Arbeitsanleitung alpha-Amylase Saliva Assay - IBL international

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alpha-Amylase Saliva Assay (RE80111) DEUTSCH 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 8. Alpha-Amylase ist in Schweiß und Speichel enthalten. Daher während der Testdurchführung Handschuhe tragen und nicht mit dem Mund pipettieren. 10. TESTVORBEREITUNGEN 10.1. Vorbereitung konzentrierter Komponenten Komponente Verhältnis Diluent Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit Probenpuffer DILBUF CONC 1:10 bidest. Wasser z.B. 10 mL Probenpuffer + 90 mL bidest. Wasser Ohne Schaumbildung mischen. 2-8°C 4 Wochen 10.2. Vorbereitung lyophilisierter Komonenten Komponente mit Diluent Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit CAL LYO 200 µL Verdünnter 15 min stehen lassen. 2-8°C 7 Tage CONTROL 1+2 LYO 200 µL Probenpuffer Ohne Schaumbildung mischen. 2-8°C 7 Tage 10.3. Vorbereitung der Standardreihe Der rekonstituierte Stockstandard muss 1:301 mit verdünntem Probenpuffer verdünnt werden. Dies ergibt den Standard 1. Aus diesem wird durch serielle Verdünnung wie im folgenden Beispiel eine Standardreihe erstellt. Name Verhältnis Diluent Bemerkungen Standard 1 1:301 Standard 2 1:2 Standard 3 1:2 Standard 4 1:2 Standard 5 - Verdünnter Probenpuffer Verdünnter Probenpuffer Verdünnter Probenpuffer Verdünnter Probenpuffer Verdünnter Probenpuffer 10 µL rekonstituierter Stockstandard + 3 mL verdünnter Probenpuffer Vor der nächsten Verdünnung gründlich mischen. 100 µL Standard 1 + 100 µL verdünnter Probenpuffer Vor der nächsten Verdünnung gründlich mischen. 100 µL Standard 2 + 100 µL verdünnter Probenpuffer Vor der nächsten Verdünnung gründlich mischen. 100 µL Standard 3 + 100 µL verdünnter Probenpuffer Gründlich mischen. Nur verdünnter Probenpuffer Berechnung U/mL s. Fläschenetikett z.B.: 400 U/mL z.B.: 200 U/mL z.B.: 100 U/mL z.B.: 50 U/mL 0 U/mL 10.4. Verdünnung der Kontrollen und Proben Proben und rekonstituierte Kontrollen müssen wie folgt verdünnt werden: Verhältnis Diluent Bemerkungen Probe 1:301 Verdünnter z.B.: 10 µL Probe (Saliva) + 3 mL verdünnter Probenpuffer. Probenpuffer Nach Verdünnung gründlich mischen. Kontrollen 1:301 Verdünnter z.B.: 10 µL Kontrolle (rekonstituiert) + 3 mL verdünnter Probenpuffer. Probenpuffer Nach Verdünnung gründlich mischen. Proben mit Konzentrationen über dem höchsten Standard müssen weiter verdünnt werden. Version V2012-02 3 / 5
alpha-Amylase Saliva Assay (RE80111) DEUTSCH 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Je 10 µL von jedem vorverdünnten Standard, jeder vorverdünnten Kontrolle und vorverdünnten Patientenprobe in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Je 200 µL der Substratlösung in jedes Well pipettieren. Für die Zugabe der Substratlösung wird die Verwendung einer 8-Kanal-Mikropipette empfohlen. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. 3. 3 min bei Raumtemperatur (18-25°C) inkubieren. 4. 1. Messung: Optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei 405 nm messen (Referenzwellenlänge 600 -690 nm). 5. Während der Inkubation wird das Substrat von der in den Proben enthaltenen Alpha-Amylase spezifisch umgesetzt. Eine gute Differenzierung innerhalb der Standardkurve ist für die Auswertung von großer Bedeutung. Allerdings sollte die OD des höchsten Standards 2.900 nicht überschreiten! Die Entwicklung der OD sollte daher während des Tests regelmäßig kontrolliert werden. Dies ist besonders bei hoher Raumtemperatur wichtig. 6. Weitere 5 min bei Raumtemperatur (18-25°C) inkubieren (gesamte Inkubationszeit 8 min.). Bei hoher Raumtemperatur oder erstmaliger Verwendung des Assays wird eine zusätzliche Messung nach 3 min. (Gesamtzeit 6 min.) empfohlen. 7. 2. Messung: Optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei 405 nm messen (Referenzwellenlänge 600 -690 nm). 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP- Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Zunächst das Delta-OD für jeden Standard, Kontrolle und Probe ermitteln. Dafür wird die OD der 1. Messung von der der jeweiligen 2. Messung abgezogen. Die erhaltenen Delta-OD der Standards (y-Achse, linear) gegen deren Konzentration (x-Achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (lin-log) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Alpha-Amylase-Aktivitäten der Proben können von der Standardkurve direkt abgelesen werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Bei Fragen zur Auswertung kontaktieren Sie IBL. Die Ergebnisse werden in U/mL ausgedrückt. Zur Umrechnung in Internationale Einheitern (SI) sind die Ergebnisse mit dem Faktor 0.01667 zu multiplizieren. Die so erhaltenen Ergebnisse haben die Einheit nKat/L. Version V2012-02 4 / 5
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