Versuche

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!!! Zum Start des Versuches 1 benötigt jede Gruppe bereits am 21. Oktober 2013 folgende 

Ausgangsmaterialien: 

________________________________________________________________________________ 

1.1. LACTOBACILLEN 

Joghurt, Quark, Sauerkraut, Silage, saure Bohnen, Sauerteig, usw. 

1.2. SCHWEFELBAKTERIEN (Thiobacillus) 

anaerobe (nach H 2 

S stinkende) Sedimente aus Pfützen, Tümpeln..., Erdproben aus 

Mülldeponien, Klärschlamm, abgestandenes (stinkendes) Wasser aus Blumenvasen... 

1.3. ACTINOMYCETEN 

fein gesiebte Gartenerde, Komposterde 

1.4. MYXOBACTERIEN 

faulendes Pflanzenmaterial, Kot pflanzenfressender Tiere, Baumrinde... 

1.5. RHODOSPIRILLEN 

Wasserproben aus verschlammten Gräben oder Teichen 

1.6. FLOURESZIERENDE PSEUDOMONADEN 

Erde; Teich- oder Flußwasser 

1.7. RHIZOBIEN 

Wurzeln mit Wurzelknöllchen von Alfalfa, Lupinen, rotem Klee oder anderen Leguminosen 

1.8. HALOBAKTERIEN 

gesalzener Fisch; Meersalz ... 

1.9. BDELLOVIBRIO 

(bakteriell) verschmutztes Teich- oder Flußwasser; Erdproben

WS 13/14 

AUFBAUPRAKTIKUM 

VERTIEFUNGSPRAKTIKUM MIKROBIOLOGIE I [MBI] 

Bernhard Henrich 

__________________________________________________________________________________ 

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Inhalt 

1. Anreicherung von Bakterien 

1.1. Lactobacillen 

1.2. Schwefelbakterien 

1.3. Actinomyceten 

1.4. Myxobacterien 

1.5. Rhodospirillen 

1.6. Fluoreszierende Pseudomonaden 

1.7. Rhizobien 

1.8. Halobacterien 

1.9. Bdellovibrio 

2. Wachstum von Bakterien 

2.1. Wachstumskurve 

2.2. Wachstum in Abhängigkeit von der C-Quelle 

2.3. Vitaminbestimmung mittels Bakterienwachstum 

3. Abtötung von Bakterien 

3.1. I naktivierung durch Hitze 

3.2. In aktivierung durch UV-Licht 

4. Resistzenz gegen Antibiotika 

4.1. Resistenz einer Subpopulation 

4.2. Resistenz von E. coli aus menschlicher Stuhlprobe 

5. Charakterisierung von Bakterien 

5.1. Artbestimmung von Lactobacillen 

5.1.1. Morphologie 

5.1.2. Temperaturoptimum 

5.1.3. Fermentationstyp 

5.1.4. Vergärung von Zuckern 

5.1.5. Verschiedene Stoffwechselleistungen 

5.1.6. Bestimmung der Milchsäure-Konfiguration 

5.2. Identifizierung von Enterobacteriaceae 

5.3. Mikrobiologische Trinkwasseruntersuchung 

5.3.1. Gesamtkeimzahl 

5.3.2. E. coli und coliforme Keime 

5.3.3. Sulfitreduzierende sporenbildende Anaerobier 

5.3.4. Pseudomonas aeruginosa 

5.3.5. Enterokokken 

6. Genübertragung bei Bakterien 

6.1. Transformation bei Streptococcus pneumoniae 

6.2. Konjugation bei E. coli 

7. Bakteriophagen 

7.1. Isolierung von Coliphagen aus Abwasser 

7.2. Herstellung von Lysaten 

7.3. Phagen-Wirtsspezifität (Lysotypie) 

7.4. Isolierung Phagen-resistenter Mutanten 

7.5. Bestimmung der "burst size"

1. ANREICHERUNG VON BAKTERIEN 

__________________________________________________________________________________ 

Ziel: Bakterien unterschiedlicher taxonomischer Gruppen sollen durch Anwendung gezielter 

Strategien aus Nahrungsmitteln und natürlichen Ausgangsmaterialien angereichert und 

beschrieben werden. 

3 

1.1. LACTOBACILLEN 

Material: Joghurt, Quark, Sauerkraut, Silage, saure Bohnen, Sauerteig, usw. 

Medium : Rogosa-Acetat-Agar: 

MRS-Bouillon, (MRS-Agar): 

Pepton aus Casein 10 g 

Hefeextrakt 5 g Pepton 1 g 

D(+)Glucose 20 g Fleischextrakt 5 g 

KH 2 PO 4 6 g Hefeextrakt 5 g 

NH 4 Citrat 2 g D(+) Glucose 20 g 

Tween 80 1 g K 2 HPO 4 2 g 

Na Acetat 15 g Tween 80 1 g 

MgSO 4 0.575 g (NH 4 ) 2 H Citrat 2 g 

FeSO 4 0.034 g Na Acetat 5 g 

MnSO 4 0.12 g MgSO 4 0.1 g 

Agar 15 g MnSO 4 0.05 g 

H 2 O ad 1 l (Agar 12 g) 

pH 5.5 mit Essigsäure einst. pH 6.5 

NICHT autoklavieren!! 

autoklavieren 

A. Zutaten (außer Agar!) in 700 ml H 2 O lösen, pH einstellen,-> 60°C-Bad; 

B. Agar in 300 ml H 2 O schmelzen (100°C), auf 60°C abkühlen; -> A + B 

0.9 % NaCl (in 4.5 ml Portionen) 

Durchführung: 

1. Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials in 0.9% NaCl (10-er Stufen: jeweils 4.5 ml NaCl-Lösung 

+ 0.5 ml Probe) anlegen (bis 10 -6 ). 

2. Von den Verdünnungsstufen 10 -4 , 10 -5 und 10 -6 jeweils 0.1 ml in zwei parallelen Ansätzen auf 

Rogosa-Acetat-Agar ausspateln; im Anaerobentopf bebrüten; Inkubation bei 30°C (ca. 5 

Tage) bzw. 37°C (ca. 3 Tage), je nachdem, ob Strepto- oder Thermobakterien erwartet werden. 

3. Kolonien auf den Platten der verschiedenen Verdünnungsstufen zählen! Etwa 10, möglichst 

verschiedenartig aussehende Kolonien phasenkontrastmikroskopisch untersuchen: Kolonien mit 

der Impföse abheben und in je 0.1 ml steriler 0.9% NaCl-Lösung verreiben; ein kleiner Tropfen 

der Suspension wird mikroskopiert. 

4. Suspensionen, deren Zellen stäbchenförmige Morphologie zeigen, werden mit je 5 ml MRS- 

Bouillon vermischt und bei 30 bzw. 37°C bebrütet. 

5. Bakterien in den Kulturen erneut mikroskopisch auf Stäbchenform kontrollieren. Von 3 Proben 

Verdünnungsreihen anlegen (bis 10 -7 ); je 0.1 ml der 10 -5 , 10 -6 und 10 -7 Verdünnungen auf 

MRS-Agar ausspateln und entsprechend bebrüten.

6. Von jeder Probe je 2 Einzelkolonien in je 5 ml MRS-Bouillon impfen und bebrüten; Einheitlichkeit 

der Kulturen mikroskopisch kontrollieren. (DIESE KULTUREN WERDEN AUCH IN DEN 

VERSUCHEN 5.1.2. - 5.1.5. GEBRAUCHT!) 

7. Stichkulturen in MRS-Agar anlegen, bebrüten, bei 4°C aufbewahren. 

Auswertung: 

1. Anreicherungsstrategie erklären; 

2. Gesamt-Keimzahl/ml ermitteln; 

3. Beschreibung der 3 konservierten Isolate: Ausgangsmaterial; Bebrütungstemperatur; 

Koloniemorphologie; Zellform. 

Die isolierten Lactobacillen sollen in Abschnitt 5. näher charakterisiert werden. 

4 

1.2. SCHWEFELBAKTERIEN (Thiobacillus) 

Material: anaerobe (nach H 2 S stinkende) Sedimente aus Pfützen, Tümpeln..., Erdproben aus 

Mülldeponien, Klärschlamm, abgestandenes (stinkendes) Wasser aus Blumenvasen... 

Medium: Thio-Medium 

Metall-Lösung 

Na 2 S 2 0 3 x 5H 2 O 10.0 g EDTA 50.0 g 

KH 2 PO 4 4.0 g ZnSO 4 x 7H 2 O 22.0 g 

K 2 HPO 4 4.0 g CaCl 2 5.54 g 

MgSO 4 x 7H 2 O 0.8 g MnCl 2 x 4H 2 O 5.06 g 

NH 4 Cl 0.4 g FeSO 4 x 7H 2 O 4.99 g 

Metall-Lösung 10.0 ml (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 x 4H 2 0 1.10 g 

H 2 O ad 1 l CuSO 4 x 5H 2 O 1.57 g 

15 min bei 121°C autoklav. CoCl 2 x 6H 2 O 1.61 g 

pH 3.8 mit H 2 SO 4 einst. H 2 O ad 1 l 

ACHTUNG! alles getrennt (in kleinen Reagenzgläsern) 

abwiegen und in kleinen Volumina H 2 O lösen (EDTA zum 

Lösen mit NaOH konz. bis ca. pH 8.0 titrieren). Erst dann: 

alles zusammenkippen, mit H 2 O auf ca. 800 ml auffüllen, pH 

6.0 mit KOH einstellen. 

Thio-Agar: Thio-Medium mit 15g Agar/l; pH 3.8 nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 

45...50°C mit H 2 SO 4 einstellen (ACHTUNG! der pH-Wert muß unbedingt stimmen!). 


1. 20 ml Medium (in einem 100 ml Kolben) mit ca. 1 g Probenmaterial versetzen. 

2. Über einen Zeitraum von 1 bis 2 Wochen in Abständen von 1 bis 2 Tagen Proben (2 ml) 

entnehmen, a) pH-Wert messen 

b) Bakterien im Mikroskop (Phako) anschauen 

3. Bei deutlicher pH-Absenkung und Trübung: Verdünnungsaustriche auf Thio-Agarplatten. 

Bei Raumtemperatur bebrüten. 

Auswertung:

5 


2. graphische Darstellung des pH-Wertes (und ev. der Trübung der Kultur in Abhängigkeit von 

der Inkubationszeit; 

3. Beschreibung der Zellmorphologie; 

1.3. ACTINOMYCETEN 

Material: fein gesiebte Gartenerde, Komposterde 

Medien: Jensen Agar: Soja Nährboden: 

Glucose 2 g Pepton aus 

Caseinpepton 0.2 g Sojamehl 20 g 

KH 2 PO 4 0.5 g Mannit 20 g 

MgSO 4 x 7 H 2 O 0.2 g Agar 18 g 

Spurenelementlsg. 5 ml Leitungswasser ad 1 l 

Agar 15 g 

H 2 O ad 1 l pH 6.8, autoklavieren 

pH 6.5 - 6.8, autoklavieren 

Nach dem Abkühlen auf ca.50°C 

Nystatin (= "Moronal", Fungistaticum) zugeben (300 E/ml) und sofort Platten gießen. 

Spurenelementlösung: 5 g möglichst stark mineralisierte Erde in 100 ml H 2 O kochen; 

zentrifugieren (5 min, 10 rpm); filtrieren; autoklavieren 

Ziel: Isolierung aerober Streptomyceten. Da Streptomyceten keine Einzelzellen bilden, werden 

Reinkulturen durch Vereinzelung und Auskeimen von Sporen angelegt. 


1. 10 g Probenmaterial in 100 ml Leitungswasser aufschwemmen; in Erlenmeyerkolben ca. 45 min 

schütteln; ein Teil der Suspension 1:10 mit H 2 O verdünnen. 

2. Je 2 Tropfen der unverdünnten und der 1:10 verdünnten Suspensionen mit je 10 ml Phenollösung (1 

g Phenol / 140 ml H 2 O) vermischen; 15 min stehen lassen. 

3. Je 2 Tropfen der phenolbehandelten Suspensionen in 2 Petrischalen geben; je 20 ml geschmolzenen 

und auf 47°C abgekühlten Jensen Agar (mit Nystatin) zugeben; gut vermischen durch 

kreisende Bewegungen der Petrischalen (Das Benetzen von Schalenrand und Schalendeckel mit 

Agar ist zu vermeiden!); bei 28°C inkubieren; 

4. Etwa zwischen dem 7. und dem 15. Tag nach Ausplattierung Sporen aus dem Luftmycel von 

mindestens 4 möglichst unterschiedlich aussehenden Kolonien vorsichtig mit der sterilen 

Impföse abtupfen; in Sektoren von Soja-Nährbodenplatten ausstreichen; bei Raumtemperatur 

inkubieren. 

Auswertung: 


2. Entwicklung und Aussehen der Kolonien und des Mycels während der Inkubationszeit in 

Abständen von 2 bis 3 Tagen beobachten und dokumentieren.

6 

1.4. MYXOBACTERIEN 

Material: faulendes Pflanzenmaterial, Kot pflanzenfressender Tiere, Baumrinde; 

Medien: 

Wasseragar: 20 g Agar / l H 2 O; pH 7.0 einstellen; autoklavieren; 

+ Nystatin (30µg/ml) (Nystatin erst nach Erkalten des Agars auf 50...60°C 

zugeben!) 

Futterbakterien: 24-stündige Kulturen von E. coli auf LB-Agarplatten 

E. coli-Agar: gefriergetrocknete E. coli Zellen 1 g 

MgSO 4 x 7H 2 O 

0.5 g 

CaCl 2 x 2H 2 O 

0.5 g 

Agar 

15.0 g 

H 2 0 ad 1 l 


1. Auf 4 Wasseragarplatten jeweils einen DICKEN (!) Schmier ( ca. 1 x 4 cm) aus Futterbakterien 

aufbringen. Darauf KLEINE (!) Krümel aus Erde oder Baumrinde legen. 

2. Platten bei 27°C in einer "feuchten Kammer" inkubieren; nach 3...4 Tagen sollten schwärmende 

Zellen (Mikroskop), später (1...3 Wochen) Fruchtkörper sichtbar sein. 

3. schwärmende Zellen oder Fruchtkörper baldmöglichst und möglichst weit vom Bakterienschmier 

entfernt abimpfen (z.B. mit ausgezogener Kapillare) und auf E. coli-Agar ausstreichen; Platten 

bei Raumtemperatur inkubieren. 

4. Mikroskopische Untersuchung der Myxobakterien. 

Auswertung: 


2. Morphologische Beschreibung der isolierten Myxobacterien; 

1.5. RHODOSPIRILLEN 

Material: Wasserproben aus verschlammten Gräben oder Teichen 

Medium: Rhodospirillen-Nährlösung: 

LÖSUNG A: LÖSUNG B: 

DL-Äpfelsäure 3.75 g K 2 HPO 4 1.35 g 

NH 4 Cl 1.8 g KH 2 PO 4 0.9 g 

MgSO 4 x 7H 2 O 0.3 g H 2 O ad 0.15 l 

CaCl 2 0.105 g autoklavieren 

Hefeextrakt 

0.75 g 

1/25 Spurenelemente 12.0 ml Spurenelemente (vor Gebrauch 1:25 verdünnen!!) 

H 2 O ad 1350 ml Borsäure 2.86 g 

pH 6.8 mit 20% NaOH; ZnSO 4 0.22 g 

autoklavieren MnCl 2 1.81 g 

CuSO 4 

0.08 g 

Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 0.04 g 

CoCl 2 

0.024 g

7 

H 2 O ad 1 l 

Nach dem Autoklavieren Lösungen A und B zusammengeben und in sterile 

Schraubdeckelflaschen abfüllen 

Nähr-Agar: 

Agar 17 g ; H 2 O ad 500 ml autoklavieren; noch heißen Agar zu 500 ml steriler, warmer, doppelt 

konzentrierter Nährlösung I (s.o.) geben; gut mischen; vor dem Gießen auf 50°C abkühlen; 


1. 100 ml Schraubdeckelflaschen mit 90 ml Rhodospirillen-Nährlösung füllen, 5 ml einer 

Wasserprobe zugeben und gut mischen; Flaschen mit Nährlösung bis zum Rand füllen und 

Deckel luftblasenfrei aufsetzen; Flaschen 2 bis 3 Wochen im Dauerlicht bei ca. 30°C bebrüten. 

2. Von gut bewachsenen Kulturen Verdünnungsreihen mit steriler 0.9%iger NaCl-Lösung herstellen 

(bis 10 -4 ); von den Verdünnungsstufen 10 -2 , 10 -3 und 10 -4 je 0.1 ml auf Nähragarplatten 

ausspateln; im Anaerobiertopf bei 30°C im Dauerlicht inkubieren. 

Auswertung: 


2. Titerbestimmung der Photosynthetiker und Nicht-Photosynthetiker in der Flüssigkultur; 

3. Beschreibung der Kolonieform und Farbe und der Zellmorphologie der isolierten photosynthetischen 

Bakterien; 

1.6. FLOURESZIERENDE PSEUDOMONADEN 

Material: Erde; Teich- oder Flußwasser 

Medien: Succinate-Salts Medium 

Succinate-Salts Platten 

KNO 3 0.5 g Succinate-Salts Medium 

K 2 HPO 4 0.5 g + 15 g/l Agar 

MgSO 4 x 7 H 2 O 0.2 g 

CaCl 2 x 2 H 2 O 0.1 g 

FeSO 4 x 7 H 2 O 0.2 g 

Na-Succinat 4.0 g 

H 2 O ad 1 l pH 7.0; autoklavieren 

(Im Medium bildet sich ein leichter Niederschlag, der aber nicht stört) 


1. 3 ml Succinate-Salts Medium mit 0.1 g Erde bzw. 0.1 ml Wasserprobe beimpfen; bei 30°C 

schütteln 

2. 0.1 ml der bewachsenen Kultur in 3 ml frisches Succinate-Salts Medium überimpfen; bei 30°C 

schütteln 

3. Verdünnungsausstrich auf Succinate-Salts Platten; bei 30°C inkubieren 

Auswertung: 

1. Anreicherungsstrategie erklären;

8 

2. Beschreibung der Kolonie- und Zellmorphologie. 

1.7. RHIZOBIEN 

Material: Wurzeln mit Wurzelknöllchen von Alfalfa, Lupinen, rotem Klee oder anderen 

Leguminosen 

Medium: Hefeextrakt-Mannitol-Agar 

Spurenelementlösung 

Hefeextrakt 1.5 g trockene Erde 160.0 g 

Mannitol 15.0 g Na 2 CO 3 0.4 g 

Agar 22.5 g H 2 0 400.0 ml 

Spurenelementlösung 300.0 ml 

autoklavieren (1h), zentr. (5 min 10 Krpm), 

H 2 O ad 1.5 l filtrieren; pH 7.2 einstellen. 

pH 7.0 einstellen; autoklavieren. 


1. Kurzes Wurzelstück mit einem Wurzelknöllchen ausschneiden; unter fließendem Wasser mit 

Bürste sorgfältig waschen; 3 min in eine sauere HgCl 2 -Lösung (0.1% HgCl 2 , O.2% HCl) legen 

und leicht bewegen (sterile Pinzette!); 5 min in 75% EtOH baden; mindestens fünfmal in 

sterilem H 2 O waschen. 

2. Sechs sterile Petrischalen mit jeweils 1 ml sterilem H 2 O vorbereiten; Wurzelknöllchen in die erste 

Schale legen und mit steriler Pinzette aufbrechen; Inhalt mit dem H 2 O vermischen; 50 µl der 

Suspension zu dem sterilen H 2 O in der 2. Petrischale geben (automatische Pipette); mischen; 

Suspension kontinuierlich in den verbleibenden 4 Petrischalen weiterverdünnen. 

3. Zu jeder der 6 Verdünnungen ca. 20 ml geschmolzenen und auf 45°C abgekühlten Hefeextrakt- 

Mannitol-Agar zugeben; mischen; bei Zimmertemperatur inkubieren; 

4. Von Einzelkolonien Verdünnungsausstriche auf Hefeextrakt-Mannitol-Agar anlegen; 

bei Zimmertemperatur bebrüten. 

Auswertung: 


2. Abschätzung der Gesamtbakterienzahl in einem Wurzelknöllchen; 

3. Beschreibung der Zell- und Koloniemorphologie der isolierten Rhizobien. 

1.8. HALOBAKTERIEN 

Material: gesalzener Fisch; Meersalz ... 

Medium: Halobacterien-Medium 

Halophilen-Agar 

Caseinhydrolysat 7.5 g Halophilen-Medium 

Hefeextrakt 10.0 g + 20 g/l Agar; 

Tri-Natriumcitrat 3.0 g erhitzen bis Agar geschmolzen 

Kcl 2.0 g 

MgSO 4 x 7H 2 O 20.0 g (VORSICHT, kocht schnell über !!) 

FeSO 4 x 7H 2 O 0.05 g 

MnSO 4 x H 2 O 0.2 mg

9 

NaCl 

250.0 g 

H 2 O ad 1 l 

pH 7.4 mit conc. NaOH einstellen; NICHT autoklavieren!!! 


1. 5 ml Halophilen-Medium mit Probenmaterial infizieren; bei 37°C schütteln; 

2. Verdünnungsausstrich auf Halophilen-Agar; 3 bis 4 Tage bei 37°C bebrüten (Platten in Plastiksäcke 

einpacken, um Austrocknung zu verhindern) 

Auswertung: 

1. Anreicherunsstrategie erklären; 

2. Beschreibung der Kolonie- und Zellmorphologie isolierter Halobakterien 

1.9. BDELLOVIBRIO 

Material: (bakteriell) verschmutztes Teich- oder Flußwasser; Erdproben 

Medien: CaCO 3 -Platten: 

Hefeextrakt 10.0 g 

Glucose 20.0 g 

CaCO 3 20.0 g 

Agar 

15.0 g 

H 2 O ad 1 l 

Tris-YP-Medium: 

Hefextrakt 

3.0 g 

Pepton 

0.6 g 

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ad 1 l 

Tris-YP-Weichagar: 

Tris-YP-Agar: 

Tris-YP-Medium + 0.6% Agar 

Tris-YP-Medium + 1.2% Agar 

Futterbakterien: Bakterienrasen von Pseudomonas putida auf CaCO 3 -Platten, 

abgeschwemmt in je 5 ml Tris-YP-Medium. 


für Wasserproben: 

1. 0.1 ml und 1.0 ml Probe *) mit je 5 ml geschmolzenem und auf ca. 45°C abgekühltem Tris-YP- 

Weichagar und je 0.5 ml Futterbakterien (Pseudomonas) vermischen; auf Tris-YP-Agarplatten 

(möglichst auf 37°C vorgewärmt) auskippen. 

für Bodenproben: 

1. 1.0 g Erde mit 10 ml Leitungswasser 20 min schütteln; Suspension 1:10 mit Wasser verdünnen *) ; 

davon 1 ml mit 5 ml geschmolzenem und auf ca. 45°C abgekühltem Tris-YP-Weichagar und 0.5 

ml Futterbakterien (Pseudomonas) vermischen; auf Tris-YP-Agarplatten (möglichst auf 37°C 

vorgewärmt) auskippen. 

max. 6 Tage bei 30°C inkubieren.

_____________________________ 

*) Um Kontaminationen durch andere Bakterien und Pilze zu vermeiden, können die Proben durch 

0.45 µm-Filter filtriert werden. 

2. Plaques, die innerhalb der ersten 24 h sichtbar werden, rühren mit großer Wahrscheinlichkeit von 

Bakteriophagen; sie werden markiert, um eine Verwechslung mit Bdellovibrio-Plaques, die 

frühestens nach 2 Tagen zu sehen sind, zu vermeiden. (Im Gegensatz zu Phagen-Plaques nehmen 

Bdellovibrio-Plaques außerdem bei fortdauernder Inkubation stetig an Größe zu.) 

3. Bdellovibrio mit der Impföse vom Rand der Plaques entnehmen (ausstechen) und in je 0.7 ml Tris- 

YP-Medium suspendieren (ca. 2 h schütteln); 10 -1 und 10 -2 -Verdünnungen in Tris-YP-Medium 

herstellen; je 0,1 ml der unverdünnten Suspension und derVerdünnungen mit je 0.5 ml 

ausplattieren (s. Punkt 1.); bebrüten. 

Zusätzlich: 0.5 ml Futterbakterien mit 5 ml geschmolzenem (auf ca. 45°C abgekühltem) Tris- 

YP-Weichagar auf einer Tris-YP-Platte ausplattieren; nach Erkalten des Weichagars 15 µl der 

unverdünnten Bdellovibrio-Suspension auftropfen; eintrocknen lassen; bebrüten. 

4. Einzelplaques in Tris-YP-Medium verreiben und phasenkontrastmikroskopisch auf die Gegenwart 

von dünnen, hochbeweglichen Vibrios untersuchen. 

Auswertung: 


2. Bestimmung der Zahl der Bdellovibrio-Zellen in einem Plaque 

3. Beschreibung der Zellmorphologie der isolierten Vibrios 

10 

2. WACHSTUM VON BAKTERIEN 

________________________________________________________________________________ 

2.1. WACHSTUMSKURVE 

Ziel: Das Wachstum von Bakterien soll mittels verschiedener Methoden verfolgt werden. 

Stämme: Escherichia coli K-12 wt 

Escherichia coli B 

Escherichia coli JM109 

Escherichia coli CSR603 

Bacillus subtilis 

Medien: LB-Vollmedium: 

Pepton aus Fleisch 10.0 g 

Hefeextrakt 

5.0 g 

NaCl 

5.0 g 

(Agar 15.0 g) 

H 2 O ad 1 l autoklavieren 

0.9% NaCl (in 4.5 ml Portionen ) zum Verdünnen 

Durchführung

1. 5 ml Vorkultur des zu verwendenden Bakterienstamms in LB Medium anlegen; über Nacht bei 

37°C schütteln. 

2. 100 ml frisches, auf 37°C vorgewärmtes LB Medium in 1l Erlenmeyerkolben mit 1 ml (CSR603 

3.3 ml!) der Übernachtkultur beimpfen; gut durchmischen; bei 37°C schütteln; 

3. Zu den Zeiten t = 0, 30, 60, 90, 120, ... min nach Beimpfung je 2 ml der Kultur STERIL entnehmen 

und SOFORT auf Eis stellen; (Messung bis die stationäre Phase erreicht ist oder mindestens 6 

h) 

4. In den entnommenen Proben 

a) O.D.600 durch Trübungsmessung, 

b) Geamtzellzahl mit Hilfe der Thoma-Kammer sowie 

c) Lebendkeimzahl durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen *) 

(0.1 ml) auf LB-Platten bestimmen. 

*) Die geeignete Verdünnungsstufe läßt sich abschätzen aus der Gesamtzellenzahl 

(Thoma-Kammer) mit dem Erfahrungswert, daß 50-300 Kolonien pro Platte gut 

auswertbar sind. 

Auswertung: 

1. Wachstumskurven (mit Bezeichnung der einzelnen Wachstumsphasen) durch Auftragen der 

O.D.600-Werte (a), der Gesamtzellenzahl (b) und der Lebendkeimzahlen (c) gegen die Zeit 

erstellen. (Bei der Auftragung soll auf der X-Achse der Maßstab 30 min = 1cm gewählt werden.) 

2. Bestimmung der Generatiomszeit g aus der Steigung µ der linearen Kurvenabschnitte der O.D.- 

Kurve; µ = lnX - lnX 0 /t - t 0 ; g = ln2/µ; 

3. Graphische Darstellung der Beziehung zwischen O.D.600 und Lebendkeimzahl; 

11 

2.2. WACHSTUM IN ABHÄNGIGKEIT VON DER C-QUELLE 

Ziel: Die Verwertung verschiedener Zucker als Kohlenstoff-Quelle soll untersucht werden. 

Stämme: 

E. coli K-12 Wildtyp (Lac + und Sorb + Marker überprüfen!!) 

Medien: E-Minimalmedium: 

K 2 HPO 4 

5.25 g 

KH 2 PO 4 2.2 g 

(NH 4 ) 2 SO 4 4.0 g 

MgSO 4 x 7H 2 O 0.2 g 

FeCl 3 x 6H 2 O 2.7 mg 

H 2 O 

ad 980.0 ml 

nach dem Autoklavieren: + 20 ml 40% Glucose (steril!) 

E-Minimalmedium OHNE Glucose 

Zuckerlösungen: Glucose, 0.02 g/ml 

Lactose, 0.1 g/ml 

Sorbit, 0.1 g/ml autoklavieren! 

Durchführung:

12 

1. 30 ml Vorkultur des zu verwendenden Bakterienstammes in E-Minimalmedium + 0.8% Glucose 

anlegen; über Nacht bei 37°C schütteln; Bakterien einmal mit 40 ml E-Minimal-medium OHNE 

Glucose waschen (Ja20 -Zenrifugenröhrchen); in 30 ml E-Minimalmedium OHNE Glucose 

resuspendieren (alle Gruppen gemeinsam). 

2. 90 ml frisches, auf 37°C vorgewärmtes E-Minimalmedium OHNE Glucose (in 300 ml 

Erlenmeyerkolben) mit Zuckerlösungen (Glucose + Lactose bzw. Glucose + Sorbit) *) versetzen 

und mit 3 ml der gewaschenen Bakteriensuspension beimpfen; gut durchmischen, bei 37°C 

schütteln; 

3. nach der Beimpfung in Intervallen von (höchstens) 20 min Proben (ca. 1 ml) entnehmen und 

O.D.600 messen (Kürzere Meßintervalle ergeben genauere Kurven). Entnahmezeiten und O.D.- 

Werte notieren. Messungen so lange fortsetzten, bis die zweite stationäre Phase erreicht ist! 

*) 

Gruppe 1 2 3 4 5 6 

________________________________________________ 

Glucose 0.9 0.9 1.8 0.9 0.9 1.8 ml 

(20 mg/ml) 

Lactose 1.8 0.9 0.9 - - - ml 

(100 mg/ml) 

Sorbit - - - 1.8 0.9 0.9 ml 

(100 mg/ml) 

Auswertung: Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurven und Interpretation. (Bei der 

Auftragung soll auf der X-Achse der Maßstab 20 min = 1 cm gewählt werden.) 

2.3. VITAMINBESTIMMUNG MITTELS BAKTERIENWACHSTUM 

Ziel: Bestimmung des Nicotinsäure-Gehaltes in Bier durch Messung des Wachstums und der 

Milchsäure-Produktion von Lactobacillus. 

Stamm: Lactobacillus plantarum 

Material: 1:50 - 1:200 verdünntes Bier (Bischoff Pils); (Bier vor dem Verdünnen entgasen!) 

Medien: Niacin-assay-medium (Difco) 

Nicotinsäure-Stammlösung: 10 µg/ml 

Nicotinsäure-Standard: Stammlösung 1:100 verdünnen (Endkonz. 0.1 µg/ml) 

Salzlösung: 

NaCl 

5.0 g 

MgSO 4 x 7 H 2 O 0.12 g 


Bromthymolblau: 

0.1 g in 250 ml EtOH 

Durchführung:

1. Lactobacillus plantarum in 5 ml Niacin-Assaymedium (in kleinen Reagenzgläsern), supplementiert 

mit 50 µl Nicotinsäure-Stammlösung (Endkonz. 0.1 µg/ml), 24h bei 37°C anziehen 

2. Zellen abzentrifugieren (Ja21-Röhrchen, 5 min, 8000 Upm); 2 x in je 5 ml Salzlösung waschen; in 

5 ml Salzlösung suspendieren; 1:1000 verdünnen (d.h. 0.1 ml Zellsuspension + 100 ml 

Salzlösung); 

3. Folgende Testreihen in doppelter Ausführung ansetzen (Angaben in ml): 

I-------------------Eichkurve--------------------I I -----------Analyse----------I 

Röhrchen Nr. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

__________________________________________________________________________ 

Niacin-assaymedium 

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 

Nicotinsäure- 

Standard - - 0.15 0.3 0.5 0.75 1.0 1.25 - - - - - 

H 2 O (ml) 2,5 2,5 2,35 2,2 2,0 1,75 1,5 1,25 2,25 2,0 1,5 1,0 - 

Probelösung 

(ml) - - - - - - - - 0,25 0,5 1,0 1,5 2,5 

___________________________________________________________________________ 

Röhrchen autoklavieren (nur 10 min!); 

13 

4. Jedes Röhrchen außer Nr.0 mit 0,1 ml der verdünnten Bakteriensuspension (s. 2.) beimpfen; 18-24 

h bei 37°C inkubieren; 

5. Trübung bei 600 nm gegen Röhrchen Nr.0 (Nullwert) messen; 

6. Weitere 3 Tage bei 30°C bebrüten; 

7. Menge der gebildeten Milchsäure mit 0.1 N NaOH gegen Bromthymolblau (0.1 ml Bromthymolblau-Lösung 

zu 2.5 ml Kultur) bis zum Umschlag von gelb nach grün titrieren. 

Auswertung: 

1. Erstellung zweier Eichkurven durch Auftragung der O.D.600-Werte bzw. der verbrauchten NaOH 

in ml gegen die eingesetzten Nicotinsäurekonzentrationen. 

2. Bestimmung der Nicotinsäurekonzentration in der zu analysierenden Probe anhand der Eichkurven. 

Es sollten alle Werte, die sich aus der Auswertung der Röhrchen Nr.8 bis 12 ergeben, angegeben 

werden, sofern sie innerhalb der linearen Bereiche der Eichkurven liegen. 

3. ABTÖTUNG VON BAKTERIEN 

__________________________________________________________________________________ 

Ziel: 

Erstellung der Abtötungskinetiken von Bakterien bei Einwirkung von Hitze oder UV- 

Licht. 

3.1. INAKTIVIERUNG DURCH HITZE

14 

Stämme: Bacillus subtilis, Escherichia coli 

Medien: LB-Medium, LB-Agar (s.2.1.) 

neutrale Kochsalzlösung: 0.9% NaCl 


1. Übernachtkultur des zu testenden Stammes in 10 ml LB-Medium (2 Röhrchen à 5 ml) anlegen; 

2. O.D.600 messen; Zelldichte (Zellen/ml) (a) anhand der in Versuch 2.1. erstellten Kurven und (b) 

mit Hilfe der Zählkammer ermitteln. Zellen abzentrifugieren (Ja20-Röhrchen, 5 min, 8000 

Upm), 1x mit 10 ml 0.9% NaCl-Lösung waschen; in 0.9% NaCl-Lösung zu einer Zelldichte von 

~ 1 x 10 9 (für E. coli) bzw. ~1 x 10 8 (für B. subtilis) suspendieren. 

3. Titer der Zellsuspensionen durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf LB Agar überprüfen. 

4. Jeweils 3 Reagenzgläser mit je 9 ml Kochsalzlösung beschicken; 3 Wasserbäder auf 48, 54 bzw. 

57°C vorheizen. 

5. Ein Glas mit Kochsalzlösung 5 min im 48°C Bad vorwärmen; mit 1 ml der gewaschenen 

Bakterienkultur beimpfen; nach 2, 5, 10, 20, 40 min Proben von jeweils 1 ml entnehmen, in 

Zehnerschritten mit 0.9% NaCl verdünnen (s. untenstehendes Schema) und Keimzahl der 

Überlebenden durch Ausplattieren auf LB-Agarplatten bestimmen. 

6. Entsprechend (wie unter 5. beschrieben) wird bei 54 und 57°C verfahren. 

_____________________________________ 

jeweils 0.1 ml der folgenden Verdünnungen ausplattieren: 

E.coli in 0.9% NaCl 

Temp. 48° 54° 57° 

Zeit 

_________________________________________________ 

2 min 10 -4,-5,-6 10 -2,-3,-4 10 -1,-2,-3 

5 min 10 -4,-5,-6 10 -2,-3,-4 10 -1,-2,-3 

10 min 10 -3,-4,-5 10 -1,-2,-3 10 -1,-2,-3 

20 min 10 -3,-4,-5 10 -1,-2,-3 10 -1,-2,-3 

40 min 10 -2,-3,-4 10 -1,-2 10 -0,-1,-2 

_________________________________________________ 

B. subtilis in 0.9% NaCl 

Temp. 48° 54° 57° 

Zeit 

_________________________________________________ 

2 min 10 -4,-5,-6 10 -1,-2,-3 10 -1,-2,-3 

5 min 10 -4,-5,-6 10 -1,-2,-3 10 -1,-2,-3 

10 min 10 -3,-4,-5 10 -1,-2,-3 10 -1,-2,-3 

20 min 10-3,-4,-5 10-0,-1,-2 10-0,-1,-2 

40 min 10 -2,-3,-4 10 -0,-1,-2 10 -0,-1,-2 

_________________________________________________

15 

Auswertung: 

1. Bestimmung des tatsächlichen Titers der verwendeten Zellsuspensionen; 

2. Keimzahlen der Überlebenden für jede Temperatur und jeden Stamm logarithmisch über die Zeit 

auftragen; Inaktivierungsraten bestimmen; 

3.2. INAKTIVIERUNG DURCH UV-LICHT 

Stämme: 1. E. coli K-12 wt 

2. E. coli JM109 (recA) 

3. E. coli CSR603 (uvrA, recA) 

(200-ml Übernachtkulturen in 1l-Kolben) 

Medien: LB-Agarplatten 0.9 % NaCl-Lösung 

sterile Ja20- und Ja21-Becher (zum eventuellen Konzentrieren der Kulturen) 


1. O.D.600 der ausgegebenen Übernachtkulturen (je 200 ml in 1l- Kolben) messen. Anhand der in 

Versuch 2.1. erstellten Kurven die Lebendkeimzahlen ermitteln. 

2. Titer der Kulturen durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf LB-Agar überprüfen. (Jede 

Gruppe titriert jeden der drei Stämme!) 

3. Von den Kulturen werden Verdünnungen in 0.9% NaCl hergestellt, die es erlauben, in je 0.1 ml die 

in der Tabelle angegebenen Zellzahlen auf eine LB-Agarplatte zu bringen. (ACHTUNG: 

Verdünnungen auf EIS herstellen!). Falls die Zelldichten in den ausgegebenen Übernachtkulturen 

zu niedrig sind, werden die gewünschten Zellkonzentrationen (s. Tabelle) durch 

Abzentrifugieren größerer Kulturvolumina und Resuspension der Bakterien in sterilem LB 

Medium eingestellt. 

4. Entsprechende Verdünnungnen (0.1 ml) jeweils in doppelter Ausführung auf LB-Platten ausspateln; 

Platten 5 min trocknen lassen (vor der anschließenden Bestrahlung dürfen die Bakterien nicht 

wachsen. Platten, die nicht sofort bestrahlt werden können, sollten daher im Kühlschrank 

aufbewahrt werden). 

5. Platten für die in der Tabelle angegebenen Zeiten aus den angegebenen Abständen bei 254 nm 

bestrahlen; bei 37°C über Nacht IM DUNKELN bebrüten; 

6. Kolonien auszählen. 

Verdünnungen, Bestrahlungszeiten und Abstände: 

Bestrahlungszeit 30'' 90'' 180'' 300'' 

_________________________________________________________________________ 

Stamm: E.coli K-12 

Abstand: 41 cm 

Bakterienzahl / Platte 2x10 2 5x10 2 1x10 3 1x10 5 

Stamm: E.coli JM109 



_________________________________________________________________________

16 

Bestrahlungszeit 7'' 15'' 30'' 60'' 

________________________________________________________________________ 

Stamm: E.coli CSR603 



________________________________________________________________________ 

Auswertung: 

1. Bestimmung des tatsächlichen Titers der verwendeten Kulturen; 

2. Prozentsatz der überlebenden Zellen (= N t x 100/N o ) halblogarithmisch gegen die 

Bestrahlungsdauer auftragen; 

3. Wie lange müßten die einzelnen Stämme bestrahlt werden, um die Lebendkeimzahl um den 

Faktor 10 6 zu reduzieren (d.h. N t /N o = 10 -6 )? 

4. RESISTENZ GEGEN ANTIBIOTIKA 

________________________________________________________________________________ 

4.1. RESISTENZ EINER SUBPOPULATION 

Ziel: Ermittlung des Anteils der Streptomycin-resistenten Subpopulation in einer Bakterienkultur. 

Stämme: Übernachtkulturen Streptomycin-sensitiver Stämme von Escherichia coli und 

Staphylococcus aureus 

Medien: LB-Agar; LB-Medium 

Streptomycin-Stammlösungen: 2 mg/ml in H 2 O 

0,6 mg/ml in H 2 O 


Prinzip: Streptomycin wird in 5 Konzentrationen getestet; eine Kontrolle ohne Antibiotikum wird 

mitgeführt. Verschiedene Bakterienverdünnungen werden in Gegenwart der einzelnen Streptomycin- 

Konzentrationen ausplattiert. 

1. Herstellung der Streptomycin-Verdünnungen: Ausgehend von der Streptomycin-Stammlösung mit 

sterilem H 2 O folgende Verdünnungen herstellen (es werden jeweils 2.5 ml der einzelnen 

Konzentrationen gebraucht): 

Konz. Nr. I II III IV V VI 

_____________________________________________________________________ 

für E. coli 0.6 0.3 0.15 0.075 0.0375 0.0 mg/ml 

für S. aureus: 2.0 1.0 0.5 0.25 0.125 0.0 mg/ml 

2. Agar-Platten mit unterschiedlichen Streptomycin-Konzentrationen nach folgendem Verfahren 

gießen: Je 2 ml der einzelnen Streptomycin-Verdünnungen zu je 100 ml geschmolzenem und auf 

45-50°C abgekühltem LB-Agar geben, mischen, und jeweils 5 Platten gießen. Außerdem werden 

5 Platten OHNE Streptomycin gegossen. Platten trocknen. 

3. Übernachtkultur des Teststammes mit 0.9% NaCl in 10-er Schritten bis 10 -8 verdünnen.

17 

4. Jeweils 0.1 ml der Bakterien-Verdünnungen nach folgendem Schema auf den Streptomycinhaltigen 

Platten ausspateln: 

Strep.Konz 

Nr. I II III IV V VI 

___________________________________________________ 

Bakterien 

verd. 

unverd. x x - - - - 

10-1 x x - - - - 

10-2 x x x - - - 

10-3 x x x x - - 

10-4 - x x x x - 

10-5 - - x x x x 

10-6 - - x x x x 

10-7 - - - x x x 

10-8 - - - - x x 

___________________________________________________ 

5. Platten 1 bis 3 Tage bei 37°C bebrüten; Kolonien auszählen. 

Auswertung: 

1. Bestimmung des Bakterientiters in den verwendeten Übernachtkultur durch Auszählen der 

Streptomycin-freien Platten (Verdünnungen berücksichtigen!); 

2. Berechnung der tatsächlichen Antibiotika-Konzentrationen in den Platten; 

3. Für jede Streptomycinkonzentration soll die Anzahl der resistenten Bakterien a) absolut (d.h. in 

Zellen/ml der Übernachtkultur) und b) als Prozentsatz der Gesamtpopulation ermittelt werden 

(graphische Darstellung!). 

4.2. RESISTENZ VON E. COLI AUS MENSCHLICHER STUHLPROBE 

Ziel: Untersuchung der Resistenz von E. coli aus eigener Stuhlprobe gegen gängige Antibiotika. 

Bakterien: aus eigener Stuhlprobe 

Kontrolle: E. coli K12-wt 

Medien: Endo-Agar: Pepton aus Fleisch 10.0 g 

K 2 HPO 4 

3.5 g 

Lactose 

10.0 g 

Na-Sulfit 

2.5 g 

Fuchsin 

0.4 g 

Agar 

12.5 g 

H 2 O ad 1 l 

LB-Agar, LB-Medium, LB-Weichagar, 0.9% NaCl-Lösung 

Antibiotika: Ampicillin (µg/ml): 100, 200 Kanamycin (µg/ml): 50, 100 

Streptomycin (µg/ml): 100, 200 Tetrazyklin (µg/ml): 200, 400 

Durchführung:

1. Ausstrich einer eigenen Stuhlprobe mit abgebranntem Streichholz auf einer Endo-Agarplatte; 2-3 

Tage bei 37°C bebrüten. (Als Kontrolle wird in jeder Gruppe mindestens einmal auch E. coli 

K-12 ausgestrichen und wie die Stuhlproben weiterbehandelt!) 

2. 20-25 kräftig rote, metallisch glänzende Kolonien (E. coli) mit der Impföse abkratzen und in 3 ml 

LB-Medium vereinigen; gut suspendieren (Vortex); 5 h bei 37°C schütteln; 

3. Kultur 1:50 mit 0.9% NaCl verdünnen; je 0.1 ml der unverdünnten Suspension und der 

Verdünnung mit 4 ml geschmolzenem und auf 45°C abgekühltem LB-Weichagar vermi-schen 

und auf zwei LB-Platten ausgießen. 

4. Nach Erkalten des Agars je 2 Verdünnungen der zu testenten Antibiotika auf jede der beiden 

Platten auftropfen (ca.5 µl, automatische Pipette, sterile Spitzen); vorher Auftropf-Punkte 

markieren und beschriften!). Platten ca. 30 min stehen lassen bis die Antibiotikatropfen 

eingetrocknet sind; bei 37°C inkubieren. 

Auswertung: 

Tabellarische Darstellung der Ergebnisse aller Praktikumsteilnehmer 

18 

5. CHARAKTERISIERUNG VON BAKTERIEN 

_________________________________________________________________________________ 

5.1. ARTBESTIMMUNG VON LACTOBACILLEN 

Stämme: Jede Gruppe charakterisiert zwei Lactobacillus-Stämme, die in Versuch 1.1. isoliert 

wurden. 

Medium: MRS-Medium (s.1.1.) 

5.1.1. Morphologie 

Es werden die Flüssigkulturen aus Versuch 1.1., Punkt 6. verwendet. 

Phasenkontrastmikroskopie; Gramfärbung von Ausstrichpräparaten (bei der Gramfärbung sollten 

Kontrollorganismen, z.B. E. coli, gramnegativ, bzw. Bacillus, grampositiv, mitgefärbt werden!) 

Auswertung: 

Zellmorphologie und Färbeverhalten dokumentieren 

5.1.2. Temperaturoptimum 

1. Zwei Serien von 7 Röhrchen mit jeweils 5 ml MRS Medium mit jedem der beiden Stämme 

(Kulturen aus Versuch 1.1., Punkt 6.) beimpfen (0.05 ml); in Brutschränken bzw. Wasserbädern 

bei 15, 20, 30, 37, 45, 50 bzw. 55°C maximal 15 h bebrüten; 

2. Nach 15 h O.D.600 der Kulturen gegen MRS-Medium als Nullwert messen. 

3. 15°C- und 45°C-Röhrchen noch weitere 24 h bei den entsprechenden Temperaturen bebrüten; dann 

erneut O.D.600-Messung 

Auswertung:

1. Trübungswerte in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur graphisch auftragen; Bestimmung 

des Wachstumsoptimums; Korrelation zur Fermentationstemperatur des Ausgangsmaterials. 

2. Handelt es sich bei den Isolaten um Strepto- oder Thermobakterien? 

19 

5.1.3. Fermentationstyp 

Kulturen: Kulturen aus Versuch 1.1, Punkt 6. 

Medium : "Zuckermedium": MRS-Medium (s.1.1.) ohne Fleischextrakt und ohne Glucose 

+ 0.004% Chlorphenolrot (ACHTUNG: pH in MRS erst NACH Zugabe von 

Chlorphenolrot einstellen ! 

+ Durham-Gärröhrchen 

-> in 5 ml-Portionen autoklavieren 

+ 1 ml der zu testenden Zucker (5%ige Lösungen, autoklavieren) 


Zwei Röhrchen mit Zuckermedium inkl. Glucose mit je 0.05 ml der Kulturen aus 1.1. (Punkt 6.) 

beimpfen; 48 h bei 37°C bebrüten. 

Auswertung: 

Analyse der Diagnoseröhrchen: Trübung, Farbe, Gasbildung; Interpretation 

5.1.4. Vergärung von Zuckern 

Medium: "Zuckermedium" (s.5.1.3.) 

Zuckerlösungen (je 5%ig): 


Ausgehend von den beiden Lactobacillus-Kulturen aus Versuch 1.1. (Punkt 6.) jeweils eine Serie von 

Zuckermedien, die die zu testenden Zucker enthalten, beimpfen (je 0.05 ml); 48 h bei 

"optimaler" Temperatur (s.5.1.2.) bebrüten. 

Auswertung: 

Tabellarische Übersicht über die Zuckerspektren der beiden Iso-late. (Als positiv gelten nur eindeutig 

nach gelb umgeschlagene Kulturen. Im Zweifelsfall länger bebrüten oder Versuch wiederholen!) 

5.1.5. Verschiedene Stoffwechselleistungen 

5.1.5.1. Katalase Medien, Reagenzien und Durchführung 

> s. Methodenbuch Teil I, S. 46 u. 61 

5.1.5.2. Nitratreduktion (Kulturen aus Versuch 1.1., Punkt 6. verwenden) 

mit je 0.05 ml beimpfen 

5.1.5.3. Arginin-Spaltung 

Kulturen: Vorkulturen aus 5.1.4.

20 

Medium : 

Argininmedium: 


Pepton 5 g 

Hefeextrakt 10 g 

K 2 HPO 4 2 g 

Glucose 0.5 g 

L-Arginin 3 g pH 7.0 


1. Je 5 ml Argininmedium mit den beiden Isolaten ( aus 1.1., Punkt 6.) beimpfen (0.1 ml) und 48 h bei 

30°C bebrüten; 

2. 0.5 ml Kultur mit 0.5 ml Neßlers Reagenz (s. Methodenbuch, Teil I) vermischen; 

KONTROLLE: UNbeimpftes Argininmedium + Neßlers Reagenz 

(Gelbfärbung, aber Kein Niederschlag, da kein NH 3 !) 

Auswertung: 

Positive Reaktionen (d.h. Spaltung von Arginin zu Citrullin und NH 3 ) liegt bei Bildung eines 

kräftigen gelben Niederschlages vor. 

5.1.6. Bestimmung der Milchsäure-Konfiguration 

5.1.6.1. Zusammenhang zwischen pH-Wert und Milchsäuregehalt der Kulturlösung 

20 ml unbewachsenes MRS-Medium in einem kleinen Becherglas am pH-Meter mit 10%iger 

Milchsäure bis zu einer Endkonzentration von 2% titrieren (d.h. es werden insgesamt 5 ml 10%ige 

Milchsäure zugegeben). Bei einer pH-Abnahme um 0.1 Einheiten wird jeweils der Verbrauch an 

Milchsäure protokolliert. 

Auswertung: 

Graphische Darstellung des pH-Wertes als Funktion der Milchsäurekonzentration (g/l). 

5.1.6.2. Optischer Milchsäuretest 

Prinzip: (a) Lactat + NAD + LDH Pyruvat + NADH + H + 

(b) Pyruvat + L-Glutamat GPT L-Alanin + -Ketoglutarat 

[Lactat] ~ [NADH] 

Reagenzien: 

Kommerzieller 

„UV-Test zur Bestimmung von D- und L- Milchsäure …“ 

(Boehringer Best-Nr 11 112 821 035) 

SÄMTLICHE LÖSUNGEN BEI 4°C AUFBEWAHREN! 

Bestimmungsansatz: 

Wellenlänge: 340 nm 

Glasküvette: 1 cm Schichtdicke 

Temperatur : 20-25°C 

Testvolumen: für D-Milchsäure 2.24 ml für L-Milchsäure 2.26 ml

21 

Messung gegen Leerwert 

Milchsäuregehalt der Probelösung: 30 bis 350 µg/ml 


1. 5 ml-Kulturen der zu testenden Lactobacillus-Stämme in MRS-Medium anlegen; 24 h bei optimaler 

Temperatur bebrüten; 

2. Zellen abzentrifugieren (10 min, 8000 rpm, Beckmann, Ja20); 

3. Überstand abnehmen; pH messen; ungefähre Milchsäurekonzentration anhand der in 5.1.6.1. 

erstellten Eichkurve bestimmen; 

4. Gleiches Volumen eiskaler 1 N Perchlorsäure zusetzen; mischen; 10 min bei 5000 rpm 

zentrifugieren; 

5. Überstand abnehmen; mit 2 N KOH neutralisieren; 20 min im Eisbad aufbewahren; 

6. Ausgefallenes Kaliumperchlorat abzentrifugieren (10 min, 5000 rpm); der Überstand stellt die 

"Probe" für den optischen Test dar und muß ggf. durch Verdünnen mit H 2 O auf eine 

Milchsäurekonzentration von 20 bis 200 µg/ml eingestellt werden; 

7. Es empfiehlt sich, zur Überprüfung der Arbeitstechnik zunächst Vorversuche mit den D- bzw. L- 

Lactat-Standards durchzuführen! 

8. Optische Tests: 

… Anleitung wird ausgegeben 

Auswertung: 

Ermittlung der Konzentrationen an D- bzw. L-Milchsäure in den untersuchten Kulturlösungen: 

Nach der allgemeinen Berechnungsformel für die Bestimmung der Konzentrationen gilt: 

V 1 . MG 

c = 

. E [g/l] 

. d . V 2 

. 1000 

V 1 = Testvolumen [ml] 

V 2 = Probevolumen [ml] 

MG = Molekulargewicht der zu bestimmenden Substanz 

d 

 

= Schichtdicke [cm] 

= Extinktionskoeffizient von NADH bei 

340 nm = 6.3 [l . mmol -1 . cm -1 ] 

Hg 365 nm = 3.4 [l . mmol -1 . cm -1 ] 

Hg 334 nm = 6.18 [l . mmol -1 . cm -1 ] 

Hieraus ergibt sich für D-Milchsäure: 

2.24 . 90.1 E 

c = . E = 2.018 . [g D-Milchsäure/l Probelösung] 

. 1 . 0.1 . 1000 

 

L-Milchsäure: 

2.26 . 90.1 E 

c = . E = 2.036 . [g L-Milchsäure/l Probelösung] 

. 1 . 0.1 . 1000

22 

Ist bei der Probenvorbereitung eine Verdünnung vorgenommen worden, muß das Ergebnis noch mit 

dem Verdünnungsfaktor F multipliziert werden (beachte: Im Schritt 4. wurde die Probe mit 

Perchlorsäure vermischt!). 

Gesamtauswertung: Tabellarische Zusammenstellung aller über die Lactobacillen gesammelten 

Daten; Versuch der Bestimmung der beiden charakterisierten Stämme anhand der Tab. 1, 2 und 3. 

5.2. IDENTIFIZIERUNG VON ENTEROBACTERIACEAE 

Ziel: Zwei Gemische aus je zwei Enterobacteriaceen-Gattungen sollen getrennt und die 

Gattungen bestimmt werden. 

Stämme: Flüssigkulturen in LB-Medium, die Mischungen aus je zwei Gattungen der 

Enterobacteriaceae enthalten. 

Medien: Brolacin-Agar (Merck Fertigmedium): 

Pepton aus Casein 4.0 g 

Universalpepton 4.0 g 

Fleischextrakt 3.0 g 

L-Cystein 0.128 g 

Lactose 10.0 g 

Bromthymolblau 0.02 g 

Agar 12.0 g 

33 g/Liter H 2 O lösen, autoklavieren, Platten gießen. 

Auf Brolacin-Agar können Säurebildner und Nicht-Säurebildner differenziert werden: 

Aussehen der Kolonien Mikroorganismen 

_____________________________________________________ 

groß, goldgeb, umgebendes E. coli, Lactose-positive 

Medium gelb 

Citrobacter u.a. 

groß, goldgelb, meist schleimig, 

umgebendes Medium gelb 

Enterobacter, Klebsiella, u.a. 

groß, farblos, umgebendes Proteus, Serratia, u.a. 

Medium blau 

_____________________________________________________ 

Testmedien zur Bestimmung biochemischer und physiologischer Merkmale (genaue 

Zusammensetzung, Anwendung und Wirkungsweise der Medien s. Methodenbuch, Teil I) 

Das Wirkprinzip der gebräuchlichsten Testmedien ist in Tabelle 4 dargestellt. 

Endo-Agar (s. 4.2.) 


1. Verdünnungsausstrich des Bakteriengemisches auf Brolacin-Agar; 24 h bei 37°C bebrüten; 

2a. Falls das Wachstum auf Brolacin-Agar eine Differenzierung der beiden zu bestimmenden 

Gattungen erlaubt, können entsprechende Einzelkolonien zur Durchführung weiterer 

Tests abgeimpft werden; 

2b. Falls Brolacin-Agar die beiden Gattungen nicht differenziert, muß eine genügend große Zahl (etwa 

10) Einzelkolonien abgeimpft und einem (oder mehreren) physiologischen Tests unterzogen 

werden.

3. Als biochemische Raktionen, die oft am schnellsten zur Identifizierung von Enterobakterien führen, 

sind vor allem Indol-Bildung, H 2 S-Bildung, Methylrotprobe, Voges-Proskauer-Reaktion, 

Phenylalanin-Desaminierung, Malonat-Abbau und Harnstoffspaltung zu empfehlen. 

Auswertung: 

1. Tabellarische Zusammenfassung der Testergebnisse; 

2. Bestimmung der beiden Enterobacteriaceae-Gattungen anhand der untenstehenden 

Differenzierungstabelle 5 (Tab. 5); 

23 

5.3. MIKROBIOLOGISCHE TRINKWASSERUNTERSUCHUNG 

Ziel: Verschiedene Wasserproben sollen gemäß der gesetzlichen Trinkwasserverordnung 

bakteriologisch untersucht werden. 

Material: Wasser aus Teichen, Flüssen, Bächen... oder aus dem Ablauf von Kläranlagen. 

5.3.1. Gesamtkeimzahl 

Medium: Nähragar: 

Fleischextrakt 1 g 


Pepton 5 g 

NaCl 

5 g 

Agar 

15 g 

H 2 O ad 1 l pH 7.4, autoklavieren 


1. Wasserproben mit sterilem H 2 O oder 0.9% NaCl in 10er Schritten bis 10 -4 verdünnen; 

2. Von den unverdünnten Proben und den Verdünnungen jeweils 1 ml in sterile Petrischalen 

pipettieren; 

3. ca. 10-15 ml geschmolzenen und auf 55°C abgekühlten Nähragar pro Schale zugeben; zur 

Durchmischung Platten in Form einer 8 bewegen; 

4. Platten 24 h bei 27°C bebrüten. 

Auswertung: 

Kolonien auszählen (Lupe!); Keimzahl pro ml untersuchten Wassers berechnen; 

5.3.2. E. coli und coliforme Keime 

Bei der Trinkwasseruntersuchung auf E. coli und coliforme Keime empfiehlt sich ein Vortest, 

da bei negativem Ausgang dieses einfachen Testes die aufwendige Hauptuntersuchung entfallen kann. 

5.3.2.1. Vortest 

Medium: Lactose-Bouillon:

24 

Pepton aus Fleisch 20 g 

NaCl 10 g 


Lactose 20 g 

Bromkresolpurpur 0.04 g 

H 2 O ad 1 l 


1. Je 100 ml Lactose-Bouillon in sterilem Kolben mit je 100 ml der Wasserproben vermischen; bei 

37°C bebrüten; nicht schütteln! 

2. Kulturen nach ca. 20 und 44 h auf Trübung, und Umschlag der Farbe von purpur nach gelb prüfen. 

3. Bei Trübung der Kulturen (nach ca. 20 h) Subkulturen in 5 ml Lactose-Bouillon (+ Durham 

Röhrchen) anlegen; bei 37°C bebrüten; auf Gasbildung prüfen; 

Auswertung: 

Zeigt die Kultur keine Lactosespaltung (kein Indikatorumschlag), so bedeutet das, daß sich in 100 ml 

des untersuchten Wassers weder E. coli noch coliforme Bakterien befinden: Das Wasser entspricht den 

gesetzlichen Anforderungen. 

5.3.2.2. Hauptuntersuchung 

Material: bewachsene Lactose-Bouillon aus dem Vortest (5.3.2.1.) 

Medium : Endo-Agarplatten (s. 4.2.) 


1. Verdünnungen der Kultur in Lactose-Bouillon (bzw. Verdünnungsausstrich) auf Endo-Agar 

ausplattieren; ca. 20 h bei 37°C inkubieren; 

2. Feuchte rote oder metallisch rot glänzende Kolonien durch Verwendung geeigneter Testmedien zur 

Bestimmung biochemischer und physiologischer Merkmale (s. Methodenbuch, Teil I und 

Abschnitt 5.2.) in E. coli, Coliforme und Nicht-Coliforme differenzieren. 

Die relevanten Tests sind untenstehenden Tabellen zu entnehmen. 

Auswertung: 

(a) Test E. coli und Coliforme Nicht-Coliforme 

___________________________________________________________ 

Endo-Agar feuchte rote oder metal- andere Kolonien 

lisch glänzende Kolonien 

Cytochromoxidase - + 

Lactose-Verwertung Gas- und Säurebildung keine Säurebildung 

(b) Test E. coli Coliforme 

______________________________________________________________ 

Indolbildung + - 

Glucose-Verwertung Gas-und Säurebildung keine Säurebildung 

Citrat-Verwertung - +

25 

5.3.2.3. Colititer 

Medien: 

Röhrchen mit je 10 ml Lactose-Bouillon (s. 5.3.2.1.) und 

Durhamröhrchen 0.9% NaCl-Lösung 


1. Wasserproben mit 0.9% NaCl-Lösung in 10er Schritten bis 10 -4 verdünnen (s. 5.3.1.); aus jeder 

Verdünnungsstufe und der unverdünnten Probe jeweils 3 Röhrchen mit Lactose-Bouillon 

beimpfen (je 1 ml Inokulat); 48h bei 37°C bebrüten; nicht schütteln! 

2. Jedes Röhrchen auf Trübung, Gasbildung und Farbumschlag prüfen; 

Auswertung: 

Die Röhrchen mit der stärksten Verdünnung (d.h. mit dem kleinsten Animpfvolumen), welche noch 

positive Reaktionen (Trübung, Gasbil-dung, Farbumschlag) zeigen, erlauben die Angabe des Colititers 

in Zellen/ml. 

5.3.3. Sulfitreduzierende sporenbildende Anaerobier (Clostridium perfringens) 

Medien: Sulfit-Glucose-Eisen-Agar: 


Pepton 10 g 

NaCl 

5 g 

Glucose 20 g 

Agar 15 g in 18 ml-Portionen 


10% Na 2 SO 3 -Lösung (steril) 

8% FeSO 4 -Lösung (steril) 


1. Je 100 ml der Wasserproben 20 min bei 70 bis 75°C inkubieren; schnell unter kaltem Wasser 

abkühlen; 

2. Proben durch bakteriendichte Membranfilter (Porengröße 0.45 µm) filtrieren; 

3. Filter STERIL, mit der Bakterienseite nach OBEN, in die DECKEL von Petrischalen legen 

(ACHTUNG: zwischen Filter und Deckel dürfen sich keine Luftblasen bilden!) 

4. Zu jeweils 18 ml geschmolzenem Sulfit-Glucose-Eisen-Agar 1 ml Na 2 SO 3 - und 0.25 ml FeSO 4 - 

Lösung geben; Gemisch auf 55°C abkühlen und LANGSAM und VORSICHTIG über die 

Membranfilter gießen. (ACHTUNG: Filter dürfen dabei nicht von der Stelle bewegt werden!); 

5. Unmittelbar danach den Boden der Petrischale so auf die Agarschicht legen, daß sich keine 

Luftschicht zwischen Agar und Petrischalenboden bilden kann; bei 37°C bebrüten. 

Auswertung: 

Nach ca. 20 und 44 h Zahl der schwarzen Kolonien bestimmen; Angabe des Titers (Zellzahl/ml) der 

sulfitreduzierenden, sporenbildenden Anaerobier in den einzelnen Wasserproben.

26 

5.3.4. Pseudomonas aeruginosa 

Medien: Malachitgrün-Agar: King-P-Platten: 

Fleischextrakt 3 g Pepton 20 g 

Pepton 10 g Glycerin 10 ml 

NaCl 5 g K 2 SO 4 10 g 

Malachitgrün 0.975 g MgSO 4 x 7 H 2 O 1.4 g 

Agar 15 g Agar 15 g 

H 2 O ad 1 l H 2 O ad 1 l 


King-F-Platten: 

Pepton 20 g 

Glycerin 10 ml 

K 2 HPO 4 

1.5 g 

MgSO 4 x 7 H 2 O 1.5 g 


D-Saccharose 25 g 

Agar 15 g 

H 2 O ad 1 l 

Endo-Agar (s. 4.2.) 

1. Je 100 ml der Wasserproben durch 0.45 µm-Filter filtrieren 

2. Filter STERIL, mit der Bakterienseite nach OBEN, auf die Oberfläche von Malachitgrün- 

Agarplatten legen; 24 h bei 27°C bebrüten; 

3. Von jeder gewachsenen Kolonie Verdünnungsausstrich auf Endo-Agar anlegen, 24 h bei 37°C 

bebrüten; 

4. feuchte, farblose bis leicht gelblich gefärbte Kolonien markieren; solche Kolonien mit 

Cytochromoxidase-Teststäbchen (s.Methodenbuch,Teil I) betupfen auftropfen: im Falle 

Cytochromoxidase-positiver Kolonien färben sich die Stäbchen blauviolett bis schwarz; 

5. Alle "positiven" Kolonien auf King-F- und King-P-Schrägagar ausstreichen; bei 37°C 24 h 

bebrüten. 

__________________________ 

Anm.: auch 'fluoreszierende Pseudomonaden' aus Versuch 1.6. können hier überprüft werden. 

Auswertung: 

Pseudomonas aeruginosa bildet auf King-F bzw. King-P Agar oder auf beiden Medien meist 

Farbstoffe: Pyocyanin färbt den Nährboden blaugrün 

Pyorubin färbt den Nährboden rot bis dunkelbraun. 

Außerdem wird Fluorescein gebildet, das sich nach Anregen mit UV-Licht (256 nm) nachweisen läßt: 

Schrägagar in Petrischale überführen; von OBEN mit UV-Lampe bstrahlen. 

Ist Fluorescein auf keinem der beiden King-Nährböden nachweisbar, handelt es sich mit Sicherheit 

NICHT um P. aeruginosa. 

Läßt sich Fluorescein nur auf einem Nährboden nachweisen, müssen in der Praxis noch weitere Tests 

durchgeführt werden. Angabe des P. aeruginosa Titers (Zellzahl/ml) in den Wasserproben. 

5.3.5. Enterokokken 

Medium: Enterokokken-Agar:

27 

Trypton 20 g 


Glucose 2 g 

Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 4 g 

Na-Azid 

0.4 g 

Triphenyltetrazoliumchlorid 0.1 g 

Agar 10 g 

H 2 O ad 1 l 

autoklavieren 


1. Je 100 ml der Wasserproben durch 0.45 µm Filter filtrieren 

2. Filter STERIL, mit der Bakterienseite nach OBEN, auf die Oberfläche von Enterokokken- 

Agarplatten legen; 4 h bei 37°C, dann 44 h bei 44°C bebrüten; 

Auswertung: 

Filter bei gutem Licht ggf. mit Lupe betrachten: alle roten oder braunroten Kolonien werden als 

darmbewohnende Streptokokken gezählt. 

Angabe des Enterokokken-Titers (Zellzahl/ml) in den Wasserproben. 

Übersicht: tabellarische Zusammenfassung der über die einzelnen Wasserproben gesammelten Daten. 

6. GENÜBERTRAGUNG BEI BAKTERIEN 

________________________________________________________________________________ 

6.1. TRANSFORMATION BEI STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE 

Ziel: Der Streptomycinresistenz-Marker von Streptococcus pneumoniae soll mittels Transformation 

von einem Donor in einen Rezipienten übertragen werden. 

Stämme: S. pneumoniae AmiA9 Str R (Donor) 

S. pneumoniae R6 Str S (Rezipient) 

Medien, Lösungen: 

C-Medium PreC (NaAc, Casaminosäuren, Trp, Cys) 

Supplement (MgCl 2 , CaCl 2 , MnSO 4 , Glucose, Saccharose, Adenosin, Uridin) 

Glutamin 1 mg/ml 

AdamsIII (Biotin, Nicotinsäure, Pyridoxin, Pantothenat, Thiamin, Riboflavin / 

400 ml 

13 ml 

10 ml 

FeSO 4 , CuSO 4 , ZnSO 4 , MnCl 2 / Cholin, CaCl 2 ) 

10 ml 

Pyruvat 2 % 

5 ml 

Phosphatpuffer pH8.0 

15 ml 

Hefeextrakt 5 % 

9 ml 

Medium wird aus vorgefertigten, sterilen Komponenten erst kurz vor der Verwendung STERIL 

zusammenpipettiert. 

GM17-Medium Casein, tryptisch verdaut 5 g 

Pepton aus Soja 5 g

28 



Ascorbinsäure 

0.5 g 

MgSO 4 

0.25 g 

Na-β-Glycerophosphat 19 g 

H 2 O ad 975 ml lösen (pH 6.9), autoklavieren 

+ 20 % Glucose (getrennt autoklaviert) 25 ml 

THB-Medium Rinderherz 3.1 g 

Pepton 

20 g 

Glucose 2 g 

NaCl 2 g 

Natriumcarbonat 2.5 g 

Dinatriumphosphat 0.4 g 

H 2 O ad 1 l 

EDTA-DOC-SDS EDTA 0.1 M, pH 8.0 50 ml 

Na-Desoxycholat 0.25 % 2 ml 

SDS 0.5 % 2 ml 

TE-Puffer Tris-HCl 1 M, pH 8.0 1 ml 

EDTA 0.1 M, pH 8.0 1 ml 

H 2 O 

98 ml 

D-Agar-Blut-Streptomycin Glucose 1 g 

Bactopepton 10 g 

Neopepton 5 g 


NaCl 5 g 

Tris 

1.25 g 

H 2 O ad 1 l lösen 

+ 16,7 g Agar/l -> autoklavieren -> abkühlen lassen auf ca. 60 °C 

+ Schafsblut, steril 3 ml/100 ml Agar (-> 3 %) 

+ Streptomycin (20 mg/ml), steril 1 ml/100 ml Agar (-> 200 µg/ml) 

ETOH p.a., 0 °C 

Proteinase K 200 mg/ml in H 2 O 

Phenol, wassergesättigt (Phenol ist in der Unterphase!) 

CHCl 3 :Isoamylalkohol (24:1), wassergesättigt 

Glycerin 0.1 ml-Portionen in sterilen Eppendorfgefäßen 

BSA 

8%ig 

RNase 10 mg/ml 


I. ISOLIERUNG VON DNA AUS DEM DONORSTAMM 

1. 5 ml GM17-Medium mit S. pneumoniae AmiA9 aus Glycerinkultur beimpfen; ca. 4...5 h "über 

Nacht" bei 37°C bebrüten, sodaß sich die Kultur morgens in der exponentiellen Wachstumsphase 

befindet (Trick: Kultur abends in ein mit Eis gefülltes Wasserbad stellen; Wasserbad um ca. 4 

Uhr nachts mit Hilfe einer Zeitschaltuhr einschalten) = Vorkultur.

2. 30 ml GM17-Medium + 0.3 ml Streptomycinlösung (20 mg/ml) auf 37°C vorwärmen; mit 1.5 ml 

der Vorkultur beimpfen; bei 37°C inkubieren und OD600 verfolgen; bei OD600 ca. 1.2, Zellen 

abzentrifugieren (Ja20, 5 min 10 Krpm, Raumtemp.); Überstand abnehmen. 

3. Sediment in 1 ml EDTA-DOC-SDS suspendieren; in 2.2-ml Eppendorfgefäß überführen; 3-5 min 

bei 37°C inkubieren (nicht schütteln! Lyse ist am Aufklaren der Suspension zu erkennen). 

4. + 1 Vol. eiskaltes ETOH (0 °C!!); DNA um einen Glasstab (= Pasteurpipette, über Bunsenbrenner 

zugeschmolzen) wickeln; DNA mit Glasstab in großes Eppendorfgefäß mit 0.8 ml TE-Puffer + 

16 µl RNase (10 mg/ml) überführen. 

5. + 64 µl Proteinase K (200mg/ml), mischen; ca. 1h bei 55 °C inkubieren, Röhrchen langsam 

bewegen (nicht vortexen !); über Nacht bei RT (oder 0 °C) stehen lassen (solange, bis die Lösung 

klar ist !). 

6. + 1 ml Phenol (VORSICHT GIFT! -> Handschuhe, Abzug); gut mischen, aber nicht schütteln (> 5 

min); 10 min in der Eppendorfzentrifuge zentrifugieren. 

7. Obere, wäßrige Phase VORSICHTIG abheben (z.B mit einer abgeschnittenen blauen 

Eppendorfspitze); 

-> Schritte 6. und 7. mit 1 ml CHCl 3 :Isoamylalkohol (24:1) wiederholen. 

8. Maximal 0,6 ml der wäßrigen Phase abheben; + 2 Vol. EtOH (0°C); mischen; 30 min –70 °C. 

9. 10 min in der Eppendorfzentrifuge zentrifugieren; Überstand abnehmen; Sediment mit 2 ml 80 % 

EtOH waschen; zentr.; Überstand möglichst vollständig abnehmen (ev. nochmals kurz 

zentrifugieren); Sediment ca. 30 min an der Luft trocknen. 

10. DNA in 0.1 ml TE-Puffer lösen (24 h, 4°C). Reinheit durch Absorptionsmessungen bei 260 und 

280 nm (Quarzküvetten!) einer 1:50 Verdünnung (5 µl DNA + 245 µl TE) abschätzen. DNA- 

Konzentration aus A260 und durch Elekrophorese von Aliquots in einem 0.7 %igen Agarosegel 

bestimmen. DNA Lösung im Kühlschrank aufbewahren. 

29 

II. PRÄPARATION KOMPETENTER ZELLEN 

1. 5 ml THB-Medium mit S. pneumoniae R6 aus Glycerinkultur beimpfen; ca. 4...5 h "über Nacht" bei 

37°C bebrüten, sodaß sich die Kultur morgens in der exponentiellen Wachstumsphase befindet 

(s.o. I.1.) = Vorkultur. 

2. 0.5 ml Vorkultur zu 10 ml vorgewärmtem (37°C) C-Medium + 90 µl 8 % BSA; Trübung 

(Nephelometer !) verfolgen. 

3. Bei N = 10, N = 30, N = 60 und N = 100 (Gruppe 1, 4) 

N = 30 (Gruppen 2, 3, 5, 6) 

jeweils 2 x 0.5 ml Kultur entnehmen und zu 2 x 0.1 ml Glycerin (in sterilen Röhrchen) geben; 

sofort auf dem Vortex mischen und in flüssigen Stickstoff werfen; bei –80 °C aufbewahren. 

III. TRANSFORMATION 

Gruppen 1, 4: Abhängigkeit von der Wachstumsphase 

1. Kompetente Zellen (jeweils ein Röhrchen von N = 10, N = 30, N = 60 und N = 100) im Eisbad 

auftauen; 1:10 mit C-Medium+BSA verdünnen (0.2 ml Zellsuspension + 1.8 ml Medium); davon 

jeweils zwei Portionen à 0.2 ml in sterile Eppendorgefäße verteilen (Eis !) (Glycerinkulturen 

SOFORT wieder in flüssigem Stickstoff einfrieren !) 

2. 2µl der unverdünnten Donor-DNA (s. I.) (bzw. 2 µl TE-Puffer für die Kontrollen) mit je 0.2 ml der 

verdünnten kompetenten Zellen mischen; 30 min bei 30 °C inkubieren; dann 2 h bei 37 °C 

inkubieren. 

3. Ansätze entsprechend der untenstehenden Tabelle mit 0.9 % NaCl verdünnen; je 0.1 ml der 

Verdünnungen in leere Petrischalen geben; + je 15 ml D-Agar-Blut-Streptomycin; vorsichtig 

mischen; über Nacht bei 37 °C inkubieren. 

Gruppen 2, 5: Abhängigkeit von der DNA-Konzentration

30 

1. Verdünnungen der Donor-DNA (günstige Ausgangskonzentration: ca. 1 mg/ml) mit TE-Puffer in 

10-er Schritten herstellen: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , (jeweis 10 µl + 90 µl). DNA-Konzentrationen der 

Verdünnungen mit Hilfe des in I.10. ermittelten Wertes kalkulieren. 

2. Ein Röhrchen kompetente Zellen (N = 30) im Eisbad auftauen; 1:10 mit C-Medium+BSA 

verdünnen (0.2 ml Zellsuspension + 1.8 ml Medium); davon 5 Portionen à 0.2 ml in sterile 

Eppendorgefäße verteilen (Eis !) (Glycerinkulturen SOFORT wieder in flüssigem Stickstoff 

einfrieren !) 

3. 2µl-Portionen der unverdünnten DNA und der drei DNA-Verdünnungen (bzw. 2 µl TE-Puffer für 

eine Kontrolle) mit je 0.2 ml der verdünnten kompetenten Zellen mischen; 30 min bei 30 °C 

inkubieren; dann 2 h bei 37 °C inkubieren. 


Verdünnungen in leere Petrischalen geben; + je 15 ml D-Agar-Blut-Streptomycin; vorsichtig 

mischen; über Nacht bei 37 °C inkubieren. 

Gruppen 3, 6: Abhängigkeit von der Zell-Konzentration 

1. Ein Röhrchen kompetente Zellen (N = 30) im Eisbad auftauen; in 10-er Schritten mit C- 

Medium+BSA verdünnen: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 (jeweis 0.2 ml + 1.8 ml). Von der 10 -1 - 

Verdünnung 2 Portionen à 0.2 ml in 2 sterile Eppendorgefäße überführen, von den übrigen 

Verdünnungen jeweils eine Portion à 0.2 ml (Eis !) (Glycerinkulturen SOFORT wieder in 

flüssigem Stickstoff einfrieren !) 

2. 2µl der unverdünnten Donor-DNA (s. I.) mit je 0.2 ml der Zell-Verdünnungen mischen (bzw. 2 µl 

TE-Puffer für eine Kontrolle mit der 10 -1 -Verdünnung); 30 min bei 30 °C inkubieren; dann 2 h 

bei 37 °C inkubieren. 


unverdünnten Ansätze, bzw. 0.1 ml der Verdünnungen in leere Petrischalen geben; + je 15 ml D- 

Agar-Blut-Streptomycin; vorsichtig mischen; über Nacht bei 37 °C inkubieren. 

Kontrollen ohne DNA 

Ansätze mit DNA 

Verdünnungen unverd. 10 -4 10 -5 10 -6 unverd. 10 -2 10 -4 

Platten Strep + - - - + + + 

Auswertung: 

Spontan- 

Resistente 

Gesamtkeimzahl des 

Rezipienten 

Tranformanten 

(+ Spontan-Resistente) 

1. Gesamt-Titer (Zellen/ml) der kompetenten Zellen durch Auszählen der Kolonien auf Platten OHNE 

Strep bestimmen; 

2. Titer (Zellen/ml) der Transformanten (= Strep-Resistenten) für die verschiedenen kompetenten 

Zellen (Gruppen 1, 4), die einzelnen DNA-Konzentrationen (Gruppen 2, 5) und die 

verschiedenen Zellkonzentrationen (Gruppen 3, 6) bestimmen; 

3. Gruppen 1, 4: Kombinierte Darstellung des Wachstums der kompetenten Zellen und der 

Transformationshäufigkeit (in %) als Funktion der Zeit. 

4. Gruppen 2, 5: Graphische Darstellung der Transformationshäufigkeit (in %) in Abhängigkeit von 

der eingesetzten DNA-Konzentration; 

Transformanten/ml 

% transformierte Zellen = x 100 

Gesamtzellenzahl/ml

5. Gruppen 3, 6: Graphische Darstellung der absoluten Transformantenzahlen in Abhängigkeit von der 

Konzentration der kompetenten Zellen. 

31 

6.2. KONJUGATION BEI E. COLI 

Ziel: Der lac-Marker von E. coli soll mittels Konjugation übertragen werden. 

Stämme: Donor: E. coli CSH23 F'lac + , str s 

Akzeptor: E. coli CSH50 F - (lac-pro), str r 

Medien: LB-Medium (s.2.1.) 

LB PLatten 

IPTG-Xgal-Str-Platten: LB-Platten mit 0.2 mM IPTG, 40 µg/ml Xgal, 100 µg/ml Streptomycin 

0.9% NaCl-Lösung 


1. Übernachtkulturen des Donor- und des Akzeptorstammes in LB-Medium anlegen; bei 37°C 

schütteln; 

2. mit je 0.3 ml der Übernachtkulturen je 15 ml LB-Medium (in 100-ml Kolben) beimpfen; im 37°C- 

Bad schütteln bis O.D.600 = 0.25-0.3 (ca. 2 x 10 8 Zellen/ml). 

3a. Bestimmung der tatsächlichen Titer in den Subkuklturen von Donor und Akzeptor durch 

Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf LB-Agarplatten mit und ohne Streptomycin. 

3b. Donor-Kultur (D) und Akzeptor-Kultur (A) gemäß nachfolgender Tabelle in einem Reagenzglas 

mischen: 

Mischung Donor Akzeptor Donor/Akzeptor 

------------------------------------------------------------ 

1 1.0 ml 1.0 ml 1.0 

2 1.2 ml 0.8 ml 1.5 

3 1.4 ml 0.6 ml 2.3 

4 1.6 ml 0.4 ml 4.0 

5 1.8 ml 0.2 ml 9.0 

Mischungen im 37°C-Bad ohne Schütteln und ohne Belüftung inkubieren; 

4. Zu dem Zeiten 0, 30, 90 min jeweils · 0.1 ml aus dem Gemisch entnehmen; auf Eis stellen und 

SOFORT mit KALTER 0.9% NaCl-Lösung 10 -2 , 10 -3, 10 -4 , 10 -5 verdünnen; 

5. je 0.1 ml der Verdünnungen auf IPTG-Xgal-Str-Platten ausspateln; bei 37°C bebrüten; 

Auswertung: 

IPTG-Xgal-Str-Agar differenziert zwischen unveränderten Akzeptorzellen (str r , lac - -> farblos) und 

Transkonjuganten (str r , lac + -> blau). 

1. Bestimmung des Gesamt-Titers (Zellen/ml) Streptomycin-resistenter (strl r ), Zellen zu den Zeiten 0, 

30, 90 min durch Auszählen der Summe aus weißen und blauen Kolonien; 

2. Bestimmung des Titers (Zellen/ml) Streptomycin-resistenter (str r ), Lactose-verwertender (lac + ) 

Zellen zu den Zeiten 0, 30, 90 min durch Auszählen der blauen Kolonien; 

3. Tabellarische Zusammenfassung der Auswertungen 1. und 2. aller fünf Gruppen;

4. graphische Darstellung des Anteiles (%) der lac + gewordenen Akzeptorzellen in Abhängigkeit von 

der Konjugationszeit (5 Kurven für die 5 Mischungsverhältnisse von Donor und Akzeptor); 

5. graphische Darstellung des Anteiles (%) der lac + gewordenen Akzeptorzellen in Abhängigkeit vom 

Mischungsverhältnis Donor:Akzeptor (2 Kurven für die Inkubationszeiten 30 und 90 min). 

32 

7. BAKTERIOPHAGEN 

________________________________________________________________________________ 

7.1. ISOLIERUNG VON COLIPHAGEN AUS ABWASSER 

Ziel: Nachweis, Vermehrung und Beschreibung von Bakteriophagen aus Abwasser. 

Material: 

Abwasser aus dem Zulauf der städtischen Kläranlage 

Medien : LB-CM-Medium: 

LB-Medium (s.2.1.) + 5 mM CaCl 2 + 10 mM MgSO 4 (CaCl 2 und MgSO 4 nach dem 

Autoklavieren aus hochkonzentrierten sterilen Stammlösungen zugeben. 

LB-Agar (1,5% Agar); LB-Weichagar (0,7% Agar) 

0.9% NaCl 

Indikatorbakterien: Übernachtkultur von E. coli B 

ACHTUNG! Alle Glaswaren, die mit Abwasser in Berührung gekommen sind, werden in 1 % 

Hyamin-x-10 Lösung gelegt und darin mindestens 4 Stunden aufbewahrt. Nach Versuchsabschluß die 

Phagenplatten in speziellen Abfallsäcken entsorgen, und die Phagenröhrchen autoklavieren! 


1. 45 ml Abwasser 15 min bei 5000 g zentrifugieren; Überstand durch ein bakteriendichtes Filter (0.45 

µm) filtrieren; Filtrat im Kühlschrank aufbewahren; 

ACHTUNG: Bei der Handhabung des Abwassers stets Handschuhe tragen! 

Nicht mit dem Mund pipettieren! 

2. filtriertes Abwassers mit steriler 0.9% NaCl-Lösung 10 -1 und 10 -2 verdünnen. Je 0.2 ml des 

unverdünnten Filtrates und der beiden Verdünnungen mit je 0.2 ml Indikatorbakterien mischen 

und zusammen mit je 4 ml geschmolzenem und auf 45°C abgekühltem LB-Weichagar (+ 0.1 ml 

0.4 M MgSo 4 + 0.1 ml 0.2 M CaCl 2 ) auf LB-Agarplatten ausplattieren; es werden jeweils 2 

parallele Ansätze (also insgesamt 6 Platten) angelegt; Platten bei 37°C über Nacht bebrüten; 

3. falls nach Bebrütung keine Plaques sichtbar sind, müssen die Phagen aus dem Abwasser wie folgt 

angereichert werden: 

a) 10 ml doppelt konzentriertes LB-CM-Medium in 100 ml Erlenmeyerkolben mit 0.2 ml 

einer Übernachtkultur von E. coli B beimpfen; bei 37°C schütteln bis O.D.600 = 0.6 

bis 0.8; 

b) 10 ml des auf 37°C vorgewärmten Abwasserfiltrates zusetzen; 4 h bei 37°C 

weiterschütteln; 

c) Kultur steril zentrifugieren (5 min, 8000 rpm, Ja20); Überstand wie unter Punkt 2. 

beschrieben für den Nachweis von Phagen einsetzen; 

4. Mindestens 3 klare, möglichst unterschiedlich aussehende Plaques mit sterilen Pasteurpipetten oder 

Pipettenspitzen ausstechen; in Röhrchen mit je 1 ml LB-Medium überführen und gut

33 

verreiben; Röhrchen über Nacht bei Zimmertemp. stehen lassen (Phagen diffundieren aus dem 

Agar); dann in den Kühlschrank! 

Die Phagenisolate werden in Versuch 7.2. gebraucht. 

Auswertung: 

1. Bestimmung des Phagentiters (plaque forming units/ml) im Abwasser (s. Punkt 2.) bzw. in der 

Anreicherungskultur (s. Punkt 3.); 

2. Morphologie (Durchmesser, Klarheit, Rand, Hof) der 3 isolierten Plaques protokollieren. 

7.2. HERSTELLUNG VON LYSATEN 

Phagen: a) P1 vir 

b) M13 

c) mindestens 1 Eigenisolat aus Abwasser (s. 7.1.) 

Medien: s. 7.1. 

0.9 % NaCl-Lösung 

Indikatorbakterien: Übernachtkulturen von 

a) E. coli K12 für P1 vir 

b) E. coli JM109 für M13 

c) E. coli B für Eigenisolate 


1. Je 30 ml LB-CM-Medium in 100 ml-Kölbchen mit je 0.5 ml der drei Übernachtkulturen a), b), c) 

beimpfen (t = 0); Wachstum der Kulturen durch O.D.600-Messung von Proben in Abständen von 

20 min verfolgen; 2. bei O.D.600 = 0.1 bis 0.15 Kulturen mit je 0.5 ml der Phagensuspensionen 

a), b) bzw. c) infizieren (ACHTUNG! Phagensuspension vor Gebrauch ~ 1 min in der 

Eppendorf-Zentrifuge in sterilen Gefäßen zentrifugieren; klare Überstände verwenden!); heftig 

bei 37°C weiterschütteln; O.D.600 in den Kulturen a) und c) weiterhin in 20 min-Abständen, in 

Kultur b) in 40 min-Abständen messen; 

3. Kulturen a) und c), nachdem die O.D.600 ein Minimum durchlaufen hat und wieder anzusteigen 

beginnt, Kultur b) ca. 4 h nach Infektion abzentrifugieren (15 min, 15000 rpm, Ja20); 

4. Phagen-haltige Überstände (= Lysate) abnehmen; steril filtrieren; bei 4°C aufbewahren 

5. Titerbestimmung in den Lysaten: 

a) Die Lysate in 100er Schritten mit steriler 0.9% NaCl-Lösung bis 10 -10 verdünnen; je 0.1 ml 

der 10 -4 , 10 -6 , 10 -8 und 10 -10 -Verdünnungen zusammen mit je 0.2 ml der entsprechenden 

Indikatorbakterien und je 4 ml geschmolzenem und auf 45°C abgekühltem LB-CM-Weichagar 

auf LB-Platten ausplattieren; über Nacht bei 37°C bebrüten; 

b) Plaques zählen. Platten nicht wegwerfen, sondern bei 4°C aufbewahren; sie werden in Versuch 7.4. 

gebraucht! 

Die Lysate werden im Versuch 7.3. zur Wirtskreis-Bestimmung und in Versuch 7.4. zur Isolierung 

Phagen-resistenter Mutanten benötigt. (Bei 4°C aufbewahren.) 

Auswertung:

34 

1. Beschreibung der Plaque-Morphologien; 

2. Bestimmung der Phagentiter (pfu/ml) in den 3 Lysaten 

7.3. PHAGEN-WIRTSSPEZIFITÄT (LYSOTYPIE) 

Bakteriophagen: Lysate von a) P1 vir , b) M13, c) Eigenisolaten aus Abwasser (s.7.2.); 

(steril filtriert, s. 7.2. Punkt 4.) 

Bakterienstämme: 1) E. coli K-12, 2) E. coli JM109, 3) E. coli CM17, 4) E. coli C, 

5) E. coli B (Übernachtkulturen) 



I. PHAGEN-TROPFENTEST 

1. Je 0.1 ml der Bakterienkulturen 1 bis 5 mit je 4 ml geschmolzenem und auf 45°C abgekühltem LB- 

CM-Weichagar vermischen und auf LB-Platten ausgießen; 

2. Nach Erstarren des Weichagars 5 µl der zu testenden Phagenlysate (an vorher auf den Plattenböden 

markierten Stellen) auf jede Platte auftropfen; bei 37°C über Nacht inkubieren; 

II. BAKTERIEN-TROPFENTEST 

1. Je 0.1 ml der Phagenlysate a), b), c) mit je 4 ml geschmolzenem und auf 45°C abgekühltem LB- 

CM-Weichagar vermischen und auf LB-Platten ausgießen; 

2. Nach dem Erstarren des Weichagars 5 µl der zu testenden Bakterienstämme (z.B. über einem auf 

Papier aufgezeichneten Raster) auf jede Platte auftropfen; bei 37°C über Nacht inkubieren. 

Auswertung: 

Tabellarische Darstellung und Interpretation der Ergebnisse. 

7.4. ISOLIERUNG PHAGEN-RESISTENTER MUTANTEN 

Bakteriophagen: Platten mit Plaques von 

a) P1 vir auf E. coli K-12 

b) einem Eigenisolat aus Abwasser auf E. coli B (aus Versuch 7.2.) 

Lysate der Phagen a) und b) aus Versuch 7.2., (steril filtriert!) 

Bakterienstämme: Übernachtkulturen von a) E. coli K-12 

b) E. coli B 


LB-Flüssigmedium 


1. Mit steriler Impföse je 2 Plaques a) P1 vir -, bzw. b) dem Eigenisolat, die 'Resistenz-verdächtige' 

Bakterienkolonien enthalten, abimpfen und auf LB-Platten ausstreichen; über Nacht bei 37°C 

bebrüten; 

2. Von jeder Platte mit der Impföse eine Einzelkolonie abimpfen und erneut auf eine LB-Platte 

ausstreichen (Verdünnungsausstrich); über Nacht bei 37°C bebrüten;

3. Von jeder Platte eine Einzelkolonie in je 2.5 ml LB-Medium überimpfen; 4 bis 6 h bei 37°C 

schütteln; 

4. Überprüfung auf Resistenz: 

A) je 1 ml der Kulturen 2 min zentrifugieren (Eppendorf-Zentr.); je 0.1 ml der klaren 

Überstände zusammen mit je 0.2 ml der zugehörigen Indikatorbakterien in je 4 ml LB-CM- 

Weichagar (45°C) auf LB-Platten ausplattieren; bei 37°C bebrüten; 

B) Verdünnungen der Phagen-Lysate a) und b) mit einem Titer von ca. 10 5 pfu/ml herstellen; je 

0.1 ml der Verdünnungen zusammen mit je 0.2 ml der zugehörigen "resistenten" 

Indikatorbakterien (s. Punkt 3.) in je 4 ml LB-CM-Weichagar (45°C) auf LB-Platten ausplattieren; 

bei 37°C bebrüten; 

C) Je 0.2 ml der Kulturen (s. Punkt 3.) in LB-CM-Weichagar auf LB-Platten plattieren; Phagen- 

Tropfentest (s. 7.3.) mit BEIDEN verwendeten Phagen; 

Auswertung: 

1. Sind die Kulturen der isolierten Mutanten frei von Phagen? 

2. Um welchen Faktor vermehren sich die Phagen auf den Mutanten schlechter als auf den 

Ausgangsstämmen? (Grad der Resistenz: Phagentiter auf Resistenten 

Phagentiter auf Sensitiven (aus 7.2.) 

3. Zeigen Mutanten, die gegen den Phagen a) resistent sind, auch Resistenz gegen b)? 

35 

7.5. BESTIMMUNG DER "BURST SIZE" 

Ziel: Bestimmung der mittleren Wurfgröße des Phagen P1 vir . oder eines im Praktkum isolierten 

Abwasser-Phagen. D.h. Wieviele infektöse Partikel werden im Mittel in einer mit Phagen 

infizierten Zelle produziert? 

Phagen: P1 vir -Lysat mit bekanntem Titer (z.B. aus Versuch 7.2.) 

(ACHTUNG! Titer muß kurz vor Versuchsbeginn unbedingt FRISCH bestimmt werden!) 

Bakterien: Übernachtkultur von E. coli K-12 (für P1 vir ) 

Medien: S. 7.1. 

0.9 % NaCl-Lösung 


1. Alle Gruppen gemeinsam: 

80 ml LB-CM-Medium (in 300 ml-Kolben) mit 0.6 ml E. coli K-12-Übernachtkultur beimpfen; 

bei 37°C schütteln; O.D. 600 der Kultur verfolgen und O.D.600-Werte mit Hilfe der in Versuch 

2.1. erstellten Eichkurve und parallelle Zellzählungen in der Zählkammer in Zellzahl/ml 

übersetzen (ACHTUNG! die exakte Bestimmung der Zelldichte ist unbedingt erforderlich!); 

2. Jede Gruppe für sich: 

bei einer Zelldichte von 5 x 10 7 Zellen/ml *) (OD600 ~ 0.14) 1ml der Kultur in ein Reagenz-glas 

überführen und mit Phagen zu einer MOI (multiplicity of infection) von 10 infizieren (d.h. 5 x 

10 7 x 10 = 5 x 10 8 Phagen einsetzen. Dazu den Titer der zu verwendenden Phagensuspension 

auf 5 x 10 8 /ml einstellen, 1 ml davon verwenden); gut mischen; 5 min bei 37°C inkubieren 

(Absorption);

*) Als Kontrolle wird die tatsächliche Zelldichte der Kultur zum Zeitpunkt der Infektion durch 

Ausplattieren geeigneter Verdünnungen (hergestellt in EISKALTER 0.9 % NaCl-Lösung) auf 

LB-Platten und Inkubation bei 37°C bestimmt . 

3. Infizierte Kultur mit LB-CM-Medium um den Faktor 10 6 verdünnen; von der 1 : 10 6 -Verdünnung 

je 0.1 ml (darin sollten sich im statistischen Mittel je · 2 infizierte Bakterien befinden!) in 20 

sterile Reagenzgläser umfüllen; Gläser 1 h, 45 min bei 37°C ohne Schütteln inkubieren; 

4. Den Inhalt von jedem der 20 Reagenzgläser mit je 0.2 ml E. coli K-12-Übernachtkultur und 4 ml 

geschmolzenem LB-CM-Weichagar (45°C) mischen und auf 20 LB-Platten ausplattieren; über 

Nacht bei 37°C inkubieren; 

5. Plaques auszählen. 

Auswertung: 

1. Tatsächlichen Titer der Bakterien zum Zeitpunkt der Infektion angeben. 

2. Ergebnisse ALLER Gruppen sammeln; Plaque-Zahlen auf volle 5 Plaques auf- bzw. abrunden; 

3. Graphische Darstellung der Zahl der Platten gegen die Zahl der Plaques; aus der Graphik die 

mittlere burst size (= Wurfgröße) von P1 vir ermitteln; 

4. Berechnung der Wahrscheinlichkeiten (p), mit denen auf einer Platte Phagen aus n infizierten 

Bakterien zu finden sind für n = 1; n = 2 und n = 3; 

Poisson'sche Verteilungsformel p(n) = e -m m n / n! 

(m = mittlere Anzahl infizierter Bakterien pro Röhrchen = 2) 

5. Vergleich der theoretischen Werte (Punkt 3.) mit den im Versuch tatsächlich ermittelten Werten 

(Punkt 2.); Interpretation. 

36

Versuche

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