Steigerung von Qualität und Ausbeute in der ... - DASGIP

Blitzlicht Biomanufacturing
Steigerung von Qualität
und Ausbeute in der
Wirkstoffproduktion
Christian Kaiser, Stefan Krüß, Michael Küchler, Richter-Helm BioLogics, Hamburg
Die Zahl der Multifermentersysteme im Litermaßstab hat in den vergangenen Jahren stetig
zugenommen. Dabei ist sowohl die messtechnische Ausrüstung als auch die verfahrenstechnische
Gestaltung der Bioreaktorsysteme vorangetrieben worden. Aufgrund der verbesserten
Vergleichbarkeit zwischen den small-scale-Fermentern und Bioreaktoren im Labor-, Technikums-
und Produktionsmaßstab werden diese heute für das Screening von Stämmen und Fermentationsparametern
sowohl in der Prozessentwicklung als auch für Scale-down-Experimente
eingesetzt. Dabei erlauben erweiterte Monitoringoptionen die Identifizierung qualitätskritischer
Attribute (CQA) und deren Zusammenhang mit Prozesskenngrößen im laufenden Prozess,
ein wesentlicher Anspruch der PAT-Initiative der FDA. In parallelen Kultivierungen im kleinen
Maßstab haben Forscher die Chance, mit geringem Zeit- und Kostenaufwand die kritischen
Prozessparameter (CPP) zu erforschen. Methoden der statistischen Versuchsplanung (DoE – Design
of Experiments) stellen dabei die effiziente Planung der durchzuführenden Versuche sicher
und helfen, Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Faktoren zu identifizieren. Durch einen
geeigneten Grad an Prozessautomatisierung können die Prozesse innerhalb der vorgegebenen
Grenzen geführt und damit die Reproduzierbarkeit der Bioreaktionsprozesse erhöht werden.
Wie die verbesserten technischen Rahmenbedingungen zu einer effizienteren Prozessentwicklung
beitragen, zeigt das folgende Beispiel eines zu entwickelnden Upstream-Prozesses für die
Wirkstoffproduktion mit dem Bakterium Escherichia coli.
Herstellungsprozesse rekombinanter Produkte
in Bioreaktoren basieren im Wesentlichen auf
den zellbiologischen Produktionsorganismen
Bakterien, Hefen sowie tierischen bzw. Humanzelllinien.
Die Expression rekombinanter
(therapeutischer) Proteine wird ungeachtet
aufkommender eukaryotischer Expressionssysteme
wie etwa CHO-Zellen, Pichia pastoris,
Saccharomyces cerevisiae sowie Hansenula
polymorpha immer noch am häufigsten mit
Abb. 1: Prozessverlauf einer Kultivierung im 1 L-Multifermentersystem; pO 2 : relativer Gelöstsauerstoffpartialdruck;
F R1 : Zufütterrate aus dem Reservoir 1 (Glukose); c XL : Biotrockenmasse;
J L : Flüssigphasentemperatur; c S1M : Glukosekonzentration in der Medienphase;
c P1L : Zielproteinkonzentration; V L : flüssiges Reaktionsvolumen
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dem hervorragend charakterisierten Host-
System Escherichia coli durchgeführt 1 . Die
einfache Kultivierung, das schnelle Wachstum
sowie die geringen Kosten für die benötigten
Fermentationsmedien stellen dabei offensichtliche
Vorteile dar.
Durch die große Anzahl verfügbarer Stämme
und Expressionsvektoren ergibt sich bei E. coli
eine Vielzahl von Möglichkeiten, schon auf
molekularbiologischer Ebene Einfluss auf die
Zielproduktbildung zu nehmen. Hierbei steht
neben einem hohen Expressionsniveau bei
E. coli auch die Art der Expression im Fokus.
Die Expression in unlöslichen (nicht aktiven)
Einschlusskörpern (Inclusion bodies – IBs)
bietet eine höhere Stabilität des Zielproduktes
gegenüber Proteasen und verringert die
Kontamination des Startmaterials für die
Aufreinigung durch zelleigene Proteine. Dem
steht entgegen, dass der Rückfaltungsprozess
für jedes Protein individuell entwickelt und
optimiert werden muss. Ineffiziente Prozesse
beeinflussen dabei die Produktausbeute
negativ und können zur Kontamination des
Zielproduktes durch falsch gefaltete Derivate
führen, welche sich später schlecht abreinigen
lassen 2 .
Die im Folgenden vorgestellten Ergebnisse
wurden alle mit einem rekombinanten E. coli
BL21-Stamm erzielt, welcher ein hitzeinduzierbares,
von Richter-Helm BioLogics konstruiertes
Expressionsplasmid trägt. Bei dem
Zielprotein handelt es sich um ein humanes
API, welches als Fusionsprotein hauptsächlich
in IBs exprimiert wird.
Reproduzierbare Ergebnisse mit
automatisiertem Drei-Phasen-Prozess
Nach der Auswahl eines Produktionsstammes
muss eine geeignete Prozessführungsstrategie
entwickelt werden, um eine
optimale Produkt ausbeute im Upstream
zu erzielen. Um eine hohe volumetrische
Produktivität zu erzielen, wird E. coli dafür
häufig in Fed-Batch-Prozessen zu hohen
Zelldichten herangezüchtet. Dies bringt
insbesondere bei der nachfolgenden GMP-
Produktion Kosten- und Zeitvorteile, wenn
Rüstzeiten sowie aufwendige CIP-Prozeduren
und Reinigungsvalidierungen zu berücksichtigen
sind. Exemplarisch ist eine generische
Fed-Batch-Kultivierung, die als Startpunkt
für die Upstream-Prozessentwicklung bei
Richter-Helm BioLogics dient, in Abbildung 1
dargestellt. Der Prozess lässt sich im Wesentlichen
in drei Prozessphasen unterteilen. Die
unlimitierte Batch-Phase, die substratlimitierte
Fed-Batch-Phase sowie die Produktionsphase,
die ebenfalls im Fed-Batch-Modus
durchgeführt wird.
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Tab 1: Wichtige die Zielproteinexpression beeinflussende Parameter 3-6
Parameter Variationen Parameter Variationen
Medium Mineralmedium Induktion Induktionstemperatur
Semi-definiertes Medium Zeitpunkt der Induktion
Komplexmedium Induktorkonzentration
Spurenelemente Induktorzugabe
Aminosäuren pH Sollwert
Vitamine pH-Profil
Zufütterung Lineares Profil Temperatur Sollwert
Exponentielles Profil Temperaturprofil
Kombination aus exp. und lin. Profil pO 2 Sollwert
Zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und
Vergleichbarkeit von Ergebnissen steht eine
Reihe von Automatisierungsmöglichkeiten
zur Verfügung. Das verwendete Multifermentersystem
der Firma DASGIP®, Jülich,
bietet hierfür eine sehr geeignete Auswahl
an Regelungs- und Steuerungsmöglichkeiten
in der systemzugehörigen Software
DASGIP®-Control 4.0. Jeder zur Verfügung
stehende Regler (pH, pO 2 , Temperatur, Zufütterpumpen,
Begasungsraten) kann über alle
vorhandenen Prozessgrößen und Schaltzeiten
getriggert und damit an-, aus- oder mehrfach
geschaltet werden. Zusätzlich können Filter-
und Verzögerungszeiten eingesetzt werden,
um eine fehlerhafte Initiation der Regler zu
vermeiden und serielle Steuerungen zu realisieren.
Für die einzelnen Regler besteht die
Möglichkeit, konstante Sollwerte vorzugeben
sowie zeitlich oder an andere Prozessgrößen
gekoppelte Profile in Form von Tabellen oder
Funktionen vorzugeben. Für die pO 2 -Regelung
steht zusätzlich eine Kaskade zur Verfügung,
um über die Drehzahl, die Begasungsrate
und die Gasmischung von Luft und O 2 eine
ausreichende Sauerstoffversorgung der
Zellen über den gesamten Prozessverlauf
sicherzustellen.
In dem in Abbildung 1 dargestellten
Prozessverlauf stellt die Initialisierung der
pO 2 -Drehzahlregelung die erste Automatisierungsaufgabe
dar. Sobald der pO 2 -Wert für
mehr als 30 Sekunden unter den Sollwert von
30% fällt, wird diese gestartet.
Anschließend muss der vollständige Verbrauch
der vorgelegten Glukose detektiert
werden, um die Glukosezufütterung und
damit die Fed-Batch-Phase zu initialisieren.
Als Trigger kann hierbei der pO 2 -Wert genutzt
werden. Überschreitet dieser einen Wert von
45% für mehr als 30 Sekunden, wird ein vorgegebenes
Zufütterprofil gestartet. Für die
Glukosezufütterung stehen dabei – genau wie
für die Korrekturmittel Säure, Lauge und Antischaummittel
– kontinuierlich ansteuerbare
Präzisionsschlauchpumpen zur Verfügung.
Abb. 2: Proteinbildungskinetik bei unterschiedlichen Induktionstemperaturen; c XL := Biotrockenmasse;
c P1L := Zielproteinkonzentration; J Ind := Induktionstemperatur
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Die Pumpenkalibrierung erfolgt automatisiert
und simultan prä-experimentell über
die DASGIP®-Control-Software mit Hilfe von
Differenzwägungen der entsprechenden
Medien. Die Umrechnung der relativen in die
absoluten Zufütterraten erfolgt systemintern.
Über die Eingabe des Startvolumens zu
Kultivierungsbeginn sowie die Eingabe der
einzelnen Probenahmeraten steht jederzeit
das gesamte aktuelle Fermentationsvolumen
während des Prozesses zur Verfügung.
Die letzte Automatisierungsaufgabe stellt
dann die Induktion der Kultur für die Initialisierung
der Produktionsphase dar. Bei
Temperatur-induzierbaren Systemen erfolgt
dies über eine Erhöhung der Kultivierungstemperatur,
bei chemisch induzierbaren System
durch Zugabe eines Induktors. Die Induktion
kann dabei entweder zeitlich an ein Ereignis
gebunden (z.B. 1 Stunde nach Start der Zufütterung)
oder aber an die aktuelle Zelldichte
gekoppelt werden. Diese kann online sowohl
über eine Trübungsmessung als auch über
die Abgasmessung berechnet werden (Daten
nicht dargestellt).
Qualitätskritische Parameter
und Prozessoptimierung
Das systematische Screening nach optimalen
Parametern während der Prozessentwicklung
ist nicht nur von entscheidender Bedeutung,
um maximale Produktausbeuten zu
erreichen, sondern liefert auch zusätzlich
wichtige Informationen, um die Robustheit
des Upstream-Prozesses zu beurteilen. Diese
können im Folgenden eingesetzt werden, um
Spezifikationen und Grenzen für den Produktionsprozess
zu definieren, und geben erste
entscheidende Hinweise für die in den klinischen
Phasen anstehende Prozessvalidierung.
Je mehr Informationen während der Phase der
Prozessentwicklung generiert werden, desto
geringer fällt oft der Arbeits- und Zeitaufwand
für diese entscheidende und kostenintensive
Phase auf dem Weg zur Marktzulassung aus.
Einen Überblick über wichtige, die Zielproteinexpression
beeinflussende Parameter gibt
die Tabelle 1. Da ein komplettes Screening aller
Parameter schon allein aus Kosten- und Zeitgründen
nicht realistisch ist, muss zunächst
eine geeignete Auswahl getroffen werden.
Hierfür muss die Art der Expression (löslich
vs. IBs; zytoplasmatisch vs. sekretiert) sowie
die verwendete Kombination Vektor-Stamm-
Produkt berücksichtigt werden. Auf Grundlage
von in der Literatur beschriebenen Prozessen
sowie den vorliegenden Erfahrungen konnte
entschieden werden, welche Parameter in
welchem Wertebereich untersucht werden
sollten.
Es wurden insgesamt 26 Kultivierungen im
1 L-Maßstab durchgeführt, wobei die in Tabelle
1 farblich hinterlegten Parameter untersucht
wurden. Im ersten Ansatz wurde der Einfluss
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Abb. 3: Einfluss der Induktionstemperatur (TInd) sowie der optischen Dichte zu Induktionsbeginn
(ODInd) auf das IB/sol-Verhältnis sowie die Zielproteinkonzentration
verschiedener Medien hinsichtlich der Proteinexpression
analysiert. Dabei zeigte sich, dass
ein semi-definiertes Glukosemedium unter
Zusatz von pflanzlichem Pepton zur besten
Expressionsleistung führt. Der Produkttiter
von 1,2 g/L (Abb. 1) liegt dabei deutlich höher
als auf semi-definierten Glycerinmedien (ca.
320 mg/L) und glukosehaltigem Mineralmedium
(ca. 900 mg/L). Zusätzlich ergab sich das
beste IB/sol-Verhältnis (Verhältnis Inclusion
bodies zu löslichem Protein) von etwa 90%
zu 10% bei Einsatz des semi-definierten Glukosemediums.
Wie aus Abbildung 1 ersichtlich, zeigt der
verwendete Stamm eine sehr gute Proteinexpression
während der ersten vier bis
sechs Stunden nach Induktion. Anschließend
ist keine nennenswerte Zielproteinbildung
mehr zu verzeichnen. Als mögliche Ursachen
wurden im ersten Ansatz eine zu geringe
Wachstumsrate – bedingt durch das lineare
Zufütterprofil –, genetische Instabilität oder
fehlende Medienzusätze in Betracht gezogen.
Mit Hilfe der folgenden Versuche konnte die
genetische Instabilität ausgeschlossen werden.
Die Produktausbeuten wurden durch den
Zusatz von Pepton im Feedmedium sowie eine
exponentielle Zufütterung mit einer Wachstumsrate
von µ w = 0,2 h –1 zwar leicht auf ca. 1,5
g/L verbessert, die Proteinexpression erfolgte
jedoch auch hier nur während der ersten Stunden
nach Induktion.
Um den Zellstress durch die hohe Induktionstemperatur
sowie die hohe Expressionsleistung
zu reduzieren, wurden im nächsten
Ansatz unterschiedliche Expressionstemperaturen
untersucht. Zusätzlich wurden Experimente
durchgeführt, bei denen die Kulturen
bei höheren Zelldichten induziert wurden, um
einen höheren, Zellmasse-gebundenen Produkttiter
zu erreichen. Die Planung der Experimente
erfolgte dabei nach den Methoden der
statistischen Versuchsplanung. Die Eingangsgrößen
waren dabei die Induktionstemperatur
sowie die optische Dichte zu Induktionsbeginn.
Als Zielgrößen wurden die Produktausbeute
sowie das IB/sol-Verhältnis definiert.
Die Ergebnisse eines Ansatzes im Multifermentersystem
sind in Abbildung 2 dargestellt.
Dabei wurden dieselben Medien und Zufütterprofile
für alle vier Fermenter verwendet,
was der synchrone Verlauf der Biomassebildung
(c XL ) widerspiegelt. Es ist offensichtlich,
dass bereits bei einer Induktionstemperatur
von 40°C im Vergleich zu 42°C die Phase der
Produktbildung leicht verlängert werden
konnte. Bei einer weiteren Herabsetzung der
Induktionstemperatur auf 38°C konnte bei
gleichbleibend starker Expressionsleistung
die Zielproteinbildung über den gesamten
Prozess aufrechterhalten und damit der Produkttiter
mit 4.5 g/L entscheidend verbessert
werden.
Durch eine spätere Induktion der Kulturen
(5 h nach Feedstart) in Kombination mit einer
Induktionstemperatur von 38°C konnte die
Endkonzentration des Zielproteins weiter
auf 7,5 g/L gesteigert werden (Daten nicht
dargestellt).
Der Einfluss der betrachteten Faktoren
unter Verwendung der statistischen Versuchsplanung
ist in Abbildung 3 dargestellt.
Daraus wird ersichtlich, dass eine niedrige
Induktionstemperatur in Verbindung mit
einer hohen Zelldichte zu Induktionsstart zu
den besten Produkttitern führt. Ein Nachteil
der geringeren Induktionstemperatur ist dabei
das schlechtere IB/sol-Verhältnis (70% zu
30%) im Vergleich zur Induktion bei höheren
Temperaturen. Durch die wesentlich höhere
Produktbildung bei niedrigen Temperaturen
kann der Verlust an IBs jedoch vernachlässigt
werden.
Im weiteren Verlauf des Projektes konnte
die Produktkonzentration durch die Variation
des verwendeten pflanzlichen Peptons und
eine verlängerte Expressionsphase bis auf 11
g/L erhöht werden. Anschließend wurde der
Prozess erfolgreich in den 10 L-Maßstab skaliert
und – bedingt durch den besseren Sauerstoffeintrag
und die damit verbundene längere
Expressionsphase – eine Produktkonzentration
von mehr als 20 g/L erzielt werden.
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Fazit
In dem hier vorgestellten Projekt wurden in
einem Multifermentersystem im Labormaßstab
26 Kultivierungen für die Upstream-
Prozessentwicklung durchgeführt. Durch die
parallele Prozessführung werden dabei identische
Startbedingungen durch den Einsatz
der gleichen Vorkulturen sichergestellt und ein
schnelles und effizientes Parameterscreening
ermöglicht. Durch eine einfache Automatisierung
der Fermentationsprozesse wurde die
Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der
Kultivierungen gewährleistet.
Es wurden der Einfluss der verwendeten
Medien und Medienzusätze, die Zufütterprofile
für die Fed-Batch-Phase sowie die
Induktionstemperatur und der Induktionszeitpunkt
näher untersucht. Dabei wurden auch
Verfahren der statistischen Versuchsplanung
(DoE) eingesetzt. Durch die Absenkung der
Induktionstemperatur konnte die Expressionsphase
entscheidend verlängert und damit
die Produktkonzentration deutlich gesteigert
werden. Die Produktausbeute konnte dadurch
um 1 L-Maßstab von 1,2 g/L auf 11 g/L nahezu
verzehnfacht werden.
Literatur
[1] Anderson, D.C., and Krummen, L., Curr. Opin. Biotechnol. 13
(2002), 117-123
[2] Sørensen, H.P., Mortensen, K.K., Microb. Cell. Fact. 4 (2005)
[3] Mark A. Eiteman, Elliot Altman. (2006) Trends in Biotechnology,
24 (11), 530-536
[4] Delia M. Ramirez and William E. Bentley. (1995) Biotechnology
and Bioengineering, 47, 596-608
[5] Lars Strandberg and Sven-Olaf Enfors. (1991) Applied and
Environmental Microbiology, 57 (6), 1669-167
[6] Jong H. Choi, Ki. C. Keum, Sang Y. Lee. (2006) Chemical
Engineering Science, 61, 876-885
Korrespondenzadresse
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