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Tab 1: Wichtige die Zielproteinexpression beeinflussende Parameter 3-6 Parameter Variationen Parameter Variationen Medium Mineralmedium Induktion Induktionstemperatur Semi-definiertes Medium Zeitpunkt der Induktion Komplexmedium Induktorkonzentration Spurenelemente Induktorzugabe Aminosäuren pH Sollwert Vitamine pH-Profil Zufütterung Lineares Profil Temperatur Sollwert Exponentielles Profil Temperaturprofil Kombination aus exp. und lin. Profil pO 2 Sollwert Zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit von Ergebnissen steht eine Reihe von Automatisierungsmöglichkeiten zur Verfügung. Das verwendete Multifermentersystem der Firma DASGIP®, Jülich, bietet hierfür eine sehr geeignete Auswahl an Regelungs- und Steuerungsmöglichkeiten in der systemzugehörigen Software DASGIP®-Control 4.0. Jeder zur Verfügung stehende Regler (pH, pO 2 , Temperatur, Zufütterpumpen, Begasungsraten) kann über alle vorhandenen Prozessgrößen und Schaltzeiten getriggert und damit an-, aus- oder mehrfach geschaltet werden. Zusätzlich können Filter- und Verzögerungszeiten eingesetzt werden, um eine fehlerhafte Initiation der Regler zu vermeiden und serielle Steuerungen zu realisieren. Für die einzelnen Regler besteht die Möglichkeit, konstante Sollwerte vorzugeben sowie zeitlich oder an andere Prozessgrößen gekoppelte Profile in Form von Tabellen oder Funktionen vorzugeben. Für die pO 2 -Regelung steht zusätzlich eine Kaskade zur Verfügung, um über die Drehzahl, die Begasungsrate und die Gasmischung von Luft und O 2 eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Zellen über den gesamten Prozessverlauf sicherzustellen. In dem in Abbildung 1 dargestellten Prozessverlauf stellt die Initialisierung der pO 2 -Drehzahlregelung die erste Automatisierungsaufgabe dar. Sobald der pO 2 -Wert für mehr als 30 Sekunden unter den Sollwert von 30% fällt, wird diese gestartet. Anschließend muss der vollständige Verbrauch der vorgelegten Glukose detektiert werden, um die Glukosezufütterung und damit die Fed-Batch-Phase zu initialisieren. Als Trigger kann hierbei der pO 2 -Wert genutzt werden. Überschreitet dieser einen Wert von 45% für mehr als 30 Sekunden, wird ein vorgegebenes Zufütterprofil gestartet. Für die Glukosezufütterung stehen dabei – genau wie für die Korrekturmittel Säure, Lauge und Antischaummittel – kontinuierlich ansteuerbare Präzisionsschlauchpumpen zur Verfügung. Abb. 2: Proteinbildungskinetik bei unterschiedlichen Induktionstemperaturen; c XL := Biotrockenmasse; c P1L := Zielproteinkonzentration; J Ind := Induktionstemperatur Blitzlicht Biomanufacturing Die Pumpenkalibrierung erfolgt automatisiert und simultan prä-experimentell über die DASGIP®-Control-Software mit Hilfe von Differenzwägungen der entsprechenden Medien. Die Umrechnung der relativen in die absoluten Zufütterraten erfolgt systemintern. Über die Eingabe des Startvolumens zu Kultivierungsbeginn sowie die Eingabe der einzelnen Probenahmeraten steht jederzeit das gesamte aktuelle Fermentationsvolumen während des Prozesses zur Verfügung. Die letzte Automatisierungsaufgabe stellt dann die Induktion der Kultur für die Initialisierung der Produktionsphase dar. Bei Temperatur-induzierbaren Systemen erfolgt dies über eine Erhöhung der Kultivierungstemperatur, bei chemisch induzierbaren System durch Zugabe eines Induktors. Die Induktion kann dabei entweder zeitlich an ein Ereignis gebunden (z.B. 1 Stunde nach Start der Zufütterung) oder aber an die aktuelle Zelldichte gekoppelt werden. Diese kann online sowohl über eine Trübungsmessung als auch über die Abgasmessung berechnet werden (Daten nicht dargestellt). Qualitätskritische Parameter und Prozessoptimierung Das systematische Screening nach optimalen Parametern während der Prozessentwicklung ist nicht nur von entscheidender Bedeutung, um maximale Produktausbeuten zu erreichen, sondern liefert auch zusätzlich wichtige Informationen, um die Robustheit des Upstream-Prozesses zu beurteilen. Diese können im Folgenden eingesetzt werden, um Spezifikationen und Grenzen für den Produktionsprozess zu definieren, und geben erste entscheidende Hinweise für die in den klinischen Phasen anstehende Prozessvalidierung. Je mehr Informationen während der Phase der Prozessentwicklung generiert werden, desto geringer fällt oft der Arbeits- und Zeitaufwand für diese entscheidende und kostenintensive Phase auf dem Weg zur Marktzulassung aus. Einen Überblick über wichtige, die Zielproteinexpression beeinflussende Parameter gibt die Tabelle 1. Da ein komplettes Screening aller Parameter schon allein aus Kosten- und Zeitgründen nicht realistisch ist, muss zunächst eine geeignete Auswahl getroffen werden. Hierfür muss die Art der Expression (löslich vs. IBs; zytoplasmatisch vs. sekretiert) sowie die verwendete Kombination Vektor-Stamm- Produkt berücksichtigt werden. Auf Grundlage von in der Literatur beschriebenen Prozessen sowie den vorliegenden Erfahrungen konnte entschieden werden, welche Parameter in welchem Wertebereich untersucht werden sollten. Es wurden insgesamt 26 Kultivierungen im 1 L-Maßstab durchgeführt, wobei die in Tabelle 1 farblich hinterlegten Parameter untersucht wurden. Im ersten Ansatz wurde der Einfluss LABORWELT 11. Jahrgang | Nr. 3/2010 | 21
Blitzlicht Biomanufacturing Abb. 3: Einfluss der Induktionstemperatur (TInd) sowie der optischen Dichte zu Induktionsbeginn (ODInd) auf das IB/sol-Verhältnis sowie die Zielproteinkonzentration verschiedener Medien hinsichtlich der Proteinexpression analysiert. Dabei zeigte sich, dass ein semi-definiertes Glukosemedium unter Zusatz von pflanzlichem Pepton zur besten Expressionsleistung führt. Der Produkttiter von 1,2 g/L (Abb. 1) liegt dabei deutlich höher als auf semi-definierten Glycerinmedien (ca. 320 mg/L) und glukosehaltigem Mineralmedium (ca. 900 mg/L). Zusätzlich ergab sich das beste IB/sol-Verhältnis (Verhältnis Inclusion bodies zu löslichem Protein) von etwa 90% zu 10% bei Einsatz des semi-definierten Glukosemediums. Wie aus Abbildung 1 ersichtlich, zeigt der verwendete Stamm eine sehr gute Proteinexpression während der ersten vier bis sechs Stunden nach Induktion. Anschließend ist keine nennenswerte Zielproteinbildung mehr zu verzeichnen. Als mögliche Ursachen wurden im ersten Ansatz eine zu geringe Wachstumsrate – bedingt durch das lineare Zufütterprofil –, genetische Instabilität oder fehlende Medienzusätze in Betracht gezogen. Mit Hilfe der folgenden Versuche konnte die genetische Instabilität ausgeschlossen werden. Die Produktausbeuten wurden durch den Zusatz von Pepton im Feedmedium sowie eine exponentielle Zufütterung mit einer Wachstumsrate von µ w = 0,2 h –1 zwar leicht auf ca. 1,5 g/L verbessert, die Proteinexpression erfolgte jedoch auch hier nur während der ersten Stunden nach Induktion. Um den Zellstress durch die hohe Induktionstemperatur sowie die hohe Expressionsleistung zu reduzieren, wurden im nächsten Ansatz unterschiedliche Expressionstemperaturen untersucht. Zusätzlich wurden Experimente durchgeführt, bei denen die Kulturen bei höheren Zelldichten induziert wurden, um einen höheren, Zellmasse-gebundenen Produkttiter zu erreichen. Die Planung der Experimente erfolgte dabei nach den Methoden der statistischen Versuchsplanung. Die Eingangsgrößen waren dabei die Induktionstemperatur sowie die optische Dichte zu Induktionsbeginn. Als Zielgrößen wurden die Produktausbeute sowie das IB/sol-Verhältnis definiert. Die Ergebnisse eines Ansatzes im Multifermentersystem sind in Abbildung 2 dargestellt. Dabei wurden dieselben Medien und Zufütterprofile für alle vier Fermenter verwendet, was der synchrone Verlauf der Biomassebildung (c XL ) widerspiegelt. Es ist offensichtlich, dass bereits bei einer Induktionstemperatur von 40°C im Vergleich zu 42°C die Phase der Produktbildung leicht verlängert werden konnte. Bei einer weiteren Herabsetzung der Induktionstemperatur auf 38°C konnte bei gleichbleibend starker Expressionsleistung die Zielproteinbildung über den gesamten Prozess aufrechterhalten und damit der Produkttiter mit 4.5 g/L entscheidend verbessert werden. Durch eine spätere Induktion der Kulturen (5 h nach Feedstart) in Kombination mit einer Induktionstemperatur von 38°C konnte die Endkonzentration des Zielproteins weiter auf 7,5 g/L gesteigert werden (Daten nicht dargestellt). Der Einfluss der betrachteten Faktoren unter Verwendung der statistischen Versuchsplanung ist in Abbildung 3 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass eine niedrige Induktionstemperatur in Verbindung mit einer hohen Zelldichte zu Induktionsstart zu den besten Produkttitern führt. Ein Nachteil der geringeren Induktionstemperatur ist dabei das schlechtere IB/sol-Verhältnis (70% zu 30%) im Vergleich zur Induktion bei höheren Temperaturen. Durch die wesentlich höhere Produktbildung bei niedrigen Temperaturen kann der Verlust an IBs jedoch vernachlässigt werden. Im weiteren Verlauf des Projektes konnte die Produktkonzentration durch die Variation des verwendeten pflanzlichen Peptons und eine verlängerte Expressionsphase bis auf 11 g/L erhöht werden. Anschließend wurde der Prozess erfolgreich in den 10 L-Maßstab skaliert und – bedingt durch den besseren Sauerstoffeintrag und die damit verbundene längere Expressionsphase – eine Produktkonzentration von mehr als 20 g/L erzielt werden. 22 | 11. Jahrgang | Nr. 3/2010 LABORWELT Fazit In dem hier vorgestellten Projekt wurden in einem Multifermentersystem im Labormaßstab 26 Kultivierungen für die Upstream- Prozessentwicklung durchgeführt. Durch die parallele Prozessführung werden dabei identische Startbedingungen durch den Einsatz der gleichen Vorkulturen sichergestellt und ein schnelles und effizientes Parameterscreening ermöglicht. Durch eine einfache Automatisierung der Fermentationsprozesse wurde die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Kultivierungen gewährleistet. Es wurden der Einfluss der verwendeten Medien und Medienzusätze, die Zufütterprofile für die Fed-Batch-Phase sowie die Induktionstemperatur und der Induktionszeitpunkt näher untersucht. Dabei wurden auch Verfahren der statistischen Versuchsplanung (DoE) eingesetzt. Durch die Absenkung der Induktionstemperatur konnte die Expressionsphase entscheidend verlängert und damit die Produktkonzentration deutlich gesteigert werden. Die Produktausbeute konnte dadurch um 1 L-Maßstab von 1,2 g/L auf 11 g/L nahezu verzehnfacht werden. Literatur [1] Anderson, D.C., and Krummen, L., Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002), 117-123 [2] Sørensen, H.P., Mortensen, K.K., Microb. Cell. Fact. 4 (2005) [3] Mark A. Eiteman, Elliot Altman. (2006) Trends in Biotechnology, 24 (11), 530-536 [4] Delia M. Ramirez and William E. Bentley. (1995) Biotechnology and Bioengineering, 47, 596-608 [5] Lars Strandberg and Sven-Olaf Enfors. (1991) Applied and Environmental Microbiology, 57 (6), 1669-167 [6] Jong H. Choi, Ki. C. Keum, Sang Y. Lee. (2006) Chemical Engineering Science, 61, 876-885 Korrespondenzadresse Dr. Christian Kaiser Richter-Helm BioLogics, Hamburg Habichthorst 30, 22459 Hamburg C.Kaiser@richter-helm-biologics.eu
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