Molekulare Sonden für die sichere Identifizierung von Spezies der ...

Johannes Gutenberg-Universität Mainz 

Institut für Mikrobiologie und Weinforschung 

- Abschlussbericht - 

Molekulare Sonden für die sichere Identifizierung von 

Spezies der 

Gattungen Brettanomyces / Dekkera 

Projektbearbeitung: 

Christoph Röder 

Dr. Jürgen Fröhlich 

Prof. Helmut König 

Johannes Gutenberg-Universität Mainz 

Institut für Mikrobiologie und Weinforschung 

Becherweg 15 

55128 Mainz 

Mainz, März 2007 

1

Inhaltsverzeichnis 

1. Abbildungsverzeichnis III 

2. Einleitung 1 

3. Material 4 

3.1 Verwendete Mikroorganismen 4 

3.2 Oligonukleotidsonden 5 

4. Versuchsdurchführung und Ergebnisse 7 

4.1 Entwicklung von Art-spezifischen DNA Sonden 7 

4.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 10 

4.3 Untersuchung der regionalen Verbreitung 16 

4.4 Stammdifferenzierung 19 

5. Diskussion 24 

6. Literaturverzeichnis 29 

Anhang 33 

2-II-

1. Abbildungsverzeichnis 

Abb. 1: LSU rRNA Strukturmodell 9-10 

Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen 14 

Abb. 3: Regionale Verbreitung von Dekkera bruxellensis 18 

Abb. 4: Stoffwechselmuster der Typstämme 21 

Abb. 5: Verwandschaftsverhältnisse der Typstämme 22 

Abb. 6: Stoffwechselmuster der Eigenisolate 23 

Abb. 7: Verbreitungsrichtung von D. bruxellensis Stämmen 24 

Abb. 8: Variable LSU rRNA-Bereiche und Sonden-Zielregionen 33-35 

-III- 3

2. Einleitung 

Bei der industriellen Verarbeitung von Lebensmitteln ist die mikrobielle Analytik 

der Lebensmittel und der für den Verarbeitungsprozess eingesetzten Rohstoffe 

von großer Bedeutung. Noch immer wird jedoch eine prozessbegleitende 

Qualitätssicherung durch die Anwendung zeitintensiver Testverfahren wie z. B. 

diverse Kultivierungsmethoden verhindert. Die klassischen Methoden für die 

Identifizierung und Quantifizierung der Brettanomyces-Kontamination durch 

Kultivierung auf semiselektivem Anreicherungsmedium mit anschließender 

Charakterisierung durch biochemische und physiologische Analysen sowie 

mikroskopischer Untersuchung (Fugelsang, 1997) dauern 1 bis 2 Wochen. Ein 

Verfahren zur Detektion und Identifizierung von Mikroorganismen im Wein muß 

sicher, das Ergebnis nach kurzer Zeit vorliegen, es sollte kostengünstig und 

einfach durchzuführen sein. 

Hefen der Gattung Brettanomyces bzw. deren ascosporenbildende Form 

Dekkera verursachen ein unerwünschtes Aroma im Wein und Most, bei der 

Sektbereitung und der Sherrysierung. Der sensorische Eindruck dieses „Brett“- 

Aromas wird auch als „mäuseln“ oder „Pferdeschweiß“-Geschmack 

beschrieben (Heresztyn, 1986, Licker et al., 1998, Loureiro & Malfeito-Ferreira, 

2003). Während der Gärung kann außerdem eine Essigsäure- und 

Essigsäureethylester-Bildung (Lösungsmittelton) auftreten. Das Vorkommen der 

Brettanomyces-typischen Aromanoten (animalisch, Leder, Pferdestall) führte 

bisher oft zur Beanstandung der Qualität. Dennoch ist der Verderb durch 

Mikroorganismen bzw. deren Stoffwechselprodukte selten exakt definiert. In 

Abhängigkeit von der Intensität ergeben sich durchaus positive Effekt auf die 

geschmackliche Komplexität, die von der überwiegenden Mehrheit der 

Weintrinker geschätzt wird (Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2003). Ihre hohe 

Alkoholtoleranz gewährt diesen Weinhefen eine lange Lebensdauer im 

infizierten Wein oder Most. Die poröse, schlecht zu reinigende Holzoberfläche 

sowie die Fähigkeit zur Verwertung von Cellobiose bzw. Cellodextrinen (Freer 

et al., 1991; Fia et al., 2005) machen insbesondere Holz- und Barriquefässer zu 

1

einem geigneten Habitat und einer dauerhaften Infektionsquelle für 

Brettanomyces. 

Das vorliegende Forschungsprojekt diente dazu, eine schnelle und sichere 

Identifizierung von Hefen der Gattungen Dekkera/Brettanomyces im Wein und 

Most zu gewährleisten. Hierfür wurden fluoreszenzmarkierte 

Oligonukleotidsonden in einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 

eingesetzt. Die FISH stellt eine sehr geeignete Methode zur schnellen, 

kostengünstigen und sicheren Detektion und Identifizierung von 

verschiedensten Mikroorganismen in ihrer natürlichen Umgebung dar. Sie 

verbindet die Vorteile einer direkten in situ Detektion in einer komplexen 

mikrobiellen Biozönose ohne Vorkultivierung mit den signifikanten 

Möglichkeiten einer Spezies-Identifizierung und Zellzahlbestimmung. Diese 

Methode ermöglicht einen Nachweis innerhalb weniger Stunden. Als Zielbereich 

für einen spezifischen Nachweis bietet sich die ribosomale RNA (rRNA) der 

Ribosomen an, die in der Zelle in großer Zahl (ca. 10 3 – 10 5 ) vorliegen. Die 

rRNA-Sequenzen vieler Mikroorganismen sind bekannt und bestehen aus 

Regionen höherer und geringerer Konservierung. Hochvariable 

Sequenzbereiche der large subunit (LSU) rRNA sind als Zielregionen für 

Spezies-spezifisch Sonden besonders geeignet. Neben der 

Zellwandpermeabilität und dem Ribosomengehalt der Zelle ist die 

Zugänglichkeit der Sondenzielregionen maßgeblich für die Effizienz der 

Hybridisierung und die Fluoreszenzausbeute verantwortlich. Die Hybridisierung 

der Sonde mit ihrer Zielregion kann sowohl durch rRNA-rRNA Sekundär- und 

Tertiärstrukturen als auch durch Interaktionen der rRNA mit ribosomalen 

Proteinen behindert werden (Behrens et al., 2003) Mehrere Arbeiten 

untersuchten bereits die in situ Zugänglichkeit der ribosomalen LSU für 

fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden sowie Möglichkeiten zur Verbesserung der 

Signalstärke (Fuchs et al., 2001; Behrens et al., 2003; Inacio et al., 2003). 

Vor dem Hintergrund einer Vielzahl verschiedener molekularer 

Nachweismethoden (Kurtzman, 2006) gilt es, die Vorteile der Fluoreszenz in 

situ Hybridisierung weiter auszubauen und die Methode an den Organismus 

bzw. die Hefespezies anzupassen. 

2

Die Nachweisempfindlichkeit und die Möglichkeit für eine routinemäßigen 

Anwendung dieser Technik sollte durch die Isolierung mehrerer Dekkera 

bruxellensis-Stämme aus Weinproben überprüft werden und darüber hinaus 

das Vorkommen und die geographischen Verbreitung dieser Hefen in der 

Weinbauregion Rheinhessen untersucht werden. 

3

3. Material 

3.1 Verwendete Mikroorganismen 

Tab. 1. Brettanomyces/Dekkera-Stämme 

Stamm Gattung / Art Herkunft Isoliert aus Region 

374 Dekkera bruxellensis IMW Sekt Deutschland 

566 D. bruxellensis IMW Sekt Deutschland 




573 D. bruxellensis Henick-Kling Wein USA (NY) 

574 D. anomala T DSMZ 70732 Bier Deutschland 

575 D. bruxellensis T DSMZ 70001 Lambic Bier Belgien 

576 Brettanomyces custersianus T CBS 4805 Bantu Bier Südafrika 

577 B. nanus T CBS 1945 Flaschenbier Schweden 

578 B. naardenensis T CBS 6042 Limonade Niederlande 

579 D. bruxellensis Henick-Kling Wein USA (CA) 

Oben aufgeführte Institutsstämme wurden für die Entwicklung von DNA-Sonden und 

zur Entwicklung von geeigneten Methoden zur Stammdifferenzierung verwendet. Die 

im Rahmen dieser Forschungsarbeit aus Weinproben isolierten Stämme sind im 

Ergebnisteil (5.2) aufgeführt. 

Die Brettanomyces/Dekkera Institutsstämme wurden als Reinkulturen auf YPG- 

Schrägagar (ohne Cycloheximid) in Stammhaltung genommen. Nach dem 

Anwachsen (ca. 1 Woche bei 30 °C; Stämme 577, 578 bei 20 °C) wurden die Hefen 

im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt und alle 3 Monate auf neuen YPG-Schrägagar 

überimpft. Für DNA-Isolierung, Färbung, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 

und Stoffwechselversuche wurden die Stämme auf YPG-Agar-Platten (ohne 

Cycloheximid) ausgestrichen und bei 30 °C (Stämme 577, 578 bei 20 °C) bis zur 

Zellernte (2 – 3 Tage) inkubiert. 

4

3.2 Oligonukleotidsonden 

Tab. 2. Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide, die an artspezifische Sequenzbereiche der LSU 

rRNA außerhalb der D1/D2 Domänen binden 

Sonde a 

Sequenz 

Relative 

Position b 

Spezifische 

c GC (%) 

Base 

26S-D.anom. 1.1 TACCGCACCCGAAGGCACT 2115-2135 3 63 

26S-D.anom. 1.2 TGTCCGCGTCTAGACACG 2150-2168 3 61 

26S-D.anom. 1.3 CGGAGGCTGGTACCTGT 2165-2183 2 65 

26S-D.anom. 2.1 GGATCAACGGCACAAAAGGC 2680-2695 3 55 

26S-D.anom. 3/4.1 CCTTAACAGAATTAAGGCGTTG 1668-1690 2 41 

26S-D.brux. 1.1 CGTCTAGGCCTCGCCGT 2145-2163 3 71 

26S-D.brux. 1.2 CAAGACCCTTCTCCCAACA 2076-2094 2 53 

26S-D.brux. 1.3 CAAGTGCACAGCTATCTCC 2103-2124 2 53 

26S-D.brux. 2.1 CGGATCAACGGCCTAATAC 2680-2696 3 53 

26S-D.brux. 3/4.1 TTACGTTGCCGTCGTAATAAATT 1737-1754 2 35 

26S-D.brux. 3/4.2 GGCATGAAGAATATCTGTCTTC 1918-1938 2 41 

26S-D.brux. 5.1 CTTACTCAAATCCCTCCGGT 879-897 2 50 

26S-B.custer. 1.1 TACCGGAACGACCGCAGT 2178-2195 5 61 

26S-B.custer. 1.2 TGTCACAGGCCTCTACATTG 2149-2171 3 50 

26S-B.custer. 1.3 TCGCAGCGTCATCCCG 2078-2097 5 69 

26S-B.custer. 2.1 CCCGGATCACCTATAGATAG 2678-2698 4 50 

26S-B.custer. 3/4.1 CTGAATATTGCTTCGTTCCTG 1916-1932 5 43 

26S-B.custer. 3/4.2 CGCTTACGTTGCCGTCTC 1740-1756 3 61 

26S-B.custer. 3/4.3 TTTACAGAGTTACCTTACTCC 1648-1668 9 38 

26S-B.nanus 1.1 TGGTCGTTACTGGGAGCT 2184-2211 4 56 

26S-B.nanus 1.2 CTCGCCTTTCGGTGTCTC 2066-2084 4 61 

26S-B.nanus 1.3 CGAAAACTGAGCTTTGCGA 2165-2183 5 47 

26S-B.nanus 1.4 TTCCAAAAACCCCGCTTCG 2085-2103 6 53 

26S-B.nanus 1.5 GTTTTCGAACAGAACAGGGC 2144-2163 6 33 

26S-B.nanus 1.6 GGTCGTAAAACTTGTAAAACT 2113-2138 8 33 

26S-B.nanus 2.1 GGACACGCCGCTTTTGCTA 2665-2688 3 58 

26S-B.nanus 3/4.1 CTTTCGATGGACACTTGATCAG 1674-1702 4 46 

26S-B.nanus 3/4.2 CGGAATCTTGACCGGG 1707-1721 2 63 

26S-B.nanus 3/4.3 CGGCTAACGTTTGAGTAAGG 1870-1880 7 50 

26S-B.nanus 5.1 TCAAATCCGGCCACCGC 872-892 4 65 

26S-B.nanus 5.3 GCGTATTGGGTTTTACTCAC 798-814 3 45 

26S-B.naard. 1.1 GGGACGCCGCCGAAGCA 2182-2198 10 77 

26S-B.naard. 1.2 CCCACCTACTCGACCCTTA 2055-2073 4 58 

26S-B.naard. 1.4 TGTCTAAGACTAGGAGAAGGA 2150-2171 7 43 

26S-B.naard. 1.5 CGCCTCTTCTACCACCCA 2076-2093 3 61 

26S-B.naard. 2.1 AATTGCCCTTTAACCGGCGT 2674-2694 5 50 

5

26S-B.naard. 3/4.1 GTAAATTAGCCTTTTGAAACGGAG 1660-1683 3 38 

26S-B.naard. 3/4.2 TTCCCTTTCGATAGGAGGCT 1687-1706 3 50 

26S-B.naard. 5.2 TCCTTCCAATAAATATCTGGATCG 865-887 2 38 

a Sonden für Dekkera anomala (D.anom.), D. bruxellensis (D.brux.), Brettanomyces custersianus 

(B.custer.), B. nanus (B.nanus) und B. naardenensis (B.naard.) 

b Die Positionsangaben beziehen sich auf Saccharomyces cerevisiae (J01355) 

c Die Nukleotide unterscheiden sich zu allen anderen Brettanomyces/Dekkera Arten und zur 

Sekundärstruktur-Sequenz von S. cerevisiae (U53879) 

6

4. Versuchsdurchführung und Ergebnisse 

4.1 Entwicklung von Art-spezifischen DNA-Sonden 

Durch die vollständige Sequenzierung der LSU rRNA-kodierenden Gensequenz (26S 

rDNA) aller fünf bisher bekannten Brettanomyces/Dekkera Arten (Tab. 3) konnten in 

dieser Arbeit hochvariable Sequenzregionen gefunden werden. Diese Bereiche 

konnten durch ein Sequenzvergleich mit dem Programm ClustalX (Thompson et al., 

1997) identifiziert werden. Dabei wurden sowohl alle Brettanomyces/Dekkera Arten 

als auch die Referenzhefe Saccharomyces cerevisiae (U53879), für die eine LSU 

rRNA Sekundärstruktur existiert (Cannone et al., 2002; http:// 

www.rna.icmb.utexas.edu) miteinander verglichen. Die fünf hochvariablen Regionen 

(V1-V5) sind hinsichtlich ihrer Position, ihrer Größe und ihrer Spezifität im Vergleich 

mit den bekannten D1/D2 Domänen in Tabelle 4 dargestellt. 

Tab. 3. Hefestämme und GenBank Accession numbers der LSU rRNA Gensequenzen 

Art Stamm a Herkunft Accession number 

D. anomala DSM 70732 T beer DQ406714 

D. bruxellensis DSM 70001 T lambic beer (Belgium) DQ406715 

B. custersianus CBS 4805 T Bantu-beer (South Africa) DQ406717 

B. nanus CBS 1945 T botteled beer (Sweden) DQ406718 

B. naardenensis CBS 6042 T lemonade (the Netherlands) DQ406719 

a DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; CBS, 

Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Niederlande 

7

Tab. 4. Spezies-spezifische Nukleotide und Sequenzlängen der hochvariablen Regione der 26S rDNA 

Relative 121 

Position a -748 

rDNA Region 

D1-D2 V1-V6 V1 V2 V3 V4 V5 V6 

802 

-3373 

2064 

-2201 

2671 

-2694 

1649 

-1740 

1872 

-1931 

802 

-884 

3300 

-3373 

Sequenzlänge 

b 385 505 137 26 100 75 89 78 

(bp) 

Spezifische Nukleotide 

D. anomala 6 19 8 3 3 - 2 3 

D. bruxellensis 13 18 7 3 3 2 2 1 

B. custersianus 46 59 16 5 18 6 1 13 

B. nanus 53 75 35 3 10 8 14 5 

B. naardenensis 48 73 43 6 10 2 7 5 

a Die Positionsangaben beziehen sich auf Saccharomyces cerevisiae (J01355) 

b Hochvariable Sequenzbereiche ohne konservierte Abschnitte. Die Sequenzlängen beziehen sich auf 

D. bruxellensis. 

Auf Basis der LSU rRNA Sekundärstruktur von S. cerevisiae ließen sich durch 

Basenaustausch sowie durch Einfügung von Insertionen und Deletionen neue, 

artspezifische Strukturen generieren. Unter Verwendung des Programms 

RNAstructure 4.2 (Zuker, 2000) wurden hochvariable Bereiche neu gefaltet und 

konnten somit ihrem nativen Zustand annähernd darstellen werden. Strukturmodelle 

der variablen Regionen sind in der folgenden Abbildung beispielhaft für die Art D. 

bruxellensis dargestellt. 

8

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9

D.brux.1.1 

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Abb. 1. (b) Sekundärstruktur der 26S rRNA von Dekkera bruxellensis (DSM 70001): (a) 5’ Ende; 

(b) 3’ Ende. Das Model basiert auf der LSU rRNA von Saccharomyces cerevisiae (U53879) 

generiert nach den Regeln von Cannone et al. (2002).Die Struktur beinhaltet die Interaktion mit 

der 5,8S rRNA. Die D1/D2 Domänen sind grau unterlegt. Rot markierte Nukleotide sind Artspezifisch 

und unterscheiden sich von allen anderen Dekkera/Brettanomyces-Arten und von S. 

cerevisiae. Variable Regionen (V1-V6) sind durch kurze Pfeile eingegrenzt und Zielregionen für 

DNA-Sonden sind mit farbigen Linien hervorgehoben 

A 

C G 

A 

G 

U 

V2

4.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung wurde mit den neu generierten, 

artspezifischen Sonden nach der bereits beschrieben Methode (Berichte Januar 

2005, August 2005) durchgeführt. Für die Präparate wurden gut angewachsene, ca. 

2 Wochen alte Hefekulturen von Agarplatten (Glucose-Pepton Medium 85, DSMZ) 

verwendet. 

Die lyophilisierten Sonden wurden mit einer Konzentration von je 50 pmol/µl in 

sterilem Aqua dest. resuspendiert und mit je 100 pmol (2 µl) im 

Hybridisierungsansatz (siehe Bericht Januar 2005) eingesetzt. Sonden und 

teilkomplementäre bzw. dirket benachbarte Sonden (‚side’ probes) wurden 

kombiniert verwendet, um die Zugänglichkeit an die Zielsequenzen zu verbessern. 

Die geeigneten Temperaturen für die Hybridisierungsreaktionen und die darauf 

folgenden Waschschritte orientieren sich an den mittleren Schmelztemperaturen (T m ) 

der DNA-Oligonukleotiden und konnten empirisch ermittelt werden (Tab. 4) 

11

Tab. 5. Ergebnisse der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit den Cy3-markierten DNA-Sonden 

Fuoreszenzsignal a 

Sonden und 

‚side’probes b T m (°C) c T H (°C) d T W (°C) d D. anom. D. brux. B. custer. B. nanus B. naard. 

26S-D.anom.1.1 64,5 60 63 + +/- - - - 

26S-D.anom.1.2 58,2 50 54 + - - - - 

26S-D.anom.1.3 57,6 50 52 + - - - - 

26S-D.anom.1.2 

26S-D.anom.1.3 

58,2 

57,6 

50 52 ++ - - - - 

26S-D.anom.2.1 59,4 55 57 +/- - - - - 

26S-D.anom.3/4.1 56,5 50 52 +/- - - - - 

26S-D.brux. 1.1 64,4 56 58 - + - - - 

26S-D.brux. 1.2 60,2 53 55 - ++ - - - 

26S-D.brux. 1.1 

26S-D.brux. 1.2 

64,4 

60,2 

56 57 - ++ - - - 

26S-D.brux. 1.3 56,7 54 56 - + - - - 

26S-D.brux. 2.1 60,2 56 57 - + - - - 

26S-D.brux.3/4.1 55,3 52 54 + + - - - 

26S-D.brux.3/4.2 56,5 52 54 +/- + - - - 

26S-D.brux.3/4.1 

26S-D.brux.3/4.2 

55,3 

56,5 

52 54 - + - - - 

26S-D.brux.5.1 57,3 54 57 +/- ++ - - - 

26S-B.custer. 1.1 62,2 54 55 - +/- - - - 

26S-B.custer. 1.2 57,3 54 57 - - ++ - - 

26S-B.custer. 1.3 56,9 50 52 - - + - - 

26S-B.custer. 1.2 

26S-B.custer. 1.3 

57,3 

56,9 

55 56 - - ++ - - 

26S-B.custer. 2.1 57,3 52 54 - - + - - 

26S-B.custer.3/4.1 55,9 52 54 - - + - - 

26S-B.custer.3/4.2 58,2 52 54 - +/- + - - 

26S-B.custer.3/4.3 54 52 54 - - + - - 

26S-B.custer.3/4.1 



55,9 

58,2 

54,0 

53 54 - - ++ - - 

26S-B.nanus 1.1 56 53 55 - - - +/- - 

12

26S-B.nanus 1.2 58,2 53 55 - - - +/- - 

26S-B.nanus 1.1 


56 

58,2 

53 55 - - - + - 

26S-B.nanus 1.3 54,5 48 51 - - - - - 

26S-B.nanus 1.4 56,7 50 52 - +/- - - - 



54,5 

56,7 

48 51 - +/- - +/- - 

26S-B.nanus 1.5 57,3 52 54 - - - - - 



56,7 

57,3 

52 54 - - - - - 

26S-B.nanus 1.6 54,8 52 54 +/- +/- - - - 



57,3 

54,8 

48 51 +/- - - - - 

26S-B.nanus 2.1 58,8 50 54 - - - ++ - 

26S-B.nanus 3/4.1 58,4 52 54 - - - - - 

26S-B.nanus 3/4.2 54,3 52 54 - - - +/- - 

26S-B.nanus 3/4.1 

26S-B.nanus 3/4.2 

58,4 

54,3 

52 54 - - - + - 

26S-B.nanus 3/4.3 57,3 50 54 +/- - - +/- - 

26S-B.nanus 5.1 57,6 53 55 - - - + - 

26S-B.nanus 5.3 58,4 56 57 - - - ++ - 

26S-B.naard. 1.1 62,4 58 59 - - - - +/- 

26S-B.naard.1.2 58,8 53 55 - - - - + 

26S-B.naard.1.1 

26S-B.naard.1.2 

62,4 

58,8 

54 56 - - - - ++ 

26S-B.naard. 1.4 56,5 50 52 - - - - +/- 

26S-B.naard. 1.5 58,2 53 55 - - - - + 

26S-B.naard. 1.4 


56,5 

58,2 

55 56 - - - - ++ 




62,4 

56,5 

58,2 

54 58 +/- +/- +/- +/- ++ 

26S-B.naard.2.1 57,3 52 54 +/- +/- - - + 

26S-B.naard.3/4.1 57,6 52 54 - - - - + 

26S-B.naard.3/4.2 57,3 52 54 - - - - + 

13

26S-B.naard.3/4.1 

26S-B.naard.3/4.2 

57,6 

57,3 

52 54 - - - - ++ 

26S-B.naard.5.2 57,6 52 54 - - - - + 

a Visuelle Klassifizierung in vier Kategorien: - kein Signal, +/- niedrig, + mittel, ++ hoch 

b Die Sonden wurden einzeln getestet und in Kombination mit mindestens einer ‚sideprobe’ 

c Die Schmelztemperaturen basieren auf den Angaben der Hersteller 

d Verschiedene Temperaturen wurden für die Hybridisierung (T H ) und die Waschritte (T W ) ausprobiert.Die 

optimalen Temperaturen sind hier gezeigt. 

14

(a) 

(b) 

(c) 

(d) 

(e) 

(f) 

(g) 

(h) 

(i) 

(j) 

(j) 

(k) 

(l) 

(m) 

(n) 

(o) 

15

Abb. 2. Mikroskopische Aufnahmen aller Dekkera/Brettanomyces Hefespezies nach Fluoreszenz in 

situ Hybridisierung mit Art-spezifischen, Cy3 markierten DNA Sonden und Gegenfärbung mit DAPI. Es 

wurden Reinkulturen und Zellmischungen aus allen fünf Dekkera/Brettanomyces Arten verwendet. 

Dargestellt sind Phasenkontrast-Aufnahmen ohne Fluoreszenz (a, d, g, j, m), fluoreszenzmikroskopische 

Aufnahmen mit Kombinationsfilter (b, e, h, k, n) für Cy3 (pink) und DAPI (blau) sowie 

mit Cy3-Sondenfilter (c, f, i, l, o) (orange), Vergr.: 1000x. Dekkera anomala wurde mit den Sonden 

26S-D.anom. 1.2, 1.3 in einer Speziesmischung (a, b) und in Reinkultur (c) hybridisiert. D. bruxellensis 

mit der Sonde 26S-D.brux. 1.2 in Speziesmischung (d, e) und in Reinkultur (f). Brettanomyces 

custersianus mit der Sonde 26S-B.custer. 1.2 in Speziesmischung (g, h, i). B. nanus mit der Sonde 

2.1 in Speziesmischung (j, k) und in Reinkultur (l). B. naardenensis mit den Sonden 26S-B.naard. 1.1, 

1.2 in Speziesmischung (m, n) und in Reinkultur (o). 

16

4.3 Untersuchung der regionalen Verbreitung 

Die Proben wurden in semiselektivem Hefe-Medium (Glucose-Pepton-Medium 85, 

DSMZ) mit Ampicillin und Cycloheximid vorkultiviert, um auch geringe Zellzahlen, die 

unterhalb der praktischen Auflösungsgrenze von ca. 15 Zellen pro ml liegen, mittels 

FISH detektieren zu können. Ampicillin inhibiert hierbei bakterielles Wachstum und 

Cycloheximid die Vermehrung der meisten unerwünschten, eukaryotischen 

Mikroorganismen, die sensitiv auf dieses Antibiotikum reagieren. Nach 

anschließender Inkubation auf ebenfalls semiselektivem Agarmedium konnte dann 

ein Wachstum von apikulaten Hefen festgestellt werden. Anhand ihrer 

unterschiedlichen Koloniemorphologien ließen sich aus den meisten Proben mehrere 

Stämme isolieren. Durch Anwendung der bereits beschriebenen Fluoreszenz in situ 

Hybridisierung (Bericht Januar und August 2005) mit spezifischen 18S rRNA-Sonden 

konnten alle Isolate als Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera identifiziert 

werden. 

Die Weinprobennahme zur Untersuchung der regionalen Verbreitung von 

Dekkera/Brettanomyces Hefen in der deutschen Weinbauregion Rheinhessen 

erfolgte in den Bereichen Wonnegau, Nierstein und Bingen. Sie umfasste 110 

willkürlich ausgesuchte Winzerbetriebe mit Holz- und/oder Barriqueausbau. In 15 % 

dieser Betriebe konnte eine Infektion mit Dekkera bruxellensis in mindestens einem 

Wein mit unserer neue FISH-Methode nachgewiesen werden. Insgesamt wurden 

hierbei 291 Rotweinproben untersucht. Obwohl verschiedene Stämme auch aus 

Weißwein und Sekt isoliert werden konnten (diese Arbeit) begünstigt gerade Rotwein 

in hölzernen Gebinden das Vorkommen dieser Hefen. Dies hat unter anderem 

folgende Gründe: Bei der Rotweinherstellung gelangen aus der Beerenschale, den 

Samen und dem Stielgerüst mehr Phenolsäure-Verbindungen in die Maische als bei 

anderen Weinen. Diese Zimtsäurederivate (insbesondere p-Cumarsäure und 

Ferulasäure) können als Precursor-Verbindungen von Brettanomyces/Dekkera Hefen 

zu flüchtigen Etylphenolen umgewandelt werden und ergeben das charakteristische 

„Brett-Aroma“ (Chatonnet et al., 1995, 1997). Der Ausbau im Holzfaß oder Barrique 

ermöglicht selbst bei niedrigstem Restzuckergehalt (< 1 g L -1 ) das Überleben dieser 

Spezies aufgrund der Fähigkeit zur Verwertung von Cellulose-Fragmenten 

17

(Cellodextrine, Cellobiose). Die poröse und schwer zu reinigende Oberfläche des 

Holzes bietet beste Möglichkeiteten zur Überdauerung dieser Mikroorganismen, die 

mit ihrem Pseudomycel in Ritzen und Spalten der Fässer eindringen und dort 

geschützt lange Zeit überdauern können. Darüberhinaus führt der erhöhte 

Sauerstoffkontakt bei der Rotweinbereitung durch das mehrfache Umfüllen und die 

Mikroaerobisierung im Holz- oder Barriquefaßausbau zu einer erhöhten 

Fermentationsleistung (Custers-Effekt) von Brettanomyces/Dekkera Hefen (Rose & 

Harrison, 1993). Einen Selektionsvorteil gegenüber vielen anderen Weinhefen erhält 

diese Gattung im Rotwein auch aufgrund ihrer besonders hohe Alkoholtoleranz von 

bis zu 15 vol % Alkohol (Dittrich & Großmann, 2005). 

18

Weinproben ohne Brettanomyces-Infektion 

Weinproben mit Brettanomyces-Infektion 

Abb. 3. Ergebnis der Untersuchung der regionalen Verbreitung von Hefen der Gattungen 

Brettanomyces/Dekkera in den Bereichen Wonnegau und Nierstein der Weinbauregion Rheinhessen. 

19

4.4 Stammdifferenzierung 

Aus 7 % der 273 untersuchte Weinproben aus Rheinhessen konnten mehrere, 

bereits morphologisch unterscheidbare Stämme isoliert werden. Dabei traten 

mindestens zwei charakteristische Koloniemorphologien regelmäßig in den 

verschiedenen Kulturansätzen auf (siehe Bericht August 2005). Durch 

Ansequenzierung der Spezies-spezifischen 18S rDNA bzw. 26S rDNA und 

anschließender Datenbankanalyse (Blast search, Genebank) wurden alle 

Isolate als Vertreter der einen Art Dekkera bruxellensis identifiziert. Insgesamt 

wurden 28 Stämme der Art D. bruxellensis aus Rheinhessen-Wein isoliert. Eine 

Stammdifferenzierung konnte genetisch über eine neue SAPD-PCR-Methode 

(Pfannebecker, 2005; Fröhlich & Pfannebecker, 2006) vorgenommen werden. 

Darüberhinaus konnte eine Stammdifferenzierung und -charakterisierung 

physiologisch mit einem Mikrotiterplatten-Test (Biolog, Hayward, USA) erfolgen 

(Praphailong et al., 1997). Die Fähigkeit zur Oxidation oder Fermentation eines 

bestimmten Substrats im Test durch ein Isolat ergab hierbei ein 

stammspezifisches Stoffwechselmuster (Abb. 4, 6). Diese physiologischen 

„Fingerabdrücke“ konnten miteinander verglichen werden (Alignment) und nach 

einer Clusteranlyse die Beziehungen untereinander graphisch dargestellt 

werden (Cluster-Baum, Abb. 5). Auf Basis dieser stammspezifischen 

Verwandschaftsverhältnisse ließen sich sogar erste Hinweise auf 

regionsbezogene (topographische) Verbreitungswege erkennen (Abb. 7). 

20

Tab. 6. Brettanomyces/Dekkera Eigenisolate aus Weinproben 

Stamm Gattung / Art Isoliert aus Herkunft Region 

9A Dekkera bruxellensis Spätburgunder Schafhausen Wonnegau 

9B D. bruxellensis Spätburgunder Schafhausen Wonnegau 

30A D. bruxellensis St. Laurent Alsheim Nierstein 

30B D. bruxellensis St. Laurent Alsheim Nierstein 

34A D. bruxellensis Cabernet Sauvignon Mettenheim Nierstein 

34B D. bruxellensis Cabernet Sauvignon Mettenheim Nierstein 

35A D. bruxellensis Merlot Mettenheim Nierstein 

35B D. bruxellensis Merlot Mettenheim Nierstein 

75A D. bruxellensis Dornfelder Abenheim Wonnegau 

75B D. bruxellensis Dornfelder Abenheim Wonnegau 

76 D. bruxellensis Dornfelder Abenheim Wonnegau 

115 D. bruxellensis Portugieser Flomborn Wonnegau 

128 D. bruxellensis Cabernet Sauvignon Framersheim Wonnegau 

179A D. bruxellensis Cabernet Sauvignon Weinolsheim Nierstein 

179B D. bruxellensis Cabernet Sauvignon Weinolsheim Nierstein 

183A D. bruxellensis Frühburgunder Uelversheim Nierstein 

183B D. bruxellensis Frühburgunder Uelversheim Nierstein 

190A D. bruxellensis Portugieser Dolgesheim Nierstein 

190B D. bruxellensis Portugieser Dolgesheim Nierstein 

198 D. bruxellensis Dornfelder Alzey Wonnegau 

199 D. bruxellensis Dornfelder Alzey Wonnegau 

200 D. bruxellensis Spätburgunder Alzey Wonnegau 

230 D. bruxellensis Dornfelder Biebelnheim Nierstein 

238A D. bruxellensis Cuvee Gau-Odernheim Nierstein 

238B D. bruxellensis Cuvee Gau-Odernheim Nierstein 

243 D. bruxellensis St. Laurent Bermersheim Nierstein 

244A D. bruxellensis Regent Bermersheim Nierstein 

244B D. bruxellensis Regent Bermersheim Nierstein 

259A D. bruxellensis Dornfelder Hechtsheim Nierstein 

259B D. bruxellensis Dornfelder Hechtsheim Nierstein 

260A D. bruxellensis Dornfelder Hechtsheim Nierstein 

260B D. bruxellensis Dornfelder Hechtsheim Nierstein 

282 D. bruxellensis Spätburgunder Ingelheim Bingen 

283 D. bruxellensis Regent Ingelheim Bingen 

295 D. bruxellensis Dornfelder Großwinternheim Bingen 

296 D. bruxellensis Dornfelder Großwinternheim Bingen 

299 D. bruxellensis Merlot Gau-Algesheim Bingen 

21

1 

0,9 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

B. naardenensis 

B. nanus 

B. custersianus 

D. bruxellensis 

D. anomala 

Abb. 4. Graphische Darstellung der physiologischen Messdaten aus dem Biolog-Test. Die 

photometrisch bestimmten Wachstumsaktivitäten (Y-Achse, relative Einheiten) der fünf 

Brettanomyces/Dekkera Arten (Z-Achse) in Bezug auf die jeweiligen Substrate (X-Achse) 

ergeben die spezifischen Stoffwechselmuster (metabolic fingerprint). 

Die Verwandschaftsbeziehungen durch den BIOLOG-Test stimmen mit den 

phylogenetischen Ergebnissen durch Sequenzvergleich überein (Abb. 5). Eine 

Differenzierung auf Stammniveau ist durch LSU rDNA-Sequenzanalysen jedoch 

nicht möglich. 

22

26S rDNA-Sequenzvergleich 

Biolog Clusteranalyse 

B. naardenensis (CBS 6042 T ) 

DQ406719 

B. nanus (CBS 1945 T ) 

DQ406718 

B. custersianus (CBS 4805 T ) 

DQ406717 

D. bruxellensis (Isolat CE 120) 

DQ406715 

D. bruxellensis 

(DSM 70001 T ) 

DQ406716 

0,01 

D. anomala (DSM 70732 T ) 

DQ406714 

0,1 

Abb. 5. Gegenüberstellung der Verwandschaftsverhältnisse auf Basis des 26S rDNA 

Sequenzvergleichs (links) und aufgrund der Clusteranalyse von physiologischen (Biolog-Test) 

Messdaten (rechts). Die Arten sind mit Herkunft (DSM, Deutsche Sammlung von 

Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; CBS, Centraalbureau voor 

Schimmelcultures, Utrecht, Niederlande; T, Typstamm) und Sequenzhinterlegung (NCBI, 

Genbank Accession numbers) bezeichnet. Die Maßstäbe stellen die jeweiligen Unterschiede in 

Prozent dar (1 % Sequenzunterschied, bzw. 10 % Unterschied im Stoffwechselmuster). 

Die Stoffwechsel-Muster der Eigenisolate (Abb. 6) führten dagegen zu einer 

eindeutigen Differenzierung und ermöglichten die Einordnung in verschiedene 

Cluster. Die isolierten Stämme zeigen ein sehr vielfältiges 

Stoffwechselspektrum. Es gibt regelrechte Überlebenskünstler, die sehr viele 

unterschiedliche Saccharide verstoffwechseln können, aber auch Stämme, die 

nur Glucose verwerten können. 

23

wat e r 

L- p r oline 

s ucr o se 

dex t r in 

glyc er ol 

wat e r 

D- x ylose 

adon it ol 

xy lit ol 

glyc er ol 

s ucr o se 

de xt r in 

a r but in 

D- r ib ose 

D.brux.G5 

D.brux.G1 

D.brux.200 

D.brux.198 

D.brux.190B 

D.brux.190A 

D.brux.183B 

D.brux.183A 

D.brux.179B 

D.brux.153A 

D.brux.128 

D.brux.115 

D.brux.76A 

D.brux.75A 

D.brux.35A 

0,9 1 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

N- ace t yl- D- gluco sam ine 

ge nt iobio se 

f o r mic acid 

D- gala ct os e 

malt ot r ios e 

suc cinic acid 

L - sor bose 

D- me libiose 

L- a spar t ic ac id 

D- man nit ol 

D- r af f in ose 

D- a r abit o l 

t ur anos e 

N- ac et yl- D- gluc osam ine 

g ent io biose 

D- m annit ol 

L- m alic acid 

α- D- gluc ose 

N- a cet y l- L- glu t am ic ac id+D- x ylose 

malt ot r ios e 

b r om o suc cinic acid 

D- psic ose 

D- glucu r onic acid + D- xylose 

D- m elibios e 

g - amin o bu t yr ic acid 

L - sor bose 

α - D- lac t ose + D- xylos e 

D- r a f f inos e 

2- k et o- D- gluc onic acid 

β- me t hyl- D- gluc oside 

D- gala ct ose + D- xylo se 

L- ar abin ose 

1, 2- pr opa nedio l + D- xylos e 

t ur ano se 

D.brux.34A 

D.brux.30B 

D.brux.30A 

D.brux.9B 

D.brux.9A 

Abb. 6. Graphische Darstellung der physiologischen Messdaten aus dem Biolog-Test. Die 

photometrisch bestimmten Wachstumsaktivitäten (Y-Achse, relative Einheiten) von 20 

D. bruxellensis Stämmen (Z-Achse) in Bezug auf die jeweiligen Substrate (X-Achse) ergeben 

die spezifischen Stoffwechselmuster (metabolic fingerprint) der Eigenisolate. 

24

Setzt man nun die Ergebnisse der Clusteranalyse mit der geographischen 

Herkunft der Isolate in Beziehung lassen sich erste Anhaltspunkte für eine Süd- 

Nord Verbreitung erkennen (Abb. 7). Ob diese Beziehungen anthropogenen 

Einflüssen unterliegen oder durch Tiere, insbesondere Vogelschwärme, 

beeinflusst werden, bleibt zu untersuchen. Eine Verschleppung von Stämmen 

ist zum Beispiel bei den Isolaten 30A und 30B zu erkennen, die zwar aus dem 

selben Wein isoliert wurden, aber in getrennten Bereichen clustern. Der 

Astverlauf zu Isolat 190 muß durch weitere Stammisolate noch bestätigt 

werden. 

Bingen 

179 

183 

190 

Nierstein 

198 

200 

9A 

9B 128 

34 

35 

30A 

30B 

115 

75 

76 

Wonnegau 

Abb. 7. Darstellung der geographischen Herkunft von 15 D. bruxellensis Stämmen in 

Rheinhessen. Die Verbindungslinien beschreiben die auf Basis der Stoffwechselmuster 

analysierten Verwandschaftsverhälnisse der Eigenisolate (Cluster-Analyse) unter 

Berücksichtigung der topographischen Gegebenheiten in der Verbreitungszone. 

25

5. Diskussion 

Die vollständige Sequenzierung der LSU ribosomalen RNA Gene (26S rDNAs) 

der bisher bekannten Brettanomyces bzw. Dekkera Arten D. anomala, D. 

bruxellensis, B. custersianus, B. naardenensis und B. nanus führte im Rahmen 

dieses Projekts zur Entdeckung besonders geeigneter Zielregionen für ein 

spezifisches und effizientes Sonden-Design. Neben den rein wissenschaftlichen 

Aspekten dieser Arbeit, wie die Hinterlegung des Sequenzdatenmaterials in 

einer öffentlichen Datenbanken (Tab. 3) oder die neu definierten 

phylogenetischen Verwandschaftsverhältnisse dieser Hefearten (Abb. 5; vergl. 

Kurtzmann & Robnett, 1998) konnte auch ein wesentlicher Beitrag für die 

praktische, bedarfsorientierte und oenologisch relevante Anwendung geleistet 

werden. 

Durch den Vergleich der kompletten 26S rDNA-Sequenzen der 

Dekkera/Brettanomyces Hefearten wurden wenigstens sechs hochvariable 

Regionen (V1-V6, Tab. 4) neben den bisher am meisten verwendeten aber 

patentrechtlich geschützten D1/D2 Domänen (Hyldig-Nielsen, 2000) identifiziert. 

Im Vergleich mit den Ergebnissen anderer Arbeiten, die Variabilitäten der LSU 

rRNA Gensequenzen in Brettanomyces (Yamada et al., 1994) oder in der 

Pilzgattung Coprinus untersuchten (Hopple & Vilgalys, 1999) zeigt sich, daß 

einige in unserer Arbeit definierten Bereiche (Tab. 4) auch dort zu den 

divergentesten gehören. Übereinstimmungen lassen sich auch anhand einer 

hinterlegten LSU rRNA Variabilitäts-Karte von Saccharomyces cerevisiae (Ben 

Ali et al., 1999; http://www.psb.ugent.be/rRNA/varmaps/Scer_lsu.html) finden. 

Neben der notwendigen Spezifität der Zielregionen für die Fluoreszenz in situ 

Hybridisierung spielt die tatsächliche Zugänglichkeit dieser Bereiche für die 

Sonden eine nicht weniger bedeutende Rolle. Unser Sonden-Konzept 

erleichtert die Hybridisierung und verstärkt folglich das Fluoreszenzsignal durch 

die Verwendung teilweise komplementärer oder direkt benachbarter 

Gemeinschafts-Sonden (‚side’ probes, Röder et al., 2007). Diese verbessern 

26

die Zugänglichkeit der hochstrukturierten rRNA wesentlich, wie man aufgrund 

unterschiedlicher Signalstärken in vergleichenden Ansätzen (Einzel-Sonde / 

Sondenmischung) deutlich erkennen kann (Tab. 5). Diese Ergebnisse stimmen 

mit denen einer früheren Studie überein (Fuch et al, 2000), die eine signifikante 

Verbesserung der FISH mit unmarkierten Helfersonden, die an die 16S rRNA 

von Escherichia coli binden, beschreibt. Durch die zusätzliche 

Fluoreszenzmarkierung an unseren Gemeinschafts-Sonden wird das Signal 

darüber hinaus weiter verstärkt. Dies ermöglicht ein besseres Kontrastverhältnis 

zu der teilweise störenden Eigenfluoreszenz von Weinbestandteilen und 

speicherstoffhaltigen Fremdhefen in der Untersuchungsprobe. 

Unter den vielen anderen Methoden, die der Detektion und Identifizierung von 

Mikroorganismen in Lebensmitteln dienen, wie der Kultivierung auf selektiven 

Nährmedien oder diversen molekularbiologischen Assays (Loureiro &Malfeito- 

Ferreira, 2003) vereint die Fluoreszenz in situ Hybridisierung die Vorteile einer 

Zellzahlbestimmung mit den Möglichkeiten einer spezifischen 

Differenzierungsmethode. Dabei kann in vielen Fällen, in Abhängigkeit von der 

Zellzahl in der Untersuchungsprobe, auf eine Vorkultivierung verzichtet werden. 

Gegenüber molekularbiologischen Techniken bietet die FISH neben der 

Zeitersparnis (die Hybridisierung dauert ca. 3 bis 4 Stunden) eine 

vergleichsweise einfache Durchführung und Interpretation der Ergebnisse. In 

einer früheren Studie (Stender et al., 2001) wurden PNA (peptidähnliche 

Nukkleinsäure Sonden) Sonden für eine Identifizierugn von D. bruxellensis 

eingesetzt. Trotz ihrer bemerkenswerten Eigenschaften für Hybridisierungs- 

Versuche, wie ihre hohe Sensitivität und Spezifität, bleiben PNA Sonden für 

Routineanalysen in der Weinindustrie aufgrund ihrer Herstellungskosten (ca. 

10-20 mal höher als die von uns verwendeten DNA-Sonden) eher 

uninteressant. Ein weiterer Vorteil der in diesem Projekt entwickelten FISH 

Methode ist die Möglichkeit, diese mit einer Lebend- bzw. Totzellenfärbung zu 

kombinieren. Dies ist ein sehr nützlicher Nachweis bei Beurteilung der 

tatsächlichen Auswirkung einer Infektion auf den Wein. 

Eine Detektion von D. bruxellensis in der Untersuchungsprobe führt nicht 

konsequent zu einer Beeinträchtigung der Weinqualität. Vor dem Hintergrund, 

27

daß Stämme dieser Hefeart bei der Herstellung bestimmter Biersorten (Lambic, 

Stout) gezielt eingesetzt werden und diese Aromanoten in bestimmten 

Rotweinen ein internationales Flair implizieren wird der Einfluß von 

Brettanomyces-typischen Metaboliten immer noch kontrovers diskutiert. In 

Abhängigkeit von der Intensität ergeben sich durchaus positive Effekte auf die 

geschmackliche Komplexität, die von der überwiegenden Mehrheit der 

Weintrinker geschätzt wird (Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2003). 

Die Untersuchung der regionalen Verbreitung dieser Wildhefe ergab, daß die 

weinrelevante Art Dekkera bruxellensis im Untersuchungsgebiet (Bereich 

Wonnegau, Teile des Bereichs Nierstein und Bingen) weiter verbreitet ist als 

allgemein von Winzern und Oenologen angenommen wird (persönliche 

Mitteilungen). Das vorliegende Projekt liefert diesbezüglich zum ersten Mal 

überhaupt in der deutschen Brettanomyces-Forschung publizierte Ergebnisse 

(Röder et al., 2007). 

Zusammenfassend: 

In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß sich mehrere Sequenzregionen hinter den 

D1/D2 Domänen der LSU rDNA befinden, die eine hohe Art-spezifische 

Variabilität aufweisen. Diese Bereiche sind sowohl für phylogenetische 

Analysen als auch für Detektions- und Identifizierungsmethoden, wie die 

Fluoreszenz in situ Hybridisierung, von Dekkera/Brettanomyces Hefen 

geeignet. Es besteht Grund zur Annahme, daß sich diese Zielregionen für die 

Sondenentwicklung auch auf andere Weinhefen übertragen lassen (vergl. 

Literatur zum Thema variable LSU rRNA Genregionen am Beginn der 

Diskussion). Das Ziel, eine Verstärkung der Fluoreszenzsignale in der FISH zu 

ermöglichen, konnte durch ein neues Sonden-Konzept realisiert werden. Die 

Generierung von fluoreszenzmarkierten Gemeinschafts-Sonden (‚side’ probes), 

die einerseits die in situ Zugänglichkeit der Zielregionen wesentlich verbessern 

und zusätzlich das Signal verstärken trägt zu einer deutlichen Verbesserung der 

bisher beschriebenen FISH-Methoden bei. Mit Eine Stammdifferenzierung und 

Cluster-Analyse auf Basis physiologischer Fingerprint-Experimente ermöglicht 

„Traceability“, die Rückverfolgbarkeit von weinrelevanten Mikroorganismen, wie 

28

z. B. Stämme der Hefe D. bruxellensis. Die in diesem Projekt entwickelte 

schnelle, spezifische und kostengünstige Nachweismethode fördert individuell 

eine prozessbegleitende Qualitätssicherung und eine vorausschauende 

Kellerwirtschaft. 

29

6. Literaturverzeichnis 

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32

Abb. 8 (a) 

(a) 

D.anom.1.2 

A 

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C 

G 

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(d) 

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3’ 

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33 

(f) 

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(h) 

(i) 

3’ 5’ 

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V6

Abb. 8 (b) 

(k) 

A 

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B.custer.1.2 

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34 

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(s) 

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G 

A 

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A 

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A A GU 

G 

A 

A 

V5 

U 

A 

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A 

G U G U U U G G G U G A G 

U 

A A 

U 

G 

A 

C G C A AC C C A 

G UA 

G 

V6 

A A A 

B.nanus 5.3 

CU AU A C C A AGG 

U 

A 

C 

GC 

G 

G 

G G C G U A C A U G C G G G C G G G C G 

C U G U G A 

A 

U 

A 

A G C 

3’ 

A G 

U U G U G C G C U U G C C C G 

C G 

5’

Abb. 8 (c) 

35 

(u) 

B.naard.1.4 

U 

C 

C 

U 

C 

U 

U 

C 

C 

U 

U 

U 

U 

U 

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G 

G 

G 

A 

G 

A 

A 

G 

A 

G 

C 

U 

U 

C 

G 

G G A 

G 

A 

A 

V1 

A G A C 

G U C U U A C C 

U 

A 

G 

B.naard.1.5 

G G G G G U A 

U 

B.naard.1.2 

B.naard.1.1 

G 

U 

C 

G 

U 

U 

U C C A U UAG 

U G G G 

G 

G 

A 

U 

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C 

U 

U 

C 

G 

C 

G 

G 

C 

C 

C 

C 

G 

G 

U 

5’ 3’ 

C 

C 

U 

A 

C A U U 

C A 

G 

A 

C 

C A 

C A 

U 

U 

A 

G 

A 

A 

U 

(v) 

C 

C GAA G 

C A 

G 

C 

C 

A 

G 

G 

U 

U 

U 

C 

G 

A 

V2 

G 

GUC 

U 

C U 

A C 

A 

U C U 

5’ 

3’ B.naard.2.1 

A 

A 

G 

C 

A A 

A 

C G C C G G U 

U 

A 

C G G G A A 

(w) 

B.naard.3/4.1 

A C C 

U C C G U U U 

A 

A 

G 

G G G U 

A 

A 

A 

U 

U 

A 

A 

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C 

G 

G 

A A 

G 

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A 

A 

C 

U 

U 

U 

A 

G 

C 

C 

U 

C 

C 

G 

A 

A 

V3 

G G 

C U 

U 

A 

U C GA A A G A A U 

G G 

B.naard.3/4.2 

C C U 

U A 

U A G U CG 

A A U A 

U U 

U U 

C 

C 

A 

G 

5’ 3’ 

A U G 

C C 

U 

U 

U G G 

U 

G A G A G 

G 

U 

A 

U 

U 

A 

A 

A 

U 

C 

U U G G 

AU A U G G U 

A 

G 

U 

C 

G 

U 

A A 

C C G U A C U U 

U 

U 

A 

G 

G 

A UAACACG 

U 

U 

U 

G G G U U U U A U G G C U G G A 

A 

C C C A AA U C U G A C G 

U C 

A 

G 

A 

A 

C U U G 

U U 

U C U U A C C G C G G C C U C 

U 

U 

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U A G G A G G G C G U C G 

U U G 

U U 

U 

U 

G C C 

U G 

C A 

C G U 

A 

C G 

A 

A 

C 

G 

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A 

A 

A 

C 

A 

C 

G 

G 

G 

U 

A 

U 

G 

G 

A 

A 

U G U G G GA C G CCG C 

G 

A G 

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A U 

G A A G 

A 

A 

G 

G C 

C 

U 

C 

A 

U 

G 

A 

V4 

(x) 3’ 5’ 

A 

U 

U 

U 

(y) 

U U G G A 

AA U A A 

G G A U U G G U 

A 

U 

A 

A C C U 

G 

B.naard.5.2 

G G 

A 

A G C 

C A 

G C 

U C 

C A CG 

G 

C 

G 

G 

G 

C 

A 

U 

A 

G 

G 

A 

C 

G 

G 

A 

G 

C 

C 

C 

U 

U 

A 

C 

G 

G A G C A U A 

A G U 

G 

A 

A 

V5 

U 

A 

U 

G 

C GA 

G U G U U U G G G U G G 

C G C A AC U C A A 

G AC 

A 

A A 

U 

G 

A 

U A C C A AGG 

CGA U 

G 

C 

G 

A 

G 

C G U U C U C A C G 

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A 

A G 

G C 

C 

U U G G G U G U 

C U G C C G G 

G A 

A C U 

3’ 5’ A 

V6 

U 

A 

A 

35

Abb. 8. Modelle der variablen LSU rRNA Regionen. Die Strukturen sind Ausschnitte aus den 

Gesamtstrukturen von D. anomala (a-e), D. bruxellensis (f-j), B. custersianus (k-o), B. nanus (p-t) und 

B. naardenensis (u-y). Sie basieren auf der LSU rRNA von S. cerevisiae gemäß den Vorgaben von 

Canone et al. (2002) und nach Anwendung von RNAstructure 4.2. Die Begrenzung der variablen 

Bereiche (V1-V6) ist zum Teil durch kurze Pfeile dargestellt. Rot markierte Nukleotide sind 

artspezifisch und unterscheiden sich von allen anderen Brettanomyces/Dekkera Arten und von S. 

cerevisiae. Zielregionen für DNA Sonden sind mit farbigen Linien markiert. Die Sonden für die 

gestrichelten Bereiche wurden noch nicht getestet. 

36

Molekulare Sonden für die sichere Identifizierung von Spezies der ...

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