downstream processing.pdf
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Downstream-Processing<br />
Downstream-Processing<br />
Bioreaktor<br />
Separation<br />
Biomasse<br />
Überstand<br />
Produktaufreinigung<br />
Zellaufschluss<br />
Überstand<br />
Food Process Engineering
Downstream ist wichtig! Und wird immer wichtiger!<br />
Produktivität im Upstream steigt ständig !!!!<br />
Food Process Engineering
Beispiel eines Downstreamprozesses<br />
Media<br />
Preparation<br />
Cell Line<br />
Fermentation<br />
Bioreactor<br />
Sampling<br />
Preparation<br />
Disposable Storage<br />
Seed Bioreactor<br />
Bioreactor<br />
Cell Harvest<br />
Cell-Harvest<br />
Cell-Debris<br />
Removal<br />
Dead-End<br />
Filtration<br />
Disposable<br />
Storage<br />
Buffer Preparation<br />
Preparation<br />
Disposable Storage<br />
Purification<br />
Single-use Crossflow<br />
Conc./ Diafiltration<br />
Affinity Chrom.<br />
Capturing Step<br />
Low pH Virus<br />
Inactivation<br />
Cation<br />
Exchange<br />
Ion Exch.<br />
Mem.ads.<br />
Disposable UF<br />
Buffer Exchange<br />
Disposable<br />
Virus Filter<br />
0.2µm Sterile<br />
Form and Fill<br />
Food Process Engineering
Downstream Processing<br />
Kosten für Downstream<br />
Processing zw. 15 und 70%<br />
der Gesamtkosten<br />
− Bioethanol 15%<br />
− Penicillin 20 bis 30%<br />
− Enzyme bis zu 70%<br />
Food Process Engineering
Downstream-Processing<br />
Downstream-Processing<br />
Bioreaktor<br />
Separation<br />
Biomasse<br />
Überstand<br />
Produktaufreinigung<br />
Zellaufschluss<br />
Überstand<br />
Food Process Engineering
Separation – Methoden der Zellernte<br />
Food Process Engineering
Sedimentation und Zentrifugation<br />
• Trennprinzip:<br />
− Dichteunterschied zwischen flüssiger und fester Phase<br />
• Stokessches Gesetz:<br />
− gilt für einzelne, kugelförmige Partikel in rein viskoser<br />
Umströmung (kleine Re-Zahlen)<br />
v<br />
v<br />
S<br />
S<br />
Z<br />
=<br />
=<br />
d<br />
2<br />
p<br />
Δρ<br />
18η<br />
Food Process Engineering<br />
⋅<br />
g<br />
2<br />
d<br />
p<br />
Δρ<br />
r<br />
2<br />
⋅ ω<br />
18η<br />
2<br />
rω<br />
g<br />
Im Schwerefeld<br />
bis 1 cm/24 h<br />
Im Zentrifugalfeld<br />
bis 10000 cm/24 h<br />
= Zentrifugalziffer<br />
F a<br />
F w<br />
F g
Bauarten von Zentrifugen<br />
a) Röhrentrommel<br />
b) Kammertrommel<br />
c) Tellerseparator<br />
d) Dekanter<br />
Tellerseparator am<br />
häufigsten eingesetzt<br />
− große Klärfläche<br />
− kontinuierliche<br />
Betriebsweise<br />
− In-situ sterilisierbar<br />
− Hoher Durchsatz<br />
(abhängig von Zellgröße)<br />
Food Process Engineering
Food Process Engineering<br />
Bauart einer Tellerzentrifuge
Food Process Engineering<br />
Filtration
Membranfiltration<br />
• Entscheidung für Zentrifugation<br />
oder Filtration hängt u.a. davon<br />
ab,<br />
− wie weit aufkonzentriert werden<br />
soll<br />
− ob Membranfouling ein Problem<br />
darstellt<br />
− ob mechanische Schädigungen<br />
eine Rolle spielen<br />
Food Process Engineering
Downstream-Processing<br />
Bioreaktor<br />
Separation<br />
Biomasse<br />
Überstand<br />
Produktaufreinigung<br />
Zellaufschluss<br />
Überstand<br />
Food Process Engineering
Zellaufschluss<br />
• Bei intrazellulär vorliegendem Produkt (v.a. Proteine)<br />
• Mögliche Lokalisierungen von Proteinen in Zellen<br />
− In/an der Zellwand gebunden<br />
− In/an der Cytoplasmamembran<br />
− Im Cytoplasma in löslicher Form<br />
− Im Cytoplasma als Einschlusskörper<br />
− An/in Membranen von Organellen<br />
− In Organellen<br />
− etc.<br />
Food Process Engineering
Zellaufschlussverfahren<br />
• Ziele:<br />
− Zerstörung der Kompartimentierung der<br />
Zellen<br />
− Permeabilisierung der Membranen<br />
− Solubilisierung der Proteine<br />
• Zellaufschlussverfahren<br />
− Mechanische Verfahren<br />
− Thermische bzw. thermodynamische<br />
Verfahren<br />
− Chemisch enzymatische Verfahren<br />
− Molekularbiologische Ansätze<br />
Food Process Engineering
Mechanische Zellaufschlussverfahren<br />
• Vermahlen in Kugel- oder Perlmühlen<br />
• Wirkungsweise: Scher- und Normalkräfte<br />
• Trennung der Mahlkörper vom Mahlgut mittels Siebeinsätzen<br />
Food Process Engineering
Mechanische Zellaufschlussverfahren<br />
• Zellaufschluss durch<br />
Hochdruckhomogenisatoren<br />
• Zellsuspension wird mit<br />
hohem Druck (500 bis 1000<br />
bar) mittels Kolbenpumpen<br />
durch einen engen<br />
Homogenisierspalt gedrückt<br />
• Wirkungsweise: Scher- und<br />
Normalkräfte sowie<br />
Kaviation<br />
Food Process Engineering
Mechanische Zellaufschlussverfahren<br />
• Zellaufschluss mittels<br />
Ultraschall (Standard-<br />
Methode im Labormaßstab)<br />
• Wirkungsweise: Kavitation<br />
im Schallfeld eines<br />
Piezokristalles<br />
• Frequenz: 15 bis 25 kHz<br />
Food Process Engineering
Downstream-Processing<br />
Bioreaktor<br />
Separation<br />
Biomasse<br />
Überstand<br />
Überstand<br />
Food Process Engineering<br />
Produktaufreinigung<br />
Zellaufschluss<br />
Produkt-<br />
Gewinnung/-<br />
konzentrierung
Produktgewinnung und -konzentrierung<br />
• Nach der Freisetzung des Produktes und Abtrennung<br />
der Zelltrümmer<br />
• Methoden zur Produktgewinnung und –<br />
konzentrierung<br />
− Thermische Verfahren<br />
− Extraktionsverfahren<br />
− Membrantrennverfahren<br />
− Fällungsreaktionen<br />
Food Process Engineering
Thermische Verfahren zur Produktkonzentrierung<br />
• Fermentationsbrühe besteht hauptsächlich aus Wasser<br />
Eindampfen des Wassers zur Aufkonzentrierung des Produkts<br />
• Biologische Produkte jedoch meist sehr thermolabil<br />
bevorzugt Fallstromverdampfer<br />
Food Process Engineering
Extraktionsverfahren<br />
• Solventextraktion:<br />
− Übergang eines Stoffes (des Extraktstoffes) von einer<br />
flüssigen Phase (Abgeber) in eine zweite fluide Phase<br />
(Aufnehmer bzw. Extraktionsmittel)<br />
− Aufnehmer und Abgeber nicht mischbar<br />
− Wässriges und organisches Lösungsmittel<br />
− Bsp: Penicillin<br />
Food Process Engineering
Extraktionsverfahren<br />
• Wässrige Zwei-Phasen-<br />
Extraktion<br />
− Besonders schonende<br />
Methode der<br />
Aufkonzentrierung<br />
• Prinzip: zwei Polymere<br />
bilden nach Überschreiten<br />
einer Grenzkonzentration<br />
zwei Phasen<br />
• Darstellung der Löslichkeit<br />
in Form von<br />
Dreiecksdiagrammen<br />
Food Process Engineering
Phänomen der Phasenseparation<br />
Theorie<br />
Praxis<br />
+<br />
polysaccharide<br />
protein<br />
segragation<br />
association<br />
incompatibility<br />
co-solubility<br />
complexation<br />
Food Process Engineering
Visualisierung durch Phasendiagramme<br />
Polysaccharide, % wt<br />
binodal line<br />
E<br />
cosolubility<br />
phase<br />
separation<br />
C<br />
tie line<br />
D<br />
Protein, % wt<br />
Zusammensetzungen:<br />
C: Ausgangsmischung<br />
D: Protein angereicherte<br />
Phase<br />
E: Polysaccharid angereicherte<br />
Phase<br />
Erstellung durch:<br />
• Chemische Analyse der Phasen<br />
• Cloudy-Point-Methode<br />
Food Process Engineering
Wässrige Zwei-Phasen Extraktion<br />
• Wässrige Zwei-Phasen-Extraktion<br />
• Darstellung in Form von Dreiecksdiagrammen<br />
• Jedoch: Produktverteilung nicht ablesbar!<br />
• Polymersysteme:<br />
− Dextran/PEG<br />
− PEG/Salz (Phosphat oder Sulfat)<br />
• Verteilungskoeffizient K<br />
− beschreibt Verteilung des abzutrennenden Stoffes in den<br />
beiden Phasen λ: Koeffizient, der die molmasseunabhängigen<br />
Wechselwirkungen beschreibt<br />
A<br />
ln K =<br />
λ<br />
A: Moleküloberfläche<br />
k T<br />
k: Boltzmann-Konstante<br />
T: Temperatur<br />
Food Process Engineering
Wässrige Zwei-Phasen Extraktion<br />
• Ziel: Verteilung des<br />
gewünschten Produktes<br />
in einer, Fremdproteine<br />
und Zellbruchstücke in<br />
der anderen Phase<br />
• Mögliches Verfahrensschema<br />
zur extraktiven<br />
Enzymaufarbeitung im<br />
wässrigen Zweiphasen-<br />
System<br />
Food Process Engineering
Trenngrenzen und Druckbereiche<br />
druckgetriebener Membranverfahren<br />
Food Process Engineering
Food Process Engineering<br />
Downstream-Processing
Membranverfahren<br />
Mikrofiltration Ultrafiltration Nanofiltration Umkehrosmose<br />
Teilchengröße<br />
Elektrodialyse<br />
NaCl<br />
Mikroorganismen<br />
Fettkügelchen<br />
Food Process Engineering<br />
Proteine Zucker Salze
Food Process Engineering<br />
EM-Bild einer MF-Membran
Rückhaltevermögen von UO und NF-Membranen<br />
Food Process Engineering
Elektrodialyse<br />
• Abtrennung ionischer<br />
Bestandteile aus einer<br />
wässrigen Lösung<br />
• Potenzialdifferenz als<br />
treibende Kraft<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
-<br />
+<br />
-<br />
- -<br />
+<br />
+<br />
+<br />
• Beispiel: Gewinnung<br />
von organischen<br />
Säuren (Milchsäure)<br />
K<br />
A<br />
K<br />
A<br />
-<br />
+<br />
+ -<br />
-<br />
-<br />
-<br />
K<br />
K...kationenselektive Membran<br />
A...anionenselektive Membran<br />
Food Process Engineering
Fällungsreaktionen<br />
• Ausfällung von Proteinen aus der<br />
Fermentationsbrühe<br />
• Anschließende Abtrennung durch Zentrifugation oder<br />
Filtration<br />
• Ausfällen der Proteine mit Hilfe von<br />
− Salz<br />
− Organischen Lösungsmitteln<br />
− Polymeren<br />
• Beispiel für Produktgewinnung mittels Fällung:<br />
Herstellung des Enzyms Transglutaminase<br />
− Fällung mit Ethanol<br />
Food Process Engineering
Fermentative Gewinnung mikrobieller Transglutaminase<br />
Mikroorganismen<br />
Dextrin + Ethanol<br />
Mikroorganismen<br />
Fermentation<br />
(Batch)<br />
Abtrennen und<br />
aufkonzentrieren<br />
⇒ Extrazelluläres Enzym<br />
Fällung<br />
(Prezipitation)<br />
Mikroorganismen: Streptoverticillium sp.<br />
Medien: Hefe, Fleischextrakt<br />
Dextrin<br />
Vakuumtrocknung Vermahlen Mischen<br />
Verpacken<br />
Food Process Engineering<br />
Transglutaminase
Downstream-Processing<br />
Bioreaktor<br />
Separation<br />
Biomasse<br />
Überstand<br />
Überstand<br />
Food Process Engineering<br />
Zellaufschluss<br />
Produkt-<br />
Gewinnung/-<br />
konzentrierung<br />
Produktaufreinigung
Produktreinigung<br />
• Stellt den letzten und teuersten Schritt im<br />
Downstream-Processing dar<br />
• Hauptsächlich eingesetzt:<br />
− Elektrokinetische Trennverfahren (Elektrophorese)<br />
− Chromatographische Trennverfahren<br />
• Elektrokinetische Trennverfahren<br />
− Werden aufgrund hoher Kosten vorwiegend im analytischen<br />
Maßstab eingesetzt<br />
− Es werden keine besseren Trennleistungen als bei<br />
chromatographischen Verfahren erzielt<br />
Food Process Engineering
Chromatographische Trennverfahren<br />
• Wirkungsweise<br />
− Verschiedene Komponenten einer Lösung (mobile Phase)<br />
interagieren verschieden stark mit den Partikeln eines<br />
Festbetts (stationäre Phase) bei der Durchströmung<br />
Unterschiedliche Verweilzeiten führen zu einer<br />
Komponententrennung<br />
• Hohe Selektivität chromatographischer<br />
Trennverfahren bei richtiger Auswahl von mobiler und<br />
stationärer Phase<br />
Food Process Engineering
Chromatographiesäulen im<br />
Downstreambereich einer Pharmaproduktion<br />
Food Process Engineering
Arten von Flüssig-Chromatographie<br />
Food Process Engineering
Chromatographische Trennverfahren<br />
• Trennung zweier Substanzen<br />
nur, wenn unterschiedliche<br />
Retentionsvolumina bzw.<br />
unterschiedliche<br />
Retentionszeiten<br />
(unterschiedliche<br />
Kapazitätsfaktoren)<br />
• Breite der Elutionspeaks wichtig<br />
für die Qualität der Trennung<br />
− Bodenzahl (Maß für die<br />
Effizienz)<br />
Food Process Engineering
Chromatographische Trennverfahren<br />
100<br />
CMP A<br />
A226 [mAU]<br />
80<br />
60<br />
40<br />
GMP A+B<br />
*<br />
CMP B<br />
20<br />
0<br />
10 12 14 16 18 20 22<br />
RT [min]<br />
Food Process Engineering
Beispiel Ionenaustauschchromatographie<br />
Titrationskurven von Proteinen -><br />
Einzigartig für jedes Protein<br />
unterhalb pI -> Kationenaustauscher<br />
Oberhalb pI -> Anionenaustauscher<br />
-> daher optimal für IEC<br />
Food Process Engineering
Beispiel Ionenaustauschchromatographie<br />
Food Process Engineering
Beispiel Ionenaustauschchromatographie<br />
Food Process Engineering
Beispiel Ionenaustauschchromatographie<br />
Food Process Engineering
Affinitätschromatographie<br />
• Trennmethode mit der<br />
größten Selektivität<br />
• Spezifische Bindung des<br />
Proteins (vgl.<br />
Immobilisierung von<br />
Enzymen)<br />
• Elution schwierig<br />
Food Process Engineering
Gelfiltration<br />
• Trennung nach<br />
Molekülgröße<br />
• Größte Moleküle kürzeste<br />
Retentionszeit<br />
• Bevorzugt im Labormaßstab<br />
wegen der geringen<br />
Durchsätze<br />
Food Process Engineering
Gelfiltration<br />
UV-Absorption bei 280 nm [mAU]<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
zunehmendes<br />
Molekulargewicht<br />
Na-Caseinat ohne TG<br />
Na-Caseinat +TG 90 min<br />
‣ Trennung von Molekülen<br />
unterschiedlichen Molekulargewichtes<br />
beim Durchlaufen<br />
eines Gelfiltrationsmediums<br />
‣ Alle GPC-Proben werden mittels<br />
Dithiothreitol (DTT) reduziert<br />
‣ Eluent: 6 M Harnstoffpuffer<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
Retentionszeit [min]<br />
Food Process Engineering
Scaling Up<br />
• Zuerst: absolut optimierte Methode im analytischen Maßstab ermitteln!<br />
• Up-Scale ist nicht einfach durch das Übertragen der Methode auf ein<br />
größere Säule zu erreichen!<br />
• Probleme: starker Druckanstieg (backpressure) durch kleine<br />
Partikelgrößen<br />
-> größere Partikel<br />
-> niedrigere Auflösung<br />
• wenn möglich im analytischen Maßstab schon das gleiche Material wie<br />
im up-Scale benutzen<br />
• höhere Flußrate führt zu geringerer Austrennung<br />
Food Process Engineering
Scaling-Up –<br />
Einfluss der Partikelgröße des Trägermaterials<br />
Food Process Engineering
Ion exchange<br />
In conventional Polishing Scale-Up, Bottlenecks lead to oversizing<br />
Lab scale<br />
Clinical lots<br />
Production<br />
600 mm, 50 L,<br />
50 mm, 0.5 L<br />
200 mm, 5 L<br />
500 l/h BC 1500 g<br />
Membrane-based Scale up Options in Polishing:<br />
5 ml 50 ml<br />
30‘, 0.5L, > 500 l/h,<br />
BC 15 g<br />
Food Process Engineering
Membranadsorber<br />
Typ. Flussrate 300 cm/h<br />
Food Process Engineering<br />
Flussrate 14000 cm/h<br />
Sartorius
Zusammenfassung<br />
• Downstream-Processing: Prozessschritte abhängig davon ob<br />
das Produkt<br />
− Intrazellulär vorliegt Aufarbeitung komplizierter<br />
− Extrazellulär vorliegt<br />
− die Biomasse darstellt<br />
• Mechanische Verfahren zur Zellabtrennung<br />
− Separator<br />
− Membrantrennverfahren<br />
• Meist mechanische Verfahren zum Zellaufbruch<br />
• Produktgewinnung<br />
− Thermische Verfahren<br />
− Extraktionsverfahren<br />
− Membrantrennverfahren<br />
− Fällungsreaktionen<br />
• Chromatographische Verfahren zur Produktreinigung<br />
Food Process Engineering
Change language