Entwicklung einer Aufarbeitungsmethode zur Bestimmung von Sudan

Kleinhenz, Silvia und Gertrud Eigner (2007) Mitteilungsblatt der Fleischforschung Kulmbach 46, Nr. 175, 21-26
Entwicklung einer Aufarbeitungsmethode zur Bestimmung von Sudan- und
Azofarbstoffen in Fleischerzeugnissen mittels LC-MS bzw. HPLC-UV
Development of a clean-up procedure to determine Sudan and azo dyes in meat products
by applying LC-MS or HPLC-UV
Silvia KLEINHENZ und Gertrud EIGNER
Zusammenfassung
Sudanfarbstoffe sind synthetisch hergestellte Stoffe, die trotz fehlender Zulassung in Europa
häufig wegen ihres weiten Farbspektrums den Lebensmitteln, vor allem Chili- und Paprika-
Gewürzen zugesetzt werden. Da sie im Verdacht stehen, Krebs erregend und mutagen
wirksam zu sein, sollten Analysenmethoden erarbeitet werden, um diese Farbstoffe in
Lebensmitteln zu detektieren. Nachweismethoden für diese Stoffe in Gewürzen existieren
bereits. Da Gewürze jedoch auch in Fleischerzeugnissen eingesetzt werden, sollte im
Folgenden eine qualitative und quantitative Bestimmungsmethode für diese Lebensmittelgruppe
erarbeitet werden.
Mit Hilfe der entwickelten Probenextraktion bzw. der Fettabtrennung können nun an einer
HPLC-UV/VIS- bzw. einer LC-MS-Anlage unter Einsatz einer Zorbax Eclipse XDB-C8-Säule
und einem geeigneten Gradienten die verschiedenen Sudanfarbstoffe getrennt voneinander
detektiert werden.
Summary
Sudan dyes are synthetically produced substances. Despite not existing admittance in
Europe these dyes are still used in food particularly in chili and red pepper spices. They are
suspected to be both carcinogenic and mutagenic. Therefore methods for analyzing these
dyes in different food matrices should be developed. Some methods already exist to detect
the forbidden dyes in spices. Because spices are applied during the production of meat
products, a qualitative and quantitative method to detect the Sudan and azo dyes in this
matrix had to be designed.
With the help of the developed sample extraction and fat separation these dyes can be
detected with HPLC-UV/VIS or LC-MS working with a Zorbax Eclipse XDB-C8 column and a
specific gradient.
Schlüsselwörter
Key Words
Sudanfarbstoffe – Azofarbstoffe – Fleischerzeugnisse –
Methodenentwicklung – LC-MS – HPLC-UV
Sudan dyes – azo dyes – meat products – method development –
LC-MS – HPLC-UV
Einleitung
Sudanfarbstoffe sind synthetisch hergestellte
Azofarbstoffe, die in der Natur nicht
vorkommen. Deshalb ist ein Nachweis
dieser Farbstoffe in Lebensmitteln ausschließlich
durch bewussten Zusatz zu erklären.
Bewusst zugesetzte Farbstoffe
zählen zur großen Gruppe von „Zusatzstoffen“.
Zusatzstoffe dürfen allerdings nur
dann eingesetzt werden, wenn sie eigens
zugelassen wurden, d. h., dass neu entwickelte
Zusatzstoffe grundsätzlich erst
verboten sind, bis zu dem Zeitpunkt, an
dem sie ausdrücklich erlaubt werden. Eine
solche Zulassung existiert für Sudan- und
Azofarbstoffe nicht. Es ist also verboten,
diese Substanzen Lebensmitteln zuzusetzen.
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Dennoch wurden in den letzten Jahren
durch verschiedene Staaten der Europäischen
Union vermehrt die Farbstoffe
Sudan I bis IV in Lebensmitteln, insbesondere
in scharfem Chilipulver aus Drittländern,
nachgewiesen. Es herrschte also
Handlungsbedarf. Deshalb wurden EUweite
Regelungen getroffen, welche die
verbotene Verwendung von Sudan I bis IV
in Lebensmitteln noch stärker kontrollieren.
Noch heute sind Sudan I und andere Azofarbstoffe,
wie Pararot oder Buttergelb,
Ursache für Meldungen im Europäischen
Schnellwarnsystem (Rapid Alert System
for Food and Feed, RASFF) [1]. Die aktuellste
Beanstandung (Stand: 1. Kalenderwoche
2007) stammt vom 14. Dezember
2006. Dort wurden Sudanrot I und IV in
einer Gewürzzubereitung für Geflügel aus
der Türkei durch das Importland Deutschland
beanstandet. Es stellt sich die Frage,
wie überprüft werden kann, dass nicht
etwa ein Gewürz bei der Wurstproduktion
verwendet wurde, das mit Sudanfarbstoffen
kontaminiert war. Oder, wie
können Fleischerzeugnisse auf ihren
Sudanfarbstoffgehalt überprüft werden,
wenn von einer Rückrufaktion betroffene
gefärbte Gewürze eingesetzt wurden?
Verwendung von Sudanfarbstoffen
Verwendung finden die Sudanfarbstoffe
aufgrund ihrer vielfältigen und sehr ansprechenden
Farbschattierungen beim
Färben von Mineralöl-Produkten, von
Wachserzeugnissen sowie zur Herstellung
von Kugelschreiberpasten, Tuschen und
Filzschreibern. Am bekanntesten neben
Sudan I bis IV ist mit Sicherheit das zur
Kennzeichnung von Heizöl verwendete
farblose Solvent Yellow 124, das im
sauren Milieu zu einem intensiv roten
Farbstoff reagiert, der sich in der wässrigen
Phase anreichert und damit sehr
einfach und schnell nachweisbar ist.
Toxizität von Sudanfarbstoffen
Sudanfarbstoffe, beziehungsweise Azofarbstoffe
im Allgemeinen, stehen im Verdacht,
Krebs erregend zu sein. Außerdem
sollen diese Farbstoffe mutagen wirksam
sein. Die Mutagenität soll aus einer im
menschlichen Körper stattfindenden Azospaltung
der Farbstoffmoleküle resultieren,
bei der sich Amine bilden können, die in
der Lage sind, mit dem menschlichen Erbgut
in Interaktion zu treten und es damit zu
schädigen. Sudan I kann überdies bei
Kontakt mit der Haut oder beim Einatmen
als Staub sensibilisierende Wirkung haben
[2]. Diese Risiken sind Ursache für eine
strikte Regelung der Verwendung von
Sudanfarbstoffen.
Rechtliche Aspekte
Die Tatsache, dass noch immer Sudan I in
Lebensmitteln gefunden wurde, war der
Auslöser dafür, dass die Europäische
Kommission am 20. Juni 2003 eine Entscheidung
über Dringlichkeitsmaßnahmen
(2003/460/EG) [3] erlassen hat. Danach ist
in den Mitgliedsstaaten der EU die Einfuhr
von scharfen Chilis und scharfen Chilierzeugnissen
aus Drittländern komplett
verboten, wenn nicht durch einen Analysenbericht
bestätigt wird, dass kein
Sudan I nachweisbar ist.
Durch die Entscheidung 2004/92/EG der
Kommission vom 21. Januar 2004 [4]
wurde die Palette der zu untersuchenden
Produkte von Chilis und Chilierzeugnissen
(entspricht Curry) auf Paprikapulver,
Kurkuma und Palmöl ausgeweitet. Außerdem
ist ein Analysenbericht für Sudan II,
Sudan III, und Sudan IV verpflichtend, da
sie noch immer in Lebensmitteln nachgewiesen
wurden und durch ihre sehr
ähnliche Struktur zu Sudan I ebenfalls als
kanzerogen eingestuft werden.
Bestehende Methoden zur Bestimmung
von Sudan- und Azofarbstoffen
Weder der qualitative noch der quantitative
Nachweis von Sudanfarbstoffen, die
verbotenerweise in Lebensmitteln eingesetzt
werden, lassen sich ohne Probleme
aufgrund der komplizierten Matrices
von Lebensmitteln durchführen. In Landesuntersuchungsämtern
werden die
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Sudanfarbstoffe üblicherweise in einem
Screening-Verfahren mittels Dünnschichtchromatographie
bestimmt. Wenn dort
positive Befunde ermittelt werden, wird
eine Absicherung dieser Ergebnisse durch
empfindlichere Verfahren mittels HPLC/
Diodenarray-Detektor (DAD) oder HPLC/
MS-MS durchgeführt.
Die dabei verwendeten und auch die in
anderen Laboratorien entwickelten Methoden
sind vielfältig. Einige der Methoden
sind sehr empfindlich mit Nachweisgrenzen
unter 1 mg/kg (ppm) und kommen in
ähnliche Konzentrationsbereiche, wie sie
für Fleischerzeugnisse nötig wären. Allerdings
gelten diese Methoden nur für Gewürze,
Soßen und Palmöl. Für den Nachweis
und die Bestimmung von Sudanfarbstoffen
in Wurst oder für eiweißreiche
erhitzte Produkte wurde noch keine
adäquate Analytik entwickelt.
Entwicklung einer Methode zur
Bestimmung von Sudan- und Azofarbstoffen
in Fleischerzeugnissen
Sudanfarbstoffe, die verbotenerweise
durch Gewürze in die Wurst gelangten,
sollen in Fleischerzeugnissen durch eine
geeignete Aufarbeitung sowohl qualitativ
als auch quantitativ bestimmt werden. Die
Schwierigkeit der quantitativen Bestimmung
von Sudanfarbstoffen in Fleischerzeugnissen
liegt – neben der Entfernung
der großen Mengen an Fett – darin, die
Farbstoffe vom Eiweiß zu lösen, da sie
aufgrund ihrer chemischen Struktur eine
besonders feste Bindung zum Eiweiß aufbauen.
Für die allgemeine Probenvorbereitung
wurde zunächst eine Modellbrühwurst
(Lyoner) hergestellt. Dabei handelt es sich
um handelsübliche Brühwürste, denen
nach dem Garen Farbstofflösungen zugesetzt
wurden. Bei diesen Modellwürsten
konnte die Abtrennung großer Mengen
Fett erarbeitet werden.
Durch den Zusatz von Farbstofflösungen
zum Brät wurde im Anschluss die Anwendbarkeit
der Methode an realen Produkten
und nochmals die Extraktion
überprüft. Damit konnte das Lösen der
Farbstoffe vom Eiweiß besser simuliert
und später überprüft werden.
Vorläufige Methode zur Aufarbeitung
von Fleischerzeugnisproben für die
Sudan- und Azofarbstoffbestimmung
20 g homogenisierte Probe werden im
Bühlerhomogenisator dreimal mit jeweils
40 ml Extraktionsgemisch (n-Hexan/
Cyclohexan/Ethylacetat/Acetonitril/Aceton,
1/1/1/1/1) extrahiert und über eine 1G3-
Fritte abfiltriert. Nach Abrotieren des
Lösungsmittels wird der Fettrückstand mit
50 ml Petrolether (40-60 °C) wieder aufgenommen
und mit 50 ml Dimethylformamid
(DMF) ausgeschüttelt. Die DMF-
Phase wird mit Petrolether gereinigt und
anschließend mit ca. 200 ml 10%iger
Zitronensäure verdünnt bzw. angesäuert.
Die Farbstoffe werden aus der DMF-
Phase durch Cyclohexan extrahiert. Die
Extraktion wird nach erneutem Ansäuern
mit 30 ml konzentrierter Salzsäure wiederholt.
Nach dem Entfernen des Lösungsmittels
aus den vereinigten Extrakten
werden die zu bestimmenden Farbstoffe
mit Acetonitril aufgenommen und mittels
HPLC-UV/VIS bzw. HPLC-MS vermessen
(Abb. 1).
Dafür wurden die HPLC-Bedingungen
nach Hönicke et al. (2006) [5] mit verändertem
Fluss verwendet:
Säule Zorbax Eclipse XDB-C8,
150 x 4,6 mm, 5 µm (Agilent)
Säulenofen 40 °C
Eluent
Fluss
Injektionsvolumen
Detektion
A: H 2 O (0,1 % Ameisensäure)
B: Acetonitril (0,1 % Ameisensäure)
Start: A: 30 %; B: 70 %
In 5 min auf A: 5 %; B: 95 %,
dann 25 min konstant
0,2 ml/min
3 µl
- UV/VIS-Spektrometer: 480 nm
- Ionenfalle (ESI-Quelle)
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Tab. 1: Strukturformeln und Bezeichnungen der Farbstoffe, die mit der entwickelten Methode
bestimmt werden können
Substanz Synonyme CAS-Nr. Strukturformel
Sudan I Sudan Gelb
Sudan Orange R
Solvent Yellow 14
1-Phenylazo-2-naphthol
842-07-9
Sudan II
Sudan Orange
Solvent Orange 7
1-(2,4-Dimethylbenzolazo)-2-
naphthol
3118-97-6
Sudan III
Sudan red
Ceresinrot
Solvent Red 23
1-[(4-Benzolazo)-benzolazo]-2-
naphthol
85-86-9
Sudan IV
Scharlachrot
Solvent Red 24
Ölrot 2B
2´,3-Dimethyl-4-(2-hydroxy-1-
naphthylazo)-azobenzol
85-83-6
Pararot
Nitroanilinrot
1-(4-Nitrobenzolazo)-2-
naphthol
1-(4-Nitrophenylazo)-2-
naphthol
6410-10-2
Buttergelb Dimethylgelb 60-11-7
Sudanrot 7B
Ceresrot 7B
Solvent Red 19
N-ethyl-1-[[p-
(phenylazo)phenyl]azo]-2-
naphthalenamin
6368-72-5
Sudanrot G
Fettrot G
Oelrot 113
Solvent Red 1
1-(2-Methoxyphenylazo)-2-
naphthol
1229-55-6
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Die zu bestimmenden Farbstoffe wurden
auf Sudan I bis Sudan IV, Pararot, Buttergelb,
Sudanrot G und Sudanrot 7B
(Tab. 1) eingegrenzt. Bei den HPLC-
MS/MS-Messungen wurden in Standardfarblösungen
die Nachweisgrenzen für
Sudan I, II und IV ebenso wie für Buttergelb,
Sudanrot G und Sudanrot 7B mit
Werten unter 10 ng/ml erreicht. Die beiden
Farbstoffe Sudan III und Pararot waren bei
Konzentrationen bis zu 20 ng/ml nachzuweisen.
Bei der zu verwendenden Probeneinwaage
von 20 g Fleischerzeugnis
können Farbstoffe bis zu einem Gehalt
von unter 1 µg/kg (ppb) nachgewiesen
werden.
Pararot
Sudanrot G
Sudan 1
Sudan 4
Sudan 3
Sudan 2
Buttergelb
Sudanrot 7B
Abb. 1: In türkis: UV/VIS-Chromatogramm eines Farbstoffgemisches in Brühwurst, das nach dem
beschriebenen „Clean-up“ aufgearbeitet wurde, nach Auftrennung mittels genannter HPLC-
Methode. Als Beispiel für die sehr empfindliche MS/MS-Detektion sind für diesen Lauf in rot der
MS/MS-Peak für Buttergelb und in grün der MS/MS-Peak für Sudanrot 7B dargestellt. Es ist eine
minimale zeitliche Verschiebung festzustellen, da das UV/VIS-Spektrometer dem Massenspektrometer
vorgeschaltet ist
Mit dieser Aufarbeitungsmethode konnten
in gegarten Fleischerzeugnissen am Beispiel
von Brühwürsten, die im Nachhinein
mit Sudanfarbstoffen aufdotiert wurden,
Wiederfindungen zwischen 86 und 101 %
erreicht werden. Dabei wurde das Fett
quantitativ entfernt und die Sudanfarbstoffe
konnten noch sehr gut vom Eiweiß
abgelöst werden, da sie noch keine zu
festen Bindungen mit dem Eiweiß aufgebaut
hatten. Das Problem der zu festen
Bindung an Eiweiß tritt erst dann auf,
wenn die zu analysierenden Farbstoffe
bereits dem rohen Brät zugesetzt werden.
Sie erhöhen sich sogar noch, wenn dieses
Brät anschließend erhitzt wird. Bei solchen
Produkten wurden weniger zufriedenstellende
Wiederfindungsraten erreicht, die
noch verbessert werden müssen. Erste
positive Ergebnisse konnten durch Ansäuern
der Probenlösung mit Zitronensäure
bereits während der Extraktion
erzielt werden.
Schlussfolgerung
Aufgrund der Tatsache, dass Lebensmittel
keine Sudan- und Azofarbstoffe enthalten
dürfen, sind die unbefriedigenden Wieder-
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findungsraten ohne Belang. Ausschlaggebend
ist nämlich bereits ein qualitativer
Nachweis von Sudanfarbstoffen, der eine
Beanstandung des Produkts nach sich
zieht, da Sudanfarbstoffe in Lebensmitteln
grundsätzlich verboten sind, auch wenn
sie nicht zum Färben eingesetzt wurden,
sondern lediglich in nicht mehr färbenden
Konzentrationen durch Kontamination ins
Produkt gelangt sind. Deshalb ist es
wichtig, dass diese Farbstoffe auch in
Fleischerzeugnissen und nicht nur in
Gewürzen nachweisbar sind.
Literatur
[1] Bundesamt für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit, Schnellwarnungen
RASFF: Lebensmittelsicherheit / Täglich
aktualisierte Liste: Dezember / Stand
15.12.2006
[2] BfR, Bundesamt für Risikobewertung,
Farbstoffe Sudan I bis IV in Lebensmitteln,
Stellungnahme vom 19.11.2003
[3] EU-Kommission (2003/460/EG): Entscheidung
der Kommission vom 20. Juni 2003
über Dringlichkeitsmaßnahmen hinsichtlich
scharfer Chilis und scharfer Chilierzeugnisse;
Amtsblatt Nr. L 154 vom 21/06/2003
S. 0114 - 0115
[4] EU-Kommission (2004/92/EG): Entscheidung
der Kommission vom 21. Januar
2004 über Dringlichkeitsmaßnahmen hinsichtlich
Chilis und Chilierzeugnissen;
Amtsblatt Nr. L 027 vom 30/01/2004 S.
0052-0054
[5] Hoenicke, K.; Mass, S.; Gatermann, R.;
Ultraspurenkonzentrationen von Sudanfarbstoffen
und anderen verbotenen Farbstoffen
in Gewürzen und Oleoresinen – Ein
analytischer Artefakt oder eine Kontamination?
Poster zum 35. Lebensmittelchemikertag
2006 in Dresden
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