Rotavirus Latextest D - mibius

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WICHTIGE HINWEISE ZUR HANDHABUNG 1. Nach längeren Lagerungszeiten kann es zu Aggregations- oder Austrocknungserscheinungen des Latex im oberen Bereich des Fläschchens kommen. In diesem Fall sollte das Latexfläschchen einige Minuten lang vorsichtig geschwenkt werden, bis die Reagenzien wieder vollständig suspendiert sind. NICHT EINFRIEREN. 2. Die Reagenzien nicht über das angegebene Verfallsdatum hinaus verwenden. 3. Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen oder anderer Hersteller verwenden. 4. Die Patientenproben, das Positive Kontroll-Antigen und alle Materialien, die mit diesen Materialien in Berührung kommen, müssen als potenziell infektiös gehandhabt und mit der entsprechenden Vorsicht entsorgt werden. 5. Niemals mit dem Mund pipettieren. 6. Eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien ist zu vermeiden, da es andernfalls zu falschen Ergebnissen kommen kann. 7. Alle Reagenzien müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (vorzugsweise auf 18 - 25°C) gebracht werden. 8. Eine Kreuzkontamination der Proben ist zu vermeiden, da es andernfalls zu falsch-positiven Reaktionen kommen kann. 9. Verschüttete oder verspritzte potenziell infektiöse Materialien müssen mit einer 1%igen Natriumhypochlorit-Lösung dekontaminiert werden. Alle zur Untersuchung der Proben verwendeten Materialien sollten als infektiös entsorgt werden, vorzugsweise durch Autoklavieren bei 121°C, 20 Minuten lang. PROBENENTNAHME, TRANSPORT UND LAGERUNG Die Stuhlprobe in einen sauberen Plastik- oder Glasbehälter entnehmen. Eine Probe kann auch von einer gebrauchten Windel entnommen werden. Für die Testdurchführung ist ein Mindestvolumen von 0,1 ml erforderlich. Abstrichproben sind nicht zu empfehlen, da die Stuhlmenge nur schwer festzustellen ist. Kann die Probenentnahme jedoch nicht anders erfolgen, sollte die Untersuchung wie im Abschnitt Testdurchführung beschrieben durchgeführt werden. Die Probe sollte nicht zusammen mit potenziell interferierenden Materialien wie Detergenzien oder Gewebekulturmedien verwendet werden, die aufgrund ihres Kälber- bzw. Rinderserumgehaltes möglicherweise Rotavirus-Antikörper enthalten. Um eine maximale Sensitivität des Testsystems zu erreichen, sollten die Stuhlproben innerhalb eines Zeitraumes von 3 bis 5 Tagen nach Einsetzen der Symptome entnommen werden, da in dieser Phase die Anzahl der Rotaviren am höchsten ist. Proben, die 8 Tage oder später nach Einsetzen der Symptome entnommen wurden, enthalten möglicherweise keine ausreichende Menge an nachweisbarem Antigen 1,2,4,10,11 . Die Proben sollten so bald wie möglich getestet werden. Sie können jedoch über Nacht bei 2 - 8°C oder tiefgefroren bei -15°– -25°C gelagert werden, falls eine längere Lagerungszeit erforderlich ist. Dennoch kann bei Verwendung von zuvor tiefgefrorenen Proben ein Sensitivitätsverlust des Testverfahrens eintreten. Diese Proben nicht wiederholt einfrieren und wieder auftauen. Zur Lagerung möglichst keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden. Für den Transport zur Untersuchung in einem Labor sollten die Proben unmittelbar mit Kältepackungen verpackt werden 15 . Mekonium-Proben und Stuhlproben von Neugeborenen, die jünger als einen Monat alt sind, wurden nicht ausreichend validiert und sind daher nicht als Proben zu empfehlen. TESTVERFAHREN MITGELIEFERTE MATERIALIEN Der Rotavirus Latextest enthält ausreichend Material für die Durchführung von 25 Tests (siehe Abschnitt Inhalt des Kits). BENÖTIGTE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN Spatel oder Probenentnahmestäbchen. Plastik- oder Glasentnahmebehälter für die Proben. • Vortex-Mischer. Zentrifugenröhrchen (2 ml oder größer) mit Stopfer oder Schraubverschluß, mit einem Widerstand von 1000 x g. • Laborzentrifuge mit einer Mindestgeschwindigkeit von 1000 x g* (muss nicht gekühlt werden). Stoppuhr (2 Minuten). • Stuhlproben, negativ für Rotavirus, zur Verwendung bei der Qualitätskontrolle. * g = 1,12 x 10-5 x (U/min)2 x R (R = Radius des Zentrifugenarmes bzw. -kopfes) TESTDURCHFÜHRUNG Schritt 1 Während der Probenbearbeitung alle Reagenzien auf Raumtemperatur (vorzugsweise auf 18 - 25°C) bringen. Schritt 2 Eine ca. 10%ige Suspension der Probe in Extraktionspuffer herstellen. Diesen Schritt durch Überführen von 1 ml Extraktionspuffer (2 Teile 0,5 ml aus dem kalibrierten Tropfer in dem Fläschchen) in ein Zentrifugenröhrchen durchführen. Mit einem Spatel oder einem Probenentnahmestäbchen ca. 0,1 ml Stuhlprobe, d.h. etwa ein Zehntel des Volumens des Extraktionspuffers, hinzufügen, das Röhrchen verschließen und zum Homogenisieren des Pellet auf dem Vortex mischen. Mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur (vorzugsweise bei 18 - 25°C) stehen lassen und danach bei 1000 x g 10 Minuten lang zentrifugieren. Der Überstand kann bei 2 - 8°C bis zu 3 Tage lang oder zur Lagerung über einen längeren Zeitraum bei -15° - -25°C gelagert werden. Das Extrakt nicht auftauen und wieder einfrieren, da dies die Sensitivität des Tests beeinträchtigen kann. Wird eine Abstrichprobe verwendet, den Tupfer in ein kleines Röhrchen mit 1 ml Extraktionspuffer geben und gründlich mischen. Den Tupfer herausnehmen und wie oben beschrieben zentrifugieren. Zur Vermeidung von nicht spezifischen Reaktionen muss ein klarer Überstand gewonnen werden. Falls nötig, erneut zentrifugieren und anschließend die Probe wie beschrieben bearbeiten. Schritt 3 Mit einem der mitgelieferten Einwegtropfer je 1 Tropfen des Probenüberstandes auf beide Kreise auf der Karte geben. Darauf achten, dass die Proben korrekt identifiziert werden. Schritt 4 Die Latexreagenzien schütteln und jeweils 1 Teil (40 µl) des Testlatex bzw. des Kontroll-Latex neben jeweils einen Tropfen des Überstandes geben. Schritt 5 Für jede Probe den Inhalt jedes Kreises mit einem separaten Rührstäbchen mischen. Die Mischung so verteilen, dass der ganze Kreis so vollständig wie möglich ausgefüllt ist. Darauf achten, dass keine der Proben über den Kreisrand hinausläuft, da andernfalls eine Kreuzkontamination zu falschen Ergebnissen führen kann. Jedes Rührstäbchen nach Gebrauch entsorgen. Schritt 6 Die Karte vorsichtig schwenken und beobachten, ob es innerhalb von 2 Minuten zu einer Agglutination kommt. Dabei die Karte in normalem Leseabstand (25 - 35 cm) von den Augen entfernt halten. Kein Vergrößerungsglas verwenden. Die erhaltenen Muster zeichnen sich deutlich ab und können unter normalen Lichtverhältnissen erkannt werden. Schritt 7 Die Karte sicher entsorgen - nicht wiederverwenden. ERGEBNISSE ABLESEN DER ERGEBNISSE Ein positives Ergebnis wird durch Auftreten einer Agglutination, die innerhalb von 2 Minuten nach dem Mischen des Latex mit dem Stuhlextrakt eine deutlich sichtbare Verklumpung der Latexpartikel aufweist, angezeigt. Die Schnelligkeit und die Qualität der Agglutination hängen von der Konzentration des Antigens ab. Es kann z. B. innerhalb weniger Sekunden nach dem Mischen zu einer starken Verklumpung oder zu einer langsamer eintretenden, schwachen Verklumpung kommen. (Siehe Abbildung 1). 2
Bei einem negativen Ergebnis agglutiniert der Latex nicht, und das milchige Aussehen bleibt während des zweiminütigen Tests im wesentlichen unverändert. In den negativen Mustern können jedoch leichte Spuren von granulierten Strukturen beobachtet werden, was jedoch von der Sehschärfe des Bedieners abhängt. (Siehe Abbildung 2). Abbildung 1 Abbildung 2 QUALITÄTSKONTROLLE Reagieren die Reagenzien nicht wie beschrieben, deutet dies auf den Zerfall der Reagenzien. Latexreagenzien, die sich nicht vollständig resuspendieren lassen, können eingefroren gewesen sein und sollten nicht verwendet werden. Eine Kontamination des Puffers wird durch Schimmelbildung bzw. eine generelle Trübung angezeigt. Die Reaktivität der Latexsuspensionen sollte an jedem Tag, an dem der Test durchgeführt wird, mit einem Tropfen des Positiven Kontroll- Antigens an Stelle der Stuhlprobe überprüft werden. Im Testlatex sollte eine eindeutige Agglutination eintreten, im Kontroll-Latex hingegen sollte es zu keiner deutlichen Agglutination kommen. Ist eine Negative Kontrolle erforderlich, sollten Proben der für Rotavirus negativen Stuhlextrakte zu diesem Zweck aufbewahrt werden, vorzugsweise tiefgefroren in Aliquoten bei -20° bis -25°C. Bei Verwendung einer Negativen Kontrolle sollte weder mit dem Testnoch mit dem Kontroll-Latex eine Agglutination sichtbar sein. Die Latexsuspensionen sollten immer auf Aggregation untersucht werden, sobald sie auf den Testobjektträger getropft werden. Falls es zu einer Autoagglutination kommt, sollte die Suspension nicht mehr verwendet werden. Reagieren die Kontrollen anders als erwartet, sind die Ergebnisse der Tests ungültig. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE a) Positives Ergebnis Eine deutliche Agglutination des Testlatex zusammen mit dem Ausbleiben einer Agglutination des Kontroll-Latex weist auf das Vorliegen von Rotavirus in der Stuhlprobe hin. b) Negatives Ergebnis Das Ausbleiben einer Agglutination in beiden Latexreagenzien bedeutet, daß Rotavirus im Stuhlextrakt nicht nachweisbar ist. Dieses Ergebnis schließt die Möglichkeit einer Infektion nicht aus, da aufgrund einer unangemessenen oder inkorrekten Probenentnahme möglicherweise keine ausreichende Menge an Antigen vorliegen könnte. Der Test sollte mit einer frischen Stuhlprobe, die so bald wie möglich entnommen werden muss, durchgeführt werden. c) Nicht interpretierbares Ergebnis Eine sichtbare Agglutination des Kontroll-Latex, die stärker oder schwächer als die des Testlatex ist, zeigt eine nicht spezifische Reaktion an und weist darauf hin, dass die Probe für dieses Testverfahren ungeeignet ist. d) Spurenreaktion Spurenreaktionen (±) sollten als negativ protokolliert werden. GRENZEN DES VERFAHRENS Das Testergebnis hängt davon ab, ob die Proben korrekt entnommen, gelagert und transportiert wurden. Der Rotavirus Latextest ist spezifisch für Rotavirus und wurde so standardisiert, dass er eine ähnliche Sensitivität besitzt wie herkömmliche elektronenmikroskopische Verfahren. Die Sensitivität basiert jedoch auf der Reaktivität des Positiven Kontroll-Antigens, das nach der Antigenkonzentration, nicht nach der Anzahl der Viruspartikel standardisiert wurde. Gelegentlich können Proben mit Antigen in dem Latextest zu einem positiven Ergebnis führen, das mit der Elektronenmikroskopie nicht bestätigt werden kann. Mekonium- Proben und Proben von Neugeborenen, die jünger als einen Monat alt sind, wurden nicht validiert. Von asymptomatischen Rotavirusträgern und Mischinfektionen wurde berichtet 14 . Daher sollten bakteriologische Untersuchungen parallel zum Rotavirustest durchgeführt werden, um bakterielle Ursachen auszuschließen. Rotaviren können zusammen mit anderen bakteriellen Krankheitserregern, die Gastroenteritis verursachen, auftreten und die durch andere Erreger, wie enterotoxische E. coli-Stämme, verursachte Erkrankung verschlimmern 14 . Bei einigen Proben kann Rotavirus eventuell nicht mit serologischen Assays nachgewiesen werden, da das Virusantigen durch sekretorische Darmantikörper verdeckt wird 16 . Ein kleiner Teil der Proben enthält Rotavirus-ähnliche Partikel (Para- Rotavirus), die morphologisch nicht von dem klassischen Rotavirus zu unterscheiden sind. Diese Partikel reagieren jedoch nicht mit gruppenspezifischen Antikörpern 6,12 . Proben mit Simian-Rotavirus reagieren unter Umständen nicht mit diesem Kit. ERWARTETE ERGEBNISSE Proben, die eine erfassbare Konzentration des Rotavirus-Antigens enthalten, weisen eine Agglutination im Testlatex auf. SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN Der Rotavirus Latextest wurde in 2 Labors, eines in Großbritannien und eines in Finnland, evaluiert. In beiden Labors wurde die Elektronenmikroskopie als Referenzverfahren verwendet. In einem Labor wurde zusätzlich ein Enzymimmunoassayverfahren angewandt, bei dem die Antikörperneutralisation eingesetzt wurde, um die im Latextest positiven, in der Elektronenmikroskopie jedoch negativen Ergebnisse zu bestätigen. Von den insgesamt 408 getesteten, zuvor tiefgekühlten Proben ergaben 10 nicht spezifische Reaktionen und wurden bei der Gesamtzahl nicht berücksichtigt. Die Mehrzahl der Proben wurde Kindern (Neugeborene und Kinder im Alter von bis zu 24 Monaten) entnommen. Einige der untersuchten Proben stammten von Erwachsenen. Alle Patienten wiesen Symptome einer Gastroenteritis auf. Die Sensitivität des Latexreagenzes lag bei 90% (138/153), die Spezifität bei 99% (244/245). Tabelle 1 Vergleich der Leistungsdaten des Rotavirus Latextests mit denen der Elektronenmikroskopie bei Stuhlproben Rotavirus Latextest Positiv Negativ Gesamt E.M. Positiv 136 15 151 E.M. Negativ* 3* 244 247 *2 Proben wurden im Enzymimmunoassay als positiv bestätigt. EVALUIERUNG DER SPEZIFITÄT Das Latexreagenz wurde getestet und reagierte mit repräsentativen Rotaviren der Serotypen 1 - 4 (WA, 7729, SA-11 und VA 70) sowie mit dem Nebraska-Kälber-Diarrhoe-Virus positiv. Reproduzierbarkeit Aus 3 Stuhlproben (eine stark positive, eine schwach positive und eine negative Probe) wurden Extrakte hergestellt. Diese Extrakte wurden jeweils sechsmal in 3 separaten Messreihen über einen Zeitraum von 1 Woche mit dem Test- und dem Kontroll-Latex getestet. Es wurden die zu erwartenden Ergebnisse erzielt. Eine nachweisbare Änderung der Reaktivität der positiven Proben wurde weder innerhalb eines Tages noch zwischen den Tagen festgestellt. Das negative Extrakt ergab in allen 18 Tests ein negatives Ergebnis. 3
Seite 1: BESCHREIBUNG DER REAGENZIEN, VORBER

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