Quantitative Dünnschichtchromatographie Densitometrie
Quantitative Dünnschichtchromatographie Densitometrie
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Einleitung<br />
<strong>Quantitative</strong><br />
Dünnschichtchromatographie<br />
<strong>Densitometrie</strong><br />
Bislang fand die quantitative DC im Vergleich zur qualitativen<br />
DC nur wenig Anwendung als Untersuchungsverfahren.<br />
Die Arzneibücher nennen bis 1999 nur die halbquantitative<br />
Grenzwertbestimmung, bei der Fleckengröße und Farbintensität<br />
verglichen werden.<br />
Seid 1999 wird die quantitative Direktbestimmung von DC-<br />
Platten ebenfalls beschrieben. Diese wurde aufgrund der<br />
Entwicklung entsprechender Messgeräte möglich.<br />
Referenten: Anika Peusquens, Franz Thomas Rothausen 1<br />
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Verwendete DC-Platten<br />
Methode<br />
Bei der quantitativen DC müssen HPTLC-Platten eingesetzt<br />
werden.<br />
Die Vorteile der HPTLC-Platten im Vergleich zu den<br />
konventionellen Platten liegen in der<br />
• gleichmäßigeren Beschichtung (0,1mm anstatt 0,2-1mm)<br />
→ Minimierung des Untergrundsignals<br />
• geringen Korngröße (5-7µm) , kleines Porenvolumen<br />
→ optimale Trennstrecke 5cm (konvention. DC 6-17cm)<br />
• höheren Trennleistung<br />
→ deutlich geringere Substanzmengen erforderlich<br />
(HPTLC: pg – ng ; konv. DC: µg)<br />
Probenauftragung<br />
Grundvoraussetzung für eine genaue Messung sind die exakte<br />
Positionierung des Startpunktes und das präzise<br />
Auftragevolumen.<br />
Die Probenauftragung kann auf zwei verschiedene Weisen<br />
erfolgen:<br />
Kontaktauftragung<br />
Aufsprühtechnik<br />
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Kontaktverfahren<br />
• Auftragung mit Hilfe von Glas- oder Platin/Iridium<br />
Festvolumenkapillaren oder Mikroliterspritzen<br />
Vorteile:<br />
• geringer Zeitbedarf<br />
• einfaches Verfahren<br />
Nachteile:<br />
• Zirkular-Chromatographie an der Auftragestelle →<br />
ungleichmäßige Verteilung der Probenkomponenten → breite<br />
und unsymmetrische Flecken<br />
– Verbesserte Auflösung durch den Einsatz von<br />
Konzentrierungszonen<br />
Aufsprühverfahren<br />
Mit Hilfe spezieller Geräte kann die Substanzlösung<br />
auf die DC-Platte aufgesprüht werden.<br />
Vorteile:<br />
• Proben können als schmale Striche aufgesprüht werden →<br />
homogene Verteilung der Substanz über die gesamte<br />
Länge der Auftragezone → verbesserte Auflösung und<br />
Nachweisgrenze<br />
• Vermeidung jeglicher Chromatographie während der<br />
Probenauftragung<br />
Exaktes Auftragen wird durch Positioniergeräte ermöglicht.<br />
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Vorteile der Linearkammer :<br />
Entwicklung der DC-Platten<br />
Üblicherweise werden DC-Platten in Glaströgen entwickelt.<br />
Für HPTLC-Platten gibt es gesondert noch die Möglichkeit der<br />
Entwicklung in Linearkammern.<br />
• Trennung der doppelten Probenzahl auf einer Platte möglich<br />
• Ausbildung einer geraden Fließmittelfront in der Mitte bedingt<br />
durch gegenüberliegende Entwicklungsseiten →<br />
instrumentelle Auswertung<br />
• Bessere Kontrolle der Dampfphase aufgrund geringeren<br />
Volumens<br />
Messgeräte und Messprinzip<br />
DC-Scanner/Densitometer<br />
Das seit längerem gebräuchlichste Messverfahren ist die <strong>Densitometrie</strong>.<br />
Densitometer sind Dichtemessgeräte und bestehten im<br />
wesentlichem aus einem Photometer und einem motorbetrieben<br />
Messtisch, der die DC-Platte durch den Lichtstrahl bewegt.<br />
Bei der quantitativen DC<br />
werden ausschließlich<br />
Auflicht-Densitometer<br />
verwendet.<br />
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Messprinzip<br />
• Photometer sendet monochromatisches<br />
Licht in bestimmten Winkel auf DC-Platte<br />
• DC-Platte wird durch Lichtstrahl bewegt<br />
(in Laufrichtung des Fließmittels)<br />
• Substanzfreie DC-Platte reflektiert<br />
Großteil der Lichtenergie<br />
• Empfänger misst Remission (diffuse,<br />
nicht gerichtete Reflexion)<br />
• Remissionminderung durch Lichtabsorption<br />
→ Chromophor (Teil eines<br />
Moleküls der sichtbares bzw. UV-Licht<br />
absorbiert)<br />
• remitiertes Licht wird von Empfänger<br />
gemessen und von Schreiber in ein<br />
Diagramm umgesetzt (Remissionsgrad-<br />
Ortskurve)<br />
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Remissionsgrad-Ortskurve<br />
Zeigt die Remissionsminderung in Abhängigkeit von einer<br />
bestimmten Wellenlänge.<br />
Maximum der Kurve → starke Remissionsminderung →<br />
schwache Remission von Licht → starke Absorption von Licht<br />
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Ermittlung der optimalen Messwellenlänge<br />
Um die optimale Messwellenlänge festzulegen muss zunächst ein<br />
Remissionspektrum der zu untersuchenden Probe aufgenommen<br />
werden.<br />
Praktische Durchführung:<br />
• Probenauftragung und Entwicklung der DC-Platte<br />
• Messung des Remissionsminimums bei unterschiedlichen<br />
Wellenlängen<br />
• Auftragung der Remissionminderung<br />
gegen die Wellenlänge → Maximum<br />
dieses Spektrums ist optimale<br />
Messwellenlänge (bei Störungen kann<br />
andere Wellenlänge versucht werden)<br />
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Die Auswertung erfolgt durch<br />
Ermittlung der Höhe des entsprechenden<br />
Peaks im Chromatogramm<br />
und Ablesen der<br />
dazugehörigen Substanzmenge<br />
in der Kalibrierkurve.<br />
Auswertung<br />
Kalibrierkurve<br />
Zur quantitativen Auswertung<br />
benötigt man Kalibrierkurven.<br />
Kalibrierung erfolgt auf der<br />
selben DC-Platte auf der auch<br />
die Analyse durchgeführt wird.<br />
Zum Erstellen der Kurve<br />
werden die Peakhöhen gegen<br />
die verwendeten Substanzmengen<br />
aufgetragen.<br />
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Anwendung<br />
In der Pharmazie:<br />
• Qualitätskontrolle (z.B. Gehalt bei Tabletten)<br />
• Identitäts- und Reinheitsprüfungen<br />
Weitere Anwendungsgebiete:<br />
• Nachweis von Pestiziden in Lebensmitteln<br />
• Rückstands-Analytik bei Gewässern<br />
• Drogenscreening<br />
• Dopingnachweise<br />
• In der Forensik (z.B. Untersuchung von Vergiftungsfällen,<br />
Nachweis von Dokumentenfälschungen)<br />
Die <strong>Densitometrie</strong> ist aufgrund der weitgehenden<br />
Automatisierung, dem sehr hohen Probendurchsatz<br />
innerhalb kürzester Zeit und der hohen Messempfindlichkeit<br />
ein leistungsfähiges Analyseverfahren, dass in der Zukunft<br />
sicher auch im Arzneibuch mehr Verwendung finden wird.<br />
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