1 Einleitung - repOSitorium - Universität Osnabrück

Entwicklung und Einsatz 

der 

Immun-SERS-Mikroskopie 

zur 

Gewebe-basierten Tumordiagnostik 

Dissertation zur Erlangung des 

naturwissenschaftlichen Doktorgrades 

der Universität Osnabrück 

vorgelegt von 

Mohammad Salehi 

aus Teheran 

Osnabrück, April 2013

Eingereicht am: . . . . . . . . . . . . . . . 

im Fachbereich Physik 

1. Gutachter: Prof. Dr. S. Schlücker 

2. Gutachter: PD. Dr. J. Packeisen 

der Dissertation 

1. Prüfer: Prof. Dr. S. Schlücker 

2. Prüfer: PD. Dr. J. Packeisen 

3. Prüfer: Prof. Dr. H. Schrempf 

4. Prüfer: Dr. K. Kömpe 

im öffentlichen Promotionskolloquium 

Tag des öffentlichen Promotionskolloquiums: . . . . . . . . . . . . . . . 

Doktorurkunde ausgehändigt am: . . . . . . . . . . . . . . .

























1 Einleitung 


Laut Pressemitteilung des Robert Koch-Instituts vom 21.02.2012 wird die Anzahl der 

Krebsneuerkrankungen in der Bundesrepublik Deutschland im Jahr 2012 auf ca. 

490,000 Fälle geschätzt. Dabei wird der Prostatakrebs mit 25 Prozent als die 

häufigste Krebserkrankung bei Männern in Deutschland diagnostiziert. [1] Bei den 

meisten Krebsarten hängen die Überlebenschancen der Krebspatienten stark von 

einer frühzeitigen Diagnose ab. Eine rechtzeitige Diagnose des Krebses, solange er 

gutartig ist, kann sogar zur vollständigen Genesung des Patienten führen. [2] Für die 

Entstehung einer Krebserkrankung wurden bisher verschiedene Ursachen 

nachgewiesen. Als wichtigste darunter können Viren, Strahlen und Chemikalien 

genannt werden. [2-6] Die unterschiedlichen Ursachen haben ein gleiches Ereignis zur 

Folge, nämlich die genetische Veränderung der Zellen. Durch diese Veränderungen 

werden die biologischen Funktionen bestimmter Gene entweder eingeschränkt oder 

verstärkt. [7] Der Mechanismus der Ansammlung von Mutationen und deren klonaler 

Selektion wurde in einem Multi-Hit-Modell beschrieben. [8] In der Regel verlieren die 

Tumorzellen nach einer ersten Mutation zuerst einen kleinen Wachstumsvorteil, 

können aber das veränderte Gen an nachkommende Zellen weitergeben. [7] 

Die Umwandlung der normalen Zellen in maligne Tumoren (Transformation) verlangt 

noch weitere Mutationen, die in genveränderten Zellen permanent akkumuliert 

werden. [8] Dieser Prozess erstreckt sich manchmal über Jahrzehnte. Daher ist die 

Aussage, dass Krebs eine altersbedingte Erkrankung sei, meistens zutreffend. Nach 

der zweiten oder dritten Mutation unterliegen die veränderten Zellen nicht mehr der 

Wachstumsregulation und wachsen in Folge schneller als normale Zellen. Da die 

Tumorzellen ursprünglich aus einer Zelle stammen und genetisch ähnlich sind, 

wurde diese Vermehrung klonale Expansion genannt. [7] Ab einer gewissen Größe 

sezernieren die gebildeten Tumore die Sauerstoffmangel-Faktoren wie HIF-1α und 

HIF-2α (Hypoxia Inducible Factor) und setzten eine neue Gefäßbildung 

(Angiogenese) in Gang. [9-11] Wie normale Zellen während der Proliferation behalten 

die Tumorzellen vorläufig noch die Zell-Zell-Kontakte; diese gehen aber später 

verloren und die Zellen können in Bindegewebe invadieren. [12] 

Die Tumoren, die in der Regel nur proliferieren und noch keine Angiogenese 

hervorgerufen haben, sind als benigne oder gutartige Tumoren bekannt. [12] Solche 

Zellen bekommen noch die Nahrung und Sauerstoff durch Diffusion und ihr 

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Durchmesser ist meist kleiner als 1-2 Millimeter. [13] Die malignen Tumoren sind 

meistens größer als 1-2 Millimeter und werden durch Gefäße mit Blut versorgt. Die 

Zellen sind auch fähig, sich vom Tumor abzulösen und neue Tochtertumoren zu 

bilden bzw. zu metastasieren. Die Reifung der Krebserkrankung wurde von 

Onkologen in drei Stufen unterteilt: 1. Die Initiationsphase, in der die maligne 

Transformation ausgelöst wird, 2. Die Promotionsphase, in der die klonale Expansion 

stattfindet und 3. Die Progressionsphase oder Phase des Tumorwachstums. [14] Die 

Molekulare Onkologie befasst sich intensiv mit dem Thema Karzinogenese um 

dadurch eine bessere Prognose für krebskranke Patienten zu ermöglichen. Von der 

Entstehung bis zum Ausbruch des Krebses als Krankheit gibt es verschiedene 

Stufen. [14] Die Krebsreifung von der Gutartigkeit hin zur Bösartigkeit wird von der 

Expression bestimmter Proteine als Tumormarker und dem Fehlen mancher Proteine 

(Tumorsuppressoren) begleitet. [15-17] Deshalb streben viele Wissenschaftler nach 

neuen Methoden zur besseren Detektion von Biomolekülen auf subzellulärer Ebene, 

um für Krebspatienten eine passende Therapie zu finden und dadurch ihre 

Lebenserwartung zu verlängern. Die Existenz oder das Fehlen von Tumormarkern 

oder Tumorsuppressor-Proteinen werden mit Hilfe von Antikörpern ermittelt. Über 

den Einsatz der Antikörper zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen und die 

Etablierung eines Radioimmunoassays wurde zum ersten Mal von Berson und Yalow 

im Jahr 1960 berichtet. [18] Dafür erhielten Berson und Yalow 1977 den Nobelpreis. 

1971 wurde ELISA (Enzyme linked Immunosorbent assay) durch Engvall etabliert, 

um die Ermittlung der Protein-Menge im Serum zu ermöglichen. [19,20] 1979 haben 

Renart und Towbin durch die Entwicklung von weiteren Verfahren, bekannt als 

Western Blot, das Repertoire an Methoden zur Detektion und Quantifizierung der 

Proteine ergänzt. [21] Die selektive Detektion von Proteinen auf Gewebe mit Hilfe der 

optischen Mikroskopie gehört auch zur biomedizinischen Diagnostik. Fluoreszenzmarkierte 

Antikörper zur Detektion und Lokalisation von Zielproteinen (Antigenen) auf 

dem Gewebe wurden erstmals 1941 durch Coons eingesetzt. [22] Die selektive 

Bindung der Antikörper an Antigene und die Bildung von Antigen-Antikörper- 

Komplexen spielt bei der Immunhistochemie eine zentrale Rolle. [23] Die Bildung von 

Antigen-Antikörper-Komplexen auf dem Gewebe ist in Schema 1 dargestellt. Die 

Bildung der Immun-Komplexe in Form direkter (markierter Primärantikörper) und 

indirekter (markierter Sekundärantikörper) Detektion bei der Immunhistochemie sind 

in Schema 1A und B dargestellt. Aufbau und Prinzip der Bestimmung von Proteinen, 

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z.B. Zytokinen, in Form eines Sandwich-Immunoassay sind in Schema 1C skizziert. 

Das Zielprotein (Antigen) in Schema 1A und B wurde durch optische Detektion des 

verwendeten Markers lokalisiert. In der Standard-Immunhistochemie werden als 

Marker Fluoreszenz-Stoffe, Farbstoffe und insbesondere Enzyme verwendet. [24] 

Schema 1: Prinzip der Immundetektion auf dem Gewebe, direkte Detektion in Schema 1A 

und indirekte Detektion in Schema 1B. Aufbau des Sandwich-Immunoassays beim ELISA 

in Schema 1C. Das zum Antikörper passende Antigen ist als roter Kreis dargestellt. 

Die Lokalisierung der Antigene wird durch das charakteristische Signal des an den 

Antikörper gebundenen Markers ermöglicht. Die Nachteile bei herkömmlichen 

Markern sind eingeschränktes Multiplexing (Parallelnachweis) und Quantifizierung 

der Proteine. Das Multiplexing von mehr als zwei Farben mittels Enzym-markierten 

Antikörpern ist praktisch nicht möglich. Die Multiplexing-Kapazität der 

Fluoreszenzsubstanzen durch ihre intrinsisch großen Halbwertsbreiten der 

Fluoreszenzbanden ist auch auf maximal 4-6 Farben begrenzt. [25] Der Einsatz von 

Quantenpunkten (quantum dots) erlaubt zwar den Nachweis von etwa drei bis zehn 

Markern, aber sie sind hochgiftig und die Handhabung ist dadurch erschwert. [26-27] 

Watanabe et al. haben 2010 mit Hilfe von konjugierte Adapter Proteinen (Protein A) 

an Quantenpunkten ein Verfahren zur Detektion der lebendigen Zellen etabliert. [27] 

Die Firma Ventana unternahm den ersten Schritt zur Kommerzialisierung solcher 

Adapterproteine und QD-Konjugate. 

Die erste Verwendung von Goldpartikeln in Kombination mit Meerrettichperoxidase 

als immunhistochemischem Marker zur Markierung der Leukozyten wurde bereits 

1977 von Geoghegan und Ackerman vorgenommen. [28] 

Ein neuer Ansatz hinsichtlich einer Methode zur Lokalisation der Proteine auf 

Gewebe basiert auf der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS, engl. 

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surface enhanced Raman scattering) und wurde 2006 zum ersten Mal von Schlücker 

und Mitarbeitern entwickelt. Dabei wurde die Lokalisierung von PSA (Prostataspezifische-Antigen) 

auf den Gewebeschnitten von Patienten mit Prostatakrebs 

aufgezeigt. [29] Diese vielseitige Methode der Nanodiagnostik bietet im Gegensatz zu 

den bereits genannten Methoden die Aussicht auf Mehrfarbendetektion und eine 

Quantifizierung der Proteine in situ. 

Bei dieser Methode werden Edelmetallen Nanopartikel mit Raman- 

Reportermolekülen markiert. Die Ramanreporter können z.B. über deren Thiol- 

Gruppe auf der Goldoberfläche eine stabile selbstangeordnete Monolage (self 

assembled monolayer, SAM) ausbilden. In Abbildung 1.1 ist ein Raman-Spektrum 

von 4-TNB einem Fluoreszenz-Spektrum von Cy5 gegenübergestellt. Die intensive 

Raman-Bande bei ca. 1340 cm -1 ist der symmetrischen Streckschwingung der Nitro- 

Gruppe zuzuordnen. Die zwei schwächeren Banden bei 1130 und 1550 cm -1 lassen 

sich aromatischen Ringdeformationsschwingungen ordnen. [30] Die geringe 

Linienbreite der Schwingungs-Raman-Bande im Vergleich zum breiten Fluoreszenz- 

Emissionsprofil ist klar zu erkennen. 

Abbildung 1.1: Gegenüberstellung eines Fluoreszenz- und SERS-Spektrums. Die 

Raman-Banden im SERS-Spektrum (4-TNB in Rot) ist im Vergleich zur 

Fluoreszenzbande (Cy5 in Schwarz) um den Faktor 10 bis 100 schmaler. 

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Vorteilhaft für biologische und medizinische SERS-mikroskopische Anwendungen ist 

die Ausnutzung der einstellbaren Plasmonenbande von Gold/Silber-Hohlkugeln im 

roten bis nah-infraroten Spektralbereich. Die auftretende Autofluoreszenz der 

biologischen Proben (z.B. Gewebe) im roten und nah-infraroten Spektralbereich ist 

deutlich geringer als bei blauer oder grüner Lichtanregung. Dies ist vorteilhaft für 

einen guten Bildkontrast in der SERS-Mikroskopie. [31] Als erwünschte Ziele in der 

Immunhistochemie können die Erweiterung des Multiplexings und die in situ 

Quantifizierung der Proteine benannt werden. Dabei ist das Potential der 

vorgestellten Methoden sehr unterschiedlich. Die intensiven Forschungen zur 

Applikation dieser neuartigen Methodik begannen Anfang des 21. Jahrhunderts. Es 

wurden in kurzer Zeit unterschiedlichste Konzepte für das Design und die Synthese 

von SERS-Markierungspartikeln entworfen. „Immuno-SERS-Marker“ ist eine 

Bezeichnung für das Antikörper/SERS-Partikel-Konjugat, welches über den 

Antikörper spezifisch an das entsprechende Antigen binden soll und über die 

charakteristische Spektrale des SERS-Partikel identifiziert werden kann. 

2002 veröffentlichten Mirkin et al. Ergebnisse zu einer mehrfach-Detektion von sechs 

verschiedenen DNA-Sequenzen im Mikroarray-Format. Mit diesem Verfahren konnte 

man ohne falsch-positive oder falsch-negative Resultate die Zielmoleküle bis zu einer 

Konzentration von 20 femtomolar nachweisen. [32] Kurz danach konnten Porter et al. 

mittels eines Sandwich Immunassays die Menge von PSA in femtomolaren 

Konzentrationen nachweisen. [33] 

Schlücker et al. haben 2006 Gold/Silber-Nanoschalen zur Lokalisierug von PSA auf 

Prostatagewebeschnitten eingesetzt. [29] Später wurden dann von derselben 

Arbeitsgruppe hydrophil stabilisierte und glasverkapselte Gold/Silber-Nanoschalen 

entworfen und synthetisiert (Abschnitt 3.1). [37] 

2007 stellten Sun et al. ein Modell von zu Oligomeren aggregierte Silberpartikeln mit 

einer Größe von 60 bis 100 nm her. [34-35] Die auf der Oberfläche der Nanopartikel 

adsorbierten Raman-Reportermoleküle liefern nach Bildung der Aggregate starke 

SERS-Signale. Am Ende wurden die kleinen Aggregate zwecks Stabilität und auch 

Quervernetzung mit BSA (Bovine Serum Albumin) verkapselt. 

2008 haben Nie et al. zum Schutz der SERS-Substrate Polyethylenglykolen (PEG) 

verwendet, wobei die PEG-Thiole gleichzeitig mit Raman-Reportermolekülen auf der 

Goldoberfläche adsorbiert wurden. Die Polyethylenglykol-Reste führen zur höheren 

Hydrophilie und ermöglichen ebenfalls die Biokonjugation der Antikörper. Diese 

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Nanopartikel wurden zur in-vivo-Detektion von Tumorzellen eingesetzt. [36] Jüngst 

wurden SERS-Marker mit Einzelpartikelsensitivität bei kurzen Belichtungszeiten 

charakterisiert und für die schnelle Immun-SERS-Bildgebung eingesetzt. [38] 

Fernziel der Arbeiten ist der Einsatz der SERS-Mikroskopie im Rahmen einer 

quantitativen Diagnostik zur Früherkennung von Prostatakrebs. Dies soll das Grading 

des Karzinoms für Pathologen leichter und genauer machen und schlussendlich 

dadurch auch zu einer effektiveren Therapie führen. In der Arbeitsgruppe Schlücker 

wurde für die vorläufigen Untersuchungen und Einstellungen PSA als Modell-Antigen 

verwendet. [29,39] 

PSA ist eine Serinprotease mit einer Größe von 33 kDa, die zur Kallikrein-Familie der 

Proteasen gehört. Das Glykoprotein wird sowohl in normalem als auch 

neoplastischem Gewebe nahezu ausschließlich in der Prostata exprimiert und 

deshalb als prostataspezifisch angesehen. PSA wurde von zwei voneinander 

unabhängigen Forschungsgruppen in den Jahren 1966 und 1979 isoliert. [40,41] Das 

PSA-Protein wird sowohl bei Krebskranken als auch bei gesunden Probanden mit 

unterschiedlichen Konzentrationen exprimiert. [42,43] Daher wurde PSA mehr als ein 

gewebespezifisches und nicht tumorspezifisches Antigen angesehen. [43-45] 

Bei vorläufigen Einstellungen der SERS-Mikroskopie wurde PSA als Ersatz für ein 

Haushaltsprotein betrachtet. Dadurch konnten im Laufe der Untersuchungen die 

Qualität der Färbung mit Immuno-SERS und die Wirkung von Biofunktionalisierung 

oder auch die notwendige Inkubationszeiten permanent beobachtet und nach Bedarf 

variiert werden. Seit 2010 wurde p63 als ein weiteres Protein bei der 

Prostatakrebsdiagnose mittels SERS-Mikroskopie in Betracht gezogen. [37] 

Das Protein p63 gehört zur p53-Familie und spielt eine Schlüsselrolle bei der 

Proliferation, Entwicklung und Apoptose der Epithelzellen der Prostata. [47-50] Das 

Protein wird nur in Basalzellen der gesunden Prostatadrüsen exprimiert. Die 

fehlenden Basalzellen bzw. p63-positiven Zellen sind eine Bestätigung für 

Prostatakrebs. Daher wird das Protein p63 im Gegensatz zu PSA als ein 

krebsspezifischer Marker angesehen. [50-53] 

In Abbildung 1.2 (links) wird die schematische Verteilung der PSA und p63-Antigene 

auf der Prostatadrüse dargestellt. Auf der rechten Seite der Abbildung ist eine p63 

Immunfärbung auf einer gesunden Drüse zu sehen. Bei dem Verdacht auf 

Prostatakrebs werden verschiedene Untersuchungen vorgenommen. In der Regel 

führt der Hausarzt selbst zuerst die digitalrektale Untersuchung (DRU) durch. [54] 

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Abbildung 1.2: Schematische Darstellung der Verteilung von PSA und p63-Proteinen auf 

Prostatagewebe (links). Immunfärbung von p63-Proteinen auf Prostatagewebeschnitten 

eines gesunden Probanden (rechts). 

Die Abtast-Resultate werden durch die Messung von PSA (im Serum) und bei Bedarf 

durch eine Nadel-Biopsie der Prostata ergänzt. Die drei genannten Methoden sind 

als randomisierte kontrollierte Studien (abgekürzt RCT, Randomised Controlled 

Trials) in der klinischen Forschung bekannt. Anhand der auf diese Weise ermittelten 

Daten bemühen sich die Wissenschaftler, ein besseres Früherkennungssystem für 

die Diagnostik des Prostatakarzinoms zu etablieren. [55,56] Dieser Standard soll 

einerseits der frühzeitigen Erkennung von Prostatakrebs bei Patienten, die zu einer 

Risikogruppe gehören, dienen und anderseits nicht notwendige Untersuchungen bei 

gesunden Patienten verhindern. [55] 

Die DRU-Resultate hängen zum großen Teil von der Erfahrung des behandelnden 

Arztes ab. Allein anhand der normalen DRU-Resultate kann über die bestehende 

Erkrankung nicht entschieden werden. Die Ermittlung des PSA-Wertes und auch die 

Einschätzung des Grades des Karzinoms können manchmal irreführend wirken. [55-58] 

Mit der Ermittlung der normalen PSA-Konzentration (Cut-Off-Wert) haben sich viele 

Forschungsgruppen befasst. In zahlreichen Publikationen wurde ein Cut-Off-Wert 

von 0,1-4 ng/ml oder 2,6-4 ng/ml eingetragen. [59-60] Der Cut-Off-Wert ist in direkter 

Abhängigkeit vom Alter der Männer zu sehen. Oesterling hat die Abhängigkeit der 

PSA-Konzentration vom Alter der gesunden Männer in einer Publikation erörtert und 

in diesem Zusammenhang die Erhöhung des PSA-Wertes bei älteren Männern 

geklärt. Nach seinen Ermittlungen beträgt eine normale PSA-Konzentration für 

Männer zwischen 40-49 Jahren 0,0 bis 2,5 ng/ml, für 50- 59-Jährige 0,0 bis 3,5 ng/ 

ml; bei 60-69-Jährigen 0,0 bis 4,5 ng/ ml, und für 70-79-Jährige ca. 0,0 bis 6,5 

ng/ml. [61,62] Um die Krebsvorsorgeuntersuchung zu erleichtern und dabei eine 

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Überdiagnose zu verhindern, werden meist die Werte zwischen 0-2,5 ng/ml bei 

jüngeren Männern als harmlos angesehen. [63,64] 

In der Tat existiert kein Grenzwert bezüglich der PSA-Konzentration, unterhalb 

dessen die Existenz eines Karzinoms ausgeschlossen werden kann. Ein erhöhter 

PSA-Cut-Off kann nicht als 100-prozentiger Maßstab für die Diagnose von 

Prostatakrebs genommen werden. [59,65-67] Besonders die Spezifität des PSA Cut-Off- 

Wertes im kritischen Bereich zwischen 4 und 10 ng/ml ist irrführend, denn in der 

Regel werden mit diesem PSA-Wert Biopsien durchgeführt. Studien zeigen, dass in 

nur 12,3 bis 24% der durchgeführten Biopsien mit PSA-Wert zwischen 4-10 nm/ml 

Karzinome nachweisbar waren. [68,69] Sogar bei Werten zwischen 10-20 ng/ml konnte 

nur bei 15,6% der Biopsien Prostatakrebs diagnostiziert werden. [69] Einige Faktoren 

können den PSA-Test drastisch beeinflussen. Eine akute oder chronische 

Entzündung der Prostata (Prostatitis) kann den PSA-Wert um das 5- bis 40-fache 

erhöhen. [70] Der erhöhte PSA-Wert, der durch Infektion oder Entzündung zustande 

gekommen ist, reduziert sich wieder nach der Behandlung mit Antibiotika wie 

Ofloxacin oder Ciprofloxacin. [71] 

Die dritten und sehr wichtigen Parameter der RCTs sind immunhistologische 

Ergebnisse der Biopsien, die durch Pathologen ausgewertet werden. Die 

Aggressivität der Tumoren wird nach einem von dem amerikanischen Pathologen 

Donald Gleason entwickelten System eingestuft. [72] Aufgrund dieser Einschätzung 

werden die weiteren Therapie-Entscheidungen gefällt. Wäre die Gradierung als 

Ergebnis der Biopsie niedriger als der tatsächlich ermittelte Grad, so würde dem eine 

unzureichende Therapie folgen sowie die Gefahr der Krebsrückkehr. Anderseits 

müssen durch eine Überschätzung des Grades des Karzinoms die Patienten unnötig 

unter Nebenwirkungen leiden. Die Genauigkeit der Aussage über Grad der 

Krebserkrankung hängt von der Expertise und Erfahrung der Pathologen ab. Die 

Bewertungen von Pathologen im internationalen Vergleich stimmen mit den Gleason- 

Graden nur zu 35% bis 80% überein. Die Meinungsverschiedenheit der Pathologen 

ist besonders bei der Begutachtung der niedrigeren Gleason-Grade sehr groß. [73-76] 

Wegen dieser Meinungsverschiedenheit und auch wegen der geringen Spezifität bei 

PSA-Tests leiden viele Patienten unerkannt unter Prostatakrebs oder aber sollen 

aggressive Therapien mit unnötigen Nebenwirkungen in Kauf nehmen. Erstaunlich 

sind in diesem Zusammenhang die Ergebnisse einer Gegenüberstellung der 

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Untersuchungen von zwei Zentren, die Langzeitstudien über die Wirkung von RCTs 

durchgeführt haben. 

In Europa werden die diagnostischen Methoden für Prostatakrebs und die dadurch 

ermittelten Resultate durch ERSPC (European Randomized Study of Screening for 

Prostate Cancer) in Rotterdam permanent kontrolliert und ausgewertet. Dadurch soll 

eine frühzeitige Erkennung von Prostatakrebs verbunden mit einer besseren 

Prognose für die Patienten erreicht werden. In den USA wurde diese Aufgabe PLCO 

(Prostate, Lung, Colorectal, and Ovarian Cancer Screening Trial) übertragen. 

Mit kleinen Abweichungen haben die zwei Zentren eine gleiche Studie durchgeführt, 

um den Einfluss von RCTs bzw. Früherkennung auf die Mortalitätsrate zu ermitteln. 

ERSPC hat eine Langzeit-Untersuchung durchgeführt, an der 182,000 Männer 

zwischen 54 und 75 Jahren aus sieben europäischen Ländern teilgenommen haben. 

Die Männer wurden per Zufall auf zwei Gruppen, nämlich eine Testgruppe 

(Screening) und eine Kontrollgruppe, verteilt. Bei den Männern der Testgruppe 

wurden während der 6-jährigen Untersuchung im Schnitt alle 4 Jahre die PSA-Werte 

überprüft. Im Laufe der Studien wurden 126,462 Biopsie-Proben (bei 85.8% der 

Gruppe) entnommen. Am Ende stellte sich heraus, dass 1,410 Screenings 

durchgeführt werden müssten, um einen erkrankten Mann zu finden und dadurch 

seinen Tod verhindern zu können. ERSPC belegte, dass durch RCTs die Mortalität 

um 20% gesenkt werden kann. [72] 

In Gegensatz dazu führte PLCO eine ähnliche Studie mit 76,693 nordamerikanischen 

Männern durch. Die PLCO-Studie wurde im Vergleich zu ERSPC über einen 

längeren Zeitraum und mit geringerer Teilnehmeranzahl durchgeführt. 

Im Gegensatz zu ERSPC konnte PLCO keine signifikante Senkung der 

Mortalitätsrate bei der Testgruppe feststellen und widerlegte damit die Ergebnisse 

von ERSPC. [78] Die Berichte von ERSPC und PLCO basieren auf DRU, PSA-Wert 

und Biopsien, wobei bekannt ist, dass zwei der drei Parameter, nämlich der PSA- 

Wert und die Auswertung der Biopsien, Schwankungen verursachen können. Die 

widersprüchlichen Berichte der zwei Zentren lassen die Frage, ob eine Durchführung 

der RCTs für die rechtzeitige Erkennung von Prostatakrebs sinnvoll ist, offen. 

Drei Jahre vor der Durchführung der zwei Studien ist Professor Fritz Schröder in 

einer Veröffentlichung auf die Problematik eingegangen. Er findet die Durchführung 

von PSA-Tests zwar sinnvoll, erhofft sich aber durch die Entwicklung von besseren 

Algorithmen eine Verbesserung der Früherkennung des Prostatakarzinoms. [65] Der 

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vorsichtige Optimismus hinsichtlich eines Früher-kennungssystems wird gedämpft 

durch einen Blick auf den Bericht vom NHS (National Health Service) in England. [79] 

Es geht um die festgestellten Prostatakarzinome nach Autopsien. In Tabelle 1.1 wird 

dem prozentualen Anteil der detektierten Prostatakrebs-Fälle nach Autopsien das 

Alter der Verstorbenen gegenübergestellt. 

Alter 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 

Prozentuale Anteil 8 28 39 53 66 80 

Tabelle 1.1: Detektierte Präsenz eines Prostatakarzinoms nach Autopsien. 

Der Bericht macht klar, dass der Prostatakrebs viel früher und zwar bereits im 

Jugendalter zuschlägt und langsam brütet. Die Altersgruppen der 20-29-Jährigen 

sowie der 30-39 Jahre Alten fehlen in vielen Statistiken, da diese Männer keine 

Symptome der Krankheit zeigen. Daher werden sie gar nicht erst durch eine 

Früherkennungs-Methode erfasst. 

Hier soll die SERS-Mikroskopie als neue Methode ansetzen, und zwar sowohl im 

Hinblick auf eine in situ Multiplex-Detektion als auch eine Quantifizierung der 

Biomoleküle auf dem Gewebe. 

Im Gegensatz zu der Standard-Immunhistochemie werden bei der SERS- 

Mikroskopie keine sekundären Antikörper benötigt. Die primären Antikörper, die zur 

Detektion der Antigene verwendet werden, tragen gleichzeitig auch die SERS- 

Marker (Schema 2D). [29,37,39] Die sekundären Antikörper sind in der Regel polyklonale 

Antikörper, die gegen die primären Antikörper gerichtet sind. Eine optimale und 

erwünschte Erkennung von primären Antikörpern mittels sekundärer Antikörper ist in 

Schema 2A dargestellt. Angesichts einer Größe von Immunoglobulin-Molekülen von 

ca. 150 kDa besteht die Möglichkeit, dass der primäre Antikörper durch mehr als 

einen sekundären Antikörper erkannt wird (Schema 2C). Eine solche 

Doppelerkennung während des Immundetektionsverfahrens führt zu einer 

Signalamplifikation im Assay. [80-82] In der Regel kann das Problem mit einer optimalen 

Einstellung der Konzentration von sekundären Antikörpern vermindert, aber nicht 

behoben werden. Das Immunglobulin-Molekül besteht aus 2 Fab-Fragmenten 

(Fragment of antibody binding) und einem vollständigen Fc-Fragment (Fragment of 

crystallization). [83-84] Die Bindung zwischen Antikörper und Antigen geschieht über 

Fab-Fragmente. [85,86] In der Regel werden die Marker-Moleküle an freie 

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Aminogruppen (z.B. Lysinreste) innerhalb des Immunoglobulin-Moleküls gekoppelt. 

Die Verteilung der Lysinreste innerhalb des Immunoglobulin-Moleküls durch Einsatz 

des PyMol-Programms wurde von C. Herrmann visualisiert. 

Schema 2: Schematische Darstellung der Standard-Immunhistochemie (A). 

Verteilung der Lysinreste in Immunoglobulin (B). Signal-Amplifikation während der 

Immun-Detektion (C). Detektion der Proteine mittels Immuno-SERS. Schematische 

Darstellung der Antigenerkennung mittels Immuno-SERS (D). Der rote Kreis stellt 

die passenden Antigene zu den detektierenden Antikörpern dar. Weiße Dreiecke 

und blaue Vierecke stellen Antigene dar, die nicht durch Antikörper erfasst werden. 

In Schema 2B wird diese Verteilung der Lysinreste in roter Farbe auf dem Molekül 

dargestellt. Wie aus dem Schema ersichtlich ist, sind Lysinreste überwiegend in dem 

Fab-Fragment verteilt. 

Bei vielen Methoden wird Glutaraldehyd (GA) für Quervernetzungen der Marker über 

freie Aminogruppen des Immunoglobulin eingesetzt. [87-89] Durch die Quervernetzung 

von Markern, insbesondere durch Enzyme oder Nanopartikel an Fab-Fragmenten, 

kann die Bindungsaffinität der Antikörper beeinträchtigt werden. 

Das Streben nach zuverlässigen Methoden zur quantitativen Bildgebung in situ auf 

Gewebe ist für weitere Fortschritte auf dem Gebiet der Krebsfrüherkennung 

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unerlässlich. Viele Forschungsgruppen sind deshalb bemüht, durch die Entwicklung 

geeigneter Algorithmen die absolute Menge eines chromogenen Substrats auf dem 

Gewebe zu erfassen. [90-93] 

Die entwickelten Methoden weisen einige Nachteile auf und wurden daher noch nicht 

als Routineverfahren in der Immunhistologie etabliert. Die Reproduzierbarkeit dieser 

Methoden hängt stark von Signalamplifikationen der sekundären Antikörper und auch 

deren Enzymaktivität (Peroxidase) ab. Diese Methoden haben keine oder nur eine 

sehr begrenzte Multiplexing-Kapazität. 

Bei der SERS-Mikroskopie werden ultrasensitive SERS-Substrate nur an primäre 

Antikörper gekoppelt. Die Sensitivität der neuen SERS-Markerpartikel aus der 

Arbeitsgruppe Schlücker ist hoch genug, um während 30 Millisekunden 

Belichtungszeit ein einzelnes Partikel detektieren zu können. [38] Dadurch entfallen 

unnötige Kosten und Inkubationszeiten für die sekundären Antikörper. Mit dem 

Verzicht auf sekundäre Antikörper wird keine Signalamplifikation zustande 

kommen. [80-82] 

In der SERS-Mikroskopie wird idealerweise durch die Bindung eines einzelnen 

Immuno-SERS-Nanopartikel-Konjugates ein einzelnes Antigen auf dem Gewebe 

erkannt. Die fehlende Signalamplifikation der Methode ist ein großer Vorteil für die 

Quantifizierung der Antigene. Angesichts des enormen Multiplexing-Potentials dieser 

neuartigen Marker können bei der Immunhistochemie eine Vielzahl von 

Informationen über Tumormarker und auch Tumor-Suppressor-Proteine gesammelt 

werden. 

Um eine bessere Bindungsaffinität bei der Bindung von Immuno-SERS-Markern mit 

Antigenen zu erreichen, wurde auch die Möglichkeit der Kopplung der Antikörper auf 

Nanopartikel mittels Adapter-Proteinen wie dem Fusion-Protein A/G in Betracht 

gezogen (Abschnitt 2.3.2). Das Fusion-Protein A/G als Adapter-Protein kann sechs 

Bindestellen für die Kopplung mit Fc-Fragmenten der Antikörper bieten. [94,95] Somit 

binden sich die Immunglobuline über deren Fc-Fragmente auf Nanopartikel oder 

Quantenpunkten und die zwei Fab-Fragmente bleiben frei. Dies verleiht den 

Immunoglobulin-Molekülen eine optimale Orientierung. Diese optimale Orientierung 

der SERS-markierten-Antikörper wurde in Schema 2D dargestellt. Das zukünftige 

Ziel der SERS-Mikroskopie-Methode wird kurz in Schema 3 zusammengefasst. Eine 

direkte und unkomplizierte Detektion und Quantifizierung der unterschiedlichen 

Proteine auf dem Gewebe kann durch die SERS-Mikroskopie erreicht werden. Das 

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Expressions-Muster der Proteine des gesunden Prostatagewebes unterscheidet sich 

von dem des Erkrankten. Dieses Expressions-Muster unterscheidet sich sogar 

abhängig von den Stadien des Prostatakarzinoms bei Patienten. [94,95] 

Schema 3: Die SERS-Mikroskopie soll in Zukunft als neue Methode in der 

Immunhistochemie eingesetzt werden. Dabei können mit einer einzigen Messung 15 

verschiedene Antigene auf dem Gewebe detektiert und quantifiziert werden. 

Dank intensiver Forschung in der molekularen Pathologie und Biologie wurde die 

Funktion vieler Proteine, die während der Krebsentstehung und Entwicklung beteiligt 

sind, exakt aufgeklärt. Zurzeit werden mit Hilfe der neuen Techniken in der 

molekularen Biologie wie dot blot und real time PCR die Stadien des Prostatakrebses 

und auch die betroffene Signaltransduktionskaskade erkannt. Diese Methoden 

können aber nur semiquantitative Informationen liefern. Daher ist die Entwicklung 

und Etablierung von weiteren Methoden wie der SERS-Mikroskopie eine 

unentbehrliche Notwendigkeit um Krebspatienten eine Lebensverlängerung mit 

Qualität zu ermöglichen. 

13


Zielsetzung 

Die multiple Detektion der Proteine in der Immunhistochemie und die quantitative 

Detektion der Proteine auf der Glasplatte (Immunoassay) mittels 

oberflächenverstärkter Raman-Streuung sind die Hauptziele dieser Arbeit. Um das 

zu erreichen sollten zuerst die Methoden für die Biofunktionalisirung an zwei 

verschiedene Markertypen etabliert werden. Dabei sollte zuerst die 

Biofunktionalisierungsmethode für hydrophil stabilisierte Immuno-SERS und auch 

glasstabilisierte Cluster entworfen werden. Diese Methoden sollten einerseits die 

Kolloidstabilität gegen Aggregation gewähren und anderseits die Biokompatibilität 

der Marker erhöhen. Die in dieser Arbeit vorgesehenen Zielproteine zur Detektion auf 

dem Gewebe und auch auf dem Glasobjektträger wurden unterschiedlich 

ausgewählt. Daher sollten diese Methoden die Detektion der Proteine sowohl 

vereinzelt, als auch simultan ermöglichen. 

14

2 Theoretische Grundlagen 


In diesem Kapitel werden die Grundlagen der Raman- und SERS-Spektroskopie 

beschrieben. Die angewandten Techniken zur Verstärkung der Raman-Streuung 

wurden ausführlich in bisherigen Dissertationen und auch Publikationen der 

Arbeitsgruppe Schlücker vorgestellt. In diesem Abschnitt werden die Grundlagen der 

notwendigen immunhistologischen Verfahren zur Protein-Kopplung und auch zum 

Nachweis von Proteinen beschrieben. 

2.1 Raman-Effekt 

Das Phänomen der inelastischen Streuung von Licht an Materie wird als Raman- 

Streuung bezeichnet. Dieses Phänomen wurde 1923 von Smekal theoretisch 

vorhergesagt und 1928 wurde es durch Raman und Krishnan experimentell an 

Flüssigkeiten bestätigt. [98,99] Im selben Jahr haben Landsberg und Mandelstam 

unabhängig von Raman denselben Effekt an Kristallen nachgewiesen. [100] Trifft 

monochromatisches Licht einer bestimmten Frequenz ( ) und elektrischen 

Feldstärke (E) auf ein Molekül, wird ein Teil der Photonen beim Zusammenstoß mit 

dem Molekül in alle Richtungen gestreut. Es werden zwei unterschiedliche Arten der 

Lichtstreuung unterschieden: elastische und inelastische Streuung. 

Beim elastischen Streuprozess sind die Energien und Frequenzen des einfallenden 

Photons ( ) und des gestreuten Photons unverändert. Dieser Effekt ist bei 

Molekülen auch unter dem Namen Rayleigh-Streuung bekannt. Die inelastische 

Lichtstreuung wird auch Raman-Streuung genannt, bei dieser Streuung findet immer 

eine Energieübertragung zwischen Molekül und Photon statt. Dadurch ist die Energie 

bzw. die Frequenz des einfallenden Photons und des gestreuten Photons 

unterschiedlich. Der Gewinn oder Verlust an Energie für die Photonen hängt von den 

Schwingungs- und/oder Rotationszuständen des Moleküls ab. [101] Der Energietransfer 

vom Photon ans Molekül wurde als Stokes-Prozess und der Energieübergabe vom 

Molekül an das Photon als Anti-Stokes-Prozess definiert. Die Photonen können ihre 

Energie an ein Molekül übertragen, das sich im Grundzustand befindet. Dadurch wird 

das Molekül in ein höheres Schwingungs-Niveau versetzt. Das gestreute Licht des 

Stokes-Prozess besitzt eine niedrigere Frequenz bzw. größere Wellenlänge 

als das eingestrahlte Licht. Bei dem Anti-Stokes-Prozess ist das Molekül bereits in 

15


einem angeregten Schwingungszustand und streut damit Licht mit höherer Frequenz 

. bzw. kürzerer Wellenlänge (Abbildung 2.1). [102,103] 

Im klassischen Bild wurde der Raman-Effekt als Wechselwirkung eines Moleküls mit 

einer elektromagnetischen Welle beschrieben. [104] Durch Bestrahlung mit Licht der 

Frequenz ν 0 und der elektrischen Feldstärke wird ein 

oszillierendes Dipolmoment (µ) im Molekül induziert. [105] 

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der Raman-Streuung (a und c) und 

der Rayleigh-Streuung (b). i: Grundzustand, f: angeregter Zustand, r: virtuelles 

Energieniveau. [103] 

Gleichung 2.1: 

µ 

µ = Dipolmoment 

= Polarisierbarkeit des Moleküls 

16


Dieses Dipolmoment hängt stark von der einwirkenden Feldstärke (E) und der 

Beweglichkeit der Elektronenhülle bzw. von der Polarisierbarkeit () des Moleküls 

ab. [106] Die richtungsabhängige Polarisierbarkeit () des Moleküls kann durch einen 

Tensor beschrieben werden, welcher die richtungsabhängige Antwort des Systems 

bezüglich x-, y- und z-Richtung berücksichtigt. [107] 

Die Polarisierbarkeit () kann dann um die Ruhelage mit einer Taylor-Reihe erster 

Ordnung angenähert werden. Der Polarisierbarkeitstensor von Molekülen ist nicht 

konstant, sondern variiert mit dem Bindungsabstand der Atome und ändert sich 

daher periodisch mit der Schwingungsbewegung des Moleküls (Eigenfrequenz - ). 

Der Polarisierbarkeitstensor () des Moleküls, das mit der Frequenz schwingt, 

besteht aus einem unveränderlichen Anteil (Polarisierbarkeit in der 

Gleichgewichtslage) und einem veränderlichen Anteil, der mit der Frequenz ( ) um 

Null oszilliert. 


 

 

 

 

: mittlere Polarisierbarkeit in der Gleichgewichtslage 

: Amplitude der einzelnen Atome bei der Normalschwingung 

: Normalkoordinate mit 

 

Durch Einsetzen der Gleichung 2.2 in Gleichung 2.1 ergibt sich: 


µ 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Der erste Term beschreibt die Rayleigh-Streuung, der zweite und dritte Term den 

Stokes- bzw. Anti-Stokes-Anteil der Raman-Streuung. [108] Die Polarisierbarkeit von 

17


Molekülen ändert sich mit dem Bindungsabstand der Atome und wird somit von 

Schwingungen beeinflusst. Diese Schwingungen und Veränderungen der 

Polarisierbarkeit beeinflussen die Frequenz des gestreuten Photons. Dadurch 

werden die Stokes- und Anti-Stokes-Streuung erzeugt. Die Veränderung der 

Polarisierbarkeit [ 

] ist eine Voraussetzung für die Raman-Streuung. 

 

 

2.2 Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) 

Der SERS-Effekt (surface-enhanced Raman scattering) bezeichnet das Phänomen 

der Verstärkung eines Raman-Signals an plasmonisch aktiven Metalloberflächen 

(wie z.B. Ag, Au, Cu) um einen Faktor von 10 6 bis zu 10 11 . [109-111] Dieser Effekt wurde 

zuerst 1974 von Fleischmann beobachtet. [112] 1977 wurde die Raman-Streuung von 

Molekülen auf Edelmetalloberflächen als ein oberflächenverstärker Prozess von Van 

Duyne und Jean Maire interpretiert. [113-114] 

Zwei Beiträge zur SERS-Verstärkung 

spielen eine Rolle: Der dominante elektromagnetische Beitrag und der "chemische" 

Beitrag. [115] 

Elektromagnetische SERS-Verstärkung 

Ein stärkeres elektromagnetisches Feld induziert ein größeres Dipolmoment und 

dadurch erhöht sich die Intensität des SERS-Signals. Dieser Effekt der 

elektromagnetischen Verstärkung wird als Hauptfaktor für die SERS-Verstärkung 

herangezogen. Die chemische Verstärkung basiert eher auf der Änderung der 

Polarisierbarkeit () der Elektronenhülle der Moleküle, die zu einer Erhöhung der 

Signal-Intensität führen kann. [116-117] 

Die Erhöhung der Raman-Intensität durch die elektromagnetische Feldverstärkung ist 

nur dann maximal, wenn die Anregungsfrequenz des Lasers mit der 

Plasmonenfrequenz des Metallnanopartikels überein 

stimmt. Dies ist bei 

Wellenlängen der Fall, die wesentlich größer sind als die Durchmesser des Partikels, 

weswegen die Streuung durch die Mie-Theorie beschrieben werden kann. Für die 

Verstärkung spielt die Entfernung zwischen Metalloberfläche und Molekül eine 

entscheidende Rolle. Unter optimalen Bedingungen werden durch Bestrahlung mit 

Licht kollektive Schwingung der Leitungselektronen (Valenzelektronen) angeregt, 

was zur so genannten Plasmonenschwingung führt. In Abbildung 2.2 ist dies für die 

18


bei Metallkolloiden auftretende lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanz (LSPR, 

localized surface plasmon resonance) schematisch dargestellt. [117] 

Abbildung 2.2: Darstellung der optischen Anregung einer kollektiven Oszillation der 

Elektronen in einem Edelmetall-Nanopartikel. Die Resonanzfrequenz hängt von dem 

Material, der Größe und Form des Nanopartikels ab. [117] 

Ohne das verstärkende Metall wird das Molekül nur dem elektromagnetischen Feld 

E 0 ausgesetzt. Das resultierende Raman-Signal ist nicht stark genug, um detektiert 

zu werden. Wenn das Molekül auf der Metalloberfläche adsorbiert ist, steht es nicht 

allein unter dem Einfluss des elektromagnetischen Feldes E 0 , sondern wird 

zusätzlich vom elektromagnetischen Feld E LM beeinflusst. Dieses zusätzliche Feld 

E LM entsteht durch elastische Streuung des einfallenden Feldes E 0 an der 

Metallkugel. Somit wird ein Gesamtfeld aus dem eingestrahlten Feld E 0 und dem an 

der Metalloberfläche induzierten Feld E LM (Eges = E0 + ELM) gebildet (Abbildung 2.3). 

Am Molekül kommt es zur Ramanstreuung. Die Intensität des inelastischen 

Streulichts E DIP ist proportional zur Intensität von E LM . Dieses Streulicht kann dann 

wiederrum elastisch an der Metallkugel gestreut werden, was den zusätzlichen 

Beitrag E SC liefert. Am Detektor wird das Betragsquadrat der Summe aus E DIP und 

E SC erfasst. 

Abbildung 2.3: Verstärkung des elektromagnetischen Feldes an der Oberfläche von 

plasmonisch aktiven Metallnanopartikeln. [116] 

19


Mehrere Faktoren können diese Verstärkung beeinflussen. Je größer der Abstand 

zwischen Metall und Molekül ist, desto geringer wird die Verstärkung des Signals. [118] 

Besonders bei plasmonischer Kopplung, wie zum Beispiel in Aggregaten, können 

hohe SERS-Verstärkungen erreicht werden. Wenn zwei oder mehrere Metallpartikel 

nah zusammen liegen, treten an den Berührungspunkten zwischen einzelnen 

Nanopartikeln enorm hohe elektrische Feldstärken auf. Diese werden auch als hot 

spots bezeichnet, welche einen Einzelmolekül-Nachweis ermöglichen. [119-121] 

Chemische SERS-Verstärkung 

Gleichung 2.1 macht deutlich, dass das Dipolmoment neben dem elektrischen Feld 

auch von der Polarisierbarkeit (ā) des Moleküls abhängt. Während bei der 

elektromagnetischen Verstärkung Größenordnungen von 10 6 bis 10 11 diskutiert 

werden, liegt die Dimension der chemischen Verstärkung im Bereich von10 2 . [118] 

Diese Art der Verstärkung wird durch verschiedene Theorien, wie Adsorbatlokalisierte 

Resonanzeffekte oder Ladungstransfer-Resonanzen (englisch: charge 

[118, 122,123] 

transfer, CT) vom Metall zum Adsorbat zu erklären versucht. 

Der Beitrag der chemischen SERS-Verstärkung im Vergleich zur elektronischen 

Verstärkung ist geringer. Die experimentellen Daten zeigen aber, wie wichtig die 

chemische SERS-Verstärkung für biomedizinische Applikationen ist. In der Abbildung 

2.4 wurden zwei Gewebeschnitte mit zwei verschiedenen Immuno-SERS-Markern für 

die Lokalisierung von PSA behandelt. 

Bei der Vorbereitung der Immuno-SERS-Marker wurde dasselbe SERS-Substrat, 

nämlich Gold/Silber-Nanoschalen und auch der gleiche Antikörper (α PSA) 

verwendet. Der einzige Unterschied ist der verwendete Raman-Reporter gewesen. 

Es wurden zwei verschiedene Raman-Reporter 4-MBA und SEMA4 (Abschnitt 4.3) 

zur Markierung des SERS-Substrats eingesetzt. An Hand der Ergebnisse der 

Einfluss des Raman-Reportermoleküls bei Verwendung desselben SERS-Substrates 

(Au/Ag-Nanoschalen) ersichtlich. Während mit den mit 4-MBA bedeckten Au/Ag- 

Nanoschalen innerhalb von 1 sec Belichtungszeit kein SERS-Signal detektiert 

werden konnte, lässt sich im Fall von SEMA4 ein SERS-Signal bereits innerhalb von 

0,2 sec erhalten. 

20


Abbildung 2.4: SERS- Mikroskopie auf Prostataschnitten eines gesunden Probanden. 

Auf der linken Seite sind Weißlichtbilder (A, B) und auf der rechten Seite, die SERS- 

Falschbilder von zwei verschiedenen Ramanreportern dargestellt. Für Lokalisierung von 

PSA an den Epitelzellen in A wurde Raman-Reporter 4-MBA mit Intensitätsverteilung 

Bande bei 1590 cm -1 verwendet. In Abbildung B wurde die SEMA4-Raman-Reporter mit 

Intensitätsverteilung Bande bei 2210 cm -1 eingesetzt. Die verwendete Laserleistung für 

beide Proben beträgt, 5mW. Die Belichtungszeit für Probe A beträgt 1Sekunde und für 

Probe B nur 0,2 Sekunden. 

SERS-Substrat 

Unter dem SERS-Substrat versteht man kolloidale Edelmetall-Nanopartikel, die 

Raman-Moleküle auf ihrer Oberfläche aufnehmen können. SERS-Substrate verleihen 

nach resonanter Lichtanregung die elektromagnetische SERS-Signal-Verstärkung 

zur Detektion oder Lokalisierung der Biomoleküle. Die Form, Beschaffenheit und 

Größe der SERS-Substrate kann unterschiedlich gewählt werden. Die SERS- 

Substrate bestehen entweder aus einem einzelnen Nanopartikel oder aus mehreren 

[33, 34,37-39,119] 

Metall-Nanopartikeln bzw. kleinen Aggregat-Clustern. 

Die Bildung von Aggregaten führt zur Plasmon-Kopplung und damit einer enormen 

Verstärkung der SERS-Signale. Diese physikalische Eigenschaft kann hervorragend 

für die Diagnostik genutzt werden. Voraussetzung dafür ist, dass die Nanopartikel 

permanent zusammen bleiben, denn sonst geht die Intensitäts-Verstärkung verloren. 

Um diese Voraussetzung zu erfüllen wurden bisher verschiedene Strategien zur 

Verkapselung (bzw. zur Versieglung) der Aggregate entwickelt. Dadurch sollte auf 

21


zwei wichtige Faktoren Rücksicht genommen werden. Zuerst sollte die Verkapselung 

die SERS-Substrate gegen chemisch-physikalische Veränderungen schützen und 

dazu sollte die äußere Schicht biofunktionalisierbar für die Kopplung mit Proteinen 

(z.B. Antikörpern) sein. 

Sun et al. stellten 2005 aggregierte Silberpartikeln mit einer Größe von ca. 60 bis 100 

nm her. [119] Die Silber-Aggregate verleihen den gebundenen Raman-Molekülen einen 

erhöhten SERS-Effekt. Die Entwickler nannten dieses Design von Aggregaten COINs 

(Composite Organic-Inorganic Nanoparticles). Das Konstrukt von Silberpartikeln und 

Raman-Molekülen wird durch eine Quervernetzung mit BSA stabilisiert. Die BSA- 

Beschichtung der Nanopartikel soll zur Stabilisierung der Aggregate dienen und auch 

eine weitere Funktionalisierung mit Proteinen mittels Glutaraldehyd ermöglichen. [34,35, 

87-89] 

2008 entwickelten S. Nie und Mitarbeiter ein weiteres Modell von mit 

Polyethylenglykolen (PEG) geschützten Aggregaten als SERS-Substrat. In diesem 

Konzept wurden PEG-Thiol-Moleküle neben den Raman-Molekülen auf der 

Goldoberfläche aufgebracht. [36] Die Polyethylenglykole steigern einerseits die 

Hydrophilie und anderseits ermöglichen sie eine weitere Biokonjugation mit 

Proteinen. 

Die Arbeitsgruppe Schlücker hat in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Schmuck 

Ethylenglykol-modifizierte Raman-Reportermoleküle hergestellt und zur SERS- 

Mikroskopie eingesetzt. [39] Anstelle von Goldkolloid als SERS-Substrat wurden 

Gold/Silber-Nanoschalen verwendet. Die hergestellten Gold/Silber-Nanoschalen sind 

in der Lage ca. achtmal intensivere SERS-Signale im Vergleich zu gleich großen 

Goldvollkugeln bei roter Laseranregung zu generieren. [126] 

Seit 2011 werden in der Arbeitsgruppe Schlücker ultrasensitive Gold-Nanopartikel- 

Cluster zur Lokalisierung von Proteinen in Gewebeschnitten eingesetzt. [38] Die 

Besonderheiten des neu entwickelten SERS-Substrats werden in 2.3.1 und 2.3.2 

behandelt. In den Abbildungen 2.5 und 2.6 ist das Design der beschriebenen SERS- 

Nanopartikel gegenüber gestellt. 

2.3 Proteinkopplung an Nanopartikel 

Der selektive Nachweis von Proteinen erfolgt meistens mit Einsatz der markierten 

Antikörper. Zur Markierung der Proteine mit Farben oder auch mit anderen Proteinen 

22


wurden verschiedene Cross-Linking-Methoden entwickelt. Das Cross-Linking wurde 

als Einführung der kovalenten Bindungen zwischen funktionellen Gruppen von 

Aminosäuren innerhalb eines Proteins (intramolekular), oder zwischen 

interagierenden Proteinen (intermolekular) mittels eines chemischen Reagenzes. [129] 

Die Verwendung von verschiedenen funktionellen Gruppen wie, Carboxyl- Sulfhydryloder 

Aminogruppen für das Cross-Linking werden anhand der Applikationen in 

Protokollen vorbestimmt. Nennenswerte funktionelle Gruppen, die zur Kopplung 

miteinander paarweise ausgewählt werden sind: 

Aminogruppen zur Kopplung mit Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen zur Kopplung 

mit Aminogruppen und Sulfhydrylgruppen zur Kopplung mit Sulfhydrylgruppen. Zur 

Kopplung der funktionellen Gruppen werden in der Regel kommerzielle Materialien 

(Kits) verwendet. [130] In der Nanobiotechnologie werden auch sehr oft diese 

Vorschriften zur Kopplung der Proteine, wie z.B. Antikörper mit Nanopartikeln 

verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich mit zwei verschiedenen 

SERS-Substraten experimentiert. Die SERS-Substrate unterscheiden sich durch ihre 

äußere Schale. Die Substrate lagen entweder mit Glas verkapselt oder in nicht 

verkapselter Form vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Kopplung von der 

funktionellen Aminogruppe zur Kopplung mit der Carboxylgruppe für die Vernetzung 

der Proteine an Nanopartikel optimiert. 

In dieser Arbeit wurden Chemikalien, wie N-Hydroxysulfo-succinimid (s-NHS) und N- 

Ethyl-N´-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) als Crosslinker verwendet. 

Diese Kopplungsmethode wurde für beide Sorten SERS-Substrat durchgeführt. 

2.3.1 Kovalente Kopplung von IgG an Nanopartikeln 

1999 wurde der erste Immuno-SERS-Marker für ein Sandwichassay von Marc D. 

Porter verwendet. In diesem Konzept wurden 30 nm quasi-sphärische Gold- 

Nanopartikel mit Raman-Reportern markiert. Zur Kopplung der Antikörper an die 

Oberfläche der Nanopartikel wurde damals keine Biokonjugation durchgeführt. Wie in 

der Publikation angegeben wurde, sollten die Immunoglobulin G-Moleküle (IgG) 

mittels einer Kombination von ionischen und hydrophoben Wechselwirkung auf der 

Oberfläche der selbst-organisierenden Monolage (SAM) binden. [131] Die kovalente 

Kopplung der Antikörper an Nanopartikel wurde in derselben Gruppe später zur 

Detektion von PSA in femtomolaren Konzentrationen eingeführt. [33] Für beide 

23


Messungen wurde auf einem goldbeschichteten Glassubstrat gearbeitet, welches 

eine Plasmonenkopplung zwischen Immuno-SERS-Markern und Goldbeschichtung 

zulässt. Das gleiche Konzept wurde auch zum schnellen Nachweis von feline 

calicivirus (Katzenschnupfen) verwendet. [133] Im etablierten Konzept dient der 

Raman-Reporter gleichzeitig durch seine funktionelle Carboxylgruppe zur weiteren 

Biokonjugation mit Antikörpern. Der große Vorteil bei dem hergestellten Immuno- 

SERS-Marker ist die vollständige Bedeckung der Nanopartikeloberfläche mit Raman- 

Reportern gewesen, denn die SERS-Intensität ist im Vergleich zur unvollständig 

bedeckten Oberfläche höher. Ein zentraler Nachteil in diesem Konzept ist die 

sterische Hinderung bei einem vollständig ausgebildeten SAM, welche zur 

Verhinderung des nukleophilen Angriffs der Aminogruppen des Proteins auf die 

aktivierte Säuregruppe führen kann. 

Um das Problem zu lösen verwendeten Porter und Mitarbeiter 2008 eine gemischte 

SAM aus Raman-Reporter und einem Linker (succinimidyl propionate) für eine 

Bindung mit dem Antikörper. [133] Dadurch konnte der negative Effekt der sterischen 

Hinderung behoben werden aber durch die unvollständige Bedeckung der 

Oberfläche musste ein geringen Verlust von SERS-Intensität in Kauf genommen 

werden (Abbildung 2.5). Im selben Jahr wurde ein Konzept für die Herstellung einer 

hydrophil stabilisierten vollständigen SAM auf einem SERS-Substrate von der 

Arbeitsgruppe Schlücker publiziert. [39] In diesem Konzept handelt es sich um 4-TNB- 

Derivate, die mit unterschiedlich langem Ethylenglykoleinheiten verknüpft sind.Die 

Ethylenglykoleinheiten sorgen für eine bessere Wasserlöslichkeit der Nanopartikel. 

Das längere Molekül [4-TNB-TEG (Triethylenglykol)] besitzt eine funktionelle 

Carboxylgruppe, die der Biokonjugation zu Nutze kommt. Das kürzere Molekül [4- 

TNB-MEG (Monoethylenglykol)] hat am Ende eine Hydroxyl-Gruppe und kann keine 

späteren Bindungen mit Biomolekülen eingehen. In Abbildung 2.5 sind die zwei 

verschiedenen Konzepte gegenüber gestellt. 

Dieses Konzept basiert auf unterschiedlich langen hydrophilen Abstandshaltern 

(MEG und TEG), die den ausgebildeten SAMs drei verschiedene Besonderheiten 

verleihen können. Zum einen ist die Oberflächenbedeckung der Nanopartikel 

vollständig und es wird kein Signalverlust vorkommen. Zum anderen garantieren die 

hydrophilen Ethylen-Glykol-Einheiten mit der terminalen OH-Gruppe eine 

hervorragende Stabilisierung der Nanopartikel in wässrigen Pufferlösungen. Zum 

24


dritten ermöglichen die längeren hydrophilen Ethylenglykol-Einheiten mit der 

terminalen COOH-Gruppe eine reibungslose Konjugation mit Proteinen. 

 

Abbildung 2.5: Die unvollständige Bedeckung von SAMs auf einem Gold- 

Nanopartikel (A). Vereinzelte Darstellung der Bindung von 4-TNB-Derivaten (B). 

Beide Moleküle können über deren Thiol-Ende kovalent an Gold binden. Die 

Unterschiede zwischen R r1 (4-TNB–MEG–OH) und R r2 (4-TNB–TEG–OH) sind die 

Anzahl der EG-Untereinheiten und auch die funktionellen Gruppen. 

2.3.2 Kopplung von IgG über Adapter-Proteine 

Die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes basiert auf schwachen Kräften, wie 

Van der Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophoben 

Wechselwirkungen. [23, 134,135] Solche nicht kovalenten Kopplungen wurden zwischen 

weiteren Proteinen oder zwischen Proteinen und Vitaminen beobachtet. Diese 

Affinität zwischen Protein-Protein oder Protein-Vitamin wird besonders gut in der 

Nanodiagnostik genutzt. Somit kann eine zufällige und unspezifische kovalente 

Kopplung von Antikörpern an Nanopartikel verhindert werden. 

Streptavidin ist ein Protein, das von Bakterien der Spezies Streptomyces avidinii 

isoliert werden kann. Das Protein besteht aus vier identischen Untereinheiten, die 

dem Protein Molekülmasse von ca. 60 kDa verleihen. Die einzelnen Untereinheiten 

können mit hoher Affinität (femtomolare Konzentration) an jeweils ein Molekül Biotin 

binden. [136] Diese Besonderheit des Proteins wurde in zahlreichen standardisierten 

diagnostischen Verfahren und auch in der Nanodiagnostik verwendet. [137-139] 

25


Protein A ist ein weiteres Protein mit einer Größe von 40-60 kDa, welches aus der 

Zellwand des Bakteriums Staphylococcus aureus stammt. Das Protein kann sehr 

spezifisch an die Fc-Domäne muriner Immunoglobuline (IgG), wie IgG 2a , IgG 2b und 

IgG 3 und menschliche IgG 1 , IgG 2 und IgG 4 , binden. [140-142] Das Protein A kann keine 

Bindung mit IgG 3 eingehen. 

Im Gegensatz zu dem Protein A bindet das von Gruppe C und G der Streptococcus 

Spezies stammende Protein G stark an IgG 3 . Die isolierten Proteine G von Gruppe G 

und C unterscheiden sich einerseits im Molekulargewicht und anderseits bei der 

Bindung an Humanes Serum Albumin (HSA). Von der G-Gruppe sind zwei wichtige 

Isoformen G148 (65 kDa) und G43 (40 kDa) bekannt. Das isolierte Protein G von der 

Gruppe C(C 40) hat eine Größe von 58 kDa. Während die zwei isolierten Proteine C 

40 und G148 eine Bindungsaffinität für IgG und HSA zeigen, bindet G43 nur an 

IgG. [143] Die Bindungsaffinität der zwei Proteine A und G an IgG unterschieden sich je 

nach Spezies der Säugetiere. Während Protein A keine Bindung an IgG 2a der Raten 

angeht, bindet sich Protein G stark daran. Die Bindungsaffinität des Proteins G bei 

Pferden, Rindern und Kaninchen ist stärker als bei Protein A. [144] Während Protein A 

eine optimale Bindung bei pH 8,2 zeigt, beträgt für die Bindung des Protein G, der 

optimale 5. [145-146] Die beiden Proteine können in einem neutralen bzw. 

physiologischen pH-Bereich eine gute Bindung mit dem Fc-Fragment von IgG 

eingehen. [144] 1986 wurde das Protein G codierende Gen von Guss et al. geklont. 

Dieselbe Arbeitsgruppe führte durch Genfusions-Technik das notwendige DNA- 

Material der unterschiedlichen Bakterien zusammen, um ein funktionsfähiges 

rekombinantes Protein A/G herstellen zu können. In diesem Design wurden für das 

rekombinierte Protein A/G sechs Bindestellen zur Bindung an die Fc-Fragmente von 

IgG vorgesehen. Hierfür wurden die codierenden Stellen, die für die Bindung des 

Proteins an HSA notwendig waren heraus geschnitten. Somit fehlt dem 

Fusionsprotein die Fähigkeit sich an HSA zu binden. Vorteile rekombiniertem Protein 

A/G sind die erweitere Bindungsaffinität bei den meisten Spezies der Säugetiere, 

sowie optimale Interaktion mit Fc-Fragmenten bei pH 5-8 zu nennen. Dieser Ansatz 

wurde in dieser Arbeit zur Beschichtung glasverkapselter SERS-Cluster eingesetzt. 

Durch die Beschichtung mit dem rekombinanten Protein steigert sich einerseits die 

Wasserlöslichkeit der Nanopartikel und zusätzlich werden IgG-Moleküle in einer 

optimalen Orientierung auf der Oberfläche der Nanopartikel gebunden. In Abbildung 

26


2.6 sind die drei vorgestellten Konzepte zusammen gefasst. Nach der Beschichtung 

mit BSA, PEG oder Glas in allen vorgestellten Ansätzen wird die Quervernetzung mit 

Proteinen durchgeführt. Sun et al. verwendeten Glutaraldehyd für die direkte 

Kopplung der Nanopartikel mit Antikörpern. Bei S. Nie et al. und Schlücker et al. 

wurde s-NHS/EDC verwendet. 

Im Konzept von Schlücker et al. werden die Nanopartikel zuerst mit dem 

Adapterprotein eine kovalente Bindung eingehen und die Bindung mit den 

Antikörpern wird über das Protein A/G erfolgen. 

Abbildung 2.6: Unterschiedliche Modelle für die Stabilisierung von Immuno-SERS- 

Markern. [34,36,38] 

2.4 Blockierungsmethoden für Gewebeschnitte 

Das Prinzip der Bildung des Immunkomplexes basiert auf der Bindung zwischen 

Epitopen und Paratopen. Epitope sind die Stellen der Antigene, die von Antikörpern 

erfasst werden und in der Regel zwischen 8 bis 11 Aminosäuren lang sind. [147-148] 

Paratope sind die Erkennungsstellen der Antikörper, die mit Epitopen interagieren. 

Die Bindung zwischen Epitopen und Paratopen erfolgt über viele nichtkovalente 

27


Kräfte, wie Wasserstoffbrücken, elektrostatische Bindungen, Van der Waals-Kräfte, 

und auch hydrophobe Wechselwirkungen. [146] 

Bei hydrophoben Wechselwirkungen spielen drei Aminosäuren, (Phenylalanin, 

Tyrosin und Tryptophan) eine sehr wichtige Rolle. Diese hydrophoben Aminosäuren 

neigen dazu sich im Wasser zu annähen. [149] Die Fixierung des Gewebe mit Formalin 

kann die Hydrophobizität des Gewebes steigern, indem sich die reaktiven Epsilonund 

Alpha-Aminosäuren miteinander verknüpfen. Besonders kann die erhöhte 

Hydrophobizität in Bindegeweben (Kollagen, Elastin und Keratine) beobachtet 

werden. 

Die murinen Immunoglobulin Sub-Klassen sind unterschiedlich hydrophob. IgG 3 und 

IgG 1 sind hydrophober als IgG 2 und IgG 4 . Die Lagerung der Antikörper erhöht die 

Hydrophobizität der Moleküle, was zur Aggregation und Polymerisation der 

Biomoleküle führt. Dies verursacht eine Minderung oder den Verlust der Immun- 

Reaktivität der Moleküle. [149] Mit elektrostatischen Bindungen sind die Bindungen 

zwischen der gegenüberstehenden ionisierten Seite der Antikörper und Antigene 

gemeint. Die typischen Bespiele dafür sind geladene Carboxyl- und Aminogruppen 

auf der Oberfläche des Epitopen und Paratopen. [134] 

Auch die schwachen Van-der-Waals-Kräfte zwischen Atomen und Molekülen, oder 

die Bildung der Wasserstoffbrücken leisten einen Beitrag zur Bildung des Immun- 

Komplexes. In Abbildung 2.7 sind alle genannten schwachen und nicht kovalenten 

Bindungen nebeneinander dargestellt. 

Die unspezifischen Bindungen kommen wegen derselben schwachen und nichtkovalenten 

Wechselwirkungen zustande. Diese Wechselwirkungen bestehen 

zwischen Proteinen mit Proteinen oder zwischen Proteinen mit 

Festphasenoberflächen. Mit den Festphasenoberflächen sind verwendete 

Materialien, wie Glas als Objektträger bei der Immunhistochemie, Polystyrolplatten 

bei ELISA oder Membranen beim Westernblot gemeint. Diese Interaktionen können 

zu falsch-positiven Ergebnissen führen. [150] In der Regel kann die Interaktion 

zwischen Antikörpern und Festphasenoberflächen mit geeigneten 

Blockierungslösungen behoben werden. Die Interaktionen von Antikörpern und 

Proteinen verursachen auch unspezifische Bindungen, die zur Verfälschung der 

Ergebnisse führen können. Antikörper erkennen oft Proteine mit einer zufälligen 

Ähnlichkeit oder Homologie zu den Zielproteinen. 

28


Abbildung 2.7: Die wichtigen schwachen Wechselwirkungen, die zur Bildung von 

Immun-Komplexen führen sind : Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Kräfte, 

hydrophobe und ionische Wechselwirkungen. [153] 

Diese Reaktion der Antikörper mit nicht relevantem Antigen wurde als Kreuzreaktion 

bezeichnet. [150] Mit der Optimierung der Antikörperkonzentrationen, Einsatz der 

geeigneten Blockierungslösungen oder manchmal durch die Wahl eines anderen 

Antikörpers kann das Problem zum Teil behoben werden. [146] In der medizinischen 

Diagnostik werden eine genaue Quantifizierung des Fehlers und Wiederholungen mit 

anderen Methoden empfohlen. [151] 

Die Genauigkeit der Quantifizierung im ELISA-Verfahren ist stark abhängig von der 

Menge der Analyten. Im Zwei-Schritt-Immunoassay werden zuerst Analyten mit 

immobilisierten Fänger-Antikörpern in Verbindung gebracht und erst nach dem 

Waschen wird der Detektionsantikörper dazu gegeben. 

Die gemessenen Signale sind direkt proportional Menge der Analyten. Nach der 

Sättigung der Antikörper mit Analyten werden die steigenden Werte in ein Plateau 

übergehen. Bei dem Ein-Schritt-Immunoassay werden die Analyten und Antikörper 

gleichzeitig miteinander vermischt. Die sehr hohe Konzentration der Analyten sättigt 

den Antikörper und verhindert die Bildung des Immunkomplexes. Dieses falschnegative 

Resultat ist als Hook-Effekt, oder auch „High-Dose Hook Effekt“, bekannt 

(Abbildung 2.8). [152,153] 

Die Durchführung der parallelen Messungen von verschiedenen Verdünnungen der 

Probe (Antigen) kann auf einen vorliegenden Hook Effekt hinweisen. 

29


Abbildung 2.8: A) Schematische Darstelllung eines Sandwich ELISAs: Je mehr 

Analyt vorhanden ist, desto mehr Messsignal wird erzeugt. B) Hook-Effekt. Das 

Messsignal könnte als Analytkonzentration x oder y interpretiert werden. [152] 

Die unspezifischen Bindungen in der Immunhistochemie und bei Westernblot werden 

auch als Hintergrundfärbung bezeichnet. In der Abbildung 2.9 wurde beispielhaft die 

Hintergrundfärbung bei der Immunhistochemie und einem Westernblot 

gegenübergestellt. In der immunhistochemischen Abbildung handelt es sich um die 

Detektion der p63-positiven Basalzellen während der Einstellung der 

Inkubationszeiten. Wie in Abbildung 9A ersichtlich, sind gewisse 

Hintergrundfärbungen bei Stroma und Epithelium vorhanden. 

Abbildung 2.9: Lokalisierung von p63-positiven Basalzellen (A).Durch die längere 

Inkubation mit dem Detektionsantikörper wurden auch die Epithelzellen und das Stroma 

mit gefärbt(A). Die Westernblot-Analyse von ß-Aktin mit einer Größe von 43 kDa, (B). Die 

Westernblot-Analyse von EGFR mit einer Größe von 170 kDa (C). Die Zielbande wurde 

geschnitten und in einem roten Rahmen separiert (C unten). Die Experimente B und C 

wurden an der Universität Bonn durchgeführt. 

30


Diese Hintergrundfärbungen wurden nach Optimierung der Inkubationszeit 

vollständig beseitig. Die Ergebnisse von Westernblot sind aber nach den 

vollständigen Optimierung ermittelt wurden. Während beim für ß-Aktin durchgeführte 

Westernblot keine Hintergrundfärbung zu sehen ist, zeigt der Westernblot von EGFR 

viele unspezifische Bindungen. Daher werden in den meisten Publikationen nur die 

notwendigen Banden herausgeschnitten und gezeigt. Der Grund für das 

unterschiedliche Ausmaß der Hintergrundfärbungen zwischen ß-Aktin und EGFR 

können unspezifische Bindungen der verwendeten primären oder sekundären 

Antikörper sein. 

Wie schon Niels Kaj Jerne, der Gewinner des Nobelpreises für Medizin oder 

Physiologie 1984, in seinem Vortrag zur Preisverleihung sagte: “jeder Antikörper ist 

multispezifisch“. [146] 

2.5 Antigendemaskierungsmethoden für Gewebeschnitte 

Der Verdacht auf Krebs soll mit immunhistologischen Untersuchungen bestätigt 

werden. Daher werden von Patienten zuerst Gewebeproben entnommen. Um die 

Proben für längere Zeit aufbewahren zu können, sollten sie fixiert werden. Eine gut 

etablierte Methode dafür ist die Formalin-Fixierung mit anschließender Paraffin- 

Einbettung. Formalin-Lösungen beinhalten Aldehyde, die zu Quervernetzung der 

Proteine führen. Dadurch gehen in der Regel 85% von der Sekundär- und 

Tertiärstruktur der Proteine verloren. Eine spätere Detektion in diesem Zustand ist 

schlecht durchführbar. [23] Durch die Antigendemaskierungsmethoden oder Antigen- 

Retrieval kann zum großen Teil die verlorene Sekundär- und Tertiärstruktur der 

Proteine wieder hergestellt werden. Dadurch wird das räumliche Ladungsmuster, das 

in Abbildung 2.7 gezeigt wurde wieder hergestellt. Für die „Antigendemaskierung“ 

wurden bisher verschiedene Methoden etabliert, die in zwei Kategorien unterteilt 

werden können. Erste Methode ist das Hitze-induzierte Antigen-Retrieval (engl. Heat- 

Induced antigen (Epitope) Retrieval, abgekürzt HIER. Bei der zweiten Methode 

werden verschiedene Enzyme zur Verdauung der fixierten Proteine eingesetzt. Die 

Demaskierung mit Hitze in wässrigen Puffern wird häufiger als die anderen Methoden 

verwendet. Dabei werden die Gewebeproben mit verschiedenen Puffern (häufig 

Citrat oder EDTA) und bei verschiedenem pH mit Hitze (Dampf oder Mikrowelle) oder 

Mikrowelle behandelt. [154] Die HIER-Methode wurde zum ersten Mal 1991 von Shi et 

al. basierend auf der Arbeit von Fraenklen vorgestellt. [155] 1948 hat Fraenklen mit 

31


seinen Untersuchungen belegt, dass durch Hitze und alkalische Hydrolyse eine 

reversibel Auflösung der durch Formalin gebildete Bindungen möglich ist. [156,157] Die 

genaue Wiederherstellung der Strukturen ist bis heute nicht geklärt worden. Eine 

Hypothese besagt, dass die feuchte Hitzebehandlung bei löslichen und 

blockierenden Proteinen eine Extraktion und Fällung verursacht. Nach der 

Rehydratation des Gewebes können die Antikörper leichter penetrieren. [158] 

Protease-induziertes Epitope Retrieval (eng. Protease-induced epitope retrieval) oder 

abgekürzt PIER. Diese Methode wurde 1975 vor der Entwicklung von HIER von 

Huang etabliert. [159] Für die Verdauung des Gewebes wurden verschiedene Enzyme, 

wie Proteinase K, Pronase, Trypsin, und Pepsin verwendet. Die Spaltung der Peptide 

mittels Enzym ist unspezifisch, denn dadurch können die Epitopen verloren bzw. 

beschädigt werden. [23,160,161] 

32

3 Kenntnisstand 


Die Anwendungen der Nanotechnologie in verschiedenen Bereichen, wie Forensik, 

Landwirtschaft und Medizin erlangen zunehmend an Bedeutung. Allein die 

Applikationen der Nanomedizin können in verschiedene Kategorien, wie 

Gentherapie, Transport von Medikamenten, Einsatz als Kontrastmittel bei Imaging 

und die Detektion von Biomolekülen in der Diagnostik unterteilt werden. [162-165] Im 

Besonderen wird mesoporöses Silica wegen des Verhältnisses der Oberfläche zum 

Volumen für Diagnostik und Transport von Medikamenten eingesetzt. Ein Gramm 

von diesen Nanopartikeln (NP) hat ein Volumen von ca. 1 cm 3 und bietet ca. 1000 m 2 

Oberfläche. [166] Durch den Einsatz der Nanopartikel werden die notwendigen 

Reaktionszeiten verkürzt und die Sensitivität der Messung drastisch erhöht. Die 

erhöhte Sensitivität mittels Nanotechnologie erlaubt z.B. die Existenz eines einzelnen 

Zytokin-Moleküls nachweisen. [167] Während ein Standard-Elisa mehreren Stunden 

Zeit in Anspruch nimmt und eine limitierte Sensitivität bietet, kann die 

Nanotechnologie sogar innerhalb einiger Minuten ein hochsensitives Resultat ohne 

Lesegerät und Vorort ermöglichen. [168] Über die Beschreibung von vollständigen 

Applikationen der Nanopartikel wurden viele Publikationen und Bücher geschrieben. 

Daher ist es in diesem Abschnitt nur möglich, einige wichtige Publikationen zur 

Lokalisierung und Quantifizierung der Proteine mittels SERS-Mikroskopie zu 

beschreiben. Dazu sollen vor allem Komponenten eines SERS-Markers kurz 

beschrieben werden. Im nächsten Abschnitt werden diese Beschreibungen 

ausführlicher erklärt. 

3.1 Komponenten eines SERS-Markers 

Der SERS-Marker besteht aus mindestens zwei Komponenten, einem Kern aus 

Edelmetall und einer Schicht aus organischen Molekülen, die im Idealfall kovalent an 

die Oberfläche des Edelmetalls gebunden sind. Dieses Konstrukt wird oft mit Glas 

[Tetraethoxysilan bzw. Si(OC 2 H 5 ) 4 ] oder einem Protein, wie z.B. BSA, zum Schutz 

des Markers verkapselt. Das Verkapselungsmaterial kann als dritte Komponente 

angesehen werden. Die eingesetzten metallischen Nanopartikel als SERS-Substrat 

zeigen in Publikationen Unterschiede in Form, Beschaffenheit und Größe. 

Voraussetzung zur Erzeugung des SERS-Signals ist, dass die Nanopartikel kleiner 

sein sollen als die Wellenlänge des einfallenden Lichts. Der Abstand der Moleküle 

zur Metall-Oberfläche spielt für die Verstärkung des Raman-Effektes eine sehr 

33


wichtige Rolle. Für die Erzeugung eines intensiven SERS-Signals sind die Raman- 

Moleküle im optimalen Fall kovalent an die Nanopartikel gebunden oder sie liegen in 

unmittelbarer Nähe der Oberfläche des Edelmetals. Idealerweise können Raman- 

Marker über deren z. B. Aryldisulfid bzw. –thiol Reste eine kovalente Bindung mit 

dem Edelmetall eingehen. Die gebildete Schicht der organischen Moleküle wird 

selbstanordnende Monolage (engl.; SAM self assembled monolayer) genannt. In 

Abbildung 3.1 wurden zwei verschiedene SERS-Marker, die in der Arbeitsgruppe 

Schlücker entworfen wurden, dargestellt. Es handelt sich bei 3.1A um hydrophil 

stabilisierte SERS-Partikel, die durch Ethylenglykoleinheiten stabilisiert sind. In 

diesem Konzept wird das Antikörpermolekül an dem längeren Molekül mit der 

Carboxyl-Gruppe am Ende gebunden. Abbildung 3.1B zeigt schematisch 

glasstabilisierte SERS-Nanopartikeln. 

Abbildung 3.1: Darstellung von hydrophilstabilisierten SERS-Nanopartikel (A). Mono- und 

Triethylenglykol sind mit 4-TNB verknüpft und bilden unterschiedlich lange Moleküle. 

Schematische Darstellung eines glasverkapselten SERS-Markers (B), der im Kern aus 

Gold besteht. Darauf sind Raman-Marker adsorbiert, die eine selbstanordnende Monolage 

bilden. Eine Glashülle schützt das Konstrukt. 

3.2 Anwendungen der SERS-Marker in der Immunhistochemie 

Über die immunhistologische Applikation von Immuno-SERS-Nanopartikel- 

Konjugaten sind nicht viele Publikationen vorhanden. Einerseits ist diese Methode 

sehr jung und anderseits benötigt die Methode diverse Einstellungen und verlangt 

viel Fachwissen, um störende Probleme zu erkennen und zu beseitigen. Wie bereits 

34


in der Einleitung erwähnt, wurde der Machbarkeitsnachweis der SERS-Mikroskopie 

zum ersten Mal 2006 von Schlücker und Mitarbeitern zur Lokalisierung der PSApositiven 

Epithelzellen bei Prostatagewebeschnitten mit ca. 60 nm großen 

Gold/Silber-Nanoschalen als SERS-Substrat eingesetzt (Abbildung 3.2). 

Abbildung 3.2: Mikroskop-Aufnahme eines Gewebeschnittes (links) und 

punktuelle Darstellung der aufgenommenen Spektren (rechts) im Epithel (A- 

C), Stroma (D) und (E) Lumen. 

2007 gelang Sun et al. der Zwei-Farben/1-Target-Nachweis Nachweis von PSA in 

Prostatagewebe. Es wurden für die Detektion von PSA zwei unterschiedliche 

Raman-Markeraggregate verwendet. Die kleinen Aggragate wurden COINs 

(composite organic-inorganic nanoparticles) genannt (Abschnitt 2.2). [34] Mit dem 

Einsatz von Aggregaten (COINs) konnte die Arbeitsgruppe Sun im Vergleich zum 

den ersten Experimenten (proof-of-concept) aus 2006 mehr SERS-Signal 

detektieren. [29] Schließlich verleihen die Aggregate durch plasmonische 

Feldverstärkung eine enorme Signalintensität, die von Gold/Silber-Nanoschalen nicht 

zu erwarten sind. In Abbildung 3.3 ist das Ergebnis dieser Untersuchung dargestellt. 

Mit dem Einsatz von Aggregaten kann zwar mehr SERS-Intensität erzeugt werden, 

allerdings hängt der Erfolg bei immunhistochemischen Färbungen mittels SERS- 

Mikroskopie von mehreren Faktoren ab. Die Qualität der Bildgebung bei der SERS- 

Mikroskopie hängt von Faktoren, wie der Anzahl der SERS-Marker, der 

Antigendemaskierungsmethode und der Inkubationszeit sowie dem verwendeten 

Blockierungspuffer ab. Das Problem mit der schlechten immunhistochemischen 

Färbung (unspezifischen Bindungen und fehlende flächendecken SERS-Signale) 

untersuchte die Gruppe ca. anderthalb Jahre später und sie fand auch einen 

mathematischen Ansatz (Datenprozessierung) zur Nachbesserung des Problems. [35] 

35


Abbildung 3.3: Simultane PSA-Antigen-Lokalisierung mit zwei unterschiedlichen 

Ramanmarkierten COINs. Im Weißlichtbild (A) wurden die unterschiedlichen Bereiche der 

Prostatadrüse (S: Stroma, E: Epithel und L: Lumen) gezeigt. In B wurde oben das überlagerte 

Raman-Spektrum der beiden COINs nach Messung an einem Punkt gezeigt. Unten sind die 

vereinzelten Raman-Spektren der COINs sowie die detektierte Autofluoreszenz des Gewebes 

dargestellt. In Abbildung C wurde die Lokalisierung der PSA-Proteine nach Überlagerung der 

ermittelten SERS-Signale dargestellt. Die farbigen Punkte stellen die PSA-positiven Proteine 

und die grauen Punkte die PSA-negativen Bereiche dar. [34] 

In Abbildung 3.4 wurde die Färbung des Gewebes nach der Behandlung mit α-PSAgebundenen 

COINs und die Auswertung mit dem Matlab-Programm zusammen 

gefasst. Der Autor hat zwei benachbarte Gewebeschnitte für die Färbung mit Immun- 

SERS-Nanopartikel-Konjugaten und Fluorszenz-Farbstoffe verwendet. Da die 

Behandlung der Gewebeproben sowie die Ergebnisse und mathematischen 

Auswertungen in der Darstellung ähnlich sind, wird hier nur die SERS-Färbung 

abgebildet, um das Vorgehen so einfach wie möglich beschreiben zu können. 

Zur Ermittlung des gemessenen Spektrums wurde eine Linearkombination aus drei 

Komponenten gefittet: 1. Das Referenzspektrum des entsprechenden Reporters 

(COINs) 2. repräsentative Autofluoreszenz des Gewebes 3. Eine Polynomfunktion 

mit freien Parametern, um unbekannte Variationen der Autofluoreszenz zu 

berücksichtigen. Der Fit wurde als lineare Regression kleinster Quadrate 

durchgeführt. Aus dem Anteil des Referenzspektrums am gemessenen Spektrum 

wurde die Signalintensität ermittelt. [35] Abbildung 3.4 A stellt das Weißlichtbild des 

untersuchten Gewebes dar. Die ermittelten Falschfarbenbilder (Rohdateien) sind in 

dieser Publikation nicht dargestellt. In Abbildung 3.4 B wurde das ermittelte SERS- 

Signal nach der Berechnung mit dem Matlab-Programm dargestellt. Bei dieser 

Berechnung wurde zunächst das Verhältnis des Signals zu den Hintergrund-Signalen 

ermittelt. [35] 

36


Abbildung 3.4: Weißlichtbild (A), gefittetes Spektrum des Immuno-SERS- 

Nanopartikel-Konjugates (B), Darstellung des Falschfarbenbildes nach der Berechnung 

des Verhältnisses von Signalen durch Hintergrund-Signale (C), Darstellung eines 

binären Bildes nach punktueller Definition der Pixel als negativ oder positiv (D). [35] 

In diesem Zusammenhang wurde das durchschnittliche Signal im Epithel (in dem 

PSA exprimiert ist) wird durch das durchschnittliche Signal vom Stroma (PSAnegativ) 

geteilt. Da die Hintergrundbeiträge bei Erstellung der Spektren durch einen 

Algorithmus eliminiert wurden, werden weitere Signale, wie z.B. unspezifische 

Bindungen als Hintergrundsignale angesehen und eliminiert. Nach dieser 

Berechnung wurde die Abbildung 3.4 C erstellt, welche gar keine unspezifischen 

Bindungen zeigt. Im zweiten Schritt werden einzelne Pixel abhängig von deren 

Signal-Intensität als positiv oder negativ klassifiziert, um ein binäres Bild darstellen zu 

können. Nach dieser Einstufung wurde die Abbildung 3.4 D erzeugt. Diese Strategien 

und Berechnungen wurden zur visuellen Eliminierung der unspezifischen Bindungen 

und zur Erstellung einer flächendeckenden Färbung angewendet. 

Sechs Monate nach dieser Publikation veröffentlichte dieselbe Arbeitsgruppe ein 3- 

Farben-Multiplexing auf Gewebeschnitten. [169] Die Gruppe verwendete dasselbe 

Konzept für die Darstellung der binären Bilder und detektierte auf dem 

Gewebeschnitt damit Proteine, wie PSA und Zytokeratin-18, aber auch DNA. Die 

Autoren haben die an PSA gebundenen Immuno-SERS-Nanopartikel-Konjugate als 

AOH-PSA und die an Zytokeratin-18 gebundenen Immuno-SERS-Nanopartikel- 

37


Konjugate, BFU-CK18 genannt. Die DNA wurde mit einem Fluoreszenz (YOYO) 

gefärbt. Das Weißlichtbild wurde in Abbildung 3.5A und die gemessene SERS- 

Spektren in Abbildung 3.5B dargestellt. Die drei einzelnen Bilder wurden mit 

gleichem Vorgehen wie in Abbildung 3.4 beschrieben dargestellt (in Abbildung 3.5). 

In Abbildung 3.5D wurde auch ein überlagertes Bild von drei SERS-Färbungen 

dargestellt. 

Abbildung 3.5: Weißlichtbild (A), gefittetes Spektrum der SERS-Nanopartikel (B), 

Darstellung der binären Bilder nach Berechnung der Verhältnisse von Signalen durch 

Hintergrunde (in rot, grün und blauer Farbe) und Überlagerung der drei binären Bilder (D). 

Hinsichtlich einiger Probleme bei diesem Konzept gibt es Nachbesserungs- bzw. 

Lösungsbedarf. Vor allem werden die Daten zum Teil beliebig verändert um das 

Ausmaß der unspezifischen Bindungen niedrig zu zeigen. In der Standard- 

Immunhistochemie werden unspezifische Bindungen durch die Einstellung der 

Inkubationszeiten und die Auswahl der Blockierungspuffer minimiert oder beseitigt. 

Zur Darstellung des Falschfarbenbildes wurde in diesem Konzept das Matlab- 

Programm eingesetzt. Nach Verwendung dieses automatischen Programms ist noch 

eine Quantifizierung der Signale möglich. Dieses Konzept erlaubt dem Anwender bei 

der Erstellung der binären Bilder (beim zweiten Schritt) zu entscheiden, welches 

Signal als positiv oder negativ eingestuft werden darf. Nach einer Einstufung der 

Signale als positiv oder negativ in diesem Verfahren geht die Quantifizierbarkeit der 

SERS-Messungen, die wegen der fehlenden Signalamplifikation vorteilhaft wäre, 

völlig verloren. In Abbildung 3.4D oben wurde eine Skala-Bar dargestellt, die anhand 

der Signalintensität von schwarz bis rot variiert. Die rote Farbe auf dem Gewebe ist 

38


schon nach den Berechnungen monoton geworden und es gibt keine Variation der 

Signalintensität. Die Expression des PSA-Proteins steht unter dem Einfluss der 

Therapie und hängt auch von den Stadien der Erkrankung ab. Nach einem 

derartigen Vorgehen weisen die Gewebeschnitte die gleiche Färbungsqualität auf, 

nämlich entweder schwarz oder rot. In Abbildung 3.5D können bei einzelnen binären 

Bildern vor der Überlagerung der Bilder, deutlich unspezifische Bindungen auf dem 

Stroma gesehen werden (rote Pfeile), die nach der Überlagerung der Bilder nicht 

mehr vorhanden sind. In der Publikation wurde nicht klar gestellt, wieso diese Signale 

nach der Überlagerung fehlen. [169] 

Zur Erinnerung muss gesagt werden, dass diese Technologie ursprünglich für 

Pathologen zur Erleichterung bei der Begutachtung von Tumoren entwickelt wurde. 

Die Pathologen konzentrieren sich dabei nicht nur auf einen Teil der Drüse, sondern 

untersuchen mehrere Übersichtsfelder um eine Diagnose zu stellen. Mit der 

Standard-Immunhistochemie kann ein Pathologe viel schneller und präziser die 

Diagnose für den Patienten stellen. Allein für die Darstellung des binären Bildes in 

Abbildung 3.4 wurden 900 Punkte (Pixel) vereinzelt als positiv oder negativ 

klassifiziert. Die Abbildung 3.5 erfordert eine Begutachtung und Klassifizierung von 

sogar 2500 Punkten für ein einzelnes untersuchtes Antigen. Insgesamt wurden 7500 

Punkte für die ganze Abbildung begutachtet. Eine solche Begutachtung der Signale 

durch Pathologen ist sehr zeitaufwendig und recht fehleranfällig. Das bedeutet, dass 

die benötigte Zeit zur Datenauswertung eines Patienten mittels dieses Konzepts 

mehrere Tage beträgt. Zeit, die sich die Mediziner oder Patienten nicht leisten 

können. Eine vollständige Automatisierung kann es bei diesem Konzept nicht geben, 

da die Drüsen im Prostatagewebe sehr unterschiedliche Formen haben und die 

Expression der Proteine sogar in benachbarten Schnitten sehr unterschiedlich sein 

können. 

In der vorliegenden Arbeit wurde nur eine Software (Paint.NET) für die Überlagerung 

der Falschfarbenbilder benutzt, weil zurzeit die Überlagerungsfunktion beim 

eingesetzten Mikroskop (WITec-Software) fehlt. Die Bindungsaffinität der Antikörper 

wurde als Maßstab für positive oder negative Anbindungen festgelegt. Bei allen 

Abbildungen in dieser Arbeit stammen die Signale aus Nanopartikeln, die tatsächlich 

vorhanden sind. 

39


3.3 Anwendungen der SERS-Marker in Immunoassays 

SERS-markierte Antikörper wurden auch auf Grund ihres hohen Potentials zur 

Vielfarbendetektion in SERS-Immunoassays eingesetzt. Bei SERS basierten 

Immunoassays im Vergleich mit z.B. Fluoreszenz-Immunoassays kann durch 

Auswahl der geeigneten Marker die Überlappung der verschiedenen Signale 

verhindert und somit die Vielfarbendetektion ermöglicht werden. 

Der erste Sandwich-Immunoassay mit SERS als Auslese/Detektions-Methode wurde 

1989 von Rohr und seinen Mitarbeitern etabliert. [170] In diesem Konzept diente ein 

dünner rauer Silberfilm als SERS-Substrat und die Detektionsantikörper tragen als 

Farbstoff p-Dimethylaminoazobenzol (DAB). 

Abbildung 3.6: Etablierter SERS-Sandwich-Immunassay von Rohr et al. zur 

Detektion von TSH. Der Silberfilm verleiht die notwendige elektromagnetische 

Feldverstärkung für die Erzeugung des SERRS-Signales. [170] 

Mit dessen oberflächen-verstärkter Resonanz-Raman-Streuung (SERRS) konnte die 

Menge von Thyreoidea-stimulierendes Hormon (TSH) ermittelt werden. [170] 

Porter et al. haben 1999 vom ersten Simultannachweis von zwei Antigenen durch 

SERS-Immunassay berichtet. [131] In diesem Konzept wurden polyklonalen Antikörper 

von drei Spezies (Raten, Kaninchen und Ziege) verwendet. Die Ziege anti Ratten 

und Ziege anti Kaninchen wurden als Fänger-Antikörper auf Goldoberfläche 

immobilisiert. Dieselben polyklonalen Antikörper wurden als Detektionsantikörper auf 

das SERS- Substrat (30 nm Gold- Nanopartikel) aufgebracht. In diesem Konzept 

wurden die Immunoglobulin-Moleküle der drei Spezies als Antigen verwendet. Nach 

Bildung des Immunkomplexes soll durch räumliche Nähe der Nanopartikel und 

Goldoberfläche eine elektromagnetische Feldverstärkung zustande kommen. Die 

40


Wahl eines großen Moleküls, wie Immunglobulin als Antigen sollte zur Erleichterung 

der Detektion führen, weil so ein Molekül viele Epitopen zur Erkennung durch 

polyklonalen Fänger und Detektionsantikörper bietet. Die Sensitivität dieses 

Konzepts lag gegen den Erwartungen bei 10 -9 mol/l. Als Gründe für diese niedrige 

Sensitivität können die Bildung der unvollständigen Submonolage auf SERS-Substrat 

und der ungewöhnliche Umgang mit den Antikörpern genannt werden. Nach der 

Immobilisierung der Fänger-Antikörper auf der Goldoberfläche wurde diese mit 

Wasser gewaschen und unter Argongas bis zur weiteren Verwendung getrocknet 

und aufbewahrt. In Abbildung 3.7 ist die etablierte Methode von Porter et al. 

schematisch dargestellt. 

Abbildung 3.7: Zuerst wurden die Fänger-Antikörper auf goldbeschichtetem Glas 

immobilisiert. Danach wurde die Oberfläche mit einer Lösung von zwei 

verschiedenen Antigenen blockiert. Am Ende wurden zwei verschiedene Immuno- 

SERS zur Bildung des Immunkomplexes mit abgefangenen Antigenen durch 

Blockierung in Verbindung gebracht. [131] 

Etwa vier Jahre später verbesserten Porter et al. beide Hindernisse im alten Konzept 

und konnte in einem auf SERS basierten Immunassay eine femtomolare Detektion 

(ca.1 pg/ml) des prostataspezifischen Antigens (PSA) demonstrieren. Die 

Verbesserung bei dem hergestellten SERS-Substrat wurde in Abbildung 3.8 

dargestellt. Im verbesserten Konzept wurden die Nanopartikel zuerst mit einer 

vollständigen Monolage aus 4-Nitro-2-Mercaptobenzoesäure bedeckt. Die Detektor- 

Antikörper wurden danach direkt an die Raman-Reporter-Moleküle konjugiert. Bei der 

41


Immobilisierung der Fänger-Antikörper wurde auch auf das Trocknen der Antikörper 

verzichtet. 

Abbildung 3.8: Schematische Darstellung von Komponenten des SERS-Markers 

im verbesserten Konzept von Porter et al. [33] 

Basierend auf diesem Konzept erschienen noch einige Publikationen. Eine viel 

versprechende Publikation zur Detektion von PSA in niedrigen Konzentrationen (ca.1 

pg/ml) wurde 2010 von Jung et al. veröffentlicht. [171] 

Abbildung 3.9: Schematische Darstellung vom Sandwich-Immunassay. DSNB- 

Moleküle wurden in diesem Konzept für kovalente Kopplung mit Antikörpern 

vorgesehen. Nach Bildung vom Immunkomplex wird eine Verstärkung bei SERS- 

Intensität von beiden Raman-Reportern (R6G und DSNB) erwartet. [171] 

In dieser Publikation wird ein Glasobjektträger mit APTMS (3-aminopropyl 

trimethoxysilane) funktionalisiert und danach mit Goldnanopartikeln beschichtet 

(Abbildung 3.9). Auf dieser Beschichtung wird der Fänger-Antikörper immobilisiert. 

Die Detektions-antikörper werden in diesem Konzept kovalent an DSNB 5,5’- 

Dithiobis (succinimidyl-2-nitrobenzoesäure) gebunden. Der SERS-Marker trägt auch 

42


gleichzeitig die Rhodamin 6G-Moleküle, die eigentlich das notwendige Signal 

gemeinsam mit DSNB zur Detektion generieren sollen. In der negativen Kontrolle 

konnte nur das Signal von DSNB beobachtet werden. [171] 

Ein eleganter Einsatz von Aggregaten im Sandwich-Immunassay wurde 2009 von 

Song et al. publiziert. In diesem Konzept wurde der Glasobjektträger mit den Silber- 

Aggregaten für die spätere Kopplung mit Fänger-Antikörpern beschichtet. [172] Der 

Glasobjektträger wurde zuerst mit PDDA [Poly(diallyldimethylammoniumchlorid)] 

behandelt, um der Glasoberfläche eine positive Ladung zu verleihen. Die 

Beschichtung mit Silber-Aggregaten kommt durch elektrostatische Wechselwirkung 

zustande. Die Immuno-SERS-Nanopartikel-Konjugate (Goldaggregate) sollen nach 

Angaben der Autoren in kontrollierbarer Größe herstellbar sein. Die gebildeten Gold- 

Aggregate sind mit Raman-Reporter 4-Mercaptobenzoesäure markiert und 

generieren ein stärkeres SERS-Signal im Vergleich mit bisherigen SERS-Substraten. 

In Abbildung 3.10 wurde das Konzept schematisch dargestellt. 

Abbildung 3.10: Schematische Darstellung vom SERS-Immunassay von Cui et al,. 

AgNP steht für aggriegierte Silberpartikel, AuNP steht für aggriegierte 

Goldnanopartikel. Als Ramanmarker wurde 4-MBA verwendet. [172] 

Mit Einsatz der kleinen Aggregate konnte die Konzentration des humanen 

Immunoglobulin in Form einer Standardreihe von 100 ng pro Milliliter bis zu 100 fg 

pro Milliliter ermittelt werden. 

2011 wurden die glasverkapselten Gold-Clustern als SERS-Substrat für Immun- 

Detektion in der Arbeitsgruppe Schlücker eingesetzt. Sie sind in der Lage, als 

43


einzelne Nanopartikel innerhalb 30 Millisekunden genügend Signal zur Detektion zu 

generieren. Das ist mit Abstand die kürzeste Belichtungszeit, die bisher zur 

Ermittlung des einzelnen Partikel-Signals eingesetzt wurde. 

Die Verkapselung der Nanopartikel mit Glas wurde 2003 von S. Nie und M. J. Natan 

entwickelt. [173-174] Das Ziel der beiden Gruppen war es Stabilität und Schutz des 

SERS-Substrat gegen chemische und physikalische Änderungen der Umgebung zu 

gewährleisten. Diese und auch weitere Publikationen konzentrieren sich auf die 

chemischen und physikalischen Eigenschaften des glasverkapselten SERS- 

Substrats. In der Tat wurde die biologische Applikation der glasverkapselten NP 

selten demonstriert. [199] Ein möglicher Grund für den seltenen Einsatz der 

glasverkapselten Nanopartikel im Immunassay liegt an deren starker Neigung zur 

Bildung von unspezifischen Bindungen. 

Chau et al. veröffentlichte 2010 eine Publikation über die immunbasierte Detektion 

von einzelnen Bakterien (Staphylococcus aureus) mit Einsatz der glasverkapselten 

Goldaggregate. Der Autor nannte das SERS-Substrat NAEB (Nanoaggregate 

embedded bead) und verwendete für die Detektion den Einzeldomänenantikörper 

anstatt Immunoglobulin. In dieser Publikation wurde nur die SERS-Bildgebung von 

einer einzelnen Zelle gezeigt und es wurde keine negative Kontrolle durchgeführt. [175] 

In der vorliegenden Arbeit wurden die glasverkapselten Nanopartikel zuerst mit 

synthetischem Protein A/G beschichtet. Das Protein A/G spielt als ein Adapterprotein 

zur Bindung an Immunglobuline eine Rolle. Dadurch wurde die spezifische Bindung 

der Antikörper-SERS-Nanopartikel-Konjugate erheblich verbessert und gleichzeitig 

die unspezifischen Bindungen vermindert. 

44

4 Material und Methoden 


4.1 Chemikalien und Puffer 

Die folgenden Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich erworben 

- (3-Aminopropyl) trimethoxysilan 

- Ammoniaklösung 

- Bernsteinsäureanhydrid 

- Cäsiumchlorid 

- N,N-Dimethylformamid 

- 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 

- Ethylenediaminetetraessig säure 

- Ficoll 400 

- N-hydroxysulfosuccinimide Natriumsalz 

- 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) 

- 4-Mercaptobenzoesäure 

- Mercaptohexadecansäure 

- Natriumborhydrid 

- o-Phenylendiamin dihydrochlorid 

- Poly(allylaminhydrochlorid) 

- Polyvinylpyrrolidon K30 und K10 

- Polyvinylpyrrolidon K40 

- Salpetersäure 

- Salzsäure 

- Schwefelsäure 

- Silbernitrat 

- Tetrachlorogoldsäure 

- Tetraethoxysilan 

- Tween 20 

Die Raman-Reporter, 2-Bromo-4-mercaptobenzoesäure (BMBA) und 2,3,5,6- 

Tetrafluoro-4-mercaptobenzoesäure (TF-MBA) wurden von den Firmen TRC 

(Kanada) und TCI (Deutschland) erworben. 

45


Die folgenden Chemikalien wurden von Carl Roth erworben: 

- Citronensäuremonohydrat 

- Dinatriumhydrogenphosphat 

- Glycerin 

- 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure 

- Kaliumchlorid 

- Kaliumdihydrogenphosphat 

- Tris 

- Reaktionsgefäße 1,5 ml und 2 ml 

- 16 cm Zentrifugationsröhrchen 

Das Protein-LoBind-Reaktionsgefäß wurde von Eppendorf erworben. Die Lösungen, 

wie Ethanol, Aceton und Isopropanol wurden vom Chemikalienlager der Universität 

Osnabrück bereit gestellt. 

Der Raman-Reporter, SEMA4 [S-4-((4-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethylcarbamoyl)phenyl)- 

ethynyl)phenyl ethanethioat] wurde in der Arbeitsgruppe von Professor Lambert in 

Würzburg hergestellt. 

Die Raman-Reporter-Derivate, MBA-MEG-OH (Monoethylenglykol), DTNB-MEG-OH 

(Monoethylenglykol) und DTNB-TEG (Triethylenglykol) wurden von M. Schütz an der 

Universität Osnabrück hergestellt. 

Folgende Materialien wurden von Thermo Fisher Scientific erworben: 

- Carboxy-PEG 8 -Amin, Produktnummer: 26122 

- Polyacrylamide Desalting Columns, Produktnummer: 89849 

- Melon Gel IgG Spin Purification Kit, Produktnummer:45206 

46


High density (HD) TRIDIATM (Glasobjektträger) wurden bei SurModics. Co erworben 

und die Trennwände (Flexwells) stammen von der Firma Grace Bio-Labs. 

Die Antigendemaskierungspuffer, wie die kommerzielle Target Retrieval Lösung 

(Firma Dako, Code S1700) und Proteinase K (Firma Dako, Code S3004) wurden 

freundlicherweise von PD. Dr. Packeisen zur Verfügung gestellt. Die weiteren 

Pufferlösungen wurden im Labor der Arbeitsgruppe Schlücker mit Reinstwasser 

(Spezifischer Widerstand: 18,2 MΩ cm) aus einer TKA-Anlage hergestellt. Die 

Zusammensetzungen der hergestellten Lösungen in dieser Arbeit wurden in der 

Tabelle 4.1 beschrieben. 

Bezeichnung Zusammensetzung pH-Wert 

Acetat-Puffer 0,1 M CH 3 COONa 4,4 

0,5 M NaCl 

Carbonat-Puffer I 0,2 M NaHCO 3 8,5 

0,5 M NaCl 

Carbonat-Puffer II 0,1 M NaHCO 3 8 

0,5 M NaCl 

HEPES-Puffer 

50 mM [2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1- 5,9 

piperazinyl)-ethansulfonsäure] 

PBS-Puffer 137 mM NaCl 7,4 

2,7 mM KCl 

9,6 mM Na 2 HPO 4 

15 mM KH 2 PO 4 

PBST-Puffer PBS + 20 mM Tris 7,4 

Tris-Puffer 150 mM NaCl 7,4 

20 mM Tris 

0,05% Tween 20 

EDTA-Tris-Puffer 10 mM Tris 8,7 

1 mM EDTA 

0,05% Tween 20 

Citrat-Puffer Citronensäuremonohydrat 20 mM 6 

Natriumcitrate tribasic dihydrate 

10 mM 

Substrat Puffer 0,1 M Na 2 HPO 4 

50 mM C 6 H 8 O 7 *H 2 O 

Tabelle 4.1: Liste der hergestellten Arbeitspuffer 

Die kommerziell erworbenen und selbsthergestellten Puffer für Blockierungen wurden 

in Tabelle 4.2 zusammengefasst. 

47


Blokierungspuffer Selbsthergestellte Puffer pH 

Denhardt-Puffer (5 Fach) 2% BSA, 2% Ficol, 2% PVP40 in PBS 7,4 

BSA 1-4% BSA in PBS 7,4 

Magermilch 0,2-2% Magermilch in PBS 7,4 

Blokierungspuffer kommerzielle Puffer Bestellnummer 

The Blocking Solution CANDOR 110050 

BSA-Block CANDOR 115125 

Smart-Block CANDOR 113125 

Blocking Solution 1 Zytomed Systems POLAP-100 

Antikörper-Verdünnungspuffer DCS Innovative Diagnostik-Systeme AL120R100 

Roti®-Block Carl Roth A151.1 

Roti®-ImmunoBlock Carl Roth T144.1 

Tabelle 4.2: Liste der hergestellten oder kommerziell erworbenen Blockierungspuffer. 

Die erworbenen Antikörper, Antigene und auch die rekombinanten Proteine wurden 

in Tabelle 4.3 zusammengefasst. Polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper 

wurden mit pAK und mAK abgekürzt. 

Bezeichnung Spezies Firma 

antihuman p63 klon Y4A3 (mAK) Maus IgG 2a antibodies online 

antihuman p63 (pAK) kaninchen Abcam 

antiziege Hrp-Antikörper (ab99710, pAK) Maus Abcam 

antihuman PSA klon A67-B/E3 (mAK) Maus IgG 1 Zytomed 

Rekombinant humanes TNF-α/TNFSF1A (mAK) E.coli R&D Systems 

anti humanes TNF-α/TNFSF1A (mAK) Maus IgG 1 R&D Systems 

anti humanes TNF-α/TNFSF1A (pAK) Ziege IgG R&D Systems 

Rekombinant humanes IL-1ß/IL-1 E.coli R&D Systems 

anti humanes IL-1ß/IL-1F2 (mAK) Maus IgG 1 R&D Systems 

anti humanes IL-1ß/IL-1F2 (pAK) Ziege IgG R&D Systems 

Rekombinant humanes CXCL8/IL-8 E.coli R&D Systems 

anti humanes CXCL8/IL-8 (mAK) Maus IgG 1 R&D Systems 

anti humanes CXCL8/IL-8 (pAK) Ziege IgG R&D Systems 

BSA (bovine serum albumin) - Carl Roth 

Milchpulver - Carl Roth 

Tabelle 4.3: Auflistung verwendeter Antikörper und rekombinanter Proteine. 

48


4.2 Synthese von SERS-Nanopartikeln 

4.2.1 Synthese von Keimpartikeln und quasi-sphärischen Goldnanopartikeln 

Die Herstellung von Keimpartikeln ist der erste Schritt der Herstellung von Gold- 

Nanosternen und quasi-sphärischen Goldnanopartikeln. Die hergestellten 

Goldnanopartikel resultieren aus dem Wachstum von Goldkristallen und haben daher 

keine völlig sphärische Form. Deshalb werden diese als quasi-sphärische 

Goldnanopartikel bezeichnet. 

Die ursprünglichen Vorschriften zur Herstellung der Keimpartikel wurden von Xia et.al 

und Perrault et.al herausgegeben. [176,177] M. Schütz hat sich während seiner 

Forschung mit einer Verbesserung der Vorschriften auseinander gesetzt. Diese 

verbesserten Vorschriften wurden ohne weitere Änderungen übernommen. 

Zur Untersuchung der Qualität der hergestellten Nanostrukturen in dieser Arbeit 

wurden die Produkte mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und 

der UV/VIS-Absorption/Extinktionsspektroskopie charakterisiert. Diese Ergebnisse 

wurden auch mit kommerziell erworbenen Kolloiden gegenüber gestellt. 

Das Vorgehen zur Herstellung von ca. 10 nm Gold-Keimpartikeln: 

900 µl der 1%igen Natriumcitrat-Lösung wurden mit 300 µl der 1%igen HAuCl 4 

vermischt. Die Mischung wurde gleichzeitig mit 42,5 µl 0,1%igem Silbernitrat 

(AgNO 3 ) gleichzeitig auf 30 ml kochendes Wasser in einen Glaskolben überführt. 

Nach 2 Minuten weiterem Kochen wurde der Reaktionskolben bei Raumtemperatur 

(RT) über Nacht unter Magnetrühren inkubiert. 

Das weitere Wachstum der Goldnanopartikel: 

Zunächst werden 6,6 mg Hydrochinon als Reduktionsmittel in 5 ml Wasser gelöst. 

Hydrochinon leitet als Elektronendonor drei notwendige Elektronen an HAuCl 4 weiter 

und reduziert diese Säure. 

Dadurch werden elementares Gold und Chlorwasserstoff freigesetzt. Die 

Redoxreaktion der Tetrachloridogold (III)-säure mit Hydrochinon ist in Abbildung 4.1 

schematisch dargestellt. Die TEM-Bilder und Plasmonbanden der hergestellten 

Keimpartikel sind in Abbildung 5.1 dargestellt. 

49


Abbildung 4.1: Reaktionsschema der Synthese von Goldkeimpartikeln. 

Das Vorgehen zur Herstellung von quasi-sphärischen Goldnanopartikeln: 

10 ml der hergestellten Goldkeimpartikel-Suspension (OD= 6) wurden in 100 ml der 

PVP K30-Wasser-Lösung (2,5%) in einem Reaktionsglaskolben mit einem 

Magnetrührer vermischt. Es wurden weitere 50 ml Wasser und 2,5 ml 1%ige 

Tetrachloridogold (III)-säure dazugegeben. Nach 2-3 Minuten Rühren wurde die 

Hydrochinon-Lösung dazu überführt. Als Lösemittel für alle Substanzen wurde 

destilliertes Wasser (Spezifischer Widerstand: 18,2 MΩ cm) verwendet. Der 

Glaskolben wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter Magnetrühren inkubiert. Die 

TEM-Bilder der hergestellten Nanokristalle sind in Abbildung 5.3 dargestellt. 

4.2.2 Synthese von Gold-Nanosternen 

In bisherigen Publikationen wurden bei der Herstellung der Nanosterne organische 

Lösungen, wie DMF oder Stabilisatoren z.B. CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) 

verwendet. [179,180] Im neuen Konzept der Arbeitsgruppe Schlücker wurde auf die 

Verwendung der giftigen Lösungen, wie DMF verzichtet. Die vollständige Beseitigung 

der CTAB von den Oberflächen der Nanopartikel bei älteren Vorschriften war ein 

großes Hindernis. Diese Chemikalien können auch eine unerwünschte Denaturierung 

der Proteine hervorrufen. M. Schütz et al. etablierten eine biokompatible Vorschrift 

zur Herstellung von monodispersen Gold-Nanosternen. [178] Zur Herstellung der Gold- 

Nanosterne wurde eine definierte Menge von Glycerin verwendet. Die Hydroxyl- 

Gruppe von Glycerin führt zu besserer Stabilität der Nanopartikel gegen 

Oxidation. [181] 

Das Vorgehen zur Herstellung von Gold-Nanosternen: 

Zur Herstellung von Goldnanosternen wurden 300 µl Goldkeimpartikel(OD= 6) in 9,8 

ml Wasser überführt. Der Reaktionskolben wurde auf dem Magnetrührer platziert und 

die Geschwindigkeit auf 700 rpm eingestellt. Eine Mischung von 22 µl 1%iger 

50


Natrumcitrat-Lösung, 100 µl 1%iger HAuCl 4 -Lösung und 42,5 µl 0,1%iger Silbernitrat- 

Lösung wurden gleichzeitig in den Reaktionskolben überführt. Nach 5 minütigem 

Rühren wurden 100 µl 1%iger Hydrochinon-Lösung dazu pipettiert. Als Lösemittel für 

alle Substanzen wurde destilliertes Wasser (Spezifischer Widerstand: 18,2 MΩ cm) 

verwendet. Der Farbumschlag von rot auf dunkelblau konnte innerhalb weniger 

Minuten beobachtet werden. Die Bildung der Goldnanosterne wäre ohne Zugabe von 

Glycerin schneller geschehen, darunter leidet aber die Monodispersität der 

Keimpartikel. Die TEM-Bilder der hergestellten Gold-Nanosterne sind in Abbildung 

5.5 dargestellt. 

4.2.3 Synthese von Gold/Silber-Nanoschalen 

Gold/Silber-Nanoschalen können aufgrund einiger Vorteile als exzellentes SERS- 

Substrat für diagnostische Applikationen eingesetzt werden. 60 nm große 

Gold/Silber-Nanoschalen generieren im Vergleich zu gleichgroßen Goldnanopartikeln 

bei roter Laseranregung (632.8 nm) ca. 8 fach mehr SERS-Signale. [116,126] Die Lage 

der Plasmonbande von Gold/Silber-Nanoschalen kann durch die Dicke der Goldhülle 

genau an die anregende Laserwellenlänge angepasst werden. Die Herstellung und 

Handhabung der Gold/Silber-Nanoschalen ist im Vergleich zu anderen SERS- 

Substraten schneller. Die Vorschriften zur Synthese der Gold/Silber-Nanoschalen 

wurden 2002 von Xia et al. veröffentlicht. [182,183] Die Synthese und physikalische 

Charakterisierung von Gold/Silber-Nanoschalen wurden in Dissertationen von B. 

Küstner und M. Gellner detailliert beschrieben. [102,124] Gold/Silber-Nanoschalen 

entstehen durch die Oxidation des Ausgangsmaterial bzw. Silbernanopartikeln mit 

Tetrachlorgoldsäure. Das Standardreduktionspotential des [AuCl − 4]-Au-Paares (0,99 

V) ist höher als das von Ag + -Ag (0,80 V). [183] In dieser Reaktion werden die 

Silberatome mit Goldatomen ausgetauscht. 

4.1 

Der Goldanteil erhöht sich gemäß des Reaktionsschemas 4.1 mit der zugegebenen 

Menge von Tetrachlorgoldsäure. Die Lage der Plasmonbande der Legierung hängt 

von diesem Goldanteil ab. Das heißt, durch die Menge der zugegebenen Goldsäure 

kann die Lage der Plasmonenbande beliebig zwischen 400 bis 800 nm eingestellt 

werden. [184] 

51


M. Gellner beschreibt die Synthese von Gold/Silber-Nanoschalen in ihrer Dissertation 

als eine zweistufige Reaktion (Abbildung 4.2). Zuerst werden durch den Polyol- 

Prozess die polydispersen Silber-Nanopartikel hergestellt. [124] Die durch 

Zentrifugation getrennten monodispersen Silber-Nanopartikel werden im zweiten 

Schritt als Ausgangsmaterial verwendet. In einem Templatbasierten- 

Austauschreaktions-Prozess werden die Silber-Atome durch Gold-Atome 

ausgetauscht. 

Abbildung 4.2: Schema der Synthese von Gold/Silbernanoschalen nach Xia. Im ersten 

Schritt würden von Silbernitrat durch den Polyol-Prozess quasi- sphärische Silber- 

Nanopartikel hergestellt (A). Im zweiten Schritt wurden getrennte Silber-Nanopartikel als 

Ausgangsmaterial für eine Templatbasierte-Austauschreaktion mit der Tetrachlorgoldsäure- 

Lösung(HAuCl 4 ) verwendet, um Gold/Silber-Nanoschalen herstellen zu können (B). 

Das Vorgehen zur Herstellung von Gold/Silber-Nanoschalen: 

Es wurden 317,4 mg Silbernitrat in 2 ml Ethylenglykol aufgelöst. In diesem Schritt 

dürfen keine metallischen Gegenstände, wie z.B. ein Spatel mit dem Silbernitrat in 

Kontakt kommen. Daher wurde das Silbernitrat in einem Schnappdeckelglas mit Hilfe 

einem Plastiklöffel abgewogen. 

In einen 50 ml Kolben wurden 2000 mg PVP K30 und 13 ml Ethylenglykol überführt. 

Der Kolben wurde unter Rühren (1500 rpm) auf 169° C Ölbadtemperatur erhitzt. Die 

vorbereitete Silbernitratlösung wurde zum erhitzten PVP-Ethylenglykol zugetropft und 

52


weitere 65 Minuten gerührt. Zunächst wurde das Silberkolloid in einen 1l Glaskolben 

überführt und mit Reinstwasser auf 1 l aufgefüllt. Das Kolloid wurde dreimal 

nacheinander eine Stunde bei 1750 g zentrifugiert. Nach jedem Zentrifugationsgang 

wurde der Bodensatz in wässeriger PVP-Lösung (100 mg/l) resuspendiert. 

Erfahrungsgemäß befindet sich das erwünschte monodisperse Kolloid im dritten 

Überstand. Die Qualität des Kolloids wurde mittels TEM und Extinktionspektrometrie 

untersucht. 

Im zweiten Schritt wurde 1 ml der konzentrierten Silbernanopartikel-Suspension in 

100 ml Reinstwasser verdünnt und in einen Dreihalskolben mit Rückflusskühler 

überführt. Danach wurde die Kolloid-Suspension unter starkem Magnetrühren bis 

zum Siedepunkt erhitzt. 

Vor und während der Zugabe von vorbereiteter 1 mM Tetrachlorgoldsäure (HAuCl 4 ) 

wurden kleine Probenmengen von Kolloid-Lösung zur Überprüfung der Spektren mit 

der Extinktionsspektroskopie entnommen. Die Goldsäure (HAuCl 4 ) wurde 

tropfenweise auf die kochende Kolloid-Suspension zugegeben. Bei Erreichen der 

optimalen Resonanzposition wurde die Zugabe von HAuCl 4 eingestellt. Die 

ermittelten Extinktionsspektren und TEM-Bilder sind im Abschnitt 5.1 (Abbildung 5.6 

und 5.7) dargestellt. 

4.2.4 Herstellung von Clustern aus quasi-sphärischen Goldnanopartikeln 

Die hergestellten Goldnanopartikel wurden als Ausgangsstoffe zur Herstellung der 

Cluster verwendet. Die Monomere werden zuerst mit Raman-Reportern markiert und 

anschließend aggriegiert. Das aggriegierte Kolloid beinhaltet verschiedene 

Nanostrukturen, wie Monomere und unterschiedlich große Cluster. Diese Mischung 

wird zuerst mit TEOS (Tetraethoxysilan) verkapselt. Die Verkapselung mit TEOS wird 

auch als Stöbersynthese bezeichnet. Im nächsten Schritt werden die Cluster von den 

Monomeren und größeren Aggregaten getrennt. In diesem Abschnitt wird nur die 

optimale Herstellung der unkontrollierten Aggregate erklärt. Die Trennung von 

glasverkapselten Clustern wird in 4.3 beschrieben. Die unkontrollierte Aggregation 

wird nach der Markierung der Nanopartikel mit dem Raman-Marker und vor der 

Glasverkapselung durchgeführt. 

53


Die Markierung der Nanopartikel mit Raman-Reportern erfolgt durch die Ausbildung 

einer selbstorganisierten Monolage (SAM, engl. self-assembled monolayer). Darunter 

versteht man sich eine geordnete Ansammlung von Molekülen auf einer bestimmten 

reaktiven Oberfläche, wie z.B. einem Metallnanopartikel. Zur Markierung der Cluster 

wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Raman-Marker verwendet, die in 

Abbildung 4.4 dargestellt sind. Diese Marker sind in der Lage über ihre vorhandene 

Thiol-Gruppe eine kovalente Bindung mit den Goldnanopartikeln einzugehen. 

Das Vorgehen zur Ausbildung einer selbstorganisierten Monolage: 

Es wurden 10 mM Lösungen (gelöst in Ethanol) von vier Markern in vier separaten 

Schnappdeckelgläsern vorbereitet. Das Goldkolloid wurde nach der Zentrifugation in 

Ethanol aufgenommen. Zur Markierung wurden 130 µl Marker-Lösung auf 900 µl 

(OD=1) Goldkolloid pipettiert. Die Zugabe von einem Überschuss des Markers 

garantiert die Ausbildung einer vollständigen SAM. [126] Die Marker-Kolloid- 

Mischungen wurden über Nacht auf dem Elektroschüttler (900 rpm) bei 

Raumtemperatur platziert. Nach der Inkubation wurden die überschüssigen Marker- 

Moleküle durch eine einmalige Zentrifugation und Waschen mit Ethanol entsorgt. 

Das Vorgehen zur Herstellung der optimalen Goldnanopartikel-Aggregate: 

Wie erwähnt sollte vor der Verkapselung mit dem TEOS die unkontrollierte 

Aggregation der markierten Nanopartikel (SAM) durchgeführt werden. Einige SAMs 

aus Raman-Markern, wie z.B. BMBA oder 4-MBA, lassen sich ohne weitere 

Behandlung mit TEOS verkapseln. Anderer SAMs, wie z.B. aus 4-TNB oder TF-MBA, 

müssen vorher mit APTMS oder Polyelektrolyt-Beschichtung gesondert behandelt 

werden. Die Beschichtung mit Polyelektrolyten wurde in dieser Arbeit nicht praktiziert. 

Der Einsatz der definierten Mengen von APTMS bei Markern, wie 4-TNB und TF- 

MBA, ersetzt die Funktion der Polyelektrolyt-Beschichtung und kann abhängig von 

der zugegebenen APTMS-Menge eine optimale Aggregation des Kolloids bewirken. 

Die unkontrollierten Aggregate von zwei SAMs, aus BMBA oder 4-MBA-Raman- 

Markern, wurden durch Zugabe von Tris-Puffer durchgeführt. 

Das Ausmaß der Aggregation kann durch Extinktionsspektroskopie und die Bildung 

der zweiten Bande beobachtet werden. Diese rotverschobene Bande (longitudinale 

Plasmonbande) entsteht durch die Plasmonkopplung bei Dimeren bzw. Clustern. Ist 

54


das Ausmaß der Aggregation klein, wird die Ausbeute von Clustern niedrig ausgehen 

und dazu soll die Verschwendung von Materialen (Gold) im Kauf genommen werden. 

In diesem Fall wird keine zweite Bande gebildet. Bei schweren Aggregationen wird 

die Ausbeute nicht zwingend größer, sondern es werden eher größere Aggregate 

gebildet. Diese Strukturen sind für den Einsatz als Immuno-SERS-Marker nicht 

geeignet. Die zweite Bande ist in diesem Fall sehr groß. 

Die gebildeten SAMs auf den jeweiligen Kolloiden. wie BMBA oder 4-MBA (OD=0,5) 

werden nach der Ausbildung einmal mit Ethanol gewaschen und in 1 ml Tris-Puffer 

aufgenommen. Die Reaktionsgefäße werden auf dem Schüttler (900 rpm) für 20 

Minuten bei RT platziert. Danach werden die Nanopartikel zentrifugiert und zweimal 

mit Reinstwasser gewaschen, um das überschüssige Salz zu entsorgen. Die 

Nanopartikel werden zur Verkapselung mit TEOS in einer Lösung aus 815 µl 

Isopropanol, 300 µl Wasser und 40 µl 12,7 M Ammoniak resuspendiert. 

Die SAMs aus 4-TNB oder TF-MBA wurden nach dem einmaligen Waschen mit 

Ethanol wieder in Ethanol aufgenommen. Die optimale Aggregation wurde mit 

Zugabe von 200 µl von 0,15 mM APTMS an 1 ml SAMs mit OD=1 beobachtet 

(Abbildung 5.9). Nach Zugabe von APTMS wurden die Reaktionsgefäße auf dem 

Schüttler (300 rpm) bei RT für ca. 20 Minuten inkubiert. Danach wurden die Kolloide 

zentrifugiert und zweimal in Ethanol gewaschen, um überschüssiges APTMS zu 

entsorgen. Am Ende wurde das Kolloid zur Verkapselung mittels TEOS in einer 

Lösung aus 815 µl Isopropanol, 300 µl Wasser und 40 µl 12,7 M Ammoniak 

resuspendiert. 

Um den Einfluss von APTMS auf das Ausmaß der Aggregationen darzustellen, 

wurde die gleiche Anzahl von Nanopartikeln mit unterschiedlichen Konzentrationen 

von APTMS behandelt. Die höchste Konzentration von APTMS beträgt 5 mM 

(Stammlösung), welche sechsmal nacheinander 1:2 verdünnt (C1= 5mM bis C7= 

0,078 mM) wurde. Die Zugabe von 200 µl der verdünnten APTMS in Ethanol auf 1 ml 

SAMs mit einer OD von 1 verursachte unterschiedliche Aggregationsgrade, die in 

Abbildung 5.9 dargestellt sind. 

4.2.5 Glasverkapselung von SERS-Nanopartikeln 

Zur Verkapselung ausgebildeter SAMs auf den Metallkolloiden wurden hauptsächlich 

drei Methoden in der Arbeitsgruppe Schlücker etabliert. Die Methoden werden 

55


Natriumsilicat-Methode, Polyelektrolytmethode und Stöber-Methode genannt. Die 

Verkapselungen anhand der Polyelektrolytmethode und Natriumsilicat-Methode 

wurden in dieser Arbeit nicht verwendet. Diese Methode wurden in vorherigen 

Dissertationen ausführlich erklärt. [102,124] In dieser Arbeit wurden die Nanopartikel 

hauptsächlich durch die Stöber-Methode verkapselt. Als alternativer Weg zur 

Polyelektrolytmethode und der Natriumsilicat-Methode wurden in dieser Arbeit die 

SAMs (4-TNB und TF-MBA) mit APTMS behandelt. Diese Vorbehandlung wurde 

auch von S. Nie et al. durchgeführt. [174] Bei der Ströber-Methode hängt die Dicke der 

Glashülle von der zugegebenen TEOS-Menge ab. Diese Abhängigkeit wurde 

ausführlich in Diplomarbeiten von S. Sänze und M. Schütz beschrieben. In dieser 

Arbeit wurden diese Methoden übernommen und unverändert verwendet. [186,187] 

Um eine ca. 30 nm dicke Glasverkapselung auf Nanopartikeln zu erzielen, wurden 

die ausgebildeten SAMs in 6,1 ml Reinstwasser resuspendiert und in einen 

Plastikkolben überführt. Zunächst wurde mittels Extinktionsspektroskopie die OD 

ermittelt, die in einer 2 mm dicken Küvette bei 10 lag. In selbiger Küvette und in 

Reinstwasser wurden auch die SERS-Spektren überprüft (Abbildung 5.10). Danach 

wurden dem Plastikkolben unter starkem Rühren 16.5 ml Isopropanol und 375 μl 

12.7 M Ammoniak zugefügt. Erneut wurde die OD ermittelt, die auf 3,5 gesunken 

war. Über einen Zeitraum von einem Tag wurden in 150 μl Schritten insgesamt 2600 

μl der 1%ige Tetraethoxysilan-Isopropanol-Lösung (30 μl TEOS in 2970 μl 

Isopropanol) zugegeben. 

4.3 Trennung von Goldnanopartikel-Clustern 

Zur Gewinnung der reinen Goldnanopartikel-Cluster wurde die Dichtezentrifugations- 

Methode (Zonensedimentation) aus der Biologie eingesetzt. [188] Diese Methode wird 

im Besonderen von Zellbiologen zur Trennung der Zellkomponenten durch eine 

Lösung, deren Dichte von oben nach unten zunimmt, verwendet. Für die 

Dichtezentrifugation ist die Verwendung von verschiedenen Lösungen, wie Glycerin, 

Saccharose, Diethylaminoethyl-Dextran, Cäsiumchlorid und Polyvinylpyrrolidon 

möglich. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Lösungen Glycerin, Saccharose, 

Cäsiumchlorid und Polyvinylpyrrolidon ausgetestet. Während die Trennungen mit 

Lösungen aus Glycerin, Saccharose und Polyvinylpyrrolidon erfolgreich waren, führte 

56


Cäsiumchlorid zu schweren Aggregationen der Nanopartikel. [197] Wie im Abschnitt 

4.2.4 erwähnt, kann eine geringe Menge vom Salz (auch Cäsiumchlorid) 

Aggregationen hervorrufen. Außerdem ist Cäsiumchlorid im Vergleich zu weiteren 

Chemikalien, wie Glycerin oder Saccharose relativ teuer. Die Trennung auf 

Saccharose erfolgte hervorragend, aber die Beseitigung der Saccharose von der 

Oberfläche der Nanopartikel erfordert im Vergleich zu Glycerin mehrere Waschgänge 

(Ergebnisse nicht dargestellt). Deshalb wurde für die Trennung eine Glycerin-Lösung 

ausgewählt. In Abbildung 4.3 sind die schematische Probenauftragung und die 

getrennten Substanzen dargestellt. 

Abbildung 4.3: Schematische Darstellung des Zentrifugationsverfahren. A vor 

und B nach Zentrifugation. [188] 

Die Sedimentationsrate der Nanoartikel in einem Zentrifugalfeld hängt von ihrem 

Teilchenradius und ihrer Masse ab. [188] 

Um eine Dichtegradienten-Zentrifugation zur Trennung der Cluster durchzuführen, 

sollen verschiedene Glycerin-Wasser-Lösungen vorbereitet und nach bestimmter 

Einordnung in ein 100x15 mm großes Plastikröhrchen überführt werden. Die 

Lösungen wurden beginnend mit niedriger Dichte nacheinander von unten nach oben 

in dem Röhrchen geschichtet. Dafür wurde eine Spritze mit einer 15 cm lange Kanüle 

verwendet. 

57


Das Vorgehen zur Vorbereitung der Dichtegradienten-Zentrifugation: 

Es wurden fünf verschiedene Konzentrationen von Glycerin/Wasser-Mischungen im 

Wasser (30, 40, 50, 60 und 70 Volumenprozente) vorbereitet. 2 ml von 30%igem 

Glycerin wurden zuerst ins Röhrchen überführt. Danach folgte die Überführung von 

jeweils 2 ml von 40%, 50%, 60% und 70%iger Glycerin-Lösung. Die Kanüle trifft 

jedesmal den Boden des Röhrchens und der Inhalt wird vorsichtig unter die vorherige 

Glycerin-Lösung entleert. Somit wird eine Lösung hoher Konzentration immer unter 

einer Lösung niedriger Konzentration geschichtet und die vorherige Lösung niedriger 

Konzentration nach oben verdrängt. 

4 ml glasverkapslte Aggregate (OD= 3,5) wurden zentrifugiert (15 Min. bei 2400 g) 

und in 200 µl Wasser aufgenommen. 

Die Nanopartikel wurden danach sehr behutsam auf das Zentrifugationsröhrchen 

pipettiert (Abbildung 4.3 A). 

Das Zentrifugationsröhrchen wurde 20 Minuten bei 4890 g zentrifugiert. Die 

Nanostrukturen trennen sich aufgrund ihrer Größe und Gewicht während der 

Zentrifugation und bilden in der Regel scharfe Banden entlang des 

Zentrifugationsröhrchens (Abbildung 5.11). Nach der Trennung werden Goldcluster 

dreimal mit Ethanol gewaschen und die generierten Signale gemessen. 

Für die Trennung der Nanopartikel mit niedriger Konzentration oder dünner 

Verkapselung, wie Assemblate, wurde ein Miniaturformat der Dichtegradienten- 

Zentrifugation entwickelt. Diese Methode lässt eine Trennung der Nanopartikel in 2 

ml-Reaktiosgefäßen bei ca. 300 g Zentrifugal beschleunigung zu. Im Miniaturformat 

werden dieselben Konzentrationen von Glycerin verwendet. Mit einer 3-ml-Spritze 

werden ca. 400 µl von den jeweiligen Glycerin-Lösungen in ein 2 ml großes 

Reaktionsgefäß überführt. 

Für die Trennung der BBI-Goldnanopartikel in Größen von 20, 40 und 60 nm wurden 

von der jeweiligen Kolloid-Lösung in Reaktionsgefäße mit 400 µl Volumen (OD= 0,2) 

pipettiert. Die 40 und 60 nm großen Goldnanopartikel wurden 20 min. bei 2400 g 

zentrifugiert. Die 20 nm großen Goldnanopartikel wurden 30 min. bei 4600 g 

zentrifugiert. Die drei Bodensätze wurden in 80 µl Reinstwasser aufgenommen und 

gemischt. Die Mischung wurde vorsichtig auf das Reaktionsgefäß pipettiert. Nach 40 

58


min. bei 300 g Zentrifugation konnte die erfolgreiche Trennung der Nanopartikel 

beobachtet werden. Für die Trennung der Monomere aus Aggregaten hat eine 20 

minütige Zentrifugation bei 300 g ausgereicht (Abbildung 5.12). In dieser Arbeit 

wurden fünf verschiedene SERS-Substrate für die Detektion der Proteine verwendet. 

In Abbildung 4.4 wurden die Strukturformeln der verwendeten Raman-Reporter 

dargestellt. 

Abbildung 4.4: Die Strukturformeln von fünf verschiedenen Raman-Reportern. Das Molekül 

DTNB wird in der Regel mit NaBH 4 zu zwei 4-TNB-Molekülen gespalten. Die vollständigen 

Namen der Chemikalien wurden im Anhang eingetragen. Die gemessenen Signale sind in 

Abbildung 5.10 dargestellt. 

4.4 Biofunktionalisierung von SERS-Nanopartikeln 

Unter Biofunktionalisierung versteht man die gezielte Einführung bestimmter 

funktioneller Gruppen auf Oberflächen von Nanopartikeln für eine weitere Kopplung 

mit Proteinen, wie z.B. Antikörpern. Wie erwähnt werden zwei verschiedene SERS- 

Substrate in der Arbeitsgruppe Schlücker zur Detektion der Proteine verwendet. 

Diese SERS-Substrate wurden entweder mit Glas verkapselt oder liegen ohne 

Glasverkapselung vor. 

In diesem Abschnitt werden die Methoden beschieben, die zur optimalen 

Biofunktionalisierung der zwei Typen der SERS-Substrate entworfen wurden. Eine 

59


optimale Biofunktionalisierung hat mindestens zwei wichtige Erwartungen zu erfüllen. 

Zuerst sollen die Methoden die Stabilität der Nanostrukturen während der 

Modifikation und Detektionsverfahren gewährleisten d.h. die Bildung von Aggregaten 

verhindern. Desweiteren müssen genügend Proteine ohne Verlust der biologischen 

Funktion auf der Oberfläche der Nanopartikel gebunden werden. 

4.4.1 Herstellung von SERS-markierten Antikörpern mittels kovalenter 

Kopplung 

Zur kovalenten Kopplung der Antikörper müssen die Nanopartikel zuerst mit einer 

Mischung aus zwei verschiedenen Raman-Molekülen eine kovalente Bindung 

einzugehen. Eine Sorte der Moleküle ist für die Erzeugung des SERS-Signals 

zuständig und die andere als Abstandhalter (spacer) sorgt für die spätere Bindung an 

den Antikörper. 

Da die Nanopartikel mit zwei verschiedenen Molekülen beschichtet sind, werden 

diese Partikel Dual-Spacer-SAM genannt. Bei 4-TNB handelt es sich um einen und 

denselben Raman-Reporter, aber zwei verschiedene hydrophile spacer. Im Abschnitt 

2.3.1 und Abbildung 2.5B wurde die Herstellung der "hydrophil stabilisierte SAM" mit 

Derivaten von 4-TNB (4-TNB-MEG-OH und 4-TNB-TEG-OH) schematisch 

dargestellt. Die generierten SERS-Signale der beiden Derivate sind identisch. Durch 

solch eine Anordnung erzeugt das SERS-Substrat höchste Intensität. [39] Es wurde für 

weitere Raman-Marker, wie SEMA4 und 4-MBA-MEG-OH, kein längeres Molekül mit 

Carboxylgruppen am Ende des Moleküls (wie 4-TNB-TEG-OH) synthetisiert. Daher 

wurden die fehlenden Moleküle durch alternativen Moleküle, die Carboxylgruppen 

am Ende haben, ersetzt (Abbildung 4.5). 

Ein Beispiel dafür ist fehlende 4-MBA-TEG-OH Moleküle(als Abstandhalter) für die 

Bildung von Dual-Spacer-SAMs mit 4-MBA-MEG-OH. Das fehlende Molekül (4-MBA- 

TEG-OH) wurde durch Mercaptohexadecansäure für die Herstellung der Dual- 

Spacer-SAMs ersetzt. 

Zur Herstellung der Dual-Spacer-SAMs mit SEMA4 wurde Carboxy-PEG 8 -Amin 

verwendet, weil das Molekül Mercaptohexadecansäure kürzer als SEMA4 ist und 

nach Bildung der Dual-Spacer-SAMs keine Bindung mit den freien Aminogruppen der 

Proteine ausbilden kann. Die Strukturformelen der vier genannten Moleküle wurden 

in Abbildung 4.5 dargestellt. Die beiden Dual-Spacer-SAMs wurden zur Ausbildung 

60


von Immuno-SERS-Markern verwendet und in der SERS-Mikroskopie eingesetzt 

(Abbildung 2.4). Die Moleküle mit Carboxylgruppen am Ende werden als 

Abstandhalter bezeichnet. 

Abbildung 4.5: Zur Ausbildung der Dual-Spacer-SAMs wurden 4-MBA-MEG-OH 

Moleküle und als Abstandhalter zur Kopplung mit Proteinen Mercaptohexadecansäure 

verwendet (A). Der SEMA4 als Raman-Marker wurde mit Carboxy-PEG8-Amin zur 

Ausbildung von Dual-Spacer-SAMs eingesetzt (B). 

Ausbildung von Dual-Spacer-SAMs aus 4-TNB-Drivaten: 

Die Herstellung der Dual-Spacer-SAMs wurde für alle Marker gleichermaßen 

durchgeführt. Daher wurde die meisthergestellte Dual-Spacer-SAM als Beispiel für 

alle anderen beschrieben. In zwei Schnappdeckelgläsern wurden ethanolische 

Lösungen von 3 mM DTNB-MEG-OH und 0,3 mM DTNB-TEG-OH vorbereitet. Die 

Disulfidgruppen von DTNB-Derivaten wurden durch Zugabe von 30 µl 

Natriumborhydridlösung (1.5 mg NaBH4 in 300 ml Ethanol) zu freien Thiolen (spaltet 

zu 4-TNB) reduziert. Zur Ausbildung der Dual-Spacer-SAM wurden 180 µl 4-TNB- 

MEG-OH mit 20 µl 4-TNB-TEG-OH gemischt. Es wurden 160 µl Marker-Lösung zu 

800 µl (OD=2,5) Goldkolloid pipettiert. Die Marker-Kolloid-Mischung wurde über 

Nacht auf einem Elektroschüttler (900 rpm) bei Raumtemperatur platziert. Nach der 

61


Inkubation wurden die überschüssigen Marker-Moleküle durch einmalige 

Zentrifugation und Waschen mit Ethanol entsorgt. 

Ausbildung von Dual-Spacer-SAMs aus 4-MBA-MEG-OH und Mercaptohexadecansäure: 

In einem Schnappdeckelglas wurden ethanolische Lösungen von 3 mM MBA-MEG- 

OH vorbereitet. MBA-MEG-OH wurde durch Zugabe von 30 µl Natriumborhydridlösung 

(1.5 mg NaBH4 in 300 ml Ethanol) zu 4-MBA-MEG-OH reduziert. In einem 

anderen Schnappdeckelglas wurde ethanolische Lösungen von 0,3 mM 

Mercaptohexadecansäure vorbereitet. 

Zur Ausbildung der Dual-Spacer-SAM wurden 180 µl 4-MBA-MEG-OH mit 20 µl 

Mercapto-hexadecansäure gemischt. Es wurden 180 µl Marker-Lösung zu 800 µl 

(OD=2,5) Goldkolloid pipettiert. Die Marker-Kolloid-Mischung wurde über Nacht auf 

dem Elektroschüttler (900 rpm) bei Raumtemperatur platziert. Nach der Inkubation 

wurden die überschüssigen Marker-Moleküle durch einmalige Zentrifugation und 

Waschen mit Ethanol entsorgt. 

Ausbildung von Dual-Spacer-SAMs aus SEMA4 und Carboxy-PEG 8 -Amin: 

Die Herstellung der Dual-Spacer-SAMs mit SEMA4 und Carboxy-PEG 8 -Amin wurde 

in DMF durchgeführt, da Carboxy-PEG 8 -Amin in Ethanol kaum löslich sind. In einem 

Schnappdeckelglas wurde eine Lösung von 6 mM SEMA4 in DMF vorbereitet. In 

einem weiteren Schnappdeckelglas wurde eine Lösung von 0,6 mM Carboxy-PEG 8 - 

Amin in DMF vorbereitet. Zur Ausbildung der Dual-Spacer-SAMs wurden 180 µl 

SEMA4 mit 20 µl Carboxy-PEG 8 -Amin gemischt. Es wurden 180 µl Marker-Lösung 

zu 800 µl (OD=2,5) Goldkolloid pipettiert. Die Marker-Kolloid-Mischung wurde über 

Nacht auf dem Elektroschüttler (900 rpm) bei Raumtemperatur platziert. Nach der 

Inkubation wurden die überschüssigen Marker-Moleküle durch einmalige 

Zentrifugation und Waschen mit DMF entsorgt. 

Die drei verschiedenen ausgebildeten Dual-Spacer-SAMs auf den Metallkolloiden 

generieren verschiedene SERS-Signale und alle besitzen längere Molekülketten mit 

Carboxylgruppen an den Enden. Die Carboxylgruppen müssen für eine kovalente 

Kopplung mit Antikörpern zuerst durch die modifizierte Vorschrift von Pierce aktiviert 

werden. [190] Beobachtungen haben gezeigt, dass die Verwendung hoher Mengen an 

62


s-NHS oder EDC irreversible Aggregationen der NP verursacht. Für eine genaue 

Einstellung optimaler Mengen der Reagenzien (s-NHS und EDC) wurden 

Goldnanopartikel als SERS-Substrate verwendet. Die Bildung von kleineren 

Aggregaten kann mittels Extinktionsspektroskopie verfolgt werden. 

Die kleinste Änderungen der schmalen Plasmonbande der Goldnanopartikel bei 

Bildung der Aggregate kann im Vergleich zu weiteren SERS-Substraten, wie 

Goldnanosternen oder Gold/Silber-Nanoschalen besser verfolgt werden. Der Ablauf 

der s-NHS/ECD-Aktivierung von Carboxylgruppen auf einem Goldnanopartikel wurde 

in Abbildung 4.6 schematisch dargestellt. 

Abbildung 4.6: Schematische Darstellung der s-NHS/EDC-Aktivierung einer 

Carboxylgruppe auf einem Goldnanopartikel. Für eine einfache Darstellung wurde 

nur der Abstandhalter mit der Carboxylgruppe am Ende (4-TNB-MEG-OH) 

dargestellt. Die Aktivierung der Carboxylgruppe im HEPES-Puffer (A). Die aktivierte 

SAM geht eine kovalente Bindung mit dem Antikörper ein (B). 

Etablierung des s-NHS/EDC-Aktivierungsprotokolls: 

Die ausgebildeten Dual-Spacer-SAMs aus 4-TNB-PEG-Derivaten (1:99 TEG-OH zu 

MEG-OH) wurden nach einmaligem Waschen mit Ethanol in HEPES-Puffer 

aufgenommen. Zur Aktivierung von Dual-Spacer-SAMs (4-TNB) wurden zwei 

separate Verdünnungsreihen von s-NHS und EDC im HEPES-Puffer vorbereitet. Die 

vorbereitete Konzentration der Chemikalien wurde in Tabelle 4.4 zusammengefasst. 

63

Proben Menge s-NHS EDC 


C1 400% 16 mg/ml (bzw. 1,6%) 24mg/ml( bzw. 2,4%) 

C2 300% 8 mg/ml (bzw. 0,8%) 12 mg/ml(bzw. 1,2%) 

C3 200% 4mg/ml (bzw. 0,4%) 6 mg/ml(bzw. 0,6%) 

C4 100% 2 mg/ml (bzw. 0,2%) 3 mg/ml(bzw. 0,3%) 

C5 50% 1 mg/ml (bzw. 0,1%) 1,5 mg/ml(bzw. 0,15%) 

C6 25% 0,5 mg/ml (bzw. 0,05%) 0,75 mg/ml(bzw. 0,75%) 

Tabelle 4.4: Die vorbereiteten Konzentrationen von s-NHS und EDC zur Etablierung 

der Aktivierungsvorschrift der Dual-Spacer-SAMs. 

Ermittlung der optimalen Menge an s-NHS: 

Es wurden 500 µl Dual-Spacer-SAMs mit einer OD von 2,5 in sieben hydrophoben 

Protein-LoBind-Reaktionsgefäßen verteilt. Zur Ermittlung der optimalen Menge von s- 

NHS wurden 50 µl von vorbereiteten s-NHS-Lösungen unterschiedlicher 

Konzentrationen von s-NHS (Tabelle 4.4) in die jeweiligen Reaktionsgefäßen 

pipettiert. Alle Proben erhalten 50 µl von 6 mg/ml (0,6%) gelöstem EDC im HEPES- 

Puffer. Die Reaktionsgefäße wurden 20 Minuten bei RT geschüttelt (500 rpm). Eine 

Probe als Kontrolle erhält kein s-NHS/EDC. 

Ermittlung der optimalen Menge an EDC: 

Es wurden 3,5 ml Dual-Spacer-SAMs mit einer OD von 2,5 in sieben hydrophoben 

Protein-LoBind-Reaktionsgefäßen verteilt. Zur Ermittlung der optimalen Menge von 

EDC wurden 50 µl von den vorbereiteten EDC-Konzentrationen (Tabelle 4.4 

unterschiedliche Konzentrationen von EDC) auf jeweilige Reaktionsgefäßen 

pipettiert. Alle Proben erhalten 50 µl von 4 mg/ml (0,4%) s-NHS im HEPES-Puffer. 

Die Reaktionsgefäße wurden 20 Minuten bei RT auf dem Schüttler (500 rpm) 

platziert. Eine Probe als Kontrolle erhält kein s-NHS/EDC. EDC-Konzentrationen von 

mehr als 3 mg/ml führten zur Bildung von Aggregaten. Die Bildung der Aggregate 

wird bei Überschuss von beiden Chemikalien noch verstärkt. Im dritten Experiment 

wurde der Einfluss der hohen Konzentration beider Substanzen untersucht. Es 

wurden wieder 3,5 ml Dual-Spacer-SAMs mit einer OD von 2,5 in sieben 

hydrophoben Protein-LoBind-Reaktionsgefäßen verteilt. 50 µl von den vorbereiteten 

s-NHS-Lösungen (Tabelle 4.4) wurden zu den jeweiligen Reaktionsgefäßen 

pipettiert. Alle Proben erhalten 50 µl von den vorbereiteten EDC-Konzentrationen in 

HEPES-Puffer (Tabelle 4.4). Das heißt Probe 1 erhält 400% mehr als die optimale 

Menge von s-NHS und EDC, Probe 2 erhält 300% mehr, Probe 4 erhält 200% mehr 

64


usw. bis 25%. Die Kontrolle erhält kein s-NHS/EDC. Die Reaktionsgefäße wurden 20 

Minuten bei RT geschüttelt (500 rpm). Die Proben wurden zentrifugiert und im 

HEPES-Puffer aufgenommen. Zur Untersuchung der Plasmonbande der Proben 

wurden alle Proben mittels Extinktionspektroskopie untersucht. Die Probennummern: 

4, 5 und 6 zeigten die geringeren Aggregationen (Abbildung 5.15 A). 

Kovalante Kopplung von Antikörpern an Dual-Spacer-SAMs: 

Es wurden 500 µl Dual-Spacer-SAMs mit einer OD von 2,5 in ein Protein-LoBind- 

Reaktionsgefäß pipettiert. 50 µl einer 0,2 % s-NHS-Lösung und 50 µL einer 0,3 % 

EDC-Lösung wurden dazu pipettiert. Nach 20 Minuten Inkubation auf dem Schüttler 

(500 rpm) bei RT wurden die Nanopartikel zentrifugiert und wieder im HEPES-Puffer 

aufgenommen. 1µg Immunoglobulin (z.B. IgG-HRP) wurde in 200 µl HEPES-Puffer 

gelöst und in die Kolloid-Lösung pipettiert. Das Reaktionsgefäß wurde auf dem 

Schüttler (800 rpm) bei RT platziert und eine Stunde inkubiert. Nach der 

Inkubationszeit erhält die Probe ca. 250 µl von 1%iger BSA in PBST-Lösung. Die 

Probe wird weitere 20 Minuten auf dem Schüttler (800 rpm) bei RT inkubiert. Die 

Nanopartikel wurden danach zweimal mit 1%iger BSA im PBST-Puffer gewaschen. 

Bestimmung der Anzahl von gebundenen HRP-markierten Immunoglobulinen an 

einzelnen Nanopartikeln: 

Mit Hilfe des Lambert-Beer-Gesetzes kann die Anzahl von Nanopartikeln leicht 

ermittelt werden. Der Extinktionskoeffizient der verwendeten Goldnanopartikel ist 

bekannt, somit muss nur die OD ermittelt werden. 

Lambert-Beer-Gleichung: 

 

In der Gleichung bedeuten: 

: Dimensionslose Extinktion bei einer bestimmten Wellenlänge 

: Molarer Extinktionskoeffizient 

: Konzentration des Stoffs 

: Schichtdicke der Messküvette 

65


Das Vorgehen zur Ermittlung der HRP-Aktivität: 

Es wurde, wie beschrieben, eine kovalente Kopplung von HRP-Antikörpern an Dual- 

Spacer-SAMs durchgeführt. Als SERS-Substrate wurden 60 nm große 

Goldnanopartikel (Firma BBI) verwendet, die mit Derivaten von 4-TNB in einem 

Verhältnis von 99 MEG-OH-Molekülen zu 1 TEG-OH-Molekül markiert waren. 

Parallel dazu wurde eine Verdünnungsreihe von HRP-Antikörpern (als 

Standardreihe) vorbereitet. 

Standard 1: 250 ng/ml 

Standard 2: 125 ng/ml 

Standard 3: 62,5 ng/ml 



Standard 6: Null-Wert. 

Es wurden zuerst 160 µl Verdünnungspuffer (0,1% BSA in PBST) in die Vertiefungen 

einer 96er Mikrotiterplatte für alle Proben pipettiert. Danach wurden jeweils 40 μl der 

vorbereiteten Standardreihe in dreifachen Werten (n=3 bzw. drei Messungen für jede 

Konzentration) manuell in die Vertiefungen pipettiert. Die Standardreihe wurde zur 

absoluten Quantifizierung der Anzahl von an die Nanopartikel gebundenen HRP- 

Antikörpern mitgeführt. Daher wurde das gleiche Volumen Immuno-SERS-Marker (40 

µl, OD= 1) in dreifachen Werten in die 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert. 

Eine 4 mg o-Phenylendiamin dihydrochlorid Tablette wurde im 10 ml Substrat-Puffer 

aufgelöst. Kurz vor Zugabe des Substrat-Puffers in die Proben erhält der Substrat- 

Puffer 100 µl 30%iges H 2 O 2 . Es wurden 60 µl Substrat-Puffer pro Probe pipettiert. 

Anschließend wurden die Proben abgedunkelt und auf den Taumler bei RT für 15 

Minuten inkubiert. Zuletzt wurde mit Zugabe von 50 µl 1N H 2 SO 4 die Reaktion 

gestoppt. Danach wurde die Farbintensität aller Proben (auch der Standardreihe) mit 

einem ELISA-Reader ermittelt. Nach Ermittlung der Standardreihe konnte durch die 

Funktion der daraus resultierenden, linearen Regressionslinie die gesamte Aktivität 

der gebundenen HRP-Immunoglobuline in 40 µl Immuno-SERS-Marker (Anzahl der 

NP = 608 X10 6 ) bestimmt werden. Durch diesen Wert (IgG-Menge in Gramm) kann 

die Anzahl von gebundenen HRP-IgG pro Nanopartikel berechnet werden. 

66


Um den Einfluss der Senkung der s-NHS/EDC-Mengen auf die Effezienz der 

Biofunktionalisierung zu untersuchen, wurden HRP-Antikörper nach der Aktivierung 

mit allen angegebenen Mengen an s-NHS und EDC in der Tabelle 4.4 an die 

Oberflächen der Nanopartikel gebunden. Alle Proben erhalten 1 µl IgG-HRP gelöst in 

200 µl HEPES-Puffer. Die Reaktionsgefäße wurden auf dem Schüttler (800 rpm) bei 

RT platziert und eine Stunde inkubiert. Nach der Inkubationszeit erhielten die Proben 

je ca. 250 µl von 1%igem BSA im PBST-Puffer. Die Proben wurden weitere 20 

Minuten auf dem Schüttler (800 rpm) bei RT eine Stunde inkubiert. Die Nanopartikel 

wurden danach zweimal mit 1%igem BSA im PBST-Puffer gewaschen. Mit Hilfe der 

Lambert-Beer-Gleichung wurde die Anzahl der Nanopartikeln ermittelt. Das 

Experiment wurde an drei verschiedenen Tagen wiederholt und die ermittelten 

Mittelwerte in Abbildung 5.16 dargestellt. 

4.4.2 Herstellung von SERS-markerten Antikörpern über Bindung an Protein 

A/G 

Diese Art Kopplung mit Antikörpern wurde zur Ausbildung der Immuno-SERS mit 

glasverkapseltem SERS-Substrat entwickelt. In diesem Konzept werden die Protein 

A/G-Moleküle kovalent auf einer funktionalisierten Glasoberfläche gebunden. Das 

Protein A/G hat sechs Bindestellen um eine nicht kovalente Kopplung mit einem 

Immunoglobulin der Säugetiere einzugehen. 

Die Funktionalisierung der glasverkapselten Nanopartikel besteht aus drei Schritten: 

Hydrolyse, Aminofunktionalisierung und C4-Verlängerung. Nach jedem Schritt wird 

sich in der Regel die Oberflächenladung (Zetapotential) der glasverkapselten 

Nanopartikel verändern. Diese Veränderung der Oberflächenladung und die 

Extinktionsspektren wurden vor Beginn des nächsten Schrittes ermittelt. 

Zur Erhöhung der Stabilität der Glasverkapselung im wässerigen Puffer wurden die 

verkapselten Nanopartikeln zwei Wochen in alkalischem Ethanol (Mischung von 80µl 

Ammoniak und 920 µl Ethanol) gelagert. 

Hydrolyse 

Im ersten Schritt der Biofunktionalisierung werden die Alkoxygruppen auf der 

silikaoberfläche durch Hydrolyse zur Hydroxylgruppen umgewandelt. Die 

67


silikaverkapselten Cluster wurden bei 2499 g 15 min zentrifugiert und anschließend 

in einer Lösung aus Wasser und Ammoniumhydroxid bei einem Volumenverhältnis 

von 1 ml Reinstwasser : 150 μl Ammoniumhydroxid resuspendiert. Die Kolloid- 

Lösung (OD=1,2) wurde danach im Ultraschalbad ca. 20 Minuten behandelt. Die 

Probe wurde bei 2400 g 15 min zentrifugiert und für die Aminofunktionalisierung in 1 

ml Ethanol aufgenommen. 

Aminofunktionalisierung 

Durch die Reaktion mit APTMS [(3-Aminopropyl)trimethoxysilan] erhielt die Glashülle 

in dieser Stufe freie Aminogruppen. 

Von dieser Stufe der Funktionalisierung bis zur Biokonjugation wurden nur die 

Protein-LoBind-Reaktionsgefäße verwendet. Dadurch konnte eine Aggregatbildung 

bis 70% verhindert werden (nicht dargestellte Ergebnisse). 

1 ml der verkapselten Nanopartikel (OD= 1) wurde in Ethanol aufgenommen. In diese 

Kolloid-Lösung wurden 30 μl Ammoniumhydroxid und 30 μl 0,5 % (v/v) APTMS 

pipettiert. Die Kolloid-Lösung wurde anschließend ca. 30 min auf dem Schüttler (700 

rpm) bei RT inkubiert. Nach der Inkubationszeit zur Entfernung des überschüssigen 

APTMS wurden die Nanopartikel einmal mit DMF (N,N-Dimethyl-formamid) 

gewaschen und anschließend in 1000 μl destilliertem DMF aufgenommen. 

C4-Verlängerung 

Durch die C4-Verlängerung der aminfunktionalisierten Glasoberfläche mit 

Bernsteinsäureanhydrid werden Abstandshalter-Moleküle mit einer Carboxylgruppen 

am Ende auf die Glasoberfläche gebracht. Die in DMF aufgenommenen verkapselten 

Nanopartikel (OD=1) wurden zentrifugiert und in einer 5 mM Lösung (1 ml) von 

Bernsteinsäureanhydrid in trockenem DMF resuspendiert. Die Kolloid-Suspension 

wurde für ca. 30 min auf dem Schüttler (700 rpm) bei RT inkubiert. Zur Durchführung 

der Proteinkopplung wurde die Kolloid-Suspension zentrifugiert und in HEPES-Puffer 

aufgenommen. 

Proteinkopplung 

Vor der Proteinkopplung sollen die Carboxylgruppen der verkapselten Nanopartikel 

durch die gleiche Methode, wie bei den Dual-Spacer-SAMs mit s-NHS/EDC aktiviert 

68


werden. Durch die oben beschriebene Vorschrift konnte die Kopplung der Proteine 

an glasverkapselte Nanopartikeln mit wenigen Aggregationen erreicht werden. Daher 

wurde die Vorschrift ohne Änderungen durchgeführt. 

Es wurden 500 µl verkapselte Nanopartikel mit einer OD von 2,5 in ein Protein- 

LoBind-Reaktionsgefäß pipettiert. 50 µl von 0,2 %iger s-NHS HEPES-Lösung und 50 

µL von einer 0,3 %igen EDC HEPES-Lösung wurden dazu gegeben. Nach 20 

Minuten Inkubation auf dem Schüttler (500 rpm) bei RT wurden die Nanopartikel 

zentrifugiert und wieder im HEPES-Puffer aufgenommen. 3 µg Protein A/G wurden in 

200 µl HEPES-Puffer aufgelöst und in die Kolloid-Suspension pipettiert. Das 

Reaktionsgefäß wurde auf dem Schüttler (800 rpm) bei RT platziert und eine Stunde 

inkubiert. Danach wurde die Kolloid-Suspension zentrifugiert und in 1 ml PBS-Puffer 

resuspendiert. Die Kolloid-Lösung erhält gleichzeitig 1 µg Protein A/G (gelöst im 

HEPES-Puffer) und 200µl 0,1%iger Glutaraldehyd im PBS-Puffer. Das 

Reaktionsgefäß wurde auf dem Schüttler (800 rpm) bei RT platziert und für weitere 

20 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationszeit erhält die Probe ca. 250 µl PBST- 

Puffer und wird weitere 20 Minuten auf dem Schüttler (800 rpm) bei RT inkubiert. Die 

Nanopartikel wurden danach zweimal mit 2%igem BSA im PBST-Puffer gewaschen. 

Auf 500 µl Nanopartikel (OD=1) wurden 1 µg erwünschten Antikörper zur Kopplung 

pipettiert. Nach ca. 90 Minuten wurde die Immuno-SERS-Nanopartikel-Konjugate mit 

2%igem BSA im PBST-Puffer gewaschen. Zur Detektion auf Gewebe oder 

Immunoassay wurden die Nanopartikel auf eine OD von 0,2 im 0,2%igem BSA im 

PBST-Puffer verdünnt. In Abbildung 4.7 wurde der schematische Ablauf der 

Biofunktionalisierung glasverkapselten Nanopartikeln dargestellt. 

Die erfolgreiche Biofunktionalisierung der glasverkapselten Nanopartikel hängt von 

vielen Faktoren ab, wie der Menge an APTMS oder Bernsteinsäureanhydrid und 

auch den Inkubationszeiten ab. Deshalb wurden zuerst die eingesetzten Mengen an 

APTMS und Bernsteinsäureanhydrid mit bestimmter Konzentration der Nanopartikel 

eingestellt. Wie oben beschrieben, hängen die messbaren Oberflächenladungen der 

Nanopartikel von den funktionellen Gruppen, die sich auf der Oberfläche der 

Nanopartikel befinden ab. Nach einer erfolgreichen Aminofunktionalisierung wird sich 

der negative Zetapotential-Wert von ca. -30 mV auf ca. +25 mV ändern. Dieser Wert 

sinkt nach einer gelungenen C4-Verländerung von ca. +25 mV auf ca. -30 mV. 

Neben den Zetapotential-Messungen wurden auch die Extinktionsspektren der glas- 

69


verkapselten Goldkolloide während der Einstellungen ermittelt, um das Ausmaß der 

Aggregation beurteilen zu können. 

Abbildung 4.7: Schematische Darstellung der Änderung von funktionellen 

Gruppen während der Biofunktionalisierung der glasverkapselten Nanopartikel. 

Es sind die Aminofunktionalisierung durch APTMS (A), C4-Verlängerung durch 

Bernsteinsäureanhydrid (B), Aktivierung mit s-NHS und EDC (C) und 

Antikörperkopplung (D) dargestellt. 

Einstellung der Aminofunktionalisierung 

Für die Einstellung der Aminofunktionalisierung wurde glasverkapselte 60 nm 

Goldkolloide (1000 µl, OD=2,5) verwendet, um die Änderung der Extinktionsspektren 

deutlich beobachten zu können. Die Zugabe von weniger als 30 µl 0,5 % APTMS auf 

die erwähnte Menge von Kolloid führte zu keiner deutlichen Änderung des 

Zetapotentials. Daher wurde nur der Einfluss der Inkubationszeiten von der 

Mindestmenge (30 µl 0,5%) von APTMS in Betracht gezogen. 

Es wurden 4 ml glasverkapselte Goldpartikel in Ethanol mit einer OD von 2,5 in vier 

Reaktionsgefäße verteilt. Die Kontrollprobe erhält kein APTMS und drei weitere 

erhalten je 30 μl 0,5 % (v/v) APTMS und 30 µl Ammoniumhydroxid. Das 

Zetapotential und die Extinktionsspektren der Proben wurden in Zeitpunkten von 30, 

60 und 120 Minuten nach der Zugabe von APTMS gemessen. Dieses Experiment 

wurde an drei verschiedenen Tagen wiederholt (Abbildung 5.18 A). Das Zetapotential 

70


und die Extinktionsspektren der Proben wurden bei allen Messungen in dieser Arbeit 

in Reinstwasser durchgeführt. 

Einstellung der C4-Verlängerung 

Eine hohe Menge und längere Inkubationszeiten mit dem Bernsteinsäureanhydrid 

können Aggregationen hervorrufen. Um die notwendige Menge vom Bernsteinsäureanhydrid 

zu definieren wurden 4 ml glasverkapselte Goldnanopartikel (Firma BBI, 

OD=2,5) nach der Aminofunktionalisierung zentrifugiert. Während der Zentrifugation 

wurden Konzentrationen von 0 M, 2 mM, 5 mM und 10 mM von Bernsteinsäureanhydrid 

in vier Protein-LoBind-Reaktionsgefäßen vorbereitet. 

Die zentrifugierten Nanopartikel wurden in Lösungen mit verschiedenen 

Konzentrationen von Bernsteinsäureanhydrid aufgenommen. Nach Ablauf der 30 

Minuten Inkubationszeit wurden das Zetapotential und die Extinktionsspektren der 

Proben geprüft. Dieses Experiment wurde an drei verschiedenen Tagen wiederholt 

(Abbildung 5.18 A). Die optimale Menge an Bernsteinsäureanhydrid für die C4- 

Verlängerung von 1 ml glasverkapselten Nanopartikeln(OD= 2,5) wurde mit 5 mM 

festgestellt. Eine Verlängerung der Inkubationszeit führte zur Aggregation der 

Nanopartikel. Deshalb wurde in einem weiteren Experiment die optimale 

Inkubationszeit mit Bernsteinsäureanhydrid definiert. 

In vier Protein-LoBind-Reaktionsgefäßen wurden je 1 ml glasverkapselte 

Nanopartikel in 5 mM Bernsteinsäureanhydrid-DMF-Lösung aufgenommen. Nach 

Ablauf der Inkubationszeiten von 0, 30, 60 und 120 Minuten wurde das Zetapotential 

und die Extinktionsspektren der Proben geprüft. Dieses Experiment wurde an drei 

verschiedenen Tagen wiederholt (Abbildung 5.18 B). 

4.5 SERS-Mikroskopie an Gewebeschnitten 

Bei der SERS-Mikroskopie und auch weiteren Anwendungen wie Immunoassays 

werden die Zielproteine durch die charakteristischen SERS-Signale der gebundenen 

Raman-Marker auf der Oberfläche der Nanopartikel detektiert (Abbildung 1.4 D). Für 

die Hellfeld- und Raman-Messungen wurde ein WItec Alpha300 R Mikroskop 

verwendet. Für die verschiedenen Vergrößerungen wurden die entsprechende 

Objektive gewählt, die in der Tabelle 4.5 aufgelistet sind. Die Weißlichtbilder wurden 

71


mit einer Kamera aufgenommen. Das Raman-Signal wurde mit einem Spektrometer 

(Brennweite: 30 cm; Gitterkonstante: 600 Striche pro Millimeter) spektral zerlegt. Das 

Spektrum wurde mit einem Andor Newton DU-970N-BV EMCCD-Sensor 

aufgenommen. 

Zur Darstellung der Falschfarbenbilder wurden die Proben mit einem HeNe-Laser 

(632.8 nm) bestrahlt und gleichzeitig wurden die erzeugten 

Ramanstreustrahlen gesammelt. Die Laserleistung für die Gewebeuntersuchungen 

wurde zwischen 5-10 mW und für den Immunoassay auf 0,5 mW eingestellt. Die 

Detektion der Raman-Spektren erfolgte mit einer Peltier-gekühlten CCD-Kamera. Zur 

Untersuchung der biologischen Proben wurde der XY-Positionierer zur Grobjustage 

und der piezogetriebene Verschiebetisch zur Feinjustage verwendet. Der Aufbau des 

Mikroskops wurde in Dissertation von M. Gellner ausführlich beschrieben. [124] 

Die Durchführung der SERS-Mikroskopie auf dem Gewebe oder Glasobjektträger bei 

Immunoassays ist nur nach der Präparation der jeweiligen Proben möglich. Daher 

wird die Präparation der Gewebeprobe in diesem Abschnitt vor der detaillierten 

Durchführung der SERS-Mikroskopie beschrieben. 

4.5.1 Blockierungsmethoden 

Um die unspezifischen Bindungen der gebildeten Antikörper/SERS-NP zu 

vermindern, wurden verschiedene Puffer hergestellt oder kommerziell erworben. 

Diese wurden in der Tabelle 4.2 aufgelistet. Zuerst wurden die kommerziellen 

erworbenen Puffer nach empfohlenen Blockierungszeiten verwendet. Bei starker 

Blockierung, die die Bindung der Immuno-SERS-Marker verhinderte, wurden die 

Blockierungszeiten verkürzt. Da laut Vorschriften der verschiedenen Hersteller die 

Blockierungslösungen nicht verdünnt werden dürfen, wurden nur die 

Inkubationszeiten verändert. Die Blockierung wird vor der Zugabe von Immuno- 

SERS-Markern und Bildung des Immun-Komplexes durchgeführt. 

- Zur Blockierung der Gewebeproben mit kommerziellen Blockierungspuffern 

wurden 300 µl der jeweiligen Blockierungspuffern auf das Gewebe pipettiert und auf 

den Taumler gestellt. Die Inkubationszeit für kommerzielle Puffer wurde zuerst auf 20 

Minuten und danach stufenweise auf 5 Minuten verkürzt. Nach dreimal Waschen im 

PBST-Puffer wurden die Proben zur Inkubation mit Immuno-SERS-Markern und für 

die SERS-Mikroskopie-Untersuchungen verwendet. 

72


- Zur Blockierung der Gewebeproben mit Magermilch im PBST-Puffer wurde die 

Inkubationszeit auf 20 Minuten festgelegt und die Blockierungslösung verdünnt. Die 

prozentualen Mengen der Magermilch wurden in der Literatur unterschiedlich 

angegeben. Daher wurden in dieser Arbeit zur Blockierung die Konzentrationen von 

5%, 2%, 1%, 0,5% und 0,2% ausgetestet. Zur Blockierung mit Magermilch wurden 

300 µl Blockierungspuffer auf die Gewebeproben pipettiert und auf den Taumler 

gestellt. Die Inkubationszeit für alle Proben war 20 Minuten. Nach dreimal Waschen 

im PBST-Puffer wurden die Proben zur Inkubation mit Immuno-SERS-Markern und 

für die SERS-Mikroskopie-Untersuchungen verwendet. 

- Zur Einstellung der Blockierung von Gewebeproben mit BSA wurden 

verschiedene Konzentrationen von BSA im PBST-Puffer vorbereitet. Es wurden 300 

µl der 4%, 2%, 1%igen BSA-Lösung auf Gewebeproben gegeben und auf den 

Taumler platziert. Die Inkubationszeit wurde wie bei der Magermilch auf 20 Minuten 

festgelegt und nur die Blockierungslösung verdünnt. Die Gewebeproben wurden 

nach dreimal Waschen im PBST-Puffer zur Inkubation mit Immuno-SERS-Markern 

und für die SERS-Mikroskopie-Untersuchungen verwendet. Nach dem Blockierung 

und anschließendem Waschschritt wurden die Proben mit derselben Konzentration 

an Antikörper/SERS-NP mit gleicher Inkubationszeit inkubiert. 

- Als SERS-Substrate wurden Gold/Silber-Nanoschalen verwendet. Im 

nächsten Schritt wurden die Nanopartikel mit 4-TNB-MEG-OH und 4-TNB-TEG-OH 

in einem Verhältnis von 99 : 1 markiert. Die Kopplung von anti Human-PSA- 

Aktikörper (α-PSA, Klon A67-B/E3) wurde unter 4.4.1 nach angegebener Vorschrift 

durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden mit 250 µl Immuno-SERS- 

Markern(Au@Ag als SERS-Substrat) einer OD= 0,25 für 20 Minuten auf den Taumler 

bei niedriger Geschwindigkeit inkubiert. Nach dreimal Waschen im PBST-Puffer 

wurde die SERS-Mikroskopie durchgeführt. Die Blockierungsmethoden und auch die 

Detektion von Proteinen wurden an verschiedenen Tagen auf Gewebeproben 

ausgetestet. 

4.5.2 Antigendemaskierungsmethoden 

Die Gewebeproben wurden im Labor von PD. Dr. Packeisen auf einer Kühlplatte mit 

Mikrotom in Form von Scheiben mit einem Durchmesser von 4 µm durchgeschnitten. 

Die Entparaffinierung und Rehydratation des Gewebes wurde mit Xylol und 

abnehmender Konzentrationen von Ethanollösungen durchgeführt. Zur 

73


Antigendemaskierung der Gewebeproben wurden notwendige Puffer in einen 

Glasbehälter gegossen und mit dem Dampfgarer auf 95°C vorgeheizt. Danach 

wurden die Gewebeschnitte in die vorgeheizte Pufferlösung getaucht und ca. 20 

Minuten weiter erhitzt. Diese zwanzigminütige Inkubationszeit der Gewebeproben 

war für alle verwendeten Puffer-Lösungen (kommerzielle oder selbsthergestellte) 

gleich. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Glasbehälter aus dem Dampfgarer 

entnommen und auf RT abgekühlt. Danach wurden die Gewebeschnitte dreimal mit 

PBST-Puffer gewaschen und für die Blockierung mit dem Blockierungspuffer 

behandelt. 

Die Antigendemaskierung mit Proteinase K wurde nach Vorschrift der Firma Dako 

durchgeführt. Die optimale Andauung von formalinfixiertem Gewebe durch das 

Enzym wurde nach 5 Minuten Inkubation der Enzym-Lösung auf dem Gewebe 

erzielt. Nach Durchführung der Antigendemaskierung auf Gewebeproben sollte eine 

Gegenüberstellung stattfinden um die optimale Methode für weitere Untersuchungen 

festzulegen. Deshalb wurden die Gewebeproben mit einzelnen Lösungen, die in der 

Tabelle 4.2 eingetragen sind, blockiert. Gleichzeitig wurden die notwendige Immuno- 

SERS-Marker mit Gold/Silber-Nanoschalen als SERS-Substrat unter den 

Vorausetzungen, wie im Abschnitt 4.5.1 beschrieben, vorbereitet. 

Nach der Blockierung und dem Waschgang der Gewebeproben wurden die Proben 

mit 250 µl Immuno-SERS (OD= 0,25) für 20 Minuten auf dem Taumler mit niedriger 

Geschwindigkeit inkubiert. Nach dreimal 5 Minuten Waschen im PBST-Puffer wurde 

die SERS-Mikroskopie durchgeführt. 

4.5.3 Nanopartikel-Konzentrationen und Inkubationszeiten 

Nach abgeschlossener Untersuchung in den Abschnitten 4.5.1 und 4.5.2 konnten die 

optimalen Demaskierungsmethoden und die Blockierungslösung gewählt werden. 

Die Qualität der Bildgebung mittels SERS-Mikroskopie hängt noch von weiteren 

Faktoren, wie der Anzahl der Immuno-SERS-Marker und die Dauer der 

Inkubationszeit der Antikörper-gekoppelten NP auf dem Gewebe ab. 

Einfluss der Anzahl von SERS-Nanopartikeln bei der Bildgebung 

Es wurden drei Gewebeschnitte mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer vorbehandelt. 

Alle Proben wurden vor der Inkubation mit α-PSA gekoppelten NP (Klon A67-B/E3) 

mit 2%igem BSA im PBST-Puffer 20 Minuten blockiert. Als SERS-Substrate wurden 

74


Gold/Silber-Nanopartikeln verwendet. Im nächsten Schritt wurden die Nanopartikel 

mit 4-TNB-MEG-OH und 4-TNB-TEG-OH in einem Verhältnis von 99 : 1 markiert. Die 

Kopplung von α-PSA (Klon A67-B/E3) wurde gemäß der unter 4.4.1 angegebenen 

Vorschrift durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden mit 250 µl Volumen der 

verschiedenen Konzentrationen von α-PSA-gekoppelten NP auf dem Taumler mit 

niedriger Geschwindigkeit inkubiert. 

Die eingesetzten Konzentrationen entsprachen je einer optischen Dichte von: OD= 1, 

OD= 0,5 und OD= 0,25 . Die Inkubationszeit der Immuno-SERS-Marker auf dem 

Gewebe betrug für alle Proben 20 Minuten. Nach dreimaligen Waschen für je fünf 

Minuten im PBST-Puffer wurde die SERS-Mikroskopie durchgeführt. 

Einfluss der Inkubationszeit von SERS-Nanopartikeln bei der Bildgebung 

Abgesehen von der Inkubationszeit der SERS-markierten-Antikörper auf dem 

Gewebe wurden alle Einstellungen zur Detektion von p63 übernommen. Zur 

Detektion von p63 wurden als SERS-Substrat wieder Gold/Silber-Nanoschalen 

verwendet. Im nächsten Schritt wurden die Nanopartikel mit 4-TNB-MEG-OH und 4- 

TNB-TEG-OH in einem Verhaltnis von 99 : 1 markiert. Die Kopplung von anti-Human 

p63-Antikörper (α-p63, Klon Y4A3) wurde nach der unter 4.4.1 beschriebenen 

Vorschrift durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden mit 250 µl α-p63-gekoppelten 

NP (OD= 0,25) und unterschiedlichen Inkubationszeiten (20, 30 und 40 Minuten) auf 

dem Taumler mit niedriger Geschwindigkeit inkubiert. Nach dreimal fünfminütigem 

Waschen im PBST-Puffer wurde die SERS-Mikroskopie durchgeführt Zur Detektion 

von PSA und p63 mit glasverkapselten Clustern wurde die Anzahl der notwendigen 

Nanopartikel für PSA ermittelt und für p63 übernommen. Die optimale Inkubationszeit 

für das Protein p63 sollte erneut bestimmt werden, da anstatt der monoklonalen 

Antikörper (α-p63, Klon Y4A3), polyklonale antihuman p63 (Abcam) verwendet 

wurden. Die Detektion von PSA wurde unverändert mit monoklonalen Antikörpern 

(Klon A67-B/E3) durchgeführt. 

Ermittlung der optimalen Inkubationszeit für Nanocluster zur Detektion von p63 

Die optimale Inkubationszeit des Gewebes mit α-p63-gebundenen Clustern wurde 

unter 15 Minuten festgelegt. Eine längere Inkubationszeit als 15 Minuten führte stets 

zur Bildung von unspezifischen Bindungen. 

75


Die angefertigten Immuno-SERS-Marker (Cluster als SERS-Substrat) wurden auf 

OD=0,2 verdünnt. Es wurden vier Gewebeschnitte mit optimaler 

Antigendemaskierungsmethode für p63 (kommerzielles Antigen Retrieval von Dako) 

vorbereitet. Nach der Blockierung mit 2%igem BSA im PBST-Puffer wurden die 

Proben dreimal für ca. fünf Minuten. mit PBST-Puffer gewaschen. Das Gewebe 

wurde mit 250 µl vorbereitetem Immuno-SERS-NP-Konjugat bei Inkubationszeiten 

von 8, 10, 12 und 15 Minuten auf dem Taumler mit niedriger Geschwindigkeit 

inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Gewebeschnitte weitere 

dreimal mit PBST-Puffer (ca. 5 Min.) gewaschen und unverzüglich für die SERS- 

Mikroskopie verwendet. Die Laserleistung bei diesem Experiment wurde auf 8 mW 

und die Belichtungszeit auf 20 Millisekunden eingestellt. 

Die Detektion von PSA ist unter 100 Millisekunden nicht möglich gewesen. 

4.6 SERS-Sandwich-Immunoassays 

Die funktionalisierten Glasobjektträger wurden permanent in einem Exsikkator unter 

dem Vakuum aufbewahrt und nur kurz vor Beginn des Experiments aus dem 

Exsikkator entnommen. 

Die kommerziell erworbenen Trennwände (Flexwells) wurden mit Sekundenkleber 

auf der Glasoberfläche befestigt. Somit werden ähnlich zu ELISA-Platten 

Vertiefungen mit ca. 100 µl Volumen gebildet (Abbildung 4.8). Es wurde eine Lösung 

von 4 µg/ml Protein A/G im Karbonat-Puffer vorbereitet. Danach wurden in jeder 

Vertiefung 80 µl von gelöstem Protein A/G pipettiert und 3 Stunden bei RT auf dem 

Taumler platziert. Nach der Inkubation wurde der Objektträger einmal 3 Minuten mit 

Acetat-Puffer und zweimal 3 Minuten im PBST-Puffer (mit 0,05%igem Tween 20 ) 

gewaschen. Die monoklonalen Antikörper (mAK) wurden in einer Konzentration von 

10 µg/ml während der Waschgänge vorbereitet. In allen Vertiefungen wurden 80 µl 

mAK pipettiert und 1 Stunde bei RT auf dem Taumler platziert und anschließend über 

Nacht im Kühlschrank bei 4°C inkubiert. 

Vor der Vorbereitung der Antigenproben wurde der Objektträger 15 min. auf dem 

Taumler bei RT gestellt damit die Proben wieder Raumtemperatur erreichen. Der 

Objektträger wurde entleert und dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen den 

Waschgängen wurde der Puffer sorgfältig entsorgt und die Kammern ausgeklopft. 

76


Die Proben wurden mit Blockierungslösungen der Firma Candor (BSA-Block, Smart- 

Block und Blocking Solution 1) 30 Minuten blockiert. 

Abbildung 4.8: Die Durchführung des SERS-Immunassay wurde schematisch in vier 

Schritten dargestellt. Zuerst wurden Protein A/G-Moleküle kovalent an die Oberfläche 

des Glasobjektträgers gebunden (1). Danach bindet der Fänger-Antikörper an einer 

von sechs Bindestellen des Protein A/G (2). Zunächst werden Antigen-Moleküle 

durch Fänger-Antikörper immobilisiert (3). Am Ende werden die Antigenmoleküle 

durch Immuno-SERS-NP-Konjugate erkannt. 

Der Objektträger wurde wieder entleert und dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. 

Zwischen den Waschgängen wurde der Puffer sorgfältig entsorgt und die Kammern 

ausgeklopft. Während der Blockierung wurden die vorgesehenen Antigene in 

folgende Konzentrationen im PBST-Puffer vorbereitet: 

Standard 1: 

Standard 2: 

Standard 3: 

Standard 4: 

Standard 5: 

Standard 6: 

7 ng/ml 

5 ng/ml 

3 ng/ml 

1,5 ng/ml 

0,5 ng/ml 

Null-Wert. 

Der Objektträger wurde entleert und dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen 

den Waschgängen wurde der Puffer sorgfältig entsorgt und die Kammern 

ausgeklopft. Danach wurden die Antigen-Lösungen auf den Objektträger 

(immobilisiert mit mAK) überführt. Es wurden für jede Antigen-Konzentration zweimal 

77


80 µl in zwei benachbarte Vertiefungen verteilt, um eine Doppelmessung zu 

ermöglichen. Anstatt Antigen wurde BSA oder Ovalbumin als Negativ-Kontrolle in die 

Kammern pipettiert. Die Proben wurden drei Stunden bei RT auf den Taumler gestellt 

und weitere 2 Stunden im Kühlschrank bei 4°C inkubiert. Parallel zur Bearbeitung 

des Objektträgers sollte auch die Kopplung der polyklonalen (pAK) Antikörper an 

glasverkapselten Clustern durchgeführt werden (Abschnitt 4.4.2), da bei Beendigung 

der Inkubationszeit mit Antigenen das Experiment unverzüglich mit Immuno-SERS- 

Markern weiter durchgeführt werden sollte. 

Nach Beendigung der Inkubationszeit mit Antigenen wurde der Objektträger wieder 

entleert und dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen den Waschgängen 

wurde der Puffer sorgfältig entsorgt und die Kammern ausgeklopft. Alle Proben 

erhielten 80 µl beliebigen Immuno-SERS-Marker (polyklonalen IL1, IL8 oder TNFα 

mit einer OD=0,2) Der Objektträger wurde auf dem Taumler mit niedriger Umdrehung 

bei RT für ca. 2 Stunden platziert. Danach wurde der Objektträger entleert und 

dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen den Waschgängen wurde der Puffer 

sorgfältig entsorgt und die Kammern ausgeklopft. Am Ende wurden die Trennwände 

vorsichtig von der Glasoberfläche entfernt und der Objektträger ganz langsam im 

Reinstwasser getaucht, um das Puffersalz zu entsorgen. Der Objektträger wurde im 

Trockenschrank bei 37°C getrocknet und für die SERS-Mikroskopie verwendet. 

Abbildung 4.9: Schematische Darstellung der simultanen Detektion von drei 

Zytokinen. Der Objektträger wurde mit Protein A/G beschichtet (nicht dargestellt). 

Nach Immobilisierung der Fänger-Antikörper wurde eine Blockierung mit BSA- 

Lösung durchgeführt. Die verschiedenen polyklonalen Antikörper (pAK) wurden an 

verschiedene SERS-Nanopartikel gebunden. 

78


Zur simultanen Detektion von drei Zytokinen mit drei verschiedenen Immuno-SERS- 

Markern wurde dieselbe Vorschrift mit wenigen Veränderungen übernommen. Da in 

diesem Experiment drei verschiedene Zytokine detektiert werden müssen, wurden 

die Proteine in Form einer Mischung verwendet. Das heißt statt der Immobilisierung 

von einem Fänger-Antikörper sollten drei verschiedene Fänger-Antikörper auf 

Objektträgern immobilisiert werden. Ebenso wurden Immuno-SERS-NP-Konjugate 

und Antigene in einer Dreiermischung verwendet. In Abbildung 4.9 ist das 

Experiment schematisch dargestellt. 

Das Vorgehen zur simultanen Detektion von drei Zytokinen 

Der Objektträger wurde ohne Veränderung, wie oben beschrieben, mit Protein A/G 

beschichtet. Die drei monoklonalen Antikörper wurden im PBST-Puffer mit einer End- 

Konzentration von 10 µg/ml für den jeweiligen Antikörper vorbereitet. In allen 

Vertiefungen wurden 80 µl der Mischung von mAK pipettiert und eine Stunde bei RT 

auf dem Taumler platziert und anschließend über Nacht im Kühlschrank bei 4°C 

inkubiert. 

Vor der Vorbereitung der Antigenproben wurde der Objektträger 15 min. auf den 

Taumler bei RT platziert, um die Proben wieder auf Raumtemperatur zu bringen. Der 

Objektträger wurde entleert und dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen den 


Die Proben wurden mit Blockierungslösungen der Firma Candor (Smart-Block) 30 

Minuten blockiert. Der Objektträger wurde wieder entleert und dreimal mit PBST- 

Puffer gewaschen. Zwischen den Waschgängen wurde der Puffer sorgfältig entsorgt 

und die Kammern ausgeklopft. Während der Blockierung wurden die vorgesehenen 

Antigene in einer End-Konzentrationen von 7, 5, 3, 1,5 und 0,5 ng/ml für das 

jeweilige Antigen in einer Mischung im PBST-Puffer vorbereitet. Der Objektträger 

wurde entleert und dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen den 


Danach wurden die Antigenen-Lösungen auf Objektträger (immobilisiert mit mAK) 

überführt. Von jeder Misch-Konzentration wurden zweimal 80 µl in zwei benachbarte 

Vertiefungen verteilt, um eine Doppelmessung zu ermöglichen. Statt des Antigens 

wurde BSA oder Ovalbumin als Negativ-Kontrolle in die Kammern pipettiert. Die 

Proben wurden drei Stunden bei RT auf den Taumler gestellt und weitere 2 Stunden 

79


im Kühlschrank bei 4°C inubiert. Parallel zur Bearbeitung des Objektträgers sollte 

auch die Kopplung der drei verschiedenen pAk auf glasverkapselten Cluster 

(Immuno-SERS-Marker) durchgeführt werden (Abschnitt 4.4.2). Nach Beendigung 

der Inkubationszeit mit Antigenen wurde der Objektträger wieder entleert und dreimal 

mit PBST-Puffer gewaschen. Zwischen den Waschgängen wurde der Puffer 

sorgfältig entsorgt und die Kammern ausgeklopft. 

Alle Proben erhielten 80 µl von gemischten Immuno-SERS-Markern (polyklonalen 

IL1, IL8 und TNFα gebunden an relevanten SERS-Substraten mit einer OD=0,2). Die 

Inkubationszeiten mit Immuno-SERS-Markern und alle weitere Schritte wurde ohne 

Änderung, wie oben beschrieben, durchgeführt. 

Die Messungen wurden an zufälligen Stellen von verschiedenen Bereichen der 

Glasoberfläche in der Größe von 100 µm X 100 µm durchgeführt. Von den 

ausgewählten Oberflächen wurden 400 Raman-Spektren verteilt auf 20 Linien 

aufgenommen. Bei allen Messungen (vereinzelte Proteine oder Multiplexing) wurden 

eine Integrationszeit von 2 Sekunden und eine Laserleistung von 0,5 mW verwendet. 

Die Auswertung wurde durch das von D. Steinigeweg und A. Bröermann entwickelte 

Matlab-Programm durchgeführt. 

4.7 Instrumente und Software 

Zeta-Potential-Messungen: 

Das Zeta-Potential kolloidaler Lösungen wurde mit einem Zetasizer der Firma 

Malvern (Modell: Nano ZS) ermittelt. Die Messungen werden wiederum in 

Rückstreugeometrie in einer Einwegküvette aus Polystyrol durchgeführt. 

Raman-Mikroskopie: 

Die Raman-Spektren wurden mit einem konfokalen Mikrospektrometer der Firma 

WITec (Modell: Alpha 300) aufgenommen. Das Messgerät besteht aus einer Peltiergekühlten 

CCD Kamera, einem Mikroskop und einem Monochromator (600 bzw. 

1800 Striche pro Millimeter). Der HeNe-Laser liefert eine maximale Leistung von 24 

mW bei einer Wellenlänge von 632.8 nm. Die Strahlung wurde durch verschiedene 

Mikroskop-Objektive (Tabelle 4.4) auf der Probe fokussiert und das gestreute Licht 

80


wiederum mit demselben eingesetzten Objektiv (Rückstreugeometrie) gesammelt. 

Für eine detaillierte Beschreibung des Aufbaus des Raman-Mikroskops wird auf die 

Dissertation von M. Gellner verwiesen. [124] 

Objektive Numerische Apertur Bezeichnung 

10 0,25 Nikon-Japan, E Plan ∞/0 WD 12,5 

20 0,5 Nikon-Japan, UPLanFLN ∞/0,17/FN 26,5 

40 0,6 OLYMPUS -Japan, LUCPlan FLN ∞/0-2/FN22 

50 0,75 Nikon-Japan, EPlan ∞/0 WD 0,48 

Tabelle 4.5: Liste der eingesetzten Mikroskop-Objektive. 

ELISA-Reader: 

Die Messungen der Absorptionspektren wurden am Sunrise Absorbance Reader der 

Firma Tecan aufgenommen. 

UV/VIS-Absorption/Extinktionsspektroskopie: 

Zur Ermittlung der Extinktionsspektren wurde ein UV/Vis/NIR-Spektrometer der Firma 

Perkin-Elmer (Modell: Lambda 19) verwendet. Die Scangeschwindigkeit betrug dabei 

480 nm/min. Die Extinktion der Nanopartikel-Suspension wurde in einer 2 mm dicken 

Quartzküvette bestimmt. 

Transmissionselektronenmikroskopie: 

Die TEM-Aufnahmen wurden mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop der 

Firma Zeiss (Modell: EM 10, 80 keV) durchgeführt. Als Probenträger wurden 

Kohlenstoff-beschichtete Kupfer-Netze der Firma Quantifoil (400 Maschen) 

verwendet. 

Software: 

- WiTeC-Project,V2.02 

- WiTec-Control, V1.52 

- Microsoft Office, 2007 

- Matlab, R2010a 

- Origin Pro Version 8 

- Paint.NET 

81

5.1 Ergebnisse und Diskussion 

5. Ergebnisse und Diskussion 

5.1 Herstellung von SERS-Nanopartikeln 

5.1.1 Synthese von Goldkeimpartikeln und quasi-sphärischen Goldnanopartikeln 

Die Synthese der Keimpartikel aus Gold wurde im Abschnitt 4.2.1 beschrieben. [178] 

Keimpartikel werden als Vorstufe für die Herstellung von weiteren Nanostrukturen, 

wie Gold-Vollkugeln und Gold-Nanosternen verwendet, wobei deren Größe variabel 

eingestellt werden kann. Bei der Herstellung von Keimpartikeln sind Monodispersität 

und Reproduzierbarkeit der Partikelgröße äußerst wichtig. Zur Herstellung der 

Keimpartikel wurde eine Synthesevorschrift von Xia et al. herangezogen. [176,177] Die 

Herstellung von Keimpartikeln kann als ein zweistufiger Prozess, bestehend aus 

Keimbildung (engl.: nucleation) und Wachstum, beschrieben werden. Die 

ursprüngliche Vorschrift von Xia et al. wurde durch Max Schütz (Keimbildungsstufe) 

und Bernd Walkenfort (Wachstum der Keimpartikel) in der Arbeitsgruppe Schlücker 

modifiziert. Zuerst wird ein kleiner kristallförmiger Keim gebildet. Dies ist eine 

schnelle chemische Reaktion, die durch Reduktion von Tetrachloridogold (III)-säure 

mittels Natriumcitrat bei hoher Temperatur stattfindet. Danach werden die 

Reaktionskolben bei Raumtemperatur 12 Stunden unter Rühren inkubiert. Während 

dieser Inkubationszeit lagern sich überschüssige Goldatome an die kristallförmigen 

Kerne, sodass diese zu größeren Keimpartikeln heranwachsen. Die Größe der 

Keimpartikel wird durch Variation der Menge von Tetrachloridogold (III)-säure und 

der Reaktionsdauer eingestellt. Um die Qualität der so hergestellten Keimpartikel und 

Gold-Nanopartikel (Au-NP) zu beurteilen, werden kommerzielle Nanopartikel (NP) mit 

definierter Größe benötigt. Für diese Arbeit wurden dazu kommerziell erhältliche 

Goldnanopartikel der Firma BBI verwendet. In Abbildung 5.1A sind die 

Extinktionsspektren kommerziell erhältlicher und selbsthergestellter Goldkolloide 

dargestellt. Laut Angabe der Hersteller beträgt die Sphärizität der Nanopartikel über 

95% und der Varianzkoeffizient der Produkte weniger als 8%. Die 10 nm und 20 nm 

großen Goldkolloide der Firma BBI haben ein Extinktionsmaximum bei ca. 517 bzw. 

523 nm. Das Extinktionsmaximum der selbsthergestellten Kernpartikel liegt bei ca. 

518 nm. Die TEM-Aufnahmen in Abbildung 5.1B zeigen, dass die selbsthergestellten 

82


Kernpartikel eine durchschnittliche Größe von 12 nm besitzen. In Abbildung 5.1B ist 

ersichtlich, dass nur 15 von 220 abgezählten Keimpartikeln (


Abbildung 5.2: Normierte Exstinktionsspektren von 60nm BBI-Goldnanopartikeln 

(gestrichelte Linie) und von selbsthergestellten Goldnanopartikeln (durchgezogene 

Linie). Das Extinktionsmaximum der BBI-NP liegt bei 535 nm und der selbsthergestellten 

bei 533 nm. 

Diese Goldpartikel wurden als Ausgangsmaterial zur Herstellung von kleinen 

Clustern, wie Dimeren und Trimeren, verwendet. 

Abbildung 5.3: TEM-Aufnahmen der selbsthergestellten Gold-Vollkugeln in verschiedenen 

Vergrößerungen. 

5.1.2 Synthese von Goldnanosternen 

Für die Herstellung der Nanosterne wurden ca. 10 nm große Kernpartikel 

eingesetzt. [178] Die Größe der daraus herzustellenden Gold-Nanosterne wird über die 

Konzentration der Goldlösung eingestellt. Die Verwendung von Nanosternen hat 

84


zwei Vorteile. Die optimale Anregungswellenlänge der Nanosterne liegt im roten bis 

nahinfraroten Bereich, wo die Autofluoreszenz von Gewebe minimal ist. Des 

Weiteren besitzen Nanosterne an den Spitzen (engl. Tips) nach resonanter 

Laseranregung starke lokale Feldüberhöhungen, die für SERS-Messungen 

vorteilhaft sind. Diese Erhöhung des SERS-Signals ist für die Detektion in der SERS- 

Mikroskopie oder weiteren biomedizinischen Applikationen wie Assays wichtig. In 

Abbildung 5.4 sind die Extinktionsspektren von Ausgangsnanopartikeln der Größe 10 

nm und von produzierten Nanosternen gegenüber gestellt. Eine Verschiebung der 

Plasmonbande von 528 nm bis 680 nm ist feststellbar. 

Abbildung 5.4: Gegenüberstellung von normierten Extinktionsspektren der 10 nm 

großen Goldkernpartikel als Ausgangsmaterial und den daraus hergestellten ca. 60 nm 

großen Goldnanosterne. 

Außerdem ist die Plasmonbande im Extinktionsspektrum der Nanosterne in 

Abbildung 5.4 im Vergleich mit den bisher publizierten Extinktionsspektren 

breiter. [178,179] Der Grund für die breite Plasmonbande kann die Zugabe von Glycerin 

während der Herstellung der Nanosterne sein. Laut Literatur kann die Hydroxyl- 

Gruppe von Glycerin zu einer besseren Stabilität der Nanopartikel gegen Oxidation 

führen. [181] Die Goldnanosterne besitzen viele kleine Plasmonbanden, die zu einer 

"großen Bande" koppeln. Die Zugabe von Glycerin kann wahrscheinlich zur Bildung 

unterschiedlicher Längen, Durchmesser und Formen der Spitzen führen. Das 

Extinktionsspektrum der hergestellten Nanosterne ohne Zugabe von Glycerin ist 

85


schmaler. Anhand der TEM-Aufnahmen in Abbildung 5.5 ist eine einheitliche Größe 

der hergestellten Nanosterne von ca. 60 nm zu erkennen. Die hergestellten 

Goldnanosterne zeigen eine Größenabweichung von ca. ±7nm. [178] 

Abbildung 5.5: TEM-Aufnahme von ca. 60 nm großen Goldnanosternen (A), 

Darstellung eines einzelnen Nanosterns (B) Spitze eines Nanosterns in vergrößerter 

Darstellung aus B (C). 

5.1.3 Synthese von Gold/Silber-Nanoschalen 

Die gewünschte in-situ-Anwendung in der Bioanalytik mit Laseranregung im roten bis 

nahinfraroten Bereich des elektromagnetischen Spektrums wird auch mit Gold/Silber- 

Nanoschalen erfüllt. 

Die Einstellung des Extinktionsmaximums ist hierbei, wie bei den Goldnanopartikel 

und Nanosternen, von der Konzentration der Goldlösung abhängig, die während der 

Herstellung von Hohlkugeln tropfenweise dazu pipettiert wurde. Durch die Zugabe 

von Tetrachlorgoldsäure kann die Verschiebung der Plasmonbande variiert werden. 

Bei optimaler Lage der Plasmonbande wird die Zugabe von der Tetrachlorgoldsäure 

gestoppt. Im Gegensatz zur Herstellung von Goldnanopartikeln ist die Verschiebung 

der Plasmonbande bei Herstellung von Gold/Silber-Nanoschalen im roten Bereich 

nicht zwingend mit einer Änderung der Größe der Nanopartikel verbunden. [124] In 

dieser Reaktion werden die Silber-Atome durch Gold-Atome ersetzt bzw. wird nur der 

Goldanteil vermehrt. 

Die Bildung von Gold/Silber-Nanoschalen und die notwendigen Reaktionsbedingungen 

wurden im Abschnitt 4.2.3 beschrieben. Die tropfenweise Zugabe von 

Tetrachlorgoldsäure ist eine von diesen Bedingungen. In Abbildung 5.6 ist die 

Bildung der Gold/Silber-Legierung mit drei Zwischenstufen symbolisch in 

86


verschiedenen Farben dargestellt. Die langsam wachsende Goldschicht auf der 

Silberschicht verursachte die Verschiebung der Plasmonbande vom blauen in den 

grünen und schließlich in den roten Bereich des elektromagnetischen Spektrums. 

Abbildung 5.6: Extinktionsspektren von Silbervollkugeln (blau) und Goldnanoschalen 

(rot) in Wasser als Lösungsmittel. Dazwischen wurden die Zwischenprodukte bzw. 

stufenartige Verschiebungen der Plasmonbande vom blauen zum roten Bereich des 

elektromagnetischen Spektrums dargestellt. Die Silbernanopartikel und Gold/Silber- 

Nanoschalen wurden in der Abbildung mit Ag-Kolloid und Au@Ag-Partikel abgekürzt. 

Die kontinuierliche Verschiebung der Plasmonbande mit zunehmender Goldmenge 

wird ständig beobachtet und kann beliebig variiert bzw. gestoppt werden. Ein 

Extinktionsmaximum bei ca. 650 nm wäre ein optimaler Wert für die 

Anregungswellenlänge eines 633 HeNe-Laser. [125] Deshalb wurde bei der Herstellung 

der Gold/Silber-Nanoschalen die Reaktion bei einem Extinktionsmaximum von ca. 

630 nm gestoppt. [124,125] Durch weitere bzw. spätere Bearbeitungen wie die Zugabe 

von Ramanreportermolekülen, Biofunktionalisierung und die Proteinkopplung wird 

das Extinktionsmaximum bei ca. 650 nm erreicht. Die Herstellung der Gold/Silber- 

Nanoschalen ist relativ einfach verglichen mit anderen SERS-Substraten und diese 

Partikel können mit geeigneten Raman-Markern, wie 4-TNB oder SEMA4, in der 

SERS-Mikroskopie eingesetzt werden. Diese leichte Handhabung ist der Grund 

dafür, dass bei allen Einstellungen der SERS-Mikroskopie dieses Substrat 

87


bevorzugt wurde. In Abbildung 5.7 sind die Silbernanopartikel (Ag-NP) als 

Ausgangsprodukt und die daraus hergestellten Gold/Silber-Nanoschalen vor und 

nach der Glasverkapselung (ca. 5 nm) dargestellt. Die Methode zur Herstellung der 

Gold/Silber-Nanoschalen wurde ohne Änderung von M. Gellner 

übernommen. [37,124,125,126] 

Abbildung 5.7: Darstellung der Silbernanopartikel mit einer Größe von ca. 70 nm als 

Ausgangsmaterial (A). daraus hergestelltes Gold/Silber-Nanopartikel ist in B dargestellt, 

Gold/Silber-Nanopartikel mit ca. 5 nm dicker Glashülle ist in C dargestellt. 

5.1.4 Herstellung, Separation und Charakterisierung von Goldnanopartikel- 

Clustern 

Die kleinsten Goldnanopartikelcluster sind Dimere und Trimere, die wegen ihrer 

Plasmonenkopplung hohe SERS-Signale liefern können. Für die Herstellung der 

Goldnanocluster wurden 60 nm Goldnanopartikel als Ausgangsmaterial verwendet. 

Das Goldkolloid soll nach der Herstellung in mehreren Schritten bearbeitet werden, 

um an die hochsensitiven Cluster zu gelangen (Abschnitt 4.2.4). 

Zuerst wurden mit Zugabe von Raman-Markern zum Goldkolloid SAMfunktionalisierte 

Kolloide hergestellt. Die kovalente Bindung von Raman-Reportern 

auf der Oberfläche der Nanopartikel sorgt für eine Verschiebung des 

Extinktionsspektrums von 2 bis zu 4 nm. Diese Verschiebung ist in Abbildung 5.8 

deutlich zu sehen. 

Nach der SAM-Ausbildung wurde durch Zugabe von Salz (NaCl) oder APTMS die 

Bildung der unkontrollierten Aggregate hervorgerufen (Abschnitt 4.2.4). Das Ausmaß 

dieser unkontrollierten Aggregation hängt von der Menge des Salzes oder APTMS 

88


ab. Die Stabilität der hergestellten SAMs gegenüber den Salzlösungen ist sehr 

unterschiedlich und hängt von den verwendeten Raman-Reportern ab. Im Fall von 

BMBA- oder 4-MBA-Raman-Reportern ist eine niedrige Menge an Salzpuffer 

ausreichend, um die erwünschten Aggregationsgrade zu erzielen. 

Die mit TF-MBA- oder 4-TNB ausgebildeten SAMs aggregieren jedoch nicht so 

einfach. Die mit Salz durchgeführten Aggregationen der mit 4-TNB markierten 

Nanopartikeln sind in der Regel reversibel. Das heißt, nach dem Waschgang können 

sich die gebildeten Aggregate zu Monomeren auflösen. 

Abbildung 5.8: Gegenüberstellung der Extinktionsspektren von selbsthergestellten 60 

nm Goldnanopartikeln vor (gestrichelte Linie) und nach der Markierung mit Raman- 

Reportern (durchgehende Linie). 

Mit der APTMS-Menge kann das Ausmaß an Aggregation der Nanopartikel 

kontrolliert werden. In Abbildung 5.9 ist der Einfluss der verwendeten 

Konzentrationen von APTMS auf das Ausmaß der Aggregation dargestellt. 

Die 4-TNB-markierten Nanopartikel wurden in Ethanol aufgenommen und danach auf 

acht Reaktionsgefäßen mit gleichem Volumen und gleicher Konzentration verteilt. 

Die Proben erhalten zunächst eine unterschiedliche Menge vom APTMS aus einer 

Konzentrationsreihe. Zur negativen Kontrollprobe wurde kein APTMS gegeben 

(Abschnitt 4.2.4). Bei einer hohen APTMS-Konzentration, wie bei Probe C1 bis C5, 

wurde Aggregation beobachtet. Bei den Proben C6 und C7 sind die 

89


Aggregationsgrade zwar niedriger, aber die erworbene Ausbeute von optimalen 

Clustern (Dimeren und Trimeren) ist wesentlich höher im Vergleich zu C1 bis C5. 

Nach der Trennung der verkapselten Cluster wurde durch Extinktionsspektroskopie 

die Konzentration der Cluster als Ausbeute bestimmt. Die Konzentrationen der 

Cluster bei Proben mit geringeren Aggregationsgraden (C6 und C7) waren höher als 

bei Proben mit stärkeren Aggregationsgraden (C1 bis C5). Die hergestellten SAMs 

wurden kurz vor der Glasverkapselung mit APTMS behandelt. 

Abbildung 5.9: Abhängigkeit des Aggregationsgrades von der Menge an APTMS. C1 

bis C7 (C1= 5 mM bis C7= 0,078 mM) hervorgerufene Aggregation durch eine 

Verdünnungsreihe von APTMS sind in der Form veränderte Extinktionsspektren zu 

sehen. Probe C8 besteht aus den in Ethanol aufgenommenen Nanopartikeln ohne 

Zugabe vom APTMS. Zur Darstellung der Extinktionsspektren wurden alle Kolloide in 

Ethanol aufgenommen. 

In dieser Arbeit wurden fünf verschiedene Raman-Reporter verwendet. Die 

Normierung der Raman/SERS-Intensitäten der Goldnanocluster auf die jeweilige 

maximale Extinktion der Plasmonbanden sind in Abbildung 5.10 gegenüber gestellt. 

Alle ausgebildeten SAMs mit fünf Raman-Markern konnten erfolgreich mit Glas 

verkapselt und zur Detektion der Proteine eingesetzt werden. 

Zur Darstellung der SERS-Signale wurden aggregierte Goldnanopartikel als SERS- 

Substrate verwendet. Diese jeweils charakteristischen Banden sind ein 

unverwechselbarer „Fingerabdruck“ der Reporter-Moleküle und ermöglichen dadurch 

90


Multiplex-Messungen. Nach der Herstellung geeigneter Aggregate folgt das 

Aufwachsen der Glashülle nach einer modifizierten Stöber-Methode mit TEOS 

(Abschnitt 4.2.5). Die Nanopartikel werden durch die Glasverkapselung viel stabiler 

gegenüber mechanischen und chemischen Einflüssen der Umgebung, wie z.B. 

Zentrifugation oder Chemikalien (PBS-Puffer). Das Goldkolloid besteht nach der 

Glasverkapselung aus einer Mischung von verschiedenen Nanostrukturen, wie 

Monomeren, Dimeren, Trimeren oder aus noch größeren Nanopartikel-Clustern. 

Abbildung 5.10: Ausgebildete SAMs, mit fünf verschiedenen Raman-Reportern: 

BMBA, SEMA4, TF-MBA, 4-TNB und 4-MBA. Die jeweils charakteristischen Banden 

sind deutlich voneinander zu unterscheiden. Die SERS-Spektren wurden in Wasser 

als Suspensionsmedium aufgenommen. 

Die erwünschten Cluster wurden durch Dichtegradienten-Zentrifugation von weiteren 

Nanostrukturen, wie Monomeren und größeren Aggregaten getrennt. Goldnanocluster 

sind in der Lage als Einzelpartikel genügend Signal innerhalb kurzer 

Belichtungszeit zu generieren. 

Steinigeweg et al. konnten die Goldnanopartikel in der Größenordnung von 20 bis 

250 nm mit einer kontinuierlichen Dichtegradienten-Zentrifugation trennen. [189] Er 

konnte auch einen Reinheitsgrad von über 90% bei getrennten glasverkapselten 30 

nm Golddimeren erzielen. Bei den zu trennenden Clustern handelt es sich um 

glasverkapselte Nanostrukturen in der Größenordnung von ca. 120 bis 200 nm. Die 

Ziel-Cluster lassen sich durch eine nichtkontinuierliche Dichtegradienten- 

Zentrifugation mit höheren Glycerin-Konzentrationen besser trennen. Nach der 

91


Dichtegradienten-Zentrifugation sind verschiedene Fraktionen von Nanopartikeln in 

Abbildung 5.11A erkennbar. 

Die Dimere und Trimere wurden nach der Trennung wieder vereint und dreimal mit 

Ethanol gewaschen. In Abbildung 5.11B sind die TEM-Aufnahmen von Clustern nach 

den Waschgängen dargestellt. In der Abbildung ist ersichtlich, dass nur 2 von 50 

(


Abbildung 5.12: Darstellung der Trennmethode mit 2 ml Reaktionsgefäßen. Die 

Trennung der Monomere von kleineren Aggregaten (links) wurde der Trennung der 

Goldnanopartikel der Firma BBI (rechts) gegenübergestellt. 

Während die Trennung von Goldnanopartikeln der Firma BBI ca. 40 Minuten Zeit in 

Anspruch nahm, reichte für die Trennung der Cluster eine Zentrifugationszeit von 20 

Minuten aus. 

Zusätzlich zu den TEM-Aufnahmen (Abbildung 5.11) wurden die 

getrennten Cluster auch mittels Extinktionsspektroskopie und SERS-Mikroskopie 

charakterisiert. 

In Abbildung 5.13A sind die Plasmonbanden der verkapselten Monomere und 

Cluster nach der Trennung gegenüber gestellt. Das Spektrum der Monomere weist 

nur eine einzige Plasmonbande auf, die der Transversalmode der Dimere und 

linearen Trimere entspricht. Bei den Clustern ist zusätzlich eine Bande aufgrund der 

longitudinalen Plasmonmode vorhanden. Die SERS-Signale der beiden Kolloide sind 

in Abbildung 5.13B miteinander verglichen. Zur Ermittlung der SERS-Signale wurde 

die gleiche optische Dichte aus SERS-Substraten in einer Ethanol-Wasser-Lösung 

vorbereitet. 

Es kann keine Aussage über die Anzahl der Goldcluster getroffen werden, weil 

zurzeit keine Angaben über den Extinktionskoeffizient der Goldcluster bekannt sind. 

Die SERS-Signale wurden auf Raman-Bande von Ethanol in der Suspension 

normiert. Die SERS-Signale der Goldnanocluster waren in diesem Experiment ca. 

100 Mal größer als die der Monomere. Die räumliche Nähe der Goldnanopartikel 

nach Bildung der Cluster führte zu einer elektromagnetischen Feldverstärkung 

(Abschnitt 2.2). Um die Qualität der ultrasensitiven Cluster gegenüber Monomeren 

darzustellen, wurde in einem Experiment das verkapselte Aggregat vor der Trennung 

93


auf einen Silizium-Wafer verteilt, der mittels Elektronenstrahl-Lithographie 

vorstrukturiert war. 

Abbildung 5.13: Die Extinktions- Spektren von zwei getrennten Fraktionen in Wasser 

wurden in A gegenüber gestellt. In B wurden die ermittelten SERS-Signale (BMBA- 

Marker) der beiden Fraktionen unter gleichen Bedingungen (OD=1, Belichtungszeit 

und Laserleistung) gegenüber gestellt. 

Auf der Oberfläche der Silizium-Wafer wurde ein Schachbrett-Muster mit Rahmen, 

Zahlen und Buchstaben aus Gold eingeprägt, um während der Raster- 

Elektronenmikroskopie (REM) eine schnelle Orientierung zu ermöglichen. [124] Danach 

wurde mit SERS-Mikroskopie die Signal-Intensität von drei glasverkapselten 

Nanostrukturen charakterisiert. Die ausgewählte Oberfläche in der Abbildung 5.14 

beinhaltet alle Strukturen, die sich in der verkapselten Aggregatlösung vor der 

Trennung befanden. Dadurch wurde die Charakterisierung der SERS-Signale von 

Monomeren, Dimeren, Trimeren und auch sehr großen Aggregaten in nur einem 

Mapping ermöglicht. Die Position der Strukturen wurde durch Dunkelfeldmikroskopie 

gefunden (Abbildung 5.14A). Dieselbe Region wurde mit SERS-Mikroskopie 

abgerastert (5.14 B) und die generierten SERS-Signale von Dimeren und Trimeren 

sind im Falschfarbbild in Abbildung 5.14 B dargestellt. In Abbildung 5.14D wurde die 

von D. Steinigeweg durchgeführte quantitative Ermittlung der Signalintensität 

dargestellt. [38,198] Die Daten zeigen, dass Trimere 13 cts, Dimere 7 cts und Monomere 

0 cts innerhalb von 30 Millisekunden erzeugen können. Das Ergebnis zeigt, dass die 

Gold-Monomeren während der kurzen Belichtungszeit nicht ausreichend SERS- 

Signal zur Detektion generieren können. 

94


Abbildung 5.14: Gegenüberstellung von einzelnen glasverkapselten Monomeren und 

Clustern. Nanopartikel in Dunkelfeldmikroskopie Aufnahmen (A) durchgeführte SERS- 

Messungen (B), Rasterelektronenmikroskopie-Bilder (C). Nur die glasverkapselten 

Trimere (gelbe Pfeile) und Dimere (grüne Pfeile) konnten innerhalb von 30 

Millisekunden Belichtungszeit mittels SERS detektiert werden. Im Gegensatz dazu 

wurden glasverkapselte Monomere (rote Pfeile) nicht innerhalb von 30 Millisekunden 

Belichtungszeit detektiert (D). [38,198] 

Bei biomedizinischen Applikationen verursachen solche Monomere zwei Probleme 

die zu falschen-negativen Resultaten führen. Zuerst binden sie an Zielmoleküle und 

liefern während der kurzen Belichtungszeit keine Signale. Als Nächstes blockieren 

sie durch diese Bindung an die Zielmoleküle, die Bindungsstellen für die Anbindung 

der Goldnanocluster. In Schema 5.1 wurde die Bindung der verschiedenen Immuno- 

SERS-Marker schematisch dargestellt. 

Schema 5.1: Die Dimere (oben) und Monomere (unten) können sich an gleiche 

Zielmoleküle anlagern. Mit kurzer Belichtungszeit können nur Dimere genügend SERS- 

Signale zur Detektion generieren(Einzelpartikelsensitivität). [38] 

5.1.5 Herstellung von SERS-markierten Antikörpern 

Die eingesetzten SERS-Substrate in dieser Arbeit können auf Grund der 

Beschichtung in zwei Gruppen, mit oder ohne Glasverkapselung, unterteilt 

95


werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei den SERS-Messungen hängt 

besonders vom Erfolg der Biofunktionalisierung der Nanopartikel ab. Im 

folgenden Abschnitt wird zuerst die Biofunktionalisierung der nicht 

glasverkapselten Nanopartikel beschrieben. 

5.1.5.1 Biofunktionalisierung hydrophil stabilisierter Monolagen auf Edelmetallkolloiden 

Ziel der Biofunktionalisierung ist die Aktivierung der bestehenden Carboxylgruppen 

auf dem Nanopartikel für eine kovalente Bindung an die Aminogruppen der 

Antikörper oder Proteine. Das genaue Vorgehen der Proteinkopplung mit gemischten 

Dual-Spacer-SAMs wurde im Abschnitt 4.4.1 beschrieben. Dabei ist die Menge vom 

verwendeten sNHS und EDC sehr wichtig. Hohe Mengen an sNHS und EDC führen 

zur Aggregation der Nanopartikel und eine Weiterbearbeitung der Materialien wird 

dadurch unmöglich. Die Verwendung von geringen Mengen an sNHS und EDC 

verhindert zwar die Aggregation der Nanopartikel, die Effizienz und Bindungsaffinität 

der Nanopartikel wird dadurch jedoch eingeschränkt, weil weniger Proteine bzw. 

Antikörper an die Nanopartikel binden können. Das Ausmaß an Aggregation kann 

durch längerwellige Plasmonbanden aufgrund der Plasmonkopplung bei 

Clusterbildung beobachtet werden. Bei einer optimalen Kopplung der Proteine an die 

Nanopartikel dürfte diese zusätzliche langwellige Plasmonbande im 

Extinktionsspektrum nicht zu sehen sein. Das Extinktionsmaximum sollte nicht mehr 

als um 8 nm verschoben werden. Erfahrungsgemäß ist eine Verschiebung von mehr 

als 8 nm ein Zeichen für Aggregation, auch wenn keine zweite Bande sichtbar ist. Die 

notwendige Menge an sNHS und EDC wurde über zwei separate 

Verdünnungsreihen ermittelt (Abschnitt 4.4.1). In Abbildung 5.15A, ist die optimale 

Konzentration der Chemikalien (s-NHS und EDC) als 100% definiert und sie wurde 

zur Aktivierung der Carboxylgruppen von hydrophil stabilisierten Monolagen 

verwendet. Dabei wurde eine Verdünnungsreihe der Mischung von sNHS und EDC 

zu einer festen Anzahl von Goldnanopartikeln (60 nm) hinzugegeben. Die weiteren 

prozentualen Zahlen beziehen sich auf die optimale Menge (100 %). Bei doppelter 

Menge wurden 200 % und bei der Hälfte der Menge wurden 50 % eingetragen. Die 

oben genannten optimalen Bedingungen, wie z.B. keine Verschiebung des 

Extinktionsmaximums um mehr als 8 nm oder keine Bildung der zweiten Bande, sind 

nur bei drei Proben (25%, 50% und 100%) zu sehen. Im Gegensatz dazu zeigen die 

96


anderen Proben, (200%, 300% und 400%) eine Verbreiterung der Plasmonbande 

oder eine deutliche zweite Bande, was auf Aggregate hindeutet. 

Abbildung 5.15: Einstellung der Menge an sNHS/EDC und ihr Einfluss auf Bildung der 

Aggregate (A); Extinktionsspektren der 60 nm Goldkolloide nach der Bindung an HRPkonjugierte 

Antikörper (B). 

Durch die Weiterverarbeitung, z. B. nach Waschgängen oder Proteinkopplungen, 

vergrößert sich das Ausmaß der Aggregation von Nanopartikeln. In Abbildung 5.15B 

ist die Verschiebung des Extinktionsmaximums der Proben mit mehr als 100% sNHS 

und EDC deutlich sichtbar. Wie in Abbildung 5.15A und 5.15B dargestellt, wird mit 

Senkung der Menge an sNHS und EDC die Aggregation der Nanopartikel vermindert. 

Es stellt sich die Frage, wie weit man die Menge von sNHS und EDC senken darf, 

bzw. ab wann diese Senkung einen Einfluss auf die Effizienz der Biofunktionalisierung 

hat. Diese Frage wurde in einem weiteren Experiment beim 

Messen von HRP-markierten Antikörpern gebunden an NP beantwortet und das 

Ergebnis ist in Abbildung 5.16 dargestellt. Zur absoluten Quantifizierung der 

Peroxidase Aktivität von IgG/HRP-konjugierten NP wurde bei jeder Testserie an drei 

verschiedenen Tagen eine Verdünnungsserie von IgG/HRP als Standardreihe 

mitgeführt. Die Reproduzierbarkeit dieser Standardreihe ist in Abbildung 5.16 (links) 

dargestellt. Die Proben C1 bis C4 wurden mit 400 %, 300 %, 200 % und 100 % 

sNHS und EDC aktiviert. Die HRP-Aktivität aller vier Proben ist fast gleich und die 

Senkung der HRP-Aktivität fängt erst bei Probe C5 an, die nur der Hälfte der 

notwendigen Menge von sNHS und EDC versetzt wurde. Diese systematische 

97


Senkung wird, bei Probe C6, die mit 25% sNHS und EDC aktiviert wurde, deutlicher 

sichtbar. 

Abbildung 5.16: Durchgeführte Standardreihe zur Quantifizierung der Peroxidase- 

Aktivität von IgG/HRP-konjugierten NP (links). Berechnung der Anzahl gebundener Hrp- 

IgG auf einzelnen NP. C1 bis C6 sind Proben, die mit 400, 300, 200, 100, 50 und 25 % 

von sNHS und EDC aktiviert sind(rechts). 

Das Säulendiagramm zeigt die berechneten Mittelwerte der Anzahl an gebundenen 

Immunglobulin-Molekülen auf der Oberfläche eines 60 nm großen Goldnanopartikels. 

Die Mittelwerte wurden aus drei voneinander unabhängigen Testläufen an drei 

verschiedenen Tagen ermittelt (Abbildung 5.16 links und rechts). Die Fehlerbalken 

geben die jeweiligen Standardabweichungen an. Anhand dieser Untersuchung waren 

optimale Werte der HRP-Aktivität und optimale Extinktions-Spektren nur bei der 

Probe C4 feststellbar. Diese wies sowohl genügend HRP-Aktivität auf als auch keine 

Aggregationen. Das Ergebnis in Form eines Säulendiagramms ist in Abbildung 5.16 

dargestellt, wobei die berechnete Anzahl der Antikörper auf einem Partikel auf der 

jeweiligen Säule angegeben ist. 

5.1.5.2 Biofunktionalisierung glasverkapselter Edelmetallkolloide 

Die Immunglobulin-Moleküle werden nicht direkt auf die Oberfläche der 

glasverkapselten Nanopartikel gebunden, sondern die Kopplung wird über das 

Protein A/G als Adapterprotein erzielt. Bevor die verkapselten SERS-Marker mit dem 

Protein A/G gekoppelt werden konnten, mussten zunächst reaktionsfähige, 

funktionelle Gruppen auf die Oberfläche der glasverkapselten Nanopartikeln 

98


gebracht werden. Dies passiert in drei getrennten Stufen. Zuerst wird die 

Glasoberfläche der Nanopartikel durch alkalische Behandlung im Ultraschallbad 

hydrolysiert. Dann wurde durch Zugabe von APTMS, die Glasoberfläche mit freien 

Aminogruppen ausgestattet. Am Ende werden die bestehenden Aminogruppen durch 

C4-Verlängerung mit Bernsteinsäureanhydrid um vier Kohlenstoffatome verlängert. 

Die Aminofunktionalisierung und C4-Verlängerung sind besonders kritische Stufen 

der Biofunktionalisierung. Die glasverkapselten Nanopartikel aggregieren schnell, 

wenn Inkubationszeiten verlängert oder die Konzentration der Chemikalien zu hoch 

ist. Eine erfolgreiche Aminofunktionalisierung konnte durch eine Änderung des 

Zetapotentials indiziert werden. Das Zetapotential steigert sich von ca. - 30 mV nach 

der hydrolysierten Stufe auf ca. +20 mV bis +30 mV nach der 

Aminofunktionalisierung der Nanopartikel. Eine verlängerte Inkubation von 

glasverkapselten Nanopartikeln mit APTMS in EtOH führt zu einer irreversiblen 

Aggregation. 

Abbildung 5.17: Die glasverkapselten Goldnanopartikel wurden nach der Hydrolyse auf 

vier Reaktionsgefäße verteilt. Es wurden 30µl 0,5% APTMS auf alle Reaktionsgefäße 

pipettiert. Die „Ausgang“ genannte Probe erhielt 30 µl EtOH anstatt APTMS. Die 

Plasmonenbande und das Zetapotential der Nanopartikel wurden in Schritten 30, 60 und 

120 Minuten nach der Zugabe von APTMS untersucht. 

In Abbildung 5.17 ist der Einfluss der verlängerten Inkubationszeit während der 

Aminofunktionalisierung auf die Plasmonenbande der glasverkapselten 60 nm 

großen Goldnanopartikel dargestellt. Eine Bildung von Aggregationen ist bei den 

99


Inkubationszeiten von länger als 30 Minuten deutlich zu sehen. Eine verlängerte 

Inkubationszeit mit APTMS führte zu keiner Erhöhung des Zetapotentials der Proben. 

Durch die Zugabe der niedrigeren Menge von APTMS konnte keine Änderung des 

Zetapotentials festgestellt werden. Die Erhöhung der Menge von APTMS führt zu 

schnellerer Aggregation. Dadurch wird das Zetapotential nicht zwingend erhöht. Die 

letzte notwendige Stufe für die Protein A/G-Kopplung ist die sogenannte C4- 

Verlängerung. Wie erwähnt werden nach der C4-Verlängerung die bestehenden 

funktionellen Aminogruppen um vier Kohlenstoffatome verlängert. 

Diese Verlängerung konnte durch eine Senkung des Zetapotentials von ca. +20 mV 

auf ca. -35 mV indiziert werden. Die Beobachtungen in dieser Arbeit zeigen, dass 

die Verwendung von höheren Mengen von Bernsteinsäureanhydrid oder einer 

verlängerter Reaktionszeit zu erhebliche Aggregation führen können. In Abbildung 

5.18A sind die Zetapotentiale von drei Proben nach C4-Verlängerung schematisch 

dargestellt, die mit verschiedenen Konzentrationen von Bernsteinsäureanhydrid 

behandelt wurden. 

Abbildung 5.18: Ermittlung des Zetapotentials der glasverkapselten Nanopartikel 

nach Zugabe von C1 = 2 mM, C2 = 5 mM und C3 = 10 mM Bernsteinsäureanhydrid 

an der gleichen Anzahl(1000µl, OD=1) von Nanopartikeln (A). Ermittlung des 

Zetapotentials der Nanopartikel nach Zugabe von 5 mM Bernsteinsäureanhydrid und 

Inkubation nach 30, 60 und 120 Minuten (B). 

Bei allen Proben handelt es sich um die gleiche Anzahl von 60 nm glasverkapselten 

Goldnanopartikeln, die in drei verschiedenen Reaktionsgefäßen mit drei 

verschiedenen Konzentrationen von Bernsteinsäureanhydrid reagiert haben. Die 

100


Messungen wurden nach 30 Minuten Inkubation durchgeführt. In Abbildung 5.18B 

wurden auf drei Reaktionsgefäße gleiche Konzentrationen an 60 nm großen 

glasverkapselten Goldnanopartikeln verteilt. Alle Proben erhielten die gleiche 

Konzentration (5 mM) von in DMF gelöstem Bernsteinsäureanhydrid. Die 

Zetapotential-Messungen wurden nach 0, 30, 60 und 120 Minuten ermittelt. Die 

Ergebnisse weisen drauf hin, dass eine erfolgreiche C4- Verlängerung von der 

Menge und der Reaktionszeit mit Bernsteinsäureanhydrid abhängt. Durch die 

verlängerte Inkubationszeit wurde keine niedrigere Zetapotential erzeugt, sondern 

die Aggregation der Nanopartikel wurde dadurch hervorgerufen. 

In Abbildung 5.19 sind die Extinktionsspektren der Proben von Experiment 18 B 

gegenübergestellt. Es handelt sich um die Verschiebung der Plasmonbanden der 

aminofunktionalisierten Nanopartikel während der Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid. 

Abbildung 5.19: Die glasverkapselten Goldnanopartikel (60 nm) wurden nach der Aminofunktionalisierung 

in DMF (beinhaltet 5 mM Bernsteinsäureanhydrid) aufgenommen und 

auf drei Reaktionsgefäße verteilt. Die Probe „Ausgang“ wurde in DMF ohne 

Bernsteinsäureanhydrid aufgenommen. Die Extinktions-Spektren der Nanopartikel 

wurden nach 0, 30, 60 und 120 Minuten aufgenommen. 

Dieses Experiment zeigt, dass eine verlängerte Inkubationszeit während der C4- 

Verlängerung genau wie die verlängerte Inkubationszeit mit APTMS zur Bildung der 

Aggregate führen kann. Die Abhängigkeit der Aggregatbildung während der 

Inkubation mit APTMS oder Bernsteinsäureanhydrid wurde mehr fach beobachtet. 

101


5.1.6 Zusammenfassung und Ausblick 

Die erste Herstellung von kolloidaler Gold-Lösung wurde von Zsigmondy bereits 

1902 publiziert. [191] In unserer Zeit bemüht man sich diese Methoden noch zu 

verbessern um damit schneller an monodisperses Goldkolloid zu gelangen. Die 

Herstellung neuer Raman-Marker und auch die Entwicklung neuer SERS-Substrate 

bilden einen Schwerpunkt zahlreicher Arbeitsgruppen. Zwischen der Herstellung bis 

zur erfolgreichen Applikation der Nanostrukturen liegt ein langer Weg, der vielleicht 

als Biokompatibilität der Nanopartikel bezeichnet werden kann. Die Qualität der 

hergestellten Nanostrukturen in der Arbeitsgruppe Schlücker wurde mit dem Einsatz 

von der Extinktionsspektroskopie und auch TEM-Aufnahmen mit zurzeit vorhandenen 

Standardmaterialien verglichen. Anhand dieser Daten (Abbildungen 5.1 bis 5.6) 

konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Materialien als Grundstein in dieser 

Arbeit geeignet sind. 

Zunächst wurden die Trennmethoden zur Anreicherung von hochsensitiver 

Edelmetallnanopartikel-Cluster durchgeführt. Diese SERS-Substrate können für die 

Lokalisierung und auch Quantifizierung der Proteine verwendet werden. Es konnte 

die Detektion von Einzelpartikeln innerhalb von 30 Millisekunden experimentell 

nachgewiesen werden. Dadurch können mehr als 30 Bilder pro Sekunde 

aufgenommen werden. Das zeigt, dass die hergestellten und getrennten Cluster 

eventuell als geeignete Marker für weitere Echtzeit-Untersuchungen eingesetzt 

werden können. 

Außerdem wurden die bestehenden Methoden für Bio-Konjugation der Proteine an 

Oberflächen der Nanopartikel (Metall oder Glas) optimal angepasst. Damit konnte 

die Aggregation der Nanopartikel verhindert werden und dabei gleichzeitig 

ausreichend Proteine auf die Oberfläche der Nanopartikel kovalent gebunden 

werden. Die Existenz der Proteine auf der Oberfläche der Nanopartikel wurde durch 

HRP-Aktivität nachgewiesen. Die Einstellungen dieses Abschnittes wurden zur 

Herstellung von verschiedenen Immuno-SERS-Markern übernommen und zur 

Detektion von Proteinen eingesetzt. 

102


5.2 Etablierung der SERS-Mikroskopie 

5.2.1 Einfluss der Demaskierungsmethode 

Die Fixierung des Gewebes mit Formalin führt zu einer Quervernetzung der Proteine 

(Abschnitt 2.5). Um die Immunreaktivität der Proteine für die Färbung mit markierten 

Antikörpern wieder zugänglich zu machen, wurden diverse Antigen- 

Demaskierungsmethoden entwickelt. In IHC-Routinelabors werden diese Methoden 

regelmäßig kontrolliert und bei Bedarf entsprechend modifiziert. Auch in der SERS- 

Mikroskopie sind diese Methoden im Hinblick auf die Färbungsqualität besonders 

wichtig. 

Ein Ziel dieser Arbeit ist die Detektion von multiplen Antigenen. Die gewählte 

Demaskierungsmethode sollte deshalb die verlorengegangene Immunreaktivität der 

untersuchten Antigene optimal wieder herstellen. 

5.2.1.1 Antigendemaskierung mit Proteinase K 

In vielen Vorschriften wird die Immunreaktivität einiger Antigene, z.B. von 

Cytokreatinen, durch die Behandlung mit Enzymen erzielt. Manchmal wird sogar eine 

Kombination von Enzym-Vorbehandlung und Hitze bevorzugt. [149] In diesem 

Zusammenhang wurden verschiedene Vorschriften mit Enzymen, wie Trypsin, 

Proteinase K, Pepsin und Pronase etabliert. In dieser Arbeit wurde jedoch keine 

Kombination von verschiedenen Methoden verwendet. 

Abbildung 5.20 zeigt die Ergebnisse der SERS-Mikroskopie nach Demaskierung des 

Gewebes mit Proteinase K. Zwei Gewebeschnitte stammen von gesunden 

Probanden und wurden nach der Enzym-Behandlung mit SERS-markierten PSA- 

Antikörpern (Abbildung 5.20A) bzw. SERS-markierten p63-Antikörpern (Abbildung 

5.20B) inkubiert. Die SERS-Falschfarbenbilder (Abb. 5.20 A/B rechts) zeigen, dass 

die Behandlung mit Enzym nur bei der PSA-Färbung erfolgreich war. Bei p63 

hingegen sind kaum SERS-Signale zu erkennen. 

Beide Proben wiesen keine unspezifischen Bindungen der Nanopartikel in 

Bereichen, wie Lumen oder Stroma auf. Für ein erfolgreiches Multiplexing sollte die 

Demaskierungsmethode für beide Antigene optimal gewählt werden. Die 

Demaskierung mittels eines Enzyms ist jedoch nicht für beide Antigene geeignet. 

Obwohl die spezifischen SERS-Signale bei der PSA-Färbung noch vorhanden sind, 

erscheint die Qualität der Färbung im Vergleich zu weiteren Methoden (s.u.) nicht 

103


ausreichend. Auch in den Arbeiten von Lutz et al. wurde diese 

Demaskierungsmethode verwendet. [34] Für die Lokalisierung von PSA wurden dabei 

mit einer Proteinhülle verkapselte Aggregate aus kleinen AgNP (composite organic– 

inorganic nanoparticles, COINs) eingesetzt. 

Abbildung 5.20: Demaskierung der Gewebeschnitte mit Enzymverdau (Proteinase K) 

und Reaktion mit SERS-markierten PSA-Antikörpern (A) bzw. SERS-markierten p63- 

Antikörpern (B). Links sind die Weißlichtbilder und rechts daneben die dazugehörigen 

SERS-Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) dargestellt. Bei 

beiden Schnitten wurde eine Laserleistung von 5 mW und eine Belichtungszeit von 0.2 

sec verwendet. 

Theoretisch sollte aufgrund der plasmonischen Kopplung (inkl. hot spots) bei COINs 

im Vergleich zu Gold/Silber-Nanoschalen eine bessere Bildqualität zustande 

kommen. 

5.2.1.2 Antigendemaskierung mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer 

Nach der Demaskierung mit Citrat-Puffer wurden die Gewebeschnitte eines 

gesunden Probanden mit dem jeweiligen Immuno-SERS-Marker für p63 oder PSA 

inkubiert (Abbildung 5.21). Bei beiden Proben wurden Gold/Silber-Nanoschalen als 

SERS-Substrat verwendet. Die Anzahl der Immuno-SERS-Marker auf dem Gewebe 

und auch alle Inkubationszeiten mit Blockierungspuffern wurden gleich eingestellt. 

Die Detektion von p63-positiven Basalzellen wäre mit einer Belichtungszeit von 0.2 

Sekunden (zwei Mal länger als bei PSA-positiven Zellen) möglich gewesen. Die 

104


Bindung der Nanopartikel, welche mit α-PSA gekoppelt waren, an das Epithelium ist 

deutlich zu sehen (Abbildung 5.21A). 

Abbildung 5.21: Die Demaskierung der Gewebeschnitte mit selbsthergestelltem Citrat- 

Puffer und die Reaktion mit α-PSA-Immuno-SERS-Markern in A, Nachweis mit α-p63- 

Immuno-SERS-Markern in B. Auf der linken Seite wurden die Weißlichtbilder und rechts 

daneben Falschfarbenbilder durch die Intensitätsverteilung der 4-TNB- Bande bei 1340 

cm -1 dargestellt. Die verwendete Laserleistung beträgt für beide Proben, 5 mW. Die 

Belichtungszeit für die Probe in A (PSA) war 0.1 Sekunden und in B 0.2 Sekunden. Für 

beiden Proben wurde die gleiche Anzahl an Immuno-SERS-NP verwendet [V= 200 µL, 

OD=0,25 und 20 Minuten Inkubationszeit (Abschnitt 4.5)]. 

Die Bindung der SERS-NP, welche mit α-PSA gekoppelt waren, an das Epithelium ist 

deutlich zu sehen (Abbildung 5.21A). Die unspezifischen Bindungen der α-PSAgebundenen 

SERS-NP an Bereiche wie Stroma oder Lumen sind kaum vorhanden. 

Die an α-p63 gekoppelten SERS-NP binden zwar spezifisch an Basalzellen, jedoch 

sind auch unspezifische Bindungen im Epithelium vorhanden. Die Bindung der α- 

p63-gekoppelten NP an Stroma ist gering und im Lumen sind keine unspezifischen 

Bindungen zu beobachten. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Demaskierung in 

Gegenwart von Citrat-Puffer besser geeignet ist als eine enzymatische Behandlung 

(Abbildung 5.20). PSA-Antigene können nach Demaskierung mit Citrat-Puffer 

deutlich besser als p63-Antigene detektiert werden. Dadurch ist davon auszugehen, 

dass die Demaskierung mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer die Detektion von PSA- 

Antigenen besser als die von p63-Antigenen ermöglicht. Wie in Abbildung 5.21 

ersichtlich, ist die Färbungsintensität bei PSA trotz kürzerer Belichtungszeit besser 

105


als bei p63.Unter besserer Qualität wird die Flächendeckung der Färbung und ein 

geringeres Ausmass an unspezifischen Bindungen verstanden. 

5.2.1.3 Antigendemaskierung mit kommerziellem Citrat-Puffer 

Bei diesem Produkt handelt es sich um einen Citrat-Puffer, welcher von der Firma 

Dako für die Demaskierung von formalinfixierten Geweben entwickelt wurde. 

Zunächst wurde das Produkt für die Qualitätskontrolle des selbsthergestellten Citrat- 

Puffers verwendet. Nach wiederholten Experimenten erwies sich der kommerzielle 

Puffer als optimales Demaskierungsmaterial für beide Antigene (PSA und p63), die in 

dieser Arbeit untersucht wurden. In Abbildung 5.22 sind Ergebnisse für zwei 

Gewebeschnitte (von gesunden Probanden), die mit kommerziellem Citrat-Puffer 

behandelt wurden, dargestellt. 

Abbildung 5.22: Demaskierung der Gewebeschnitte mit kommerziellem Citrat-Puffer und 

Antigennachweis mit α-PSA-Immuno-SERS-Markern in A, Die Reaktion mit α-p63- 

Immuno-SERS-Markern in B. Links sind Weißlichtaufnahmen, rechts sind die 

dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB- Bande um 1340 cm -1 ) 

dargestellt. Für beide Proben beträgt die verwendete Laserleistung 5 mW und die 

Belichtungszeit 0,2 Sekunden. 

Die Proben werden unter gleichen Bedingungen, mit SERS-markierten Antikörpern 

(α-PSA oder α-p63) inkubiert. In Abbildung 5.22 ist eine drastische Senkung der 

Signal-Intensität von PSA-positiven Zellen im Vergleich zum mit selbsthergestelltem 

Puffer behandeltem Gewebe zu beobachten. Um ein detektierbares SERS-Signal zu 

106


erhalten wurde die Belichtungszeit von 0,1 auf 0,2 Sekunden erhöht. Außer dem 

Intensitätsverlust konnten keine weiteren Nachteile bei Demaskierung mit 

kommerziellem Puffer, wie z. B. die Bindung der Nanopartikel an Bereiche wie 

Lumen oder Stroma festgestellt werden. Die Signal-Intensität von p63-positiven 

Zellen zeigt zwar keine Änderungen, jedoch sind die unspezifischen Bindungen 

durch die Demaskierung mit kommerziellem Puffer nicht mehr vorhanden. Bereiche 

wie Stroma, Lumen und Epithelium zeigen keine unspezifischen Bindungen. 

5.2.1.4 Antigendemaskierung mit EDTA-Tris-Puffer 

Die Verwendung des EDTA-Tris-Puffers ist eine weitere Methode zur Demaskierung 

der Antigene, die in IHC eingesetzt wird. Diese Methode wurde besonders bei 

Färbung von Cytokreatinen empfohlen. [149] 

Abbildung 5.23: Demaskierung der Gewebeschnitte mit EDTA-Tris-Puffer und 

Antigennachweis mit α-PSA-Immuno-SERS-Markern in A, Die Reaktion mit α-p63- 

Immuno-SERS-Markern in B. Links sind Weißlichtaufnahmen, rechts sind die 

dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB- Bande um 1340 

cm -1 ) dargestellt. Für beide Proben beträgt die verwendete Laserleistung 5 mW und die 

Belichtungszeit 0,2 Sekunden. 

Der Einfluss dieser Demaskierungsmethode auf die Detektion von PSA und p63 

wurde in der vorliegenden Arbeit auch in Betracht gezogen. In Abbildung 5.23 sind 

107


zwei Gewebeschnitte eines gesunden Probanden dargestellt, die mit EDTA-Tris- 

Puffer zur Demaskierung behandelt wurden. 

Die Gewebeschnitte wurden unter gleichen Bedingungen, wie in Abschnitten 5.2.1.1, 

5.2.1.2 und 5.2.1.3 beschrieben, mit SERS-markierten Antikörpern inkubiert. 

In Abbildung 5.23 rechts sind die Ergebnisse der SERS-Mikroskopie dargestellt. Die 

Bindung der SERS-NP an die PSA-positiven Zellen im Epithelium zeigt spezifische 

aber nicht flächendeckende Bindungen. Es wurden keine unspezifischen Bindungen 

im Lumen festgestellt. Im Stroma waren jedoch geringe unspezifische Bindungen 

vorhanden. Die ermittelte Signal-Intensität im Vergleich zur anderen Demaskierungsmethode 

ist bei dem PSA-Nachweis gesunken. 

Bei der Detektion von p63-Proteinen hingegen können keine unspezifischen Signale 

der α-p63-gekoppelten NP im Epithelium oder Stroma gesehen werden. Die 

ermittelte Signal-Intensität bei p63-Proteinen mit dieser Methode ist höher als mit 

allen zuvor beschriebenen Demaskierungsmethoden in dieser Arbeit. Dadurch ist 

davon aus zu gehen, dass die Demaskierung mit EDTA-Tris-Puffer die p63-Antigene 

besser als PSA-Antigene detektieren lässt. 

5.2.2 Einfluss der Blockierungsmethode 

In Abschnitt 2.4 wurden die Gründe zur Entstehung der unspezifischen Bindungen 

beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Blockierungspuffer 

(Tabelle 4.2) zur Verminderung der unspezifischen Signale getestet. 

Unspezifische Bindungen der verkapselten oder nicht verkapselten Nanopartikel sind 

mit Abstand die größten Hindernisse in der SERS-Mikroskopie gewesen. In dem 

folgenden Abschnitt werden die eingesetzten Methoden zur Lösung des Problems 

und die relevanten Ergebnisse dargestellt. 

Der Blockierungseffekt von allen gekauften Blockierungsmaterialien, (Tabelle 4.2) ist 

sehr stark und dadurch konnten keine aussagekräftigen Ergebnisse nach der 

Färbung erzielt werden. Eine Inkubationszeit, länger als 5 Minuten mit den 

kommerziellen Produkten, führte zur vollständigen Blockierung der Immuno-SERS- 

Marker. Insgesamt wurden sechs verschiedene kommerzielle Blockierungspuffer auf 

gesundem Gewebe ausgetestet und alle gekauften Blockierungslösungen lieferten 

die gleichen Ergebnisse. 

Die Abbildung 5.24 zeigt drei Gewebeschnitte des gesunden Probanden, zunächst 

mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer behandelt und anschließend mit drei 

108


verschiedenen Blockierungspuffern blockiert. Das Gewebe in Abbildung 5.24A wurde 

5 Minuten mit einem der erwähnten kommerziellen Block-Puffer behandelt. Da die 

Ergebnisse nach Blockierung mit allen kommerziellen Puffern gleich schlecht waren, 

wurde nur eine Abbildung für jedes Beispiel dargestellt, um Wiederholungen zu 

vermeiden. 

Die Probe in Abbildung 5.24B wurde 20 Minuten mit 0,2% Magermilch blockiert und 

zur Blockierung des dritten Gewebes wurde 2%ige BSA im PBST-Puffer für 20 

Minuten eingesetzt. Alle drei Proben wurden 20 Minuten mit der gleichen 

Konzentration α-PSA-gekoppelter NP (Abschnitt 4.5) inkubiert. In Abbildung 5.24A 

sind unspezifische Bindungen im Lumen und zum Teil im Stroma vorhanden. Die α- 

PSA-gebundenen SERS-NP zeigen eine schwache Bindungsaffinität im Epithelium- 

Bereich. Die Färbung zeigt keine flächendeckende Wirkung auf dem gesamten 

Epithelium und nur punktuelle Anbindungen sind vorhanden. 

In Abbildung 5.24B konnte eine niedrigere Bindungsaffinität zum Vergleich mit 5.24C 

(blockiert mit BSA) beobachtet werden. Eine gleichmäßige Anbindung der 

Nanopartikel im Epithelium wäre wünschenswert gewesen, jedoch waren kaum 

spezifische Signale im Epithelium vorhanden. Die gebundenen Immuno-SERS- 

Marker sind auf dem Epithelium, Stroma und Basalzellen gleich verteilt. Das bessere 

Ergebnis wurde nach Blockierung mit 2%igem BSA im PBST-Puffer beobachtet. 

Während diesem Experiment wurde die Belichtungszeit auf dem Gewebe auf 0,1 

Sekunden gesenkt. Trotz kürzerer Belichtungszeit bei der Probe auf Abbildung 5.24C 

kann eine bessere Färbungsqualität festgestellt werden. 

Abgesehen von den erwähnten Methoden wurden noch weitere Vorschriften zur 

Verbesserung der SERS-mikroskopischen Ergebnisse getestet. Unter anderem kann 

die modifizierte Denhardt-Lösung (Tabelle 4.2) genannt werden, die sowohl BSA als 

auch Polyvinylpyrrolidon (PVP) enthält. Diese Lösung wurde ursprünglich in der 

Molekularbiologie zur Verminderung von unspezifischen Bindungen von 

Nukleinsäuren an Nitrocellulose oder Nylon-Membranen entwickelt. 

Bei den erwähnten Modifikationen handelte es sich um die systematische 

Verminderung der Menge von PVP von 2% auf 0,01%. Im Weiteren wurde auch eine 

Kombination von BSA und Polyethylenglykol (PEG) in diversen Konzentrationen 

getestet. Die Anwesenheit der geringen Mengen von PVP (0,01%) oder PEG haben 

zur vollständigen Blockade der Bindungen von den Immuno-SERS-Markern geführt. 

109


Diese Ergebnisse wurden nicht dargestellt, sind aber denen mit den kommerziellen 

Puffern sehr ähnlich gewesen. 

Abbildung 5.24: Drei Gewebeschnitte wurden mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer 

vorbehandelt. Vor der Inkubation mit α-PSA-Immuno-SERS wurde eine Probe mit 

kommerziellem Blockierungspuffer 5 Minuten blockiert (A). Die zweite Probe wurde mit 

0,2% Magermilch für 20 Minuten blockiert (B). Die dritte Probe wurde mit 2% BSA 20 

Minuten blockiert (C). Links sind Weißlichtaufnahmen, rechts sind die dazugehörigen 

SERS-Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB- Bande um 1340 cm -1 ) dargestellt. 

Die verwendete Laserleistung und Belichtungszeit für die Proben A und B beträgt 5 mW 

und 0,2 Sekunden. Probe C wurde mit derselben Laserleistung belichtet, aber die 

Belichtungszeit war 0,1 Sekunden. 

Es ist notwendig zu erklären, dass die Hersteller der Blockierungspuffer ihre 

Produkte nicht für die Applikation der Nanopartikel entwickelt haben. Die erworbenen 

110


Ergebnisse in dieser Arbeit können die Qualität der Produkte bei der Standard- 

Immunhistochemie nicht beurteilen. 

5.2.3 Optimierung der Anzahl von SERS-Nanopartikeln 

Wie im Abschnitt 4.4 erläutert, kann die Kopplung der Antikörper auf der Oberfläche 

der Nanopartikel durch zwei Methoden, direkt durch die kovalente Kopplung (s-NHS 

Chemie) oder über das Adapterproteine (Protein A/G), erzielt werden. Bei der SERS- 

Mikroskopie sollten die notwendigen Mengen der SERS-markierten Antikörper und 

die Blockierungszeiten definiert werden. Solche Einstellungen werden auch bei 

anderen Immun-basierten Verfahren, wie z.B. ELISA, Westernblot oder Fluoreszenz- 

Immunoassay, durchgeführt. Im Gegensatz zu allen Immun-basierten Verfahren wird 

in der SERS-Mikroskopie kein sekundärer Antikörper verwendet. Daher wurde 

anstatt der Menge von dem notwendigen Antikörper die notwendige Anzahl der 

Nanopartikel ermittelt. Mit der Lambert-Beer-Gleichung kann die Anzahl der 

Nanopartikel mittels angegebener optischer Dichte und dem Volumen ermittelt 

werden. 

In Abbildung 5.25 sind drei Prostataschnitte eines gesunden Probanden mit 

verschiedenen Überschüssen an α-PSA-Immuno-SERS-Markern inkubiert. 

Bei der Abbildung 5.25A ist eine Überfärbung des Gewebes und Anbindung der 

Nanopartikel im Lumenbereich zu erkennen. In Abbildung 5.25B ist zwar keine 

Bindung der Nanopartikel im Lumenbereich sichtbar, aber es sind geringe 

unspezifische Bindungen der Nanopartikel im Stroma vorhanden. 

Die Verteilung der Nanopartikel auf dem Gewebe in Abbildung 5.25C zeigt, dass mit 

geringerer Anzahl der Nanopartikel eine bessere Färbungsqualität mit weniger 

unspezifischen Signalen erzielt werden kann. Die ermittelten Signal-Intensitäten auf 

den Geweben sind unterschiedlich. In Abbildung 5.25A, wo mehr Nanopartikel für die 

Färbung eingesetzt wurden, ist im Vergleich zu den anderen Abbildungen (Abb. 

5.25B und C) eine niedrigere Signal-Intensität vorhanden. 

Das Experiment wurde an verschiedenen Tagen wiederholt, um die 

Reproduzierbarkeit der Einstellungen zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in 

Abbildung 5.26 zusammengefasst. Bei allen Gewebeschnitten wurde der 

selbsthergestellte Citrat-Puffer für die Demaskierung verwendet. Die drei Proben 

wurden unter gleichen Bedingungen mit 2%igem BSA im PBST-Puffer vorblockiert. 

Die Laserleistung und die Belichtungszeit waren für alle Proben gleich. Auf allen 

111


Abbildungen sind geringste unspezifische Bindungen der Nanopartikel auf Lumen zu 

sehen. Abbildung 5.26A zeigt im Vergleich mit Abbildung 5.26B und C mehr 

unspezifische Bindungen im Stroma. 


vorbehandelt. Alle Proben wurden vor der Inkubation mit α-PSA-Immuno-SERS-Markern 

mit 2%igem BSA im PBST-Puffer 20 Minuten blockiert. Links sind Weißlichtaufnahmen, 

rechts sind die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB um 

1340 cm -1 ) dargestellt. Die Proben wurden ca. 20 min. mit α-PSA-gekoppelten NP 

(Gold/Silber-Nanoschalen als SERS-Substrat) inkubiert. Verwendete Nanopartikelmenge 

OD= 1 in A, OD=0,5 in B und OD=0,25 in C (V = 250 µl für alle Proben). 

Als Negativ-Kontrolle wurde BSA anstatt der Antikörper an die SERS-NP gebunden 

und auf dem Gewebe inkubiert. Die Oberfläche des Gewebes wird nach 

verschiedenen Behandlungen (Abschnitt 4.5.2) in der Pathologie, besonders beim 

Erhitzen im Demaskierungspuffer, sehr rau. Trotz intensiver Waschgänge bleiben 

112


einige Nanopartikel in den Ritzen des Gewebes gefangen. Diese gefangenen 

Nanopartikel können unspezifische Signale verursachen. 

In der vorliegenden Arbeit wurden hauptsächlich zwei verschiedene Puffer für die 

Antigendemaskierung verwendet. 


vorbehandelt. Alle Proben wurden vor Blockierung mit α-PSA-Immuno-SERS- 

Markern mit 2%igem BSA im PBST-Puffer 20 Minuten blockiert. Links sind 

Weißlichtaufnahmen, rechts sind die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder 

(Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) dargestellt. Für Raman-mikroskopischen 

Experimente bei den Proben A und B wurde das 20x-Objektiv verwendet und bei 

der Probe C wurde das 40x-Objektiv eingesetzt. Die Laserleistung für alle Proben 

betrug 5 mW und die Belichtungszeit 0,2 Sekunden. 

Der selbsthergestellte Citrat-Puffer wurde für die Einstellungen mit PSA-Protein 

eingesetzt. Der kommerzielle Citrat-Puffer wurde für die Doppel-Färbung und den 

p63-Nachweis verwendet. 

113


Für die Negativkontrolle wurden vier Gewebeschnitte in zwei Gruppen mit den 

genannten Demaskierungspuffern vorbehandelt. Das heißt zwei Gewebeschnitte 

wurden mit der optimalen Demaskierungsmethode für PSA (Abbildung 5.27A und B) 

und zwei andere mit der optimalen Methode für p63 (Abbildung 5.27C und D) 

vorbereitet. Alle Gewebeschnitte wurden mit 2%igem BSA im PBST-Puffer vor 

Zugabe von BSA-gebundenen SERS-Markern inkubiert. 

Abbildung 5.27: Zwei von vier Gewebeschnitten wurden mit selbsthergestelltem 

Citrat-Puffer (A und B) und zwei weiteren mit kommerziellem Citrat-Puffer 

vorbehandelt (C und D). Alle Proben wurden vor der Blockierung mit an BSA 

gebundenen SERS-NP mit 2%igem BSA im PBST-Puffer 20 Minuten vorblockiert. 

Links sind die Weißlichtaufnahmen, rechts sind die dazugehörigen SERS- 

Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) dargestellt. 

114


Die Gewebeschnitte wurden unter gleichen Bedingungen mit an BSA gebundenen 

SERS-Markern inkubiert. Nach den Waschgängen wurde die SERS-Mikroskopie 

durchgeführt. Anhand der Ergebnisse ist ersichtlich, dass geringe unspezifische 

Bindungen bei der negativen Kontrolle vorhanden sind. 

Dieses Experiment wurde mehr als zwanzigmal während der Einstellungen 

wiederholt. Das Ausmaß der unspezifischen Bindungen von BSA-gekoppelten 

SERS-NP konnte mit der Blockierung und den Waschgängen sehr gut kontrolliert 

werden. 

5.2.4 SERS-Mikroskopie mit glasverkapselten Gold/Silber-Nanoschalen 

Als Alternative zur kovalenten Kopplung der Antikörper auf die Nanopartikel wurde 

die Bindung zwischen Antikörpern und Nanopartikeln über Adapter-Proteine in der 

Arbeitsgruppe Schlücker im Jahre 2010 etabliert (Abschnitt 4.4.2). [193] 

In Abbildung 5.28 sind drei verschiedene Prostataschnitte dargestellt, die zur 

Detektion der PSA und p63-Proteine mit glasverkapselten Gold/Silber-Nanoschalen 

mit den entsprechenden Immuno-SERS-Markern behandelt wurden. 

Zunächst wurde die Oberfläche der Nanopartikel mit Protein A/G-Molekülen 

beschichtet. Die Bindung der Immunoglobulin-Moleküle kommt durch die Affinität des 

Protein A/G mit der Fc-Domäne der Immunoglobulin-Moleküle zustande. 

Die optimalen Demaskierungsmethoden für die jeweiligen Proteine (PSA oder p63) 

wurden gesondert durchgeführt. Für eine genaue Gegenüberstellung wurden alle 

Proben in Abbildung 5.28 unter gleichen Bedingungen, wie Blockierungspuffer, 

Anzahl der Nanopartikel, Laserleistung und Belichtungszeit, bearbeitet. 

In den Abbildungen 5.28A und B sind die Anbindungen von glasverkapselten 

Gold/Silber-Nanoschalen an die Zielproteine p63 und PSA dargestellt. Die 

verwendeten Nanopartikel für beide Experimente wurden mit 4-TNB markiert. 

Die verkapselten Gold/Silber-Nanoschalen in diesem Experiment liefern im Vergleich 

zu nicht verkapselten weniger SERS-Signal (Abbildungen 5.21 und 5.22). 

Nicht nur die Signal-Intensität, auch die Senkungen der unspezifischen Bindungen 

der Nanopartikel sind im Vergleich mit nicht verkapselten Nanopartikeln zu 

beobachten. Geeignet dafür ist der Nachweis von p63 Proteinen mit 4-TNB- und 

SEMA4 markierten und mit glasverkapselten Gold/Silber-Nanoschalen in Abbildung 

5.28A und C. In Abbildung 5.28C konnten keine unspezifischen Bindungen in 

Bereichen wie Lumen, Epithelium oder Stroma beobachtet werden. 

115


Der Grund für ein intensiveres SERS-Signal bei den nicht verkapselten 

Nanopartikeln, die mit niedrigerer Laserleistung (5 mW) belichtet wurden, kann 

eventuell eine höhere elektromagnetische Verstärkung durch plasmonische 

Kopplung der auf dem Gewebe immobilisierten SERS-NP sein. Bei diesen 

Nanopartikeln fehlt die Glasbeschichtung als Isolator. 

Kommen die Nanopartikel in die räumliche Nähe, können hot spots gebildet 

werden. [192] Inwiefern die Glasbeschichtung als Isolator gegen die Bildung der hot 

spots wirkt und die Signalverstärkung dadurch verhindert wird, wurde in dieser Arbeit 

nicht untersucht. Die durchgeführten Experimente belegen jedoch, dass die 

verkapselten Gold/Silber-Nanoschalen im Vergleich zu nicht verkapselten weniger 

Signale liefern. 

Abbildung 5.28: SERS-Mikroskopie auf Prostataschnitten des gesunden Probanden. 

Links sind Weißlichtaufnahmen, rechts sind die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder 

dargestellt. Zum Nachweis von p63 (A) und PSA (B) wurde glasverkapselten 4-TNB- 

SERS-NP eingesetzt. Zur Markierung der p63-positiven Basalzellen wurden 

glasverkapselten SEMA4-SERS-NP (Markerbande um 2210 cm -1 ) verwendet (C). Die 

Laserleistung und die Belichtungszeit wurden auf 8 mW und 0,1 eingestellt. 

116



Die Arbeitsgruppe Schlücker versucht durch Verbesserung und Entwicklung neuer 

SERS-Substrate ein schnelles und zuverlässiges Verfahren für die Krebs-Diagnostik 

zu etablieren. Neben der Herstellung der SERS-Substrate wurde die Biokompatibilität 

der Immuno-SERS-Marker in dieser Arbeit verbessert (Abschnitt 5.1.5). Die 

erfolgreiche Biofunktionalisierung hängt stark von Faktoren wie dem verwendeten 

Cross-Linker (s-NHS/EDC in diesem Fall) und die Reinheit der Ramanreporter- 

Moleküle bzw. Abstandhalter (Moleküle mit Carobxylgruppe) ab. Abgesehen von der 

Biokompatibilität der antikörpergekoppelten Nanopartikel wurden in diesem Abschnitt 

zur Verbesserung der Qualität der SERS-Mikroskopie verschiedene Blockierungsund 

Antigendemaskierungsmethoden mit einer unterschiedlichen Anzahl an 

Nanopartikeln getestet. 

Um den Einfluss der Faktoren wie Antigendemaskierungsmethode, Anzahl der 

Nanopartikel, Blockierungspuffer, Inkubationszeit und Verdünnungspuffer zu 

untersuchen, wurden 600 Messungen innerhalb von 120 Tagen durchgeführt. 

Nach wiederholten Experimenten erwies sich der kommerzielle Puffer als optimales 

Demaskierungsmaterial für die beiden Antigene PSA und p63 (besonders optimal für 

p63). Es konnte gezeigt werden, wie wichtig die Rolle der geeigneten Blockierungslösungen, 

z. B. verwendetes BSA im PBST-Puffer, für die Funktion der SERSmarkierten 

Antikörper ist. Weiterhin wurde demonstriert, dass der Einsatz von nicht 

geeigneten Blockierungslösungen zur Verhinderung der Bindung von Immuno- 

SERS-Markern an das Gewebe führen kann. Es konnte auch nachgewiesen werden, 

dass die Detektion der Proteine bei der SERS-Mikroskopie, von der optimalen Anzahl 

von Immuno-SERS-Markern abhängig ist. In der Standard-IHC kann auch die 

optimale Färbungsqualität durch bestimmte Verdünnungen von Antikörpern erreicht 

werden. 

Am Ende wurde die spezifische Bindung des Antikörpers an glasverkapselten SERS- 

NP über das Protein A/G untersucht. Experimentell wurde demonstriert, dass mit 

glasverkapselten Gold/Silber-Nanoschalen markierte Antikörper spezifisch an deren 

Zielproteine binden können und dabei weniger unspezifische Bindungen im Vergleich 

zu nicht verkapselten NP entstehen (Abbildung 5.28C). [193] Die SERS-Intensität der 

auf dem Gewebe gebundenen glasverkapselten Gold/Silber-Nanoschalen war 

niedriger als bei nicht verkapselten Gold/Silber-Nanoschalen. 

117


Die durchgeführten Untersuchungen in diesem Abschnitt könnten zwar eine deutliche 

Verbesserung der Bildgebung mittels SERS-Mikroskopie hervorrufen, aber die 

Methode ist vom kommerziellen Einsatz in der Biomedizin weit entfernt. Die Größe 

bzw. das Gewicht der Nanopartikel im Verhältnis zu viel kleineren und leichteren 

Immunoglobulinmolekülen ist ein großes Hindernis, das oft zu unspezifischen 

Bindungen führen kann. Die Entwicklung von kleineren bzw. leichteren Nanopartikeln 

kann der Methode eventuell eine bessere Reproduzierbarkeit verleihen. 

118


5.3 Lokalisierung von p63 mittels SERS-Mikroskopie 

In der Einleitung wurde die wichtige Rolle von p63-Proteinen bei der Diagnostik von 

Prostatakrebs erklärt. Deshalb wurde für weitere Experimente versucht, die optimale 

Demaskierungsmethode zur Lokalisierung dieses Proteins (p63) zu finden. In diesem 

Abschnitt wurden unterschiedliche SERS-Substrate, wie Gold/Silber-Nanoschale, 

Gold-Nanosterne und Goldnanopartikel-Cluster für die Detektion des p63-Proteins 

erprobt. Dadurch wird die SERS-Mikroskopie für die Detektion des p63-Proteins als 

zweitem Zielprotein nach PSA validiert. 

5.3.1 Lokalisierung von p63 mit Gold/Silber-Nanoschalen 

Ein weiterer Faktor, der bei der SERS-Mikroskopie und besonders für die p63- 

Detektion sehr wichtig ist, ist die Dauer der Inkubation des Gewebes mit 

Nanopartikeln. Die Gold/Silber-Nanoschalen werden in Abbildungen mit Au@Ag 

abgekürzt. 

In Abbildung 5.29 wurde der Einfluss der Inkubationszeiten bei gleichem Volumen 

und gleicher Anzahl Immun-SERS-Marker dargestellt. Die drei Gewebeschnitte 

wurden unter gleichen Bedingungen mit α-p63-gebundenen SERS-NP inkubiert. Als 

Inkubationszeiten wurden für die Probe 5.29A, 40 Minuten, für die Probe 5.29B, 30 

Minuten und für die Probe 5.29C, 20 Minuten gewählt. Die optimale Färbung für p63 

in den Basalzellen kann in Abbildung 5.29B und C deutlich erkannt werden. 

Bei längerer Inkubation, wie z. B. 40 Minuten (Abbildung 5.29A), kann eine Bindung 

der Nanopartikel an das Epithelium beobachtet werden. In der Standard-IHC werden 

solche Anbindungen, die durch Verlängerungen der Inkubationszeiten von 

Antikörpern zustande kommen, Überfärbung oder Hintergrundfärbung genannt 

(Abschnitt 2.4). Die optimale Bildgebung von p63 wurde in Abbildung 5.29C 

dargestellt. In dieser Abbildung wurde das Gewebe nur 20 Minuten mit SERSmarkierten 

Antikörpern inkubiert, was zur begrenzten Anbindung der Nanopartikel an 

die Basalzellen führte. Im Stroma und Epithel können keine SERS-Signale detektiert 

werden. Wie in Abbildung 5.29C gezeigt wurde, ist das Stroma nicht von 

unspezifischen Bindungen betroffen. In Abbildung 5.29B wurde das Gewebe 30 

Minuten mit Immuno-SERS-Markern inkubiert. Die wachsenden Anbindungen an das 

Epithelium sind deutlich zu sehen. 

119


Aus diesen Informationen lässt sich schließen, dass bei der SERS-Mikroskopie auch 

wie bei der Standard-IHC die Inkubationszeiten eine sehr wichtige Rolle spielen. 

Bei Überschreitung der optimalen Inkubationszeiten in beiden Verfahren kann eine 

Überfärbung zustande kommen. 

Abbildung 5.29: Drei Gewebeschnitte wurden mit kommerziellem Citrat-Puffer 

vorbehandelt. Alle Proben wurden vor der Inkubation mit α-p63-gebundenen SERS- 

Markern 20 Minuten mit 2%iger BSA-Lösung (im PBST) blockiert. Links sind die 

Weißlichtbilder und rechts daneben die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder 

(Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) dargestellt. Die Proben wurden der Reihe nach 

ca. 40 min (A), 30 min. (B) und 20 min. (C) mit α-p63 Immuno-SERS-Markern Inkubiert. 

Für alle Proben wurden 250 µl einer Nanopartikel-Suspension (Au@Ag) mit einer 

optischen Dichte von 0,25 eingesetzt. 

Im Vergleich zu glasverkapselten Nanopartikeln existiert bei diesem SERS-Substrat 

(Gold/Silber-Nanoschalen) keine Isolierungsschicht. Während der Anbindung solcher 

Nanopartikel auf dem Gewebe kann die Bildung von hot spots gefördert werden. Die 

120


Bildung von Aggregaten (hot spots) führt zur Verstärkung der SERS-Signale. Dies ist 

prinzipiell wünschenswert, aber nur wenn die Bindung der Antikörper-SERS-NP- 

Konjugate tatsächlich auch spezifisch ist. Da das Ausmaß der Aggregation zudem 

nicht kontrolliert werden kann, ist eine Quantifizierung der SERS-Signale in diesem 

Fall schwierig bis unmöglich. 

Um die Reproduzierbarkeit der SERS-Mikroskopie zu ermitteln wurden drei weitere 

Ergebnisse der Bildgebung an verschiedenen Tagen in Abbildung 5.30 dargestellt. 

Abbildung 5.30: Drei Gewebeschnitte wurden mit kommerziellem Citrat-Puffer 

vorbehandelt. Alle Proben wurden vor der Inkubation mit α-p63-gebundenen SERS- 

Markern 20 Minuten mit 2%iger BSA-Lösung (im PBST) blockiert. Links sind die 

Weißlichtbilder und rechts daneben die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder 

(Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) dargestellt. Für Probe A wurde ein 10x 

Objektiv verwendet, für die Proben B und C ein 20x Objektiv. Für Experimente bei in B 

und C wurde ein 20x Objektive verwendet. Für alle Proben wurden 250µl einer 

Nanopartikel-Suspension (Au@Ag) mit einer optischen Dichte von 0,25 eingesetzt. 

(Laserleistung= 5 mW). 

121


In allen Abbildungen sind die spezifischen Bindungen der Nanopartikel an die 

Basalzellen deutlich zu sehen. Die Nanopartikel zeigen keine Neigung zur Bindung 

an andere Bereiche wie Lumen oder Stroma. In den Abbildungen 5.30A, B und C 

(besonders in Abbildung 5.30A) sind Signale im Epithelium vorhanden. Diese Signale 

sind auf die Fluoreszenz-Beiträge, die während des Mapping mit wenig stark 

vergrößernden Objektiven (10x und 20x) beobachtet wurden, zurückzuführen. Diese 

Begleiterscheinungen wurden während der Experimente mit dem 40x Objektiv nicht 

beobachtet. In Abbildung 5.31 sind beispielhaft ein SERS-Mikroskopie-Aufnahmen 

mit einem 40x Objektiv erhalten wurde, dargestellt. [37] 

Abbildung 5.31: SERS-Mikroskopie mit α-p63-gekoppelten SERS-NP. Links 

ist das Weißlichtbild (A) und rechts daneben das dazugehörigen SERS- 

Falschfarbenbild (Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) dargestellt (B). [37] 

5.3.2 Lokalisierung von p63 mittels SE-CARS-Mikroskopie und Gold/Silber- 

Nanoschalen 

Nach erfolgreicher Lokalisierung von p63 in Basalzellen von Prostatagewebe mit 

SERS-markierten Antikörpern (Au@Ag als SERS-Substrat) wurde diese 

Untersuchung mit kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung (engl. Coherent Anti- 

Stokes Raman Scattering, CARS) in einer Zusammenarbeit mit dem IPHT Jena 

wiederholt. [195] 

Zur Lokalisierung der p63-positiven Basalzellen wurden in diesem Experiment 

hydrophil stabilisierte Au@Ag als SERS-Substrate durch s-NHS-Chemie kovalent an 

α-p63-Antikörper gebunden. Der gebildete Immuno-SERS-Marker wurde für die 

Markierung der Basalzellen auf einem Prostatagewebeschnitt eines gesunden 

122


Probanden inkubiert. Die durch die CARS-Methode detektierten Signale der 

Nanopartikel sind in roter Farbe in Abbildung 5.32 dargestellt. Wie in Abbildung 5.32 

ersichtlich ist, sind die Bindungen nur im Basalbereich vorhanden und nicht im 

Epithelium, Stroma oder im Lumen. Ein Vorteil der CARS-Mikroskopie ist ihre 

Geschwindigkeit, so dass große Flächen in kurzer Zeit mikroskopisch erfasst werden 

können. 

Abbildung 5.32: Lokalisierung von p63 in den Basalzellen mittels SE-CARS. In A 

ist das Weißlichtbild dargestellt. Die Signale der gebundenen SERS-Nanopartikel 

auf dem Gewebe sind mit roter Farbe in Falschfarbenbild (B) überlagert. Mit 

herzlichem Dank an G. Bergner für die Durchführung von CARS-Experimenten. [195] 

Mit den erworbenen Ergebnissen der CARS-Mikroskopie konnte eine bessere 

Übersichtsaufnahme erstellt werden, in der die gebundenen Nanopartikel in fünf 

Drüsen sichtbar wären. Abgesehen von der sehr großflächigen Bildgebung ist dieses 

Ergebnis ein Nachweis der erfolgreichen Bindung von Nanopartikeln auf dem 

Gewebe durch die Methode der SERS-Mikroskopie. Denn bis auf die Beleuchtung 

und Erfassung der Nanopartikel sind bei der Methode der SE-CARS-Mikroskopie alle 

weiteren Schritte, wie Biofunktionalisierung des SERS-Substrats und die Inkubation 

auf dem Gewebe, gleich. 

5.3.3 Lokalisierung von p63 mit Gold-Nanosternen 

Die erwünschte in situ-Anwendung in der Biomedizin, wie z.B. die Laser-Anregung im 

Nah-Infrarot-Bereich des elektromagnetischen Spektrums, kann auch mit 

Nanosternen erfolgen. Wie im Abschnitt 2.2 beschrieben, wird an den Spitzen der 

123


Nanosterne ein enormes elektrisches Feld gebildet, das zur Erzeugung hoher SERS- 

Signale führen kann. Bei längerer Belichtungszeit konnten Nanosterne als 

Einzelpartikel mittels SERS detektiert werden. Die Herstellung der Nanosterne als 

SERS-Substrat ist, wie die Herstellung von Au@Ag, leicht zu handhaben. Die 

hergestellten Nanosterne wurden durch Zugabe von gemischten Raman-Markern (4- 

TNB-MEGOH und 4-TNB-TEGOH, 99:1) hydrophil stabilisiert. Die ausgebildeten 

Dual-Spacer-SAMs wurden, wie in Abschnitt 4.4.1 beschrieben, biofunktionalisiert 

und kovalent über s-NHS-Chemie an α-p63 gebunden. Nach 20 minütiger 

Inkubationszeit des Gewebes mit Immuno-SERS-Markern wurde die SERS- 

Mikroskopie durchgeführt. In Abbildung 5.33 sind die mit drei verschiedenen 

Gewebeschnitten nach der gleichen Behandlung mit Immuno-SERS-Markern 

erhaltenen Ergebnisse dargestellt. 

Abbildung 5.33: Drei Gewebeschnitte wurden mit kommerziellem Citrat-Puffer vorbehandelt 

Alle Proben wurden vor der Inkubation mit α-p63-gebundenen SERS-NP 20 Minuten mit 

2%iger BSA-Lösung (im PBST) blockiert. Links sind die Weißlichtbilder und rechts daneben 

die dazugehörigen SERS-Falschfarbbilder (Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 ) 

dargestellt. Für alle Proben wurden 250µl einer Suspension von Gold-Nanosternen mit einer 

optischen Dichte von 0,25 eingesetzt (Laserleistung = 5 mW). 

Die Ergebnisse zeigen, dass die Nanosterne sehr spezifisch an die Basalzellen 

gebunden sind. Im Stroma und Epithelium sind kaum unspezifische Bindungen 

124


vorhanden. Die Bildgebung durch Nanosterne auf dem Gewebe ist ähnlich wie bei 

Au@Ag nur in Kombination mit dem Ramanreporter 4-TNB möglich gewesen. 

Mehrfache Versuchswiederholungen mit 4-MBA führten zur keiner erfolgreichen 

Bildgebung auf dem Gewebe. Abbildung 5.33 zeigt, dass die Nanosterne auch als 

geeignetes SERS-Substrat erfolgreich verwendet werden können. Der Einsatz von 

Nanosternen bei der SERS-Mikroskopie wurde 2011 erstmals publiziert (Abbildung 

5.33A). [178] Die ermittelte Signal-Intensität auf dem Gewebe mittels Nanosternen 

erscheint niedriger als die mittels Au@Ag erhaltenen Signal-Intensitäten. Diese 

Tatsache ist jedoch auf die Belichtungsdauer zurückzuführen. Die oben genannten 

Experimente mit Gold-Nanosternen wurden mit einer Belichtungszeit von 0,1 

Sekunden durchgeführt. 

5.3.4 Lokalisierung von p63 mit glasverkapselten Goldnanopartikel-Clustern 

Um den gebildeten SAMs mehr Schutz und Haltbarkeit zu verleihen wurden die 

Nanopartikel mit einer Silicahülle versehen. Bei bisher etablierten Immunoassays- 

Vorschriften handelte es sich um die Kopplung der Antikörper auf Glasoberflächen 

und nicht um glasverkapselte Nanopartikel. Eine Übernahme dieser Vorschriften und 

der daraus resultierenden direkten Kopplung der Antikörper auf die Oberfläche der 

glasverkapselten Nanopartikel führte häufig zur schweren Aggregation der 

glasverkapselten Nanopartikel. 

Die Zugabe eines Überschusses von Proteinen bzw. Antikörpern zu sNHSaktivierten 

glasverkapselten Nanopartikel kann zur Verhinderung dieser 

Aggregationen führen. Dieses Vorgehen hat aber den Nachteil, dass die Kosten der 

Materialien, insbesondere der Antikörper, sehr hoch ist. Daneben sind 

glasverkapselte Nanopartikel negativ geladen und diese Ladung kann zur Bildung 

von nicht stabilen Antikörper-Polyschichten auf der Oberfläche der NP führen. 

Diese Polyschichten, die durch Ladung an die Nanopartikel gebunden sind, können 

in biologischem Puffer wie PBS unter Einfluss der Ionen während der Inkubation, z.B. 

auf dem Gewebe, desorbiert werden. Abgelöste Antikörper sind in der Lage schneller 

an Antigene zu binden. Dadurch werden die Bindestellen für Immuno-SERS-Marker 

besetzt und der Immuno-SERS-Marker kann nicht mehr an den entsprechenden 

Bindestellen haften. Um solche Hindernisse zu bewältigen wurde im Rahmen dieser 

Arbeit zum für die Kopplung der Antikörper an die Oberfläche der SERS-aktiven 

Nanopartikel ein rekombinantes Protein A/G (PrA/G) als Adapter verwendet. 

125


Das rekombinante Protein A/G hat sechs Bindestellen für Fc-Domänen von 

Immunoglobulin. Die Bindung des Proteins auf C4-verlängerte Nanopartikel wurde 

mittels s-NHS Chemie (Abschnitt 4.4.2) durchgeführt. Das Protein wurde im 

Überschuss zu den Nanopartikeln pipettiert. Um eine instabile Bildung von 

Polyschichten zu verhindern, wurde während der Kopplung des Proteins mit den 

Nanopartikeln genügend Glutaraldehyd (GA) in Lösung zugeführt. GA führt zu einer 

kovalenten Quervernetzung der Proteine und verhindert damit eine spätere Ablösung 

vom Protein A/G. 

Des Weiteren konnten die Immunoglobuline durch Verwendung des Proteins A/G in 

einer optimalen Ausrichtung auf die Oberfläche der Nanopartikel gebunden werden. 

In Schema 5.2 sind die Unterschiede zwischen der direkten Kopplung der Antikörper 

auf die Oberfläche (A) und der Kopplung über das Protein A/G (B)dargestellt. 

Schema 5.2: (A) Kopplung von IgG mittels sNHS-Chemie und zufällige Bindung der 

IgG über freie Aminogruppen an die Nanopartikel. (B) Kopplung der Fc-Domäne 

von IgG an Pr A/G (blaue Struktur im Schema 2 B) beschichtete NP. 

Eine direkte Kopplung von IgG an die Nanopartikel mittels s-NHS-Chemie hat eine 

zufällige und nicht einheitliche Ausrichtung der Antikörper auf der Oberfläche der 

Nanopartikel zur Folge. Die Effizienz der SERS-markierten Antikörper sinkt dadurch, 

weil die Erkennungsstelle der Antikörper (FAB) blockiert ist. Im Gegensatz dazu 

verleiht die Kopplung der Antikörper über das Protein A/G eine optimale Orientierung 

der Antikörpermoleküle auf der Nanopartikeloberfläche. Die Oberfläche der 

Nanopartikel ist mit Protein A/G beschichtet und das Protein hat eine große 

Bindeaffinität an die Fc-Domäne der Antikörper. 

Zur Lokalisation p63-positiver Basalzellen wurde nur die Inkubationszeit der Immuno- 

Cluster auf dem Gewebe eingestellt. Die Trennung der glasverkapselten Gold- 

126


Nanopartikelcluster wurde in Abschnitt 4.3 beschrieben. Alle weiteren Einstellungen, 

wie die Antigendemaskierungsmethode und der Blockierungspuffer, wurden aus 

Abschnitt 5.2 übernommen. In Abbildung 5.34 wurden vier Gewebeschnitte eines 

gesunden Probanden mit α-p63-gebundenen Clustern behandelt. 

Abbildung 5.34: Lokalisierung von p63-positiven Basalzellen mit Hilfe von 

glasverkapselten und PrA/G beschichteten Goldnanopartikel-Clustern. Weißlichtbilder 

sind in A,B,C und D (oben) dargestellt. In A,B,C und D (unten) wurden die 

dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder als Intensitätsverteilung der BMBA um ca. 

1580 cm −1 dargestellt. Das Gewebe wurde unterschiedlich lang [8 min. (A), 10 min. (B), 

12 min. (C) und 15 min. (D)] mit den glasverkapselten SERS-Clustern inkubiert. Bei allen 

Messungen betrug die Laserleistung 8 mW und die Belichtungszeit 20 Millisekunden. Die 

Gewebeproben wurden mit der gleichen Anzahl von Clustern inkubiert (250µl, OD 0,2). 

Die Aminofunktionalisierung, die C4-Verlängerung und auch die kovalente Kopplung 

von PrA/G wurden wie in Abschnitt 4.4.2 beschrieben durchgeführt. Die 

Inkubationszeiten während der Blockierung wurden unterschiedlich gewählt. Die 

Inkubationszeiten betrugen: 8 min. (5.34A), 10 min. (5.34B), 12 min. (5.34C) und 15 

min (5.34D). In allen überlagerten Bildern ist ersichtlich, dass die Bindung der 

Nanopartikel an den Basalbereich erfolgreich war. Die Verteilung der p63-positiven 

Zellen in den Abbildungen 5.34A, B und C sollte symmetrisch sein, weil die 

untersuchte Gewebefläche zwei Reihen Basalzellen besitzt und das Stroma in der 

Mitte liegt. Die symmetrische Verteilung der Signale ist in Abbildung 5.34C, welche 

länger als andere Proben (5.34A und 5.34B) mit Nanopartikeln inkubiert wurde, 

deutlicher zu sehen. Die Probe bei 5.34D wurde 15 Minuten mit Immuno-SERS-NP- 

Konjugaten inkubiert. Im Falschfarbenbild kann man mehr unspezifische Signale im 

127


Vergleich zu den anderen (34A, B und 34C) feststellen. Das Stroma zeigt zwar keine 

unspezifischen Bindungen, aber im Epithelbereich sind gewisse unspezifische 

Bindungen vorhanden. Bei Wiederholungen wurden während der Inkubationszeiten, 

die länger als 12 Minuten dauerten, permanent mehr unspezifische Bindungen im 

Epithelium beobachtet. In Abbildung 5.35A wurde eine längere Belichtungszeit von 

30 Millisekunden in Kombination mit niedrigerer Laserleistung (5 mW) verwendet. Die 

Intensität der SERS-Signale nimmt wegen einer Verlängerung von 10 Millisekunden 

und trotz 3 mW weniger Laserleistung genügend zu, um eine gute Färbungsqualität 

zu ermöglichen. 

Abbildung 5.35: Lokalisierung von p63-positiven Basalzellen des gesunden 

Prostatagewebes mittels glasverkapselter und an α-p63 gebundener Goldnanopartikel- 

Cluster. Darstellung des überlagerten SERS-Falschfarbenbildes des Prostatagewebes 

in Abbildung A. Darstellung der ermittelten SERS-Intensitätsverteilung der BMBA- 

Markerbande bei 1580 cm -1 auf dem Gewebeschnitt in Abbildung B. Das Spektrum der 

an Basalzellen gebundenen SERS-Marker wurde in roter Farbe dargestellt (B). Die 

Spektren von weiteren Bereichen wurden wie Epithelium (E) in grüner, Lumen in blauer 

und Stroma in oranger Farbe dargestellt. 

Das Gewebe wurde mit der gleichen Inkubationszeit (12 Min.), wie die Probe in 

Abbildung 5.34C mit α-p63-Immuno-Clustern inkubiert. Trotz einer Verminderung der 

Laserleistung von 8 auf 5 mW ist eine Verbesserung bei der Bildgebung sichtbar. 

Das zeigt, dass die Belichtungszeit eine wichtigere Rolle als die Laserleistung in der 

SERS-Mikroskopie spielen kann. In Abbildung 5.35B sind Spektren aus 

Basalbereich, Epithelium, Stroma und Lumen gegenüber gestellt. Wie ersichtlich, 

sind die SERS-Signale nur im Bereich der Basalzellen vorhanden. Anhand der 

Ergebnisse in den Abbildungen 5.34 und 5.35 kann man davon ausgehen, dass die 

Qualität der Bildgebung während des Einsatzes von Clustern als SERS-Substrat von 

128


zwei Faktoren abhängt. Einer ist die Blockierungszeit der Nanopartikeln auf dem 

Gewebe und der andere ist die Belichtungszeit mit dem Laser, die nicht kürzer als 30 

Millisekunden betragen sollte. 


Die Lokalisierung bzw. die Detektion des p63-Proteins bei Prostatakrebs ist 

besonders wichtig, weil dieses Protein im Fall von Prostatakrebs weniger oder gar 

nicht mehr exprimiert wird. Deshalb wurde die optimale Gewebedemaskierung zu 

Gunsten der Detektion dieses Proteins ausgewählt. Es wurden verschiedene SERS- 

Substrate, wie Gold/Silber-Nanoschalen, Goldnanosterne und Gold-Nanocluster für 

die Lokalisierung der p63-positiven Basalzellen auf gesundem Prostataschnitten 

getestet. Es wurde gezeigt, dass bei der SERS-Mikroskopie und Lokalisierung von 

p63-Proteinen, die Inkubationszeit von Immuno-SERS-Markern nach der Antigendemaskierungsmethode 

eine bedeutende Rolle spielen kann. 

Die unspezifischen Bindungen kommen wahrscheinlich wegen längerer 

Inkubationszeiten des Gewebes mit Immuno-SERS-Markern zustande. Die Bildung 

von unspezifischen Bindungen konnte besser beim Einsatz der ultrasensitiven 

Nanocluster während längerer Inkubationszeit als 12 min. beobachtet werden. 

Während die optimale Inkubationszeit bei Immuno-Clustern ca. 12 Minuten beträgt, 

konnte mit weniger als 20 Minuten Inkubationszeit bei Gold/Silber-Nanoschalen und 

Nanosternen keine Detektion von p63-Proteinen erzielt werden. Dazu muss die 

zufällige Kopplung von Immunoglobulin an die Nanopartikel als mögliche Ursache für 

unspezifische Bindungen genannt werden. Im Abschnitt 5.2.4 und in den 

Abbildungen 5.28A, B und C, in denen das Protein A/G verwendet wurde, konnten 

geringste unspezifische Bindungen beobachtet werden. Für weniger unspezifische 

Bindungen im Vergleich zu nicht verkapselten Gold/Silber-Nanoschalen wurde der 

Verlust der SERS-Intensität in Kauf genommen. Das deutet auf die eventuelle 

Bildung von hot spots bei nicht verkapselten Nanopartikeln hin. 

Zusätzlich wurden bei der Lokalisierung der p63-positiven Basalzellen mittels 

Nanocluster in den Abbildungen 5.34 und 5.35 gezeigt, dass die Nanocluster als 

neue Marker in der IHC erfolgreich eingesetzt werden können. Dadurch wurden auch 

die vorherigen Ergebnisse im Abschnitt 5.2.4 (Abbildung 5.28) bestätigt. In Abbildung 

5.34 konnte die Lokalisierung der Basalzellen innerhalb von 20 Millisekunden 

Belichtungszeit pro Pixel gezeigt werden. Unter denselben Voraussetzungen konnte 

129


eine bessere Qualität der Färbung innerhalb von 30 Millisekunden in Abbildung 5.35 

präsentiert werden. Während die Laserleistung bei Abbildung 5.34, 8 mW betrug 

wurde in Abbildung 5.35 mit 5 mW Laserleistung gearbeitet. Das zeigt, dass neben 

den Blockierungsmethoden und den Antigendemaskierungsmethoden, die 

Laserleistung und noch wichtiger die Belichtungszeit eine große Rolle bei der 

Detektion von Proteinen mittels SERS-Mikroskopie spielen. 

Die Detektion des p63-Proteins war unter optimalen Bedingungen, wie Belichtung 

und Inkubationszeit und Antigendemaskierungsmethode mit allen verwendeten 

SERS-Substraten erfolgreich. Im Abschnitt 5.2.5 wurde erwähnt, dass die 

Reproduzierbarkeit der Experimente von Faktoren wie dem verwendeten Cross- 

Linker (s-NHS/EDC in diesem Fall) und der Reinheit der Ramanreporter-Moleküle 

bzw. Abstandhälter abhängt. Die Stabilität der Glasverkapslung während und nach 

der Biofunktionalisierung ist ein enscheidender Faktor für die erfolgreiche SERS- 

Mikroskopie. Beim Verlust dieser Schale gehen auch die daran gebundenen 

Antikörpermoleküle verloren. Dieses Problem konnte mit der Hitzebehandlung oder 

zweiwöchigen Lagerung der glasverkapselten Nanopartikel im Ethanol zum Teil 

behoben werden. Über die Bindungsaffinität des Proteins A/G liegen zurzeit keine 

Informationen vor. Ob eine bessere Qualität der SERS-Mikroskopie mit weiteren 

Adapterproteine, wie z. B. Protein A oder Protein G erzielt werden kann, ist zurzeit 

unklar. Die beste Erfahrung und Reproduzierbarkeit wurde allerdings bei 

Nanosternen, die kleiner und leichter als andere SERS-Substrate sind, beobachtet. 

Die SERS-Mikroskopie-Experimente mit Nanosternen könnte durch weitere 

Operateur unabhängig erfolgreich reproduziert und veröffentlicht werden (Abbildung 

5.33A). [178] 

Mittels SE-CARS wurden die spezifischen Bindungen von Gold/Silber-Nanoschalen 

an Zielproteine auf größerer Fläche an verschiedenen Tagen und in einem anderen 

Labor demonstriert. [195] Erfahrungsgemäß sind die Färbungsqualität und die erzielte 

Reproduzierbarkeit mittels Nanosternen und Gold/Silber-Nanoschalen im Vergleich 

zu Goldclustern besser. Da die Unterschiede zwischen den SERS-Substraten mehr 

in Größe und Gewicht der Substrate liegen, kann zur Erhöhung der 

Reproduzierbarkeit der Versuche eventuell die Entwicklung von neuen und 

leichteren SERS-NP hilfreich sein. 

130


5.4 Zwei-Farben-SERS-Bildgebung 

5.4.1 Zwei-Farben-SERS-Bildgebung mit hydrophil stabilisierten SERS- 

Partikeln 

Nachdem die einzelnen Lokalisierungen der Proteine PSA und p63 erfolgreich 

waren, wurde als erster Schritt in Richtung Multiplexing eine simultane Detektion von 

p63 und PSA erprobt. Dazu wurden zwei verschiedene Kombinationen von Immuno- 

SERS-Konjugaten verwendet. Zum einen wurde 4-TNB auf hydrophil stabilisierten 

SERS-Marker-Partikeln (Au@Ag) kovalent an α-p63 gebunden (Abschnitt 4.4.1). 

Beim zweiten Immuno-SERS-Konjugat handelt es sich um einen gemischten SAM 

mit SEMA4 als Raman-Reporter und PEG-8 als Carboxyl-Bindestelle und 

Abstandshalter für die Bindung an PSA. In Abbildung 5.36 und 5.37 sind die 

Ergebnisse von der Doppelfärbung auf dem gesunden Gewebe dargestellt. 

Abbildung 5.36: Multiplexing von PSA und p63 auf gesunder Prostataprobe. 

Prostatagewebe von gesunden Probanden im Weißlichtbild (A). Die 

Intensitätsverteilung der 4-TNB-Bande um 1340 cm -1 von SERS-markierten p63- 

Antikörpern ist in grüner Farbe (B) und die Intensitätsverteilung der SEMA4- 

Bande bei 2210 cm -1 von SERS-markierten PSA-Antikörpern ist in roter Farbe auf 

dem Gewebe (C) dargestellt. Darstellung der beiden SERS- Falschfarbenbilder in 

einem überlagerten Falschfarbenbild (D). 

Das Gewebe wurde zuerst nach der optimierten Demaskierungsvorschrift für p63 

bzw. mittels kommerziellem Citrat-Puffer behandelt (Abschnitt 4.5.2). Danach wurde 

Das Gewebe mit einem Gemisch von SERS-markierten p63- und PSA-Antikörpern 

(4-TNB und SEMA4) simultan inkubiert. 

131



Prostatagewebe von gesunden Probanden im Weißlichtbild (A). Die 

Intensitätsverteilung der 4-TNB-Bande um 1340 cm -1 von SERS-markierten p63- 

Antikörpern ist in grüner Farbe (B) und die Intensitätsverteilung der SEMA4-Bande bei 

2210 cm -1 von SERS-markierten PSA-Antikörpern ist in roter Farbe auf dem Gewebe 

(C) dargestellt. Darstellung der beiden SERS Falschfarbenbilder in einem 

überlagerten Falschfarbenbild (D). 

In den Abbildungen 5.36B und 5.37B sind die Anbindungen der SERS-markierten 

p63-Antikörper deutlich an den Basalzellen in grüner Farbe zu erkennen. Gewisse 

unspezifische Bindungen der α-p63-gekoppelten NP sind noch im Epithelbereich 

vorhanden, aber das Stroma und Lumen sind davon nicht betroffen. 

Es wurde bei einzelnen Färbungen für p63 gezeigt, dass die Anbindungen der 

Nanopartikel nur an den Basalzellen nachweisbar sind (Abbildungen 5.29 bis 33). 

Die unspezifischen Bindungen in Bereichen, wie Epithelium oder Stroma sind selten 

oder gar nicht vorhanden. Bei Doppelfärbungen sind die Anbindungen der 

Nanopartikel, die an α-PSA gekoppelt sind, im Epithelium sehr spezifisch. Es 

konnten keine unspezifischen Bindungen an andere Bereiche wie Lumen oder 

Stroma beobachtet werden. Die Färbungsqualität der an α-PSA-gekoppelten NP ist 

bei einzelner Färbung oder Doppelfärbung unverändert. In einer Veröffentlichung von 

J. Kneipp et al. wurde der mögliche Austausch von Raman-Reportern zwischen den 

SAMs diskutiert. [192] Die verwendeten Raman-Reporter binden kovalent an die 

Oberfläche der Nanopartikel. Jedoch besteht die Möglichkeit von der Oberfläche 

desorbiert zu werden und sich an weitere Nanopartikeln zu binden. In Abbildungen 

5.36 und 5.37 wurde das Gewebe simultan mit zwei verschiedene Immuno-SERS- 

132


Marker zur Doppelmarkierung inkubiert. Im Weiteren wurde das Gewebe 

nacheinander (nicht simultan) mit SERS-markierten Antikörpern inkubiert. Es konnte 

dadurch keine Verbesserung bei der Bildgebung beobachtet werden. Daher kann die 

Bildung der hot spots als eine weitere Ursache für die Bildung der unspezifischen 

Bindungen bei nicht verkapselten SERS-Substraten in Betracht gezogen werden. 

Das bedeutet, dass vermutlich das Ausmaß der unspezifischen Bindungen der α- 

p63-gekoppelten NP durch Plasmonen-Kopplung mit α-PSA-gekoppelten NP größer 

erscheint, als bei Einzelfärbung. 

Es ist auch nicht ganz klar, wieso die unspezifischen Bindungen nur bei an α-p63 

gebunden Nanopartikeln vorhanden sind und nicht bei an α-PSA gebundenen. Dazu 

muss erwähnt werden, dass als optimale Inkubationszeit für α-p63-gebundene 

Nanopartikel mit Goldnanoclustern als SERS-Substrat ca. 12 Minuten definiert wurde 

(Abbildungen 5.34 und 5.35). Es konnte allerdings während derselben 

Inkubationszeit und durch den Austausch des SERS-Substrats mit Au@Ag keine 

Bildgebung erzielt werden. Möglicherweise sollte die Inkubationszeit der SERS- 

Marker-NP in diesem Fall weiter verkürzt werden, um die Bildung der unspezifischen 

Bindungen zu vermindern. Dadurch konnte aber mit den verwendeten Gold/Silber- 

Nanoschalen keine optimale Bindung der NP erzielt werden. 

5.4.2 Zwei-Farben-SERS-Bildgebung mit glasverkapselten SERS-Clustern 

Im Abschnitt 4.2.4 wurden die Herstellung von Clustern und auch die Vorteile der 

Glasverkapselung zum Schutz der SAMs und auch die Kopplung der IgG auf 

Nanopartikel beschrieben. In diesem Abschnitt werden zuerst die weiteren 

physikalischen Eigenschaften der Cluster während der Erzeugung der SERS-Signale 

in Betracht gezogen. Danach werden die eingestellten Bedingungen für die Detektion 

von p63-Proteinen bei der Detektion von PSA-Proteinen ausgetestet. Am Ende wird 

die Qualität der Immuno-SERS-Cluster für das Multiplexing erprobt. 

5.4.2.1 Auswahl der geeigneten Raman-Reporter-Moleküle für Antigene 

Vorversuche haben gezeigt, dass die optimalen Antigendemaskierungsmethoden für 

zwei verschiedene Biomarker unterschiedlich sein können (Abschnitt 5.2). Die Wahl 

der optimalen Methode wurde dadurch schwierig, denn was den einen Biomarker 

begünstigt, kann zum Qualitätsverlust bei der Billdgebung des anderen Biomarkers 

führen. Die diagnostische Bedeutung von p63-Proteinen ist viel höher als die von 

133


PSA. Deshalb wurde die optimale Antigendemaskierungsmethode zu Gunsten von 

p63 ausgewählt. Andernfalls konnte mittels SERS-Mikroskopie keine optimale p63- 

Lokalisierung durchgeführt werden. Um diesen Nachteil bei der Detektion von PSA- 

Antigenen kompensieren zu können, abgesehen von der Verlängerung der 

Belichtungszeit auf 100 Millisekunden, wurde als Raman-Reporter 4-TNB eingesetzt. 

Es wurde experimentell gezeigt, dass unter gleichen Bedingungen 4-TNB als 

Monomer oder Cluster im Vergleich zu anderen in dieser Arbeit genannten Raman- 

Reportern intensivere SERS-Signale generieren kann. Durch Auswahl einer 

verschachtelten Strategie wurde der intensivere Marker (4-TNB) für das schwach 

zugängliche Antigen (PSA) und der weniger intensive Marker (4-MBA oder TF-MBA) 

mit dem besser zugänglichen Antigen (p63) kombiniert. 

Schema 5.3: Um die nachteilhafte Demaskierungsmethode für PSA auszugleichen 

wurden α-PSA-Moleküle an signal-intensivere SERS-Substrate (R-Marker 2) 

gebunden (A). Die Signalintensität von Raman-Marker 1(R 1 ) ist unter gleichen 

Bedingungen schwächer als R 2 (B). 

In Schema 5.3 ist dieses Vorgehen in Form einer Waage demonstriert. Die 

ausgewählte Antigendemaskierungsmethode hat eine bessere Wirkung 

134 

für die 

Detektion von p63-Proteinen im Vergleich zu PSA-Proteinen. Um die 

Detektionsnachteile bei PSA-Antigenen auszugleichen, wurden α-PSA-Moleküle an 

SERS-Marker mit signal-intensiveren Molekülen wie SEMA4 oder 4-TNB gebunden. 

In Abbildung 5.38A sind die Spektren von drei verschiedenen SERS-Markern 

gegenübergestellt, die in dieser Arbeit für Multiplexing auf dem Gewebe und in einem 

Immunoassay (Abschnitt 5.5) eingesetzt wurden. Die Spektren sind Ergebnisse der


Signalmessung von glasverkapselten Clustern nach der Trennung. Bei der Messung 

von SERS-Signalen wurde auf die Anzahl der Nanopartikel, Laserleistung und 

Belichtungszeit Rücksicht genommen, um gleiche Bedingungen für die Messungen 

zu gewährleisten. Die optische Dichte als Maß für Anzahl der Nanopartikel wurde auf 

den maximalen Extinktionswert der Fundamentalbande (transversale Plasmonmode) 

bei ca. 538 nm normiert. 

Abbildung 5.38: Drei eingesetzte SERS-Marker bei Multiplexing-Untersuchung in dieser 

Arbeit (A). Die Bande bei 885 cm −1 stammt vom Suspensionsmittel Ethanol (EtOH) und 

wurde zur Normierung der drei Spektren herangezogen. Die Leistung vom Laser für alle 

Proben ist auf 5 mW eingestellt. Signal-Intensitäten sind der Mittelwert von 10 

Messungen. In Abbildung B wurden getrennte glasverkapselte BMBA-Cluster in 

verschiedenen Überschüssen mit glasverkapselten BMBA-Monomeren vermischt. Nach 

der Mischung wurde die SERS-Intensität der Kolloide nach drei Messungen als Mittelwert 

in Form einer Standardreihe ermittelt. 

Die Spektren wurden als Mittelwert von 10 Messungen an einem Tag ermittelt. Die 

ermittelten Daten zeigen, dass unter gleichen Bedingungen mit 4-TNB bedeckte 

Cluster verglichen mit 4-MBA das 1,6-fache und verglichen mit TF-MBA das 5,1- 

fache SERS-Signal liefern können. Dieser Versuch wurde an verschiedenen Tagen 

wiederholt. Es konnten leichte Schwankungen bei generierten SERS-Intensitäten 

beobachtet werden, die wahrscheinlich durch ein verändertes Verhältnis von 

Trimeren zu Dimeren nach der Trennung der Cluster zustande kommen. Die 

Ausbildung der Dimere und Trimere geschieht unkontrolliert und bei jeder Herstellung 

können die Populationen der Trimere oder Dimere unterschiedlich sein. In einem 

weiteren Experiment wurden zuerst die glasverkapselten BMBA-Cluster aus der 

Kolloidmischung isoliert. Im nächsten Schritt wurden die Gold-Nanocluster in Form 

einer Standardreihe mit glasverkapselten Monomeren in 8 verschiedenen 

135


Überschüssen gemischt. Die neunte Probe besteht aus reinen Monomeren. In 

Abbildung 5.13B ist die ermittelte Signal-Intensität von Clustern dem von Monomeren 

gegenübergestellt. Es wurde gezeigt, dass Cluster fast 100 Mal mehr Signale im 

Vergleich zu Monomeren liefern können. Der ermittelte Korrelationskoeffizient der 

Messungen beträgt 0,99. Dieser lineare Zusammenhang zwischen dem generierten 

SERS-Signal und ihrem Prozentsatz im Kolloid kann als Zeichen der 

Reproduzierbarkeit der Messungen mit SERS-Clustern betrachtet werden. Trotz der 

unterschiedlichen Anteile an Dimeren und Trimeren in den Kolloiden ist keine 

Änderung am Endergebnis zu beobachten. 

5.4.2.2 Lokalisierung von PSA in Prostatagewebeschnitten mit 

glasverkapselten SERS-Clustern 

Im Abschnitt 5.3.4 wurde experimentell gezeigt, dass mit den hier verwendeten 

Raman-Reportermolekülen (Arylthiole) und SERS-Substraten (Cluster aus 

Goldnanokristallen) eine Belichtungszeit von mindestens 30 Millisekunden für die 

Lokalisierung von p63 Proteinen notwendig ist. Um ein optimales Multiplexing 

durchzuführen sollte auch eine Einzelfärbung mit PSA-Proteinen optimiert werden. 

Für eine umfangreiche Lokalisierung von PSA war es nötig die Belichtungszeit auf 

100 Millisekunden zu erhöhen. 

Abbildung 5.39: Lokalisierung von PSA im Prostatagewebe des gesunden Probanden 

mittels glasverkapselten α-PSA-gebundenen Clustern. Oben sind die Weißlichtbilder 

und unten die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder (Markerbande von 4-TNB um 

1340 cm -1 ) dargestellt. 

136


Bei der Verkürzung der Inkubationszeit von Immuno-Clustern konnte keine 

vollständige SERS-Färbung erzielt werden. In Abbildung 5.39 wurden drei 

Gewebeschnitte, mit selbsthergestelltem Citratpuffer, der zur Färbung von PSA- 

Proteinen optimale Wirkung hat, vorbehandelt. Wie in den Abbildungen ersichtlich ist, 

sind die Signale weitgehend auf dem Epithelbereich verteilt und das Stroma oder 

Lumen zeigen geringe unspezifische Bindungen. 

5.4.3 Demaskierung mit kommerziellem Puffer und Doppelfärbung mit SERSmarkierten 

Antikörpern 

Nachdem die Einstellung der Antigenlokalisierung für beide Biomarker erfolgreich 

war, wurde als nächster Schritt in Richtung Doppelfärbung eine simultane Detektion 

von p63 und PSA durchgeführt. Zur Markierung der p63-positiven Basalzellen 

wurden glasverkapselte Goldcluster, die 4-MBA-Signale generieren über eine 

kovalent gebundenen PrA/G-Schicht an α-p63-Antikörper gebunden. Für die 

Markierung von PSA wuden 4-TNB-markierte Goldcluster verwendet, die mit 

derselben Methode an α-PSA-Antikörper gebunden waren. Als Antigendemaskierungsmethode 

wurde kommerzieller Citrat-Puffer verwendet, der eine 

optimale Wirkung für p63-Demaskierung zeigt. 


Prostatagewebe vom gesunden Probanden im Weißlichtbild (A). Intensitätsverteilung 

der 4-MBA-Bande um 1590 cm -1 von SERS-markierten p63-Antikörpern ist in grüner 

Farbe (B) und die Intensitätsverteilung der 4-TNB-Bande bei 1340 cm -1 von SERSmarkierten 

PSA-Antikörpern ist in roter Farbe auf dem Gewebe dargestellt (C). 

Darstellung der beiden SERS- Falschfarbenbilder in einem überlagerten 

Falschfarbenbild (D). 

137


Die Ergebnisse nach Inkubation des Gewebes mit den Nanopartikeln und die 

Durchführung der SERS-Mikroskopie sind in den Abbildungen 5.40 und 5.41 

dargestellt. In beiden Abbildungen kann die Anbindung von α-p63-gebunden Silica- 

Clustern (in grüner Farbe) an p63-positive Basalzellen deutlich erkannt werden. Die 

Anbindung von an α-PSA-gebundenen Clustern (in roter Farbe) im sekretorischen 

Epithelium weisen auf eine gelungene PSA-Färbung hin. In beiden Experimenten 

konnten keine unspezifischen Bindungen weder von 4-MBA-Partikeln (gekoppelt mit 

α-p63) noch von 4-TNB-Partikeln (gekoppelt mit α-PSA) in Lumen oder Stroma 

nachgewiesen werden. 


Prostatagewebe vom gesunden Probanden im Weißlichtbild (A). Die Intensitätsverteilung 




Darstellung der beiden SERS- Falschfarbenbilder im überlagerten Falschfarbenbild (D). 

Die Signal-Intensität von 4-MBA-markierten SERS-Nanopartikeln, die an p63-positive 

Basalzellen gebunden sind, ist ca. 3-4 Mal intensiver als die Intensität von 4-TNBmarkierten 

SERS-NP, die an α-PSA gebunden sind. Obwohl, wie in Abbildung 38A 

gezeigt wurde, die Signal-Intensität der 4-MBA-Reporter niedriger als die der 4-NTB- 

Reporter ist. Eine Erklärung für die enorme Signal-Intensität bei 4-MBA im Vergleich 

zu PSA könnte die höhere Anzahl der gebunden Nanopartikel an die p63-positiven 

Basalzellen sein. Dies könnte durch die bessere Zugänglichkeit der α-p63- zu p63- 

138


Antigenen im Vergleich zu α-PSA, auf Grund ausgewählten, für p63 optimalen 

Antigendemaskierungsmethode, zustande kommen. 

5.4.4 Demaskierung mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer und SERS- 

Doppelfärbung 

In den Abschnitten 5.2 und 5.3 wurde erwähnt, dass für die Lokalisierung von p63- 

Proteinen die Wahl einer Demaskierungsmethode zu Gunsten dieses Proteins 

notwendig ist. 

Um den Einfluss der Demaskierungsmethode bei der Doppelfärbung zu überprüfen, 

wurde zunächst das Experiment von 5.4.3 unter gleichen Bedingungen und nur mit 

einer einzigen Änderung an der Antigen-Demaskierungsmethode wiederholt. Das 

Ergebnis dieser Doppelfärbung ist in Abbildung 5.42 dargestellt. Die Bindungsstellen 

der an α-p63 gekoppelten Nanopartikel sind in Abbildung 5.42B mit grüner Farbe 

und der an α-PSA gebundenen in roter Farbe (5.42C) dargestellt. In allen bisherigen 

Abbildungen (5.29 bis 5.35) waren deutliche Bindungen von α-p63 gekoppelten 

Nanopartikeln an den Basalzellen zu erkennen. In Abbildung 5.42B sind im 

Gegensatz dazu die α-p63-Bindungen vereinzelt auf dem Epithelium verteilt. Die 

erzeugte Signalintensität (4-MBA) der unspezifisch gebundenen Nanopartikel ist im 

Vergleich zu den Ergebnissen von Abschnitt 5.4.3 ca. zehnmal schwächer. 

Im Gegensatz zur Lokalisierung von p63 zeigen an α-PSA gebundene Cluster 

spezifische Bindungen auf dem Epithelium. Die Signalintensität der Raman-Reporter 

(4-TNB) in diesem Experiment erhöhte sich leicht im Vergleich zu der Intensität in 

den Abbildungen 5.40 und 5.41. Bei diesem Experiment wurde eine Erhöhung von 

unspezifischen Signalen beim α-PSA auf dem Stroma beobachtet. Dass ein Verlust 

der Signalintensität während der Detektion von p63-Antigenen nach der 

Demaskierung mit selbsthergestelltem Citrat-Puffer zu erwarten war, wurde bereits 

durch die Vorversuche mit Au@Ag im Abschnitt 5.2.1.2 (Abbildung 5.21) belegt. Es 

wurden zwar gewisse unspezifische Bindungen beobachtet, aber die Anbindung der 

Nanopartikel an die Basalzellen blieb erhalten. Das Experiment wurde mehrfach 

wiederholt, doch es wurden keine Verbesserungen in Bezug auf die p63-Proteine 

beobachtet. Es ist nicht klar, wieso die Immuno-Cluster-Marker mit enormer 

Signalintensität schlechtere Bildgebung im Vergleich zu Au@Ag nach der 

Demaskierung mit selbsthergestelltem Puffer und Doppelfärbung hervorrufen. 

139



Prostatagewebe von gesunden Probanden in Weißlichtbild (A). Die Intensitätsverteilung 


Farbe (B) und die Intensitätsverteilung der 4-TNB-Bande um 1340 cm -1 von SERSmarkierten 

PSA-Antikörpern in roter Farbe auf dem Gewebe dargestellt (C). Darstellung 

der beiden SERS- Falschfarbenbilder im überlagerten Falschfarbenbild (D). 

Um die eventuellen Signalintensitäts-Schwankungen, die in getrennten Clustern nach 

der Trennung vorkommen können, auszuschließen, wurden genügend Cluster für 

Durchführung dieser Untersuchungen(Abbildungen 5.40 bis 5.44) an einem Tag 

hergestellt. 

5.4.5 Demaskierung mit EDTA/Tris-Puffer und SERS-Doppelfärbung 

Eine weit verbreitete Methode für die Antigendemaskierung ist die Verwendung von 

EDTA-Tris-Puffer. Wie in Abbildung 5.23B dargestellt ist, könnte durch diese 

Methode eine gute p63-Lokalisierung bei der SERS-Mikroskopie mittels Au@Ag 

erzielt werden. In Abbildung 5.43 wurde das Ergebnis des Multiplexingsversuchs auf 

dem Gewebe nach Demaskierungsmaterialien mit EDTA-Tris-Puffer dargestellt. 

Die Anbindung der an α-p63 gebundenen Nanopartikel (markiert mit 4-MBA) auf dem 

Gewebe wurde mit grüner Farbe und die Lokalisierung von PSA mittels α-PSA 

(markiert mit 4-TNB) in roter Farbe dargestellt. Die Intensität der an α-p63 

gebundenen Raman-Reporter hat im Vergleich zu den Abbildungen 5.40 und 5.41 

140


durch Demaskierung mit EDTA-Tris Puffer ca. zweifach zugenommen. Eine leichte 

Signalerhöhung kann auch bei den α-PSA gebundenen 4-TNB-Clustern beobachtet 

werden. Die Ergebnisse der SERS-Mikroskopie zeigen keine unspezifischen 

Bindungen während der Lokalisation von p63. Im Gegensatz dazu sind bei der 

Lokalisierung von PSA nach Demaskierung mit EDTA-Tris-Puffer unspezifische 

Bindungen vorhanden. 

Die Demaskierung mit EDTA-Tris hat eine optimale Wirkung für das p63-Protein 

gezeigt. In Abbildung 5.43 kann eine gute Lokalisierung der Basalzellen erkannt 

werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass diese Demaskierungsmethode 

auch für hydrophil stabilisierte Nanopartikel zur Detektion der p63-positiven 

Basalzellen optimal ist (Abbildung 5.23). 


Prostatagewebe vom gesunden Probanden in Weißlichtbild (A). Intensitätsverteilung 




Darstellung der beiden SERS- Falschfarbenbilder im überlagerten Falschfarbenbild (D). 

Nach Demaskierung durch EDTA-Tris-Puffer konnte keine optimale Wirkung bei der 

Lokalisierung des PSA-Proteins mittels Immuno-Clustern festgestellt werden. Im 

Vergleich zur Detektion mittels hydrophil stabilisierten Nanopartikeln sind mehr 

141


unspezifische Signale zu beobachten. Grund für die Erhöhung des unspezifischen 

Signals im Vergleich zu Au@Ag kann die enorme Sensitivität der Cluster sein. 

5.4.6 Einfluss der gewählten Ramanreportermoleküle 

An Hand der Ergebnisse in den Abschnitten 5.2 und 5.3 wurde argumentiert, dass 

man durch Auswahl der geeigneten Marker zum Teil den negativen Einfluss der 

Antigendemaskierungsmethode ausgleichen kann. In einem weiteren Experiment 

wurden die 4-MBA-Cluster durch TF-MBA-Cluster ersetzt. In Abschnitt 5.4.2.1 

Abbildung 5.38A wurde gezeigt, dass die TF-MBA-markierten SERS-NP ein ca. 3- 

fach kleinere SERS-Signale im Vergleich zu den 4-MBA-Clustern liefert. 

Im nächsten Schritt wurden α-p63-gekoppelte TF-MBA-Cluster zusammen mit α- 

PSA-gekoppelten 4-TNB-Clustern simultan auf dem gesunden Gewebeschnitt 

eingesetzt. Das Gewebe wurde mit EDTA-Tris-Puffer wie im Abschnitt 5.4.5 

beschrieben behandelt. In Abbildung 5.44 ist deutlich zu sehen, dass die TF-MBA- 

Cluster über ihren Antikörper (α-p63) spezifisch an Basalzellen gebunden sind. Die 

Bindung von SERS-markierten PSA-Antikörpern (4-TNB-Cluster) auf dem Epithelium 

ist noch vorhanden, es sind aber gewisse unspezifische 4-TNB-Signale auf dem 

Stroma erkennbar. 


Prostatagewebe von gesunden Probanden in Weißlichtbild (A). Die 

Intensitätsverteilung der TF-MBA-Bande um 1620 cm -1 von SERS-markierten p63- 

Antikörpern ist in grüner Farbe (B) und die Intensitätsverteilung der 4-TNB-Bande 

bei 1340 cm -1 von SERS-markierten PSA-Antikörpern in roter Farbe auf dem 

Gewebe dargestellt (C). Darstellung der beiden SERS- Falschfarbenbilder im 

überlagerten Falschfarbenbild (D). 

142


Die Signal-Intensität von 4-TNB-SERS-Markern, die für die Detektion von PSA 

eingesetzt wurden, zeigt im Vergleich zu den Abbildungen 5.40 und 5.41 keine oder 

niedrige Änderungen. Im Gegensatz dazu halbiert sich die Signal-Intensität von 

gebundenen TF-MBA-SERS-Markern gegenüber 4-MBA-SERS-Markern in den 

Abbildungen 5.40 und 5.41. Diese Absenkung der Signal-Intensität war zu erwarten, 

weil die TF-MBA-Cluster im Vergleich zu den 4-MBA-Clustern weniger SERS-Signale 

liefern. Wegen der optimalen Demaskierungsmethode sind aber die SERS-Signale 

für die Basalzellen deutlich höher als die, der am Epithelium gebundenen 4-TNB- 

Cluster. In einem weiteren Experiment wurden die Wechselwirkungen zwischen 

verkapselten Nanopartikeln und Gewebe untersucht. Dabei wurden die Nanopartikel 

kovalent an BSA, Protein A/G oder direkt an Immunoglobulin (α-p63) gekoppelt. 

Abbildung 5.45: SERS-Mikroskopie mit BSA- Pr A/G- und IgG beschichteten 

Nanopartikeln als negative Kontrolle. Die SERS-Mikroskopie-Resultate nach 

Inkubation der Gewebe mit BSA-beschichteten Nanopartikeln sind in A, mit Pr A/G 

beschichteten in B und kovalent gebundenen α-p63 an Nanopartikeln in C dargestellt. 

Links sind die Weißlichtbilder und rechts die dazugehörigen SERS-Falschfarbenbilder 

(Markerbande von 4-TNB um 1340 cm -1 bei A und B sowie von 4-MBA-Bande um 

1590 cm -1 bei C). 

143


In Abbildung 5.45 wurden drei verschiedene Gewebeschnitte mit drei 

unterschiedlichen proteinbeschichteten Nanopartikeln inkubiert. Die Abbildungen 

5.45 A und B dienen als negative Kontrolle und die Ergebnisse zeigen, dass die mit 

BSA oder Pr A/G beschichteten Nanopartikel nicht auf dem Gewebe binden. Im 

Gegensatz dazu sind die Nanopartikel, die mittels kovalenter Kopplung an α-p63 

gebunden sind, überall auf dem Gewebe verteilt. Die Inkubation der Immuno-Cluster 

ohne Protein A/G auf dem Gewebe führt zu ausgeprägter Aggregation. 

In den Abschnitten 4.4.1 und 4.4.2 wurde die Menge an notwendigen Antikörpern 

(MW= ca. 150 kDa) und Protein A/G (MW=50,46 kDa) für eine erfolgreiche 

Biofunktionalisierung der angegebenen Anzahl von Nanopartikeln angegeben. Bei 

der Herstellung von Immuno-SERS mit Au@Ag als SERS-Substrat wurden 1 µg 

Antikörper verwendet. Im Gegensatz dazu war bei der Biofunktionalisierung der 

glasverkapselten Nanopartikel mit Protein A/G ca. 3-4 µg Protein notwendig. Bei der 

Verwendung von Immuno-Clustern in Abbildung 45C wurden 15 µg α-p63 verwendet, 

um eine gleiche Anzahl der Proteinmoleküle im Experiment zu ermöglichen, da das 

Molekulargewicht von IgG ca. dreimal so groß, ist wie das von Protein A/G. Die 

mehrfache Wiederholung der Kopplung von Antikörpern an die Oberfläche von 

glasverkapselten Nanopartikeln mittels s-NHS/EDC-Chemie mit gleichen oder 

niedrigeren IgG-Konzentration (10, 5 und 2 µg IgG, Ergebnisse nicht dargestellt) 

führte zur raschen Aggregation der Nanopartikel. Deshalb wäre eine Detektion von 

Immunoglobulin ohne Einsatz der Protein A/G-Beschichtung praktisch unmöglich 

gewesen. Die Verwendung der gleichen Anzahl von BSA- oder PrA/G-Molekülen 

hingegen führt nicht zur Aggregation. Ob die Größe von Proteinen während der 

Kopplung mit den aktivierten Carboxylgruppen auf den Nanopartikeln tatsächlich eine 

Rolle spielt, wurde in dieser Arbeit nicht näher untersucht. 

Das Ausmaß der unspezifischen Bindungen der glasverkapselten Goldnanocluster 

im Vergleich zu den glasverkapselten Goldnanoschalen ist größer. Das kann an der 

unterschiedlichen Größe und Gewicht der beiden SERS-Substrate liegen. Im 

Abschnitt 5.3.5 wurde kurz der Abbau der nicht behandelten Glasverkapselung 

angedeutet. K. Rudi hat den Abbau der Glasverkapselung in verschiedenen 

Suspensionsmedien untersucht. Diese Studien haben die vollständige Auflösung des 

Glases innerhalb von 24 Stunden belegt. In Abbildung 5.46A sind die Veränderungen 

der Spektren vor und nach der Verkapselung der Nanopartikel dargestellt. 

144


Abbildung 5.46: A) Normierte Extinktionsspektren von 60 nm Au-NP (schwarz), 

Goldnanocluster nach der Glasverkapselung (blau) und dieselben glasverkapselten 

Goldcluster nach 24 Stunden Inkubation in Wasser (rot). B) Gegenüberstellung der TEM- 

Aufnahme der verkapselte NP vor und nach der Inkubation in Wasser. Mit freundlicher 

Genehmigung der Frau K. Rudi. 

Mittels zweiwöchiger Inkubation der NP in alkalischem Ethanol oder durch 

Hitzebehandlung konnte der schnelle Abbau der Glashülle zum großen Teil 

verhindert werden. Die aufgenommenen TEM-Bilder weisen auf keine 

Veränderungen oder Beschädigungen der Glasverkapselung während und nach der 

Biofunktionalisierung hin (Ergebnisse nicht dargestellt). Allerdings können kleine 

unsichtbare Beschädigungen oder geringste Verluste der Glasoberfläche die Bildung 

von unspezifischen Bindungen oder auch gar das Ausbleiben von Bindungen 

verursachen. 

Die derzeitige SERS-Mikroskopie der Arbeitsgruppe Schlücker und auch anderer 

Forschungsgruppen bietet eine limitierte Rasterfläche. [35,38,200] Der Abrastern einer 

kleinen Fläche von 40,000 µm 2 mit dem jetzigen modernen SERS-Mikroskop kann 

ca. 20 bis 4000 Minuten Zeit in Anspruch nehmen. Diese Tatsache ist ein Nachteil 

gegenüber der Standard-IHC und SE-CARS, weil durch den Einsatz dieser 

Methoden in kürzerer Zeit größere Flächen abgerastert werden können. Dadurch 

kann man sich eine präzisere Aussage über die Einstellungen treffen. In Abbildung 

5.47 ist das Ergebnis der p63-Färbung eines gesunden Probanden mittels Standard- 

IHC dargestellt. Im grün markierten Zone erscheinen die Basalzellen teilweise 

mehrschichtig gelagert, was hier einem Schnittartefakt entspricht. In den rot 

markierten Feldern ist die Basalzellschicht zum Teil deutlich fragmentiert, sie scheint 

145


dadurch teilweise zu fehlen. Die SERS-Mikroskopie-Ergebnisse der markierten 

Stellen deuten im grünen Bereich auf unspezifische Bindungen hin, während man bei 

dem roten Kreisen von einem Misserfolg bei der Lokalisierung der Zellen ausgeht. 

Daher kann die Interpretation der Ergebnisse gewisse Fehler und Ungenauigkeiten 

mit sich bringen. Zur Aufdeckung solcher Schnittartefakte ist die Entwicklung 

geeignetes Weitfeld-Ramanmikroskope mit größerem XY-Verschiebetische 

nötwendig. 

Die Lokalisierung von p63-Proteinen kann eine bessere Genauigkeit zeigen, weil die 

Bereiche wie Epithelium und Stroma als interne negative Kontrolle dienen können. 

Daher können die Auswertungen der ausgewählten Stellen, die keine unspezifischen 

Bindungen mit Stroma oder Epithelium zeigen, als korrekte Ergebnisse angesehen 

werden. 

Abbildung 5.47: Lokalisierung der p63-positiven Basalzellen mittels Standard-IHC auf 

gesundem Prostatagewebe, Bildung von einigen Schichten in der grünen Markierung 

und fehlende p63-positive Zellen in den roten Markierungen dargestellt. 

Nach Gewebebehandlungen in der Pathologie durch Hitze gehen Teile des Gewebes 

verloren und dadurch werden Vertiefungen gebildet. In eine Vertiefung von 1 µm 3 

Größe passen viele glasverkapselte Goldnanocluster (120 bis 200 nm) hinein. Jeder 

einzelne dieser ultrasensitiven NP kann genügend Signal zur Detektion generieren. 

146


Abgesehen von unspezifischen Bindungen können fehlenden Bindungen auch sehr 

oft während der SERS-Mikroskopie und besonders bei Doppelfärbungen mit 

separaten Inkubationen auftreten. Bei separaten Inkubationszeiten der Antikörpergekoppelten 

NP wird in der Regel ein Immuno-SERS-NP-Konjugate, 2-3 Mal mehr 

als andere gewaschen. Da das Prinzip der Immunkomplexbildung von Immuno- 

SERS-Markern sehr ähnlich wie bei ELISA oder Westernblot ist, kann sich die 

Qualität der Färbung beim Wiederholen des Waschens verschlechtern. Dieser 

Qualitätsverlust wurde besonders bei der Detektion von p63-Proteinen beobachtet. In 

diesem Fall zeigen nur an α-PSA gekoppelte NP sehr spezifische Bindungen auf 

dem Epithelium und α-p63 Immuno-SERS-Marker können kaum wahrgenommen 

werden. Die Nachfärbungen von p63 mit relevanten Immuno-SERS-Markern führte 

meist zur Bildung von schweren unspezifischen Bindungen. Der genaue Grund für 

dieses Ereignis ist unklar. 

Die Probleme, wie Ritzen auf Oberfläche der Gewebe, Verlust der Glasverkapselung 

oder Größe und Gewicht der NP können nicht vollständig durch Optimierung der 

Blockierungspuffer und Inkubationszeiten behoben werden. Daher ist die 

Entwicklung von kleineren SERS-Substraten ein unverzichtbarer Schritt auf dem 

Weg der Weiterentwicklung der SERS-Mikroskopie. Dazu sollte auch neue 

Mikroskope entwickelt, die eine größere Oberfläche abrasten können. Um diese 

Problem um zu gehen wurde in diese Arbeit die Experimente mehr fach wiederholt 

und nur die aussagekräftige Stellen neben negative Kontrollen dargestellt, die die 

Machbarkeit des Vorhabens belegen. Jedoch sollen für Standardisierung der SERS- 

Mikroskopie-Methode weitere zusätzliche Materialien und Methoden entwickelt 

werden. 


In diesem Abschnitt wurden zwei verschiedene Proteine (p63 und PSA) mit Hilfe von 

zwei verschiedenen Immuno-SERS-Markern (mit und ohne Glasverkapselung) auf 

dem Gewebe lokalisiert. Zuerst wurden für die simultane Detektion nicht verkapselte 

Nanopartikel (hydrophil stabilisierte) verwendet. Die Antigendemaskierungsmethode 

wurde zu Gunsten der p63-Detektion ausgewählt. Dazu wurden α-p63-Immuno- 

SERS-NP mit 4-TNB Molekülen beschichtet, die mehr SERS-Intensität im Vergleich 

mit anderen Reportern hervorbringen können. Die optimale Inkubationszeit für beide 

Proteine wurden separat ermittelt und betrug ca. 20 Minuten. Die Ergebnisse wurden 

147


in diesem Abschnitt in den Abbildungen 5.36 und 5.37 dargestellt. Die an α-p63 

gebundenen Immuno-SERS-Marker haben in den Experimenten nur im Epithelium 

unspezifische Bindungen gezeigt. Im Gegensatz dazu konnten keine unspezifischen 

Anbindungen an den α-PSA-gebundenen Immuno-SERS-NP beobachtet werden. 

Die Bereiche wie Lumen und Stroma waren nach der Färbung mit α-PSA Immuno- 

SERS von unspezifischen Bindungen nicht betroffen. 

Im Abschnitt 5.3 und Abbildung 5.29 wurde die Überfärbung wegen der verlängerten 

Inkubationszeit gezeigt. Die optimale Inkubationszeit und akzeptable Bildgebung 

wurde nach 20 minütiger Inkubation mit α-p63-gebundenen SERS-NP erreicht. 

Möglicherweise sind noch vereinzelte Nanopartikel im Epithelium vorhanden, aber 

auf Grund niedriger Belichtungszeit oder fehlender elektromagnetischen 

Feldverstärkung nicht detektierbar. Bei simultaner Inkubation durch benachbarte α- 

PSA-gebundenen Immuno-SERS-Konjugate können mit dem vereinzelten α-p63- 

Immuno-SERS hot spots bilden. 

Ein weiterer Grund für unspezifische Signale bei α-p63-gebundenen Immuno-SERS 

konnte in der neuen Untersuchung von J. Kneipp et al. gefunden werden. Laut dieser 

Untersuchung können sich die Raman-Reporter-Moleküle von den Nanopartikeln 

ablösen und an andere Nanopartikel binden. [192] 

Im Abschnitt 5.2.1 wurde der Einfluss der Demaskierungsmethode während der 

SERS-Mikroskopie mittels hydrophil stabilisierter Nanopartikeln beschrieben. Beim 

Vergleich der Ergebnisse der Abbildungen 5.40 bis 5.44 mit Abbildungen 5.29C bis 

5.32 konnte festgestellt werden, dass die Bindungen der glasverkapselten Cluster 

und der hydrophil stabilisierten Partikel, beide über α-p63, ähnlich spezifisch an den 

Basalzellen stattgefunden haben. Unspezifischen Bindungen auf Stroma oder auch 

Lumen sind nicht vorhanden. Die Bildgebung von α-PSA-gebundenen Clustern in 

Abbildung 5.40 und 5.41, wo der kommerzielle Citratpuffer zur Demaskierung 

eingesetzt wurde, entspricht den Erwartungen, da die Nanopartikel gleichmäßig am 

Epithelium verteilt sind und keine unspezifischen Bindungen in Bereichen wie Lumen 

oder Stroma zeigen. Im Gegensatz dazu zeigen die an α-PSA-gebundenen SERS- 

NP in den Abbildungen 5.43 und 5.44 nach der Demaskierung mit EDTA-Tris-Puffer 

unspezifische Bindungen auf dem Stroma. Solche unspezifischen Bindungen wurden 

auch mit dem Einsatz von hydrophil stabilisierten Nanopartikeln auf dem Gewebe 

nach der Demaskierung mit EDTA-Tris-Puffer beobachtet (Abbildung 5.23A). Durch 

148


den Einsatz von kleineren SERS-Substraten, wie Goldnanosternen und Gold/Silber- 

Nanoschalen konnte in früheren Publikationen eine noch bessere Bildgebung 

erreicht werden. [178,193] Die ultrasensitiven Cluster sind im Schnitt viermal größer als 

die erwähnten SERS-Substrate. Bei Gegenüberstellung der SERS-Mikroskopie- 

Ergebnisse von glasverkapselten SERS-NP mit nicht verkapselten SERS-NP kann 

man behaupten, dass die Größe der NP und auch die 

Antigendemaskierungsmethoden eine große Rolle für eine erfolgreiche Mikroskopie 

spielen. Mit kleineren Nanopartikeln kann zwar eine bessere Qualität der Bildgebung 

erreicht werden, aber eine nicht geeignete Antigendemaskierung kann die 

Bildgebung besonders bei glasverkapselten NP als SERS-Substrat viel stärker 

beeinflussen oder verhindern (Abbildung 5.42). Neben der Entwicklung von kleineren 

NP ist auch Entwicklung von neuen SERS-Mikroskopen, die bessere 

Übersichtsbilder aufnehmen können, erforderlich. Dadurch kann die Qualität der 

Mikroskopie wesentlich verbessert werden und die Begutachtung der Mikroskopie 

präziser und aussagekräftiger werden. 

149


5.5 Multiplex-Immunassay von Zytokinen 

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist die Prototyp-Entwicklung eines quantitativen 3-plex- 

Immunoassays im Mikrotiterplattenformat in einem gereinigten System gewesen. Um 

dieses Ziel zu erreichen wird die Detektion von einzelnen Zytokinen mit dem 

jeweiligen SERS-Partikel eingestellt. Dazu soll auch die mögliche Kreuzreaktion 

zwischen den verwendeten Antikörpern und Antigenen getestet (Schema 5.4) und 

definiert werden. 

5.5.1 Detektion und Quantifizierung der Zytokine IL1, IL8 und TNF-α 

Die Grundeinstellung des SERS-Sandwich-Immunoassay wurde durch Y. Wang und 

K. Rudi angefertigt. Bei diesen Einstellungen wurden einzelne Zielproteine mit dem 

entsprechenden Immuno-SERS-Partikel-Konjugat detektiert. Dabei wurden 

verschiedene Zytokine auf dem flexiblen Trenngitter mit insgesamt 16 

Probekammern auf einem funktionalisierten Glasobjektträger gemessen (Abschnitt 

4.6). In dieser Arbeit wird die multiple Detektion der drei verschiedenen Zytokinen 

fortgesetzt und erweitert. Deshalb wurde an dieser Stelle auf Wiederholungen und 

Vorversuche verzichtet. Bei den Grundeinstellungen wurden falschpositive 

Ergebnisse beobachtet. [194] Eine mögliche Ursache könnte die Kreuzreaktion 

zwischen Antikörper und Antigen sein. Besonders häufig wurde diese Interaktion bei 

Proteinen mit den Strukturhomologien beobachtet (Abschnitt 2.4). K. Rudi hat diese 

mögliche Kreuzreaktion zwischen den verwendeten Antikörpern und Antigenen (IL6 

und IL1) untersucht (Schema 5.4). Es konnte gezeigt werden, dass diese 

Kreuzrektionen kaum stattfinden und vernachlässigt werden können. Für die 

Detektion von drei Zytokinen wurde zuerst Protein A/G auf dem Glasobjektträger 

kovalent gebunden. Anschließend wurden die separaten Probenkammern mit der 

gleichen Konzentration der jeweiligen monoklonalen Antikörper (IL1.IL8 und TNF-α) 

blockiert. Nachdem die überschüssigen Antikörper entfernt wurden, konnten die 

Kammern mit einer kommerziellen Blockierungslösung (Smart-Block, Condor) 

blockiert werden. Anschließen wurden die Verdünnungsreihen mit den jeweiligen 

Antigenen (IL1, IL8 und TNF-α) in den Kammern verteilt. Um die negative Kontrolle 

zu ermitteln, wurde in einigen Kammern BSA an Stelle der Antigene verwendet. Die 

polyklonalen Antikörper wurden mit Protein A/G-beschichteten Clustern immobilisiert 

(Abschnitt 4.4.2). 

150


Schema 5.4: Bei den Kreuzreaktionen wurden verschiedene Kombinationen 

(Fängerantikörper, Antigen und Detektionsantikörper) getestet (links). Dabei wurden 

keine bemerkenswerten Signale beobachtet (rechts). [194] 

Die SERS-Signale der drei verwendeten SERS-Substrate und Cluster sind in 

Abbildung 5.38A dargestellt. Für die anschließenden Experimente wurden 

polyklonale TNFα an TF-MBA-Cluster, IL1 an 4-TNB-Cluster und IL8 an 4-MBA- 

Cluster gebunden. Die Blockierungszeiten für die Inkubation von monoklonalen 

Antikörpern, Antigenen und Immuno-SERS-Marker-Konjugaten waren für alle drei 

Zytokine identisch. Nach Ablauf der Inkubationszeiten wurden die flexiblen 

Trenngitter entfernt und die Objektträger gewaschen (Abschnitt 4.6). 

In Abbildung 5.48 sind die Ergebnisse zur Detektion von drei unterschiedlichen 

Zytokinen zusammengefasst. Zur absoluten Quantifizierung der Zytokine wurden 

drei separate Standardreihen für die untersuchten Proteine an verschieden Tagen 

vermessen. Dadurch war es möglich, die Ergebnisse miteinander zu vergleichen 

(Abbildungen 5.48A,B und C). Die Standardreihen zeigten einen reproduzierbaren, 

linearen Zusammenhang zwischen den gewählten Zytokin-Konzentrationen und den 

entsprechenden SERS-Signalen. Hierbei lag die höchste eingesetzte Konzentration 

für alle drei Zytokine bei 7 ng/ml und die niedrigste eingesetzte Konzentration für alle 

drei Zytokine bei 0,5 ng/ml. Mit der Konzentrationserhöhung der Antigene um mehr 

als 7 ng/ml konnte keine Veränderung der Signal-Intensität bzw. eine Sättigung der 

Signale beobachtet werden. Bei der Reduzierung der Konzentrationen (weniger als 

0,5 ng/ml) konnte kein Unterschied zwischen dem Test und der negativen BSA- 

Kontrolle festgestellt werden. Die Hintergrundsignale konnten nicht durch 

Blockierungspuffer behoben werden. Die besten Ergebnisse bzw. die niedrigsten 

151


Hintergrundsignale konnten mit kommerziellem Puffer (Smart-Block, Condor) 

beobachtet werden. 

Abbildung 5.48: Ermittlung der normierten SERS-Intensität von glasverkapselten 

SERS-Clustern als Funktion der Zytokin-Konzentration. Mit 4-TNB-markierten Cluster 

stehen für IL1-Konzentrationen, 4-MBA-Cluster für IL8-Konzentrationen und TF-MBA- 

Cluster für TNFα-Konzentrationen. Die Y-Fehlerbalken geben die jeweiligen 

Standardabweichungen an (A, B und C links). Darstellung der normierten SERS- 

Spektren von den jeweiligen Standardreihen (A,B und C rechts). Die drei Spektren 

zeigen die Mittelwerte der ermittelten SERS-Signale aus 2000 Einzel-Spektren von fünf 

gemessenen Feldern pro Probe an einem Tag. 

152


In Abbildung 5.49 ist die Verteilung der Nanopartikel auf dem Objektträger nach der 

Bildung der Sandwich-Komplexe Weißlichtbildern dargestellt (oben: schematisch; 

unten: Weißlichtbilder). Hierbei handelt es sich um die gebildeten IL1-Sandwich- 

Komplexe mit 4-TNB-Clustern als SERS-Substrat. Es ist zu beachten, dass die 

Verteilung der Nanopartikel auf dem Glas im Gegensatz zu Standard-ELISA nur 

zweidimensional ist (X undY). 

Im Standard-ELISA-Verfahren wird 96 Wells Platten verwendet, wobei ein Well 

jeweils ein Volumen von ca. 300 µl hat. In Abbildung 5.49A wurde bereits die hohe 

Dichte der Nanopartikel auf Glas vorgestellt. Wenn auch eine Überlagerung der 

Nanopartikel möglich wäre, führte sie zu keinerlei Erhöhung der SERS-Signale. Im 

Gegensatz zur Standard-ELISA lassen die Nanopartikel das Licht (Laser) nicht 

durch. Daher sind die maximalen Konzentrationen in diesem Verfahren immer durch 

vollständige Bedeckung der Oberfläche limitiert. 

Abbildung 5.49: Schmatische-Darstellung (oben) und Weißlichtbilder (unten) der 

gebundenen 4-TNB-Cluster auf dem Glasobjekträger nach Bildung der Sandwich- 

Assays (IL1) in Schichtanordnung. Die Nanopartikel können nur zweidimensional 

verteilt werden. Die maximale Bedeckung des Objektträgers wurde bei der 

Konzentration von 7 ng/ml erreicht. Die Abnahme des Immunkomplexes (schwarze 

Punkte) können auf dem Objektträger deutlich beobachtet werden. 

Die Erweiterung des Detektionsbereichs des Immuno-Assays wäre bei Erfassung 

der niedrigeren Konzentrationen (z.B. femtomolar) noch möglich gewesen. Y. Wang 

könnte eine femtomolare Sensitivität (ca. 1 pg/mL) mit Einsatz von Gold/Silber- 

153


Nanoschalen nachweisen. [196] Allerdings wurden bei der Durchführung der 

Experimente mit Goldnanoclustern, Wechselwirkungen zwischen den SERSmarkierten 

Antikörpern und BSA als negative Kontrolle (anstelle des Antigens) 

beobachtet. 

Bei der negativen Kontrolle konnten teilweise die gleichen Signalintensitäten wie bei 

der eigentlichen Probe mit femtomolarer Konzentrationen beobachtet werden. In 

Abbildung 5.49 sind die Beiträge der negativen Kontrolle dargestellt. 

Nach der Probenvorbereitung wurde das Gewebe mit einem 633 nm Laser 

zeilenweise abgerastert. Das gemessene SERS-Spektrum an jedem Messpunkt 

wurde anschließend exportiert und von D. Steinigeweg und A. Bröermann in einem 

automatisierten Verfahren analysiert. Für diese Analyse wurde das Programm Matlab 

verwendet. Im ersten Schritt wurde die Basislinienkorrektur mit dem Algorithmus 

airPLS (adaptive iteratively reweighted Penalized Least Square) durchgeführt, der im 

Manuskript von Chen et al. beschrieben ist. [197] Der Parameter λ, der die Glattheit der 

Basislinie bestimmt, wurde auf 10 festgelegt. Für die anderen Parameter wurden die 

Standardwerte belassen (itermax=20, p=0.05, wep=0.1, order=2). Im nächsten 

Schritt wurde die Fläche der Raman Bande bestimmt. Für das Raman-Molekül 4- 

TNB mit der charakteristischen Raman-Bande bei ca. 1340 cm -1 wurden die 

Integrationsgrenzen auf 1320 cm -1 bzw. 1360 cm –1 gesetzt. Im letzten Schritt wurden 

die berechneten Werte visualisiert und ausgegeben. 

5.5.2 Simultane Detektion der Zytokine IL1, IL8 und TNF-α 

Für die Detektion der drei Zielproteine wurden die separierten 4-TNB, 4-MBA und TF- 

MBA-Cluster an polyklonale IL1-, IL8-, und TNFα-Antikörper über das Protein A/G 

gebunden. Dabei wurden fünf verschiedene Konzentrationen von gemischten 

Antigenen (IL1, IL8 und TNFα) auf dem Glasobjektträger immobilisiert (siehe 

Abschnitt 4.6). Das Verhältnis von Antigenen in jeder Mischung war 1:1:1. Es 

befanden sich zum Beispiel bei der maximalen Konzentration 7 ng/ml von IL1-, IL8- 

und TNFα-Antigenen und in der niedrigsten Konzentration 0,5 ng/ml von IL1,IL8 und 

TNFα Antigenen in der Mischung. Nach der Blockierung mit gemischten 

Detektionsantikörpern (gebunden an SERS-NP) und Durchführung der Waschgänge 

154


wurden die Messungen mittels SERS-Mikroskopie durchgeführt. In Abbildung 5.50 

sind die Resultate der Messungen in Form der gemischten Signale von 4-TNB-, 4- 

MBA und TF-MBA-SERS-NP dargestellt. 

Abbildung 5.50: Normierte SERS-Spektren aus 2000 Einzelmessungen beim 

simultanen Nachweis einer 1:1:1-Mischung aus IL-1, IL-8 und TNFα mit Gold- 

Clustern. Zur Kontrolle wurde Rinderserumalbumin an Stelle des Antigens auf dem 

Glasobjektträger blockiert. 

Die Mittelwerte wurden aus fünf Messungen an einem Tag bestimmt. Die ermittelten 

Spektren wurden auf die jeweilige Raman-Bande (4-TNB-Bande um ca. 1340 cm -1 ) 

normiert. Wie in Abbildung 5.50 ersichtlich ist, gibt es einen linearen Zusammenhang 

zwischen den gewählten Zytokinen-Konzentrationen und den entsprechenden 

SERS-Signalen. Auf eine Zerlegung der Spektren und die Ermittlung der einzelnen 

Konzentrationen wurde hierbei verzichtet. Daher wurden die einzelnen detektierten 

Antigene in der Mischung nicht quantifiziert. 


In diesem Kapitel wurde ein Immuno-Assay, basierend auf SERS-Substraten für die 

multiple Detektion von Zytokinen etabliert. Diese Art von Immuno-Assay basiert, wie 

in der Biologie üblich (ELISA), auf der spezifischen Antigen- und Antikörper-Bindung. 

Im Gegensatz zu ELISA wird in diesem Verfahren keine weitere chemische Reaktion 

(z.B. HRP-Aktivität) benötigt. Ein weiterer Unterschied zu Standard-ELISA ist die 

155


Immobilisierung von Antigenen auf flache Glasoberflächen. Es konnte ein rasches 

Auftreten der Sättigungskurve der SERS-Intensität als Funktion der Antigen- 

Konzentration beobachtet werden. Diese Intensitäts-Sättigung wurde ab einer 

Antigen-Konzentration von ca. 7 ng/ml beobachtet und verhinderte die Bildung eines 

breiteren Messbereichs für die Antigen-Konzentrationen. Diese Sättigungen wurden 

in kleinerem Ausmaß auch bei den vorherigen Experimenten mit Au@Ag und auch 

nicht separierten Mischungen aus Monomeren, Dimeren und größeren Aggregaten 

beobachtet. [194] Auf Grund der niedrigeren SERS-Signalstärke dieser Partikel ist 

diese Sättigung erst bei höheren Konzentrationen von ca. 0,05 μg/ml bzw. 0,1 μg/ml 

eingetreten. Der Grund für das Auftreten dieser Sättigung kann die zweidimensionale 

Verteilung der Nanopartikel auf dem Glasobjektträger bei allen Experimenten sein. 

Bei Verwendung von ultra-sensitiven Clustern hat die Breite des abdeckenden 

Antigen-Konzentrationsbereichs im Vergleich zu weiteren SERS-Substraten 

abgenommen. Während bei Standard-Immuno-Assays das Problem der Sättigungen 

mit Verdünnung der Analyten zu beheben ist. Bei diesem Konzept kann eine viel 

größere Oberfläche mit höherer Antigenkonzentration bedeckt werden. So dass 

keine Überlagerungen bei maximaler Konzentration zustande kommen. Ein weiteres 

Problem von dem SERS-Immuno-Assay-Verfahren sind die Hintergrundbeiträge, die 

auch bei den negativen Kontrollen beobachtet wurden. Diese Beiträge konnten bei 

der SERS-Mikroskopie auf dem Gewebe durch BSA-Blockierung zum großen Teil 

vermieden werden. Eine vollständige Vermeidung der Hintergrundbeiträge konnte in 

dieser Arbeit aber noch nicht erzielt werden. Die Detektion der Zytokine in diesem 

Verfahren könnte nur bis zu picomolaren Konzentration etabliert werden. Y. Wang et 

al. haben zwischen SERS-markierter-Antikörpern und als Kontrolle verwendetem 

Protein A/G (anstatt Antigen) keine Interaktionen festgestellt. [196] Wiederum ist der 

Einsatz von glasverkapselten Nanopartikeln ohne Beschichtung mit Adapter-Protein 

undenkbar (Abbildung 5.45C). Daher sollten zur Etablierung eines ultrasensitiven 

SERS-Immunoassays mit glasverkapselten Goldnanoclustern als SERS-Substrat 

weitere Auswege gefunden werden. Der Austausch von Glasobjektträgern durch 

andere Substrate, wie z. B. Polystryrol, die in Standard-ELISA verwendet werden, 

könnte das Problem eventuell lösen. Trotz der genannten Probleme eigneten sich die 

Immuno-Assays basierend auf der SERS-Technologie als gutes Werkzeug für die 

Immundetektion. Die multiple Detektion von Zielproteinen bei Standard-ELISA wird 

zurzeit mit großem Interesse erforscht. Die chemischen Farbreaktionen oder die 

156


Verwendung der Fluorophor-markierten Antikörper ist nur in verschiedenen 

Schächten der ELISA-Platte möglich. Die eingetragenen Korrelationskoeffizienten bei 

drei Proben sind größer als 0,97 und die Standardabweichungen trotz Messung auf 

flache Ebenen recht klein. Angesichts des kleinen Linearitätsbereichs (7 bis 0,5 

ng/ml) könnten sich die SERS-Immuno-Assays als zuverlässigeres Messverfahren 

eignen, was unter gleichen Bedingungen bei den Chemogen-Assays oder den 

Fluorgen-Assays selten der Fall ist. 

157

Zusammenfassung 


Die Nanotechnologie wurde bisher bei verschiedenen Applikationen von der Forensik 

bis hin zur Medizin erfolgreich eingesetzt. [162-165] Die medizinischen Anwendungen als 

Interessensschwerpunkt der vorliegenden Arbeit können grob in zwei Kategorien, 

und zwar Diagnostik und Therapie, unterteilt werden. Durch die nahezu 

grenzenlosen Möglichkeiten nimmt die Anzahl der Applikationen der Nanomedizin 

täglich stark zu. Der Erfolg bei den Anwendungen hängt von der Qualität der 

hergestellten Nanostrukturen und deren Biokompatibilität ab. Die Form und 

Beschaffenheit der Nanostrukturen dürfen für diagnostische oder therapeutische 

Applikationen jeweils unterschiedlich sein. Der entscheidende Erfolgsfaktor bei der 

Umsetzung der wissenschaftlichen Aufgaben liegt jedoch in der Art der 

Biofunktionalisierung und Verleihung der Biokompatibilität an die Nanostrukturen. 

Ohne eine geeignete Kopplung der Biomoleküle an Nanostrukturen können weder 

bei der Diagnostik noch bei der Therapie die Ziele erreicht werden. 

In Abschnitt 5.1 der vorliegenden Arbeit wurde die Herstellung der verschiedenen 

Formen und Größen von Nanopartikeln beschrieben. Die Qualität der 

selbsthergestellten Nanostrukturen wurde kommerziell vorhandenen Materialien, 

soweit diese verfügbar waren, gegenüber gestellt. Es konnte eine reproduzierbare 

Herstellung der Nanopartikel, wie 10 und 60 nm Goldkolloide, Silber und Gold/Silber- 

Nanoschalen, mit optimaler Qualität gezeigt werden. Die 10 und 60 nm Goldkolloide 

wurden als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Goldnanosternen und 

Goldnanoclustern verwendet. [176-178] Diese Nanostrukturen können als optimale 

SERS-Substrate zum Nachweis von Biomolekülen eingesetzt werden. Es wurden für 

Laseranregung (λ = 632.8 nm) optimal geeignete SERS-Substrate gesucht. [124] 

Desweiteren wurde die Stöber-Methode für die Glasverkapselung der SERS- 

Substrate, die sich nur schwer verkapseln lassen, mit APTMS weiter modifiziert. 

Im theoretischen Hintergrund-Teil wurde die elektromagnetische Feldverstärkung 

durch räumliche Nähe der Nanopartikel und Bildung der hot spots aufgezeigt 

(Abschnitt 2.1.2). Solche Nanopartikel-Konfigurationen ermöglichen den Nachweis 

eines einzelnen Moleküls. [119-121] In der vorliegenden Arbeit wurde die Durchführung 

einer unkontrollierten Aggregation bei Goldkolloiden beschrieben. Zur Isolierung der 

ultrasensitiven Goldnanocluster wurden zwei verschiedene Trennmethoden mit 

Glycerin mittels Dichtegradientenzentrifugation etabliert und reproduzierbar 

158


durchgeführt. Durch die SERS-Mikroskopie auf einem Silizium-Wafer wurde die 

Signal-Intensität der ultrasensitiven Goldnanocluster als Dimer und Trimer der von 

Monomeren gegenüber gestellt. Die Goldnanocluster konnten als einzelne Partikel 

innerhalb von 30 Millisekunden auf dem Silizium-Wafer wahrgenommen werden. In 

weiteren Experimenten wurden die glasverkapselten Nanocluster als SERS- 

Substrate verwendet und zur Lokalisierung der p63-Proteine des Prostatagewebes 

verwendet. Die p63-Proteine konnten mit einer Belichtungszeit von nur 30 

Millisekunden nachgewiesen werden. Für die diagnostische Applikation der 

glasverkapselten und auch nicht verkapselten Nanopartikel wurden zwei 

verschiedene Biofunktionalisierungsmethoden etabliert. Für die Kopplung der 

Antikörper an nicht verkapselte Gold/Silber-Nanoschalen oder Goldnanosterne wurde 

die s-NHS/EDC Cross-Linking-Methode modifiziert. Durch diese Modifikation konnte 

die Aggregation der Nanopartikel hervorragend minimiert werden. Dabei konnte der 

Erfolg der kovalenten Kopplung der Antikörper durch HRP-Aktivität nachgewiesen 

werden. Anhand der HRP-Aktivität der Immuno-SERS-Marker in diesem Experiment 

konnte die Anzahl der gebundenen Immunoglobulin-Moleküle an drei verschiedenen 

Tagen ermittelt werden. Die s-NHS/EDC-Aktivierung der glasverkapselten 

Nanopartikel für die Proteinkopplungen durfte erst nach der Aminofunktionalisierung 

und C4-Verlängerung mit Bernsteinsäureanhydrid durchgeführt werden. Die 

Inkubationsdauer und notwendige Menge an Chemikalien sollte für die 

Aminofunktionalisierung und C4-Verlängerung genau eingestellt werden. Kleine 

Abweichungen von den etablierten Vorschriften führten zu starken Aggregationen. 

Nach Bildung der Aggregate ist eine diagnostische Applikation nicht mehr möglich. 

Die Kopplung der Antikörper an Glasoberflächen wurde indirekt über ein Adapter- 

Protein durchgeführt. 

Die Qualität der Bildgebung bei der SERS-Mikroskopie hängt von verschiedenen 

Faktoren wie die Anzahl der eingesetzten Immuno-SERS-Marker, der Inkubationszeit 

des Gewebes mit den Immuno-SERS-Markerm, der verwendeten Antigendemaskierungsmethode 

und auch dem Blockierungspuffer ab (Abschnitt 5.2). Zur 

Etablierung der SERS-Mikroskopie wurden die mit α-PSA und α-p63 konjugierten- 

SERS-Marker insgesamt mit vier verschiedenen Antigendemaskierungsmethoden 

und mehr als zehn verschiedenen Blockierungspuffern an verschiedenen Tagen 

ausgetestet. Die Ergebnisse der SERS-Mikroskopie zeigen, dass die optimalen 

159


Antigendemaskierungsmethoden für PSA und p63 unterschiedlich sind. Beim 

Nachweis der einzelnen Proteine wurde die jeweils optimale 

Antigendemaskierungsmethode angewandt, und für die Doppel-Färbung wurde die 

optimale Methode zum Nachweis von p63 bevorzugt. Die erzielten SERS- 

Mikroskopie-Ergebnisse hängen minimal von der Beschaffenheit der Oberflächen 

(mit oder ohne Glasverkapselung) der Nanopartikel ab. Die Qualität der Ergebnisse 

der durchgeführten SERS-Mikroskopie-Experimente mit verschiedenen SERS- 

Substraten hängt eher von den Blockierungspuffern und verwendeten 

Antigendemaskierungsmethoden ab. Das beweist, dass durch im Rahmen dieser 

Arbeit etablierte Biofunktionalisierungsmethoden an verschiedenen SERS- 

Substraten eine hohe Biokompatibilität verliehen wurde. 

Im Abschnitt 5.3 wurden die Zuverlässigkeit und die Reproduzierbarkeit der 

Methoden beim Nachweis von p63-Proteinen auf die Probe gestellt. Das p63-Protein 

als Krebs-Marker wird nur in Basalzellen des gesunden Prostatagewebes exprimiert. 

Die Ergebnisse belegen, dass die Immuno-SERS-Marker an Basalzellen gebunden 

sind. Die Immuno-SERS-Marker zeigen keine oder geringe Bindungen an Bereiche 

wie Epithelium oder Stroma. Bei den durchgeführten negativen Kontrollen konnten 

ebenfalls keine oder nur geringe Bindungen der Immuno-SERS-Marker beobachtet 

werden. Durch den Einsatz der SE-CARS-Mikroskopie konnte die spezifische 

Bindung der Immuno-SERS-Marker auf einer größeren Fläche nachgewiesen 

werden. Im weiteren Verlauf wurden zur Durchführung der SERS-Mikroskopie in 

separaten Untersuchungen glasverkapselte und nicht verkapselte Gold/Silber- 

Nanoschalen als SERS-Substrate verwendet. Bei der Gegenüberstellung der 

Ergebnisse wurde deutlich, dass sowohl die unspezifischen Bindungen als auch die 

SERS-Intensität bei glasverkapselten Immuno-SERS-Markern niedriger sind. Es 

besteht durchaus Grund zu der Annahme, dass die Glasverkapselung als 

Isolationsschicht die Bildung der hot spots verhindern kann. 

In Abschnitt 5.4 sind die Ergebnisse der Zwei-Farben-SERS-Bildgebung dargestellt. 

Die durchgeführten Zwei-Farben-SERS-Experimente mit nicht verkapselten 

Gold/Silber-Nanoschalen zeigen im Vergleich zu den eingesetzten verkapselten 

Goldnanoclustern mehr unspezifische Bindungen. Die hydrophil stabilisierten SAMs 

wurden im Gegensatz zu Goldnanoclustern simultan auf dem Gewebe blockiert. Die 

Untersuchungen von J. Kneipp et al. belegen, dass ein Austausch der Raman- 

160


Marker zwischen nicht verkapselten SERS-Substraten möglich ist. [192] Bei den 

durchgeführten Zwei-Farben-SERS-Experimenten sind die Goldnanocluster mit einer 

ca. 30 nm Glasschicht versiegelt und ein Austausch der Raman-Moleküle oder eine 

elektromagnetische Feldverstärkung zwischen den verkapselten Nanostrukturen ist 

ausgeschlossen. 

Im Abschnitt 5.5 wurden die verkapselten Goldnanocluster zur Detektion und 

Quantifizierung der Zytokine IL1, IL8 und TNF-α eingesetzt. Die eingetragenen 

Korrelationskoeffizienten sind bei drei Proben größer als 0,97 und die Standard- 

Abweichungen sind trotz Messung auf der ebenen Substraten recht klein. Die 

simultane Detektion der Zytokine IL1, IL8 und TNF-α konnte bis zu picomolaren 

Konzentrationen gemessen werden. Die Hintergrundbeiträge während des SERS- 

Immuno-Assays konnten mit der Blockierung der Oberflächen nicht, wie bei der 

SERS-Mikroskopie auf dem Gewebe vollständig behoben werden. Es konnte keine 

bessere Nachweisgrenze erzielt werden, da zwischen femtomolaren Konzentrationen 

und negativen Kontrollen keine Differenz feststellbar war. 

161

Summary 

Summary 

Currently, nanotechnology is successfully used in numerous different applications 

including forensics and medicine. [162-165] Medical applications as a focus of interest in 

the present work can be divided into two categories: diagnostic and therapeutic. The 

shape, appearance and nature of nanostructures can vary for diagnostic applications. 

However, the pivotal factor for success of scientific tasks depends on the quality of 

biofunctionalization and the biocompatibility of the nanostructures after 

biofunctionalization. Without suitable cross linking agents and methods for the 

conjugation of biomolecules on nanostructures, the diagnostic and therapeutic aims 

cannot be achieved. 

The production of various shapes and sizes of nanoparticles has been described in 

chapter 5.1. The quality of the nanostructures has been compared with commercially 

available materials. The reproducible production of nanoparticles, such as 10 and 60 

nm colloidal gold, silver, and hollow gold/silver nanoshells, is achieved in this study. 

The 10 and 60 nm gold colloids have been used as a starting material for the 

preparation of gold nanoparticles, gold nanostars and gold nanoclusters. [176-178] 

These nanostructures can be used as the optimal SERS substrates for the detection 

of biomolecules by immunohistochemistry and immunoassay. The extinction 

maximum of 60 nm Au/Ag nanoshells is tunable in the range of 600–700 nm. Since 

the position of the plasmon band of Au/Ag nanoshells can be tuned for maximum 

SERS enhancement upon red (λ = 632.8 nm) laser excitation, they are well suited as 

a reference material for immunohistochemistry. For Raman reporter molecules which 

are difficult to be encapsulated directly by TEOS, a generic approach based on the 

use of APTMS for non-covalent binding to the SAM is used in an adjusted method to 

yield optimal aggregation of gold colloid in this study. The aggregated colloid 

contains large amounts of small clusters such as dimers and trimers. The 

enhancement of electromagnetic field of the hotspots due to their spatial proximity is 

explained in the theoretical background (chapter 2.1.2). These nanoparticles (gold 

nanoclusters), as has been shown before, allow the detection of a single 

molecule. [119-120] The preparation of optimal and uncontrolled aggregation of gold 

nanoparticles using salt and APTMS is described in this study. Two different methods 

have been developed for the separation of clusters by density gradient centrifugation 

162

Summary 

using glycerol/water mixtures. Furthermore, SERS-microscopy on a silicon wafer is 

employed for the comparison of SERS-signals from single monomers, dimers and 

trimers. [38] Both dimers and trimers can be detected as single particles within 30 

milliseconds integration time on the silicon wafer. In further experiments, this type of 

SERS clusters was used as SERS-substrate for the localization of p63 proteins on 

healthy prostate tissue. The p63 proteins could be detected by the same exposure 

time (30 milliseconds) employing rapid immuno-SERS microscopy. 

Two different biofunctionalization methods were established for each kind of glassencapsulated 

or non-encapsulated nanoparticle. The cross-linking method by usage 

of s-NHS/EDC was modified for conjugating proteins to hollow gold/silver nanoshells 

or gold nanostars. Indeed this modification could minimize the aggregation of 

nanoparticles during and after cross-linking. The success of the covalent binding of 

the antibodies was demonstrated by measurement of Hrp-activity of Hrp-IgG bound 

to the nanoparticles. The number of bound Hrp-IgG molecules on immuno-SERS was 

determined in a reproducible manner and yields the same value on three different 

days. 

The s-NHS/EDC-cross linking method on glass-encapsulated nanoparticles can be 

achieved after the amino functionalization and C4 elongation with succinic anhydride. 

The incubation time and the necessary amount of chemicals should be precisely 

adjusted for the amino functionalization and C4 elongation. It was observed that 

small deviations of the established protocols led to strong aggregation of 

nanoparticles. After formation of the irreversible aggregates of glass-encapsulated 

nanoparticles, the diagnostic application becomes infeasible. 

As an alternative to covalent conjugation chemistry, the noncovalent binding of the 

antibody to the SERS particles via an adapter protein (protein G/A) was established 

in this work. 

It was observed that the quality of imaging in SERS microscopy depends on various 

factors, such as the number of immuno-SERS markers, the incubation time of 

immuno-SERS particle-conjugates, the antigen retrieval method and the kind of 

blocking buffer (chapter 5.2). The α-PSA and α-p63 immuno-SERS markers were 

tested with four different antigen retrieval methods and more than ten different 

163

Summary 

blocking buffers on different days to establish SERS microscopy. The results of 

SERS microscopy proved that the optimum antigen retrieval method for each protein 

(PSA and p63) is different. The optimal antigen retrieval method was used to detect 

individual proteins at first to establish the SERS-microscopy method. The antigen 

unmasking method for the detection of p63 protein was employed for multiplexing 

both proteins (p63 and PSA). 

The results of this research show that the quality of imaging by SERS-microscopy 

depends less on the nature of their surface (with or without a glass encapsulation) 

than previously thought. In fact, this quality depends more on the blocking buffer and 

antigen retrieval method. This proves that the adjustment of biofunctionalization 

protocols yielded SERS particle-antibody-conjugates with high biocompatibility for 

different SERS substrates. The reliability and reproducibility of the methods for the 

localization of p63 proteins were proved in chapter 5.3. The p63 protein as a cancer 

marker is only expressed in the basal cells of healthy prostate tissue. The results 

demonstrate that the immuno-SERS marker attaches to the basal cells of prostate 

tissue. The immuno-SERS marker show less or no binding to other areas such as 

epithelium or stroma. The result of negative controls shows also less or no binding of 

immuno-SERS NPs to the tissue. The specific binding of α-p63-immuno-SERS NPs 

on a larger area could be tested and observed with SE-CARS microscopy. The 

localization of proteins (PSA and p63) on the tissue was possible by both silicaencapsulated 

and non-encapsulated nanoshells. 

The comparison of the results shows that both non-specific binding and SERS 

intensity are lower by the use of silica-encapsulated nanoshells. A possible reason 

for it could be that the glass shell between two nanoparticles acts as an isolating 

layer to prevent plasmonic coupling and the formation of hotspots. A different 

explanation is that the glass-encapsulated SERS particles contain fewer Raman 

reporter molecules on the surface of the Au/Ag nanoshells. 

The multiplexing results of tissue imaging with glass-encapsulated and nonencapsulated 

nanoshells are summarized in chapter 5.4. It has been shown that nonspecific 

binding of non-encapsulated nanoparticles occurs more frequently than 

glass-encapsulated nanoparticles. The investigations of J. Kneipp et al. 

demonstrated a possibility of replacement of the Raman label between non- 

164

Summary 

encapsulated SERS substrates. [192] Such a molecule replacement is not possible in 

the same experiment, in which glass-encapsulated nanoclusters (30 nm layer of 

glass as an isolator) were used as SERS-substrate. 

The glass-encapsulated gold nanoclusters were used again for detection and 

quantification of cytokines (IL1, IL8 and TNF-α) in an immuno-SERS assay described 

in chapter 5.5. The correlation coefficients of the measured standard curve in the 

three samples are greater than 0.97 and the standard deviations are small. The 

simultaneous detection of the cytokines IL1, IL8 and TNF-α could be established 

down to ca. 0.3 picomolar concentrations. The background contributions during this 

SERS immunoassay could not be completely eliminated after using blocking buffer 

with SERS-Microscopy on tissue. 

165

Abkürzungsverzeichnis 

Akronyme aus dem Englischen (Deutsche Übersetzung) 

CCD 

NA 

NIR 

SEM 

SAM 

SERS 

SERRS 

TEM 

UV 

Vis 

charge-coupled device (ladungsgekoppeltes Bauteil) 

numerical aperture (numerische Apertur) 

near infrared (Nahes Infrarot) 

scanning electron microscopy (Raster-Elektronenmikroskopie, REM) 

self-assembled monolayer (selbstorganisierte Monolage) 

surface-enhanced Raman scattering (oberfl.-verstärkte Raman-Streuung) 

surface-enhanced resonance Raman scattering (oberfl. Resonanz- 

Raman-Streuung) 

transmission electron microscopy (Transmissions- 

Elektronenmikroskopie) 

ultraviolet (ultravioletter Spektralbereich) 

visible (sichtbarer Spektralbereich) 

Einheiten 

°C Grad Celsius 

cm Zentimeter 

g Erdbeschleunigung 

M molar 

mm Millimeter 

MΩ Megaohm 

min Minute(n) 

mW Milliwatt 

nm Nanometer 

rpm Umdrehungen pro Minute 

µl Mikroliter 

166

Proteine: 

BSA 

Pr A/G 

mAK 

pAK 

IL 

IgG 

HRP 

Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin) 

Rekombinantes Protein A/G 

Monoklonale Antikörper 

Polyklonale Antikörper 

Interleukine 

Immunglobulin G 

Meerrettichperoxidase 

Chemikalien: 

APTMS 

BMBA 

DMF 

DTNB 

4-MBA 

EDC 

EDTA 

HAuCl 4 

HEPES 

MEG 

TEG 

NaBH4 

NH4OH 

SEMA4 

SiO2 

TEOS 

TF-MBA 

PEG-8 

PVP 

s-NHS 

3-Amino-n-propyltrimethoxysilan 

2-Bromo-4-mercaptobenzoesäure 

N,N-Dimethylformamid 

5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) 

4-Mercaptobenzoesäure 

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 

Ethylendiamintetraessig säure 

Tetrachlorogoldsäure 

2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure 

Monoethylenglykol 

Triethylenglykol 

Natriumborhydrid 

Ammoniumhydroxid 

[S-4-((4-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethylcarbamoyl)phenyl)-ethynyl)phenyl 

ethanethioate] 

Silica 

Tetraethoxysilan 

2,3,5,6-Tetrafluoro-4-mercaptobenzoesäure 

Carboxy-PEG 8 -Amin 

Polyvinylpyrrolidon 

N-Hydroxysulfosuccinimide Natriumsalz 

167

Literaturverzeichnis 


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Publikationen 

Begutachtete Zeitschriftenbeiträge: 

1- M. Salehi, D. Steinigeweg, P. Ströbel, A. Marx, J. Packeisen, S. Schlücker. Rapid 

Immuno-SERS Microscopy for Tissue Imaging with Single Nanoparticle Sensitivity, J. 

Biophotonics. 7. doi: 10.1002/jbio.201200148 (2012). 

2- Y. Wang, M. Salehi, M. Schütz, K. Rudi, S. Schlücker. Microspectroscopic SERS 

Detection of Interleukin-6 with Rationally Designed Gold/Silver Nanoshells, Analyst. 

6, 1764-71 (2013). 

3- M. Gellner, D. Steinigeweg, S. Ichilmann, M. Salehi, M. Schütz, K. Kömpe, M. 

Haase, S. Schlücker, 3D Self-Assembled Plasmonic Superstructures of Gold 

Nanospheres: Synthesis and Characterization at the Single Particle Level. Small. 24, 

3445–3451 (2011). 

4- S. Schluecker, M. Salehi, G. Bergner, M. Schütz, P. Ströbel, A. Marx, I. Petersen, 

B. Dietzek, J. Popp, Immuno-SECARS Microscopy: Immunohistochemistry with 

SERS-Labeled Antibodies and CARS Microscopy. Anal. Chem. 83, 7081-7085 

(2011). 

5- D. Steinigeweg, M.Schütz, M. Salehi, S. Schlücker, Fast and Cost-Effective 

Purification of Gold Nanoparticles in the 20-250 nm Size Range by Continuous 

Density Gradient Centrifugation. Small, 7, 2443-2448 (2011). 

6- M. Schütz, D. Steinigeweg, M. Salehi, K. Kömpe, S. Schlücker, Hydrophilically 

stabilized gold nanostars as SERS labels for tissue imaging of the tumor suppressor 

p63 by immuno-SERS microscopy, Chem. Comm. 47, 4216-4218 (2011). 

7- M. Schütz, C. I. Müller, M. Salehi, C. Lambert, S. Schlücker, Design and synthesis 

of Raman reporter molecules for tissue imaging by immuno-SERS microscopy, J. 

Biophoton. 4, 453-463 (2011). 

Nicht begutachtete Zeitschriftenbeiträge: 

1- M. Salehi, P. Ströbel, A. Marx, J. Packeisen, S. Schlücker, High Quality Two-Color 

SERS Microscopy for Protein Colocalization in Prostate Tissue with Primary 

Antibody-Protein G/A-Gold Nanocluster Conjugates (in press).

2- CM. Muntean, M. Salehi, S. Niebling, B. Walkenfort,The influence of divalent metal 

ions on low pH induced LacDNA structural changes as probed with ultraviolet(275 

nm) resonance raman spectroscopy. (in press). 

Unabhängig von der Dissertation: 

J. Müller, B. Iserman, I. Dücker, M. Salehi, B. Pötzsch, An exosite-specific ssDNA 

aptamer inhibits the anticoagulant functions of activated protein C and alters 

protease inhibition by protein C inhibitor in a glycosaminglycanlike fashion. Chem 

Biol. 16, 442-451. 2009.

Danksagung 

An dieser Stelle möchte ich mich bei all jenen Menschen bedanken, die mich 

während der Anfertigung meiner Promotion auf vielfältige Art und Weise unterstützt 

haben. 

Als Erstes danke ich Herrn Professor Sebastian Schlücker, der mir die Möglichkeit 

zur Promotion gegeben hat. Ich danke ihm für die freundliche Aufnahme in seine 

Arbeitsgruppe, das interessante Thema mit der vielseitigen Aufgabenstellung und die 

hervorragende Betreuung. Er hat mir beigebraucht, wie man als Wissenschaftler 

seine Aufgaben erkennen und bewältigen muss. Er hat mich kontinuierlich unterstützt 

und auch in schwierigen Situationen mit mir nach Lösungen gesucht und Auswege 

gefunden. Von ihm habe ich gelernt, geduldig zu sein. 

Ich danke Herrn PD. Dr. Jens Packeisen, für die Übernahme des Zweitgutachtens 

und Vermittlung von pathologischem Fachwissens. Ich danke auch seine 

Mitarbeiterinnen Frauen C. Vodde und R. Künneken, die mich bei der Präparation 

der Proben permanent unterstützt haben. 

Ich bedanke mich bei Frau Professor Hildgund Schrempf, für das Interesse an 

meiner Dissertation und auch viele hilfreiche Ratschläge zur Etablierung der 

Methoden aus biologischer Sicht. 

Ich bedanke mich bei Astrid Vochtel, Katharina Rudi und Herrn Dr. Axel Hoffmann für 

das Korrekturlesen meiner Arbeit. 

Die Hilfsbereitschaft von Bernd Walkenfort werde ich ebenfalls nie vergessen. Er hat 

mir den Umgang mit zahlreichen Geräten beigebracht und hat sich trotz vieler 

anderer Aufgaben immer für mich Zeit genommen. 

Bei allen derzeitigen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe - Max, Lena, 

Christoph, Sunil, Yuling, Wei, Lilli und Stephan - bedanke ich mich für die 

freundschaftliche Atmosphäre und ausdauernde Hilfsbereitschaft, die eine 

angenehme Zusammenarbeit ermöglichten. Mein besonderer Dank gilt Katharina 

Rudi und Andreas Bröermann, die mich besonders in der Endphase der Dissertation 

in jeglicher Hinsicht tatkräftig unterstützt haben. 

Ich möchte auch die Gelegenheit nutzen, um meiner Familie für ihre Unterstützung 

und ihr Verständnis in den vielen Stunden meiner Abwesenheit meinen tiefsten Dank 

auszusprechen.

Erklärung 

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die Dissertation 

„Entwicklung und Einsatz der Immun-SERS-Mikroskopie zur Gewebe-basierten 

Tumordiagnostik“ 

selbständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und 

Hilfsmittel benutzt habe. 

Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation weder in gleicher oder anderer Form 

bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat. 

Ich habe früher außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten 

Graden keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht. 

Osnabrück, den 15,04,2013 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 

(Mohammad Salehi)

1 Einleitung - repOSitorium - Universität Osnabrück

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