetik hat sich das Interesse in <strong>de</strong>r jüngeren<br />
Vergangenheit vor allem <strong>de</strong>n STRs zugewen<strong>de</strong>t. Die Informativität <strong>de</strong>r einzelnen Marker ist<br />
im Vergleich zu <strong>de</strong>n klassischen Markern um ein Vielfaches gestiegen. Die heute<br />
angewandten STRs haben meist zwischen 10 und 25 Allele, manche jedoch noch viel mehr.<br />
Das Resultat davon ist, dass man die Anzahl <strong>de</strong>r genutzten Marker drastisch reduzieren<br />
konnte. Ein unkomplizierter Abstammungsfall kommt heute mit <strong>de</strong>r Anwendung <strong>de</strong>s Testkits<br />
Powerplex 16 (15 autosomale Marker) o<strong>de</strong>r <strong><strong>de</strong>m</strong> SGM plus (12 autosomale Marker) aus. Nur<br />
in komplizierten Defizienzfällen wird die Anzahl erhöht, wobei jetzt auch meist die<br />
gonosomalen Marker (ChrY o<strong>de</strong>r ChrX ) genutzt wer<strong>de</strong>n o<strong>de</strong>r 3 - 6 autosomale Single-Locus<br />
Son<strong>de</strong>n eingesetzt wer<strong>de</strong>n. Als ein zusätzliches positives Ergebnis dieser Entwicklung ist zu<br />
verzeichnen, dass die Übersichtlichkeit zugenommen hat. Auch ohne große Mühe kann man<br />
72
die Lokalisierung <strong>de</strong>r Marker überprüfen. Meist sind die STRs in einem Testkit vom<br />
Hersteller so kombiniert wor<strong>de</strong>n, dass keine gekoppelten Marker zum Einsatz kommen.<br />
In letzter Zeit zeichnet sich jedoch <strong>für</strong> die Forensische Genetik ein methodischer Umbruch ab.<br />
Führen<strong>de</strong> Wissenschaftler propagieren ein Umschwenken auf die Metho<strong>de</strong> <strong>de</strong>r SNP-Analyse<br />
[253]. Der enorme technische Fortschritt hinsichtlich <strong>de</strong>r Genshiptechnik ermöglicht es in<br />
Kürze, mit effektiven Metho<strong>de</strong>n eine Vielzahl SNPs zu analysieren. Das Argument da<strong>für</strong>, ist<br />
dass SNPs eine extrem geringe Neigung zur Mutation zeigen. Die geringe Informativität pro<br />
SNP kann durch die Vielzahl von Einzelinformationen ausgeglichen wer<strong>de</strong>n. Anzumerken ist<br />
in dieser Hinsicht aber, dass mit <strong>de</strong>r Einführung einer großen Anzahl von Einzelmarkern die<br />
Übersicht zur Kopplungsproblematik leicht verloren geht. Es wird von hoher Be<strong>de</strong>utung sein,<br />
die SNPs Sortimente so zusammen zustellen, dass diese ungekoppelt sind. Wie gezeigt wur<strong>de</strong>,<br />
kann <strong>de</strong>r Einsatz von gekoppelten Markern im Defizienzgutachten zu Fehlern führen. Man<br />
mag einwen<strong>de</strong>n, dass ein bestimmtes Gesamtergebnis vom Vorhan<strong>de</strong>nsein einer Kopplung<br />
zwischen wenigen Markern das Ergebnis kaum verfälschen kann. Obwohl diese Feststellung<br />
sicher zutrifft, darf daraus <strong>de</strong>nnoch keine Sorglosigkeit erwachsen. Es ist bekannt, dass in <strong>de</strong>r<br />
Rechtsprechung je<strong>de</strong>r auch noch so geringe Formfehler ein Gutachten o<strong>de</strong>r sogar ein Urteil zu<br />
Fall bringen kann. Die Wichtigkeit <strong>de</strong>r tatsächlichen und <strong>de</strong>r formalen Richtigkeit eines<br />
Befun<strong>de</strong>s ist von höchster Be<strong>de</strong>utung.<br />
Daraus folgt, dass bei <strong>de</strong>r Etablierung <strong>de</strong>r SNP-Analytik in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> die Frage <strong>de</strong>r<br />
Lokalisierung von vornherein sehr ernst genommen wer<strong>de</strong>n sollte. Es erscheint sinnvoll, in<br />
absehbarer Zeit eine Übersicht zur Kartierung <strong>de</strong>r in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> genutzten SNPs zu<br />
erstellen.<br />
73
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87
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forensic purposes.Int J Legal Med (2001) 114 :204–210<br />
88
89<br />
6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Die Organisation <strong>de</strong>s menschlichen Genoms..................................................... 15<br />
Abbildung 2: Gregor Johann Men<strong>de</strong>l....................................................................................... 24<br />
Abbildung 3: Thomas Hunt Morgan ........................................................................................ 25<br />
Abbildung 4: Herstellung von Mensch-Hamster-Hybridzellkulturen...................................... 30<br />
Abbildung 5: NCBI-I<strong>de</strong>ogram ................................................................................................. 43<br />
Abbildung 6: NCBI-I<strong>de</strong>ogram ................................................................................................. 45<br />
Abbildung 7: NCBI-I<strong>de</strong>ogram ................................................................................................. 47<br />
Abbildung 8: Distanzratio weiblich/männlich <strong>de</strong>r genetischen Lage von Markern ................ 48<br />
90
91<br />
7 TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1 - 1: Zur zeitl. Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Blutgruppens. ........ 10<br />
Tabelle 1 - 2: Zur zeitl. Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Proteinsysteme ....... 11<br />
Tabelle 1 - 3: Zur zeitl. Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r Enzymsysteme........ 12<br />
Tabelle 1 - 4: Zur zeit. Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r HLA-Systeme.......... 13<br />
Tabelle 1 - 5: Metho<strong>de</strong>n und Techniken in <strong>de</strong>r <strong>Rechtsmedizin</strong> ............................................... 17<br />
Tabelle 1 - 6: Zur zeitl. Abfolge <strong>de</strong>r Ent<strong>de</strong>ckungen auf <strong><strong>de</strong>m</strong> Gebiet <strong>de</strong>r DNA-Systeme ........ 22<br />
Tabelle 2 - 1: PCR-Bedingungen <strong>für</strong> D3S1358 ....................................................................... 38<br />
Tabelle 2 - 2: PCR-Bedingungen <strong>für</strong> D7S1517 ....................................................................... 39<br />
Tabelle 2 - 3: PCR-Bedingungen <strong>für</strong> SE33 (ACTBP2) ........................................................... 40<br />
Tabelle 4 - 1: Abstammungstest in einer Defizienzfamilie...................................................... 70<br />
92
93 III<br />
DANKSAGUNG
Mein beson<strong>de</strong>rer Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Szibor <strong>für</strong> die Überlassung <strong>de</strong>s Themas,<br />
<strong>für</strong> seine hilfreichen Anmerkungen und kritischen Betrachtungen.<br />
Für die ausgezeichnete und intensive Betreuung bei <strong>de</strong>r Anfertigung <strong>de</strong>r Arbeit möchte ich<br />
mich bei Herrn Prof. Dr. D. Krause ganz herzlich bedanken.<br />
Frau Doreen Exner danke ich <strong>für</strong> die Unterstützung bei <strong>de</strong>r Medline-Recherche.<br />
Ein beson<strong>de</strong>rer Dank geht an meine Eltern, <strong>für</strong> ihr Verständnis und die vielen aufmuntern<strong>de</strong>n<br />
Worte während <strong>de</strong>r Anfertigung <strong>de</strong>r Arbeit.<br />
94
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNGEN<br />
95 IV
Selbstständigkeitserklärung<br />
Ich erkläre, dass ich die vorliegen<strong>de</strong> Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung <strong>de</strong>r<br />
angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.<br />
Mag<strong>de</strong>burg, 05.12.2004<br />
________________________<br />
Sebastian Lieske<br />
Erklärung zur Bewerbung<br />
Ich erkläre, dass ich mich mit <strong>de</strong>r vorliegen<strong>de</strong>n Arbeit an keiner an<strong>de</strong>ren Hochschule um <strong>de</strong>n<br />
aka<strong><strong>de</strong>m</strong>ischen Grad doctor medicinae beworben habe und dass ich we<strong>de</strong>r früher noch<br />
gegenwärtig die Eröffnung eines Verfahrens zum Erwerb <strong>de</strong>s o.g. aka<strong><strong>de</strong>m</strong>ischen Gra<strong>de</strong>s an<br />
einer an<strong>de</strong>ren Hochschule beantragt habe. Ich übertrage <strong>de</strong>r Medizinischen Fakultät das<br />
Recht, weitere Kopien meiner Dissertation herzustellen und zu vertreiben.<br />
Mag<strong>de</strong>burg, 05.12.2004<br />
________________________<br />
Sebastian Lieske<br />
96
97V<br />
CURRICULUM VITAE
Persönliche Daten:<br />
Name<br />
: Sebastian Lieske<br />
Geboren<br />
: 15.03.1976, in Mag<strong>de</strong>burg<br />
Staatsangehörigkeit : <strong>de</strong>utsch<br />
<strong>Aus</strong>bildung:<br />
1982-1990 : Polytechnische Oberschule „Heinrich-Reichel“, Mag<strong>de</strong>burg<br />
1990-1994 : Geschwister-Scholl-Gymnasium, Mag<strong>de</strong>burg<br />
1994 : Abitur<br />
1994-1995 : Zivildienst, Otto-von-Guericke-Universität Mag<strong>de</strong>burg<br />
1996 : Immatrikulation, Otto-von-Guericke-Universität Mag<strong>de</strong>burg<br />
1998 : Ärztliche Vorprüfung<br />
1999 : 1. Staatsexamen<br />
2002 : 2. Staatsexamen<br />
04/ 2003 : 3. Staatsexamen<br />
seit 05/ 2003 : Arzt im Praktikum an <strong>de</strong>r Klinik <strong>für</strong> Unfall- Hand- und<br />
Wie<strong>de</strong>rherstellungschirurgie, St. Salvator Krankenhaus, Halberstadt<br />
Mag<strong>de</strong>burg, 05.12.2004<br />
________________________<br />
Sebastian Lieske<br />
98
99VI<br />
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS
1. Gläß F, Lieske S, Kasten E (1999) Was <strong>de</strong>nken Patienten über Ärzte? Was halten Ärzte<br />
von ihren Patienten? Zeitschrift <strong>für</strong> Medizinische Psychologie 2, 85-93<br />
2. Szibor R, Lieske S, Beck N, Krause D (2002) Zur Lokalisation forensisch genutzter Marker<br />
im menschlichen Genom - Ergebnisse einer World-Wi<strong>de</strong>-Web-Datenbankrecherche.<br />
<strong>Rechtsmedizin</strong> 2, 65-76<br />
100